JP2614848B2 - ヒト―プロテインｃをコードする遺伝子 - Google Patents
ヒト―プロテインｃをコードする遺伝子Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は一般に、血漿蛋白質及びそれらをコードす
るDNA配列に関し、そしてさらに詳しくはヒト−プロテ
インＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋白
質の発現に関する。
るDNA配列に関し、そしてさらに詳しくはヒト−プロテ
インＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋白
質の発現に関する。
プロテインＣは、インビボにおける血液凝固の制御及
びフィブリン溶解活性の発生において重要な役割を演ず
るセリンプロテアーゼのチモーゲン（zymogen）又は前
駆体である。これは肝臓内で単鎖ポリペプチドとして合
成され、この単鎖ポリペプチドはかなりのプロセシング
を受けて、ジスルフィド結合により一体化されたヘビー
鎖（Mr＝40,000）及びライト鎖（Mr＝21,000）から成る
２本鎖分子となる。循環する２本鎖中間体が、ヘビー鎖
のアミノ末端からの12−残基ペプチドのスロンビン介在
開裂により、“活性化されたプロテインC"（APC）とし
て知られている生物学的に活性な形態の分子に転換され
る。この開裂反応は、インビボにおいて、内皮細胞コフ
ァクターであるスロンボモジュリン（thrombomodulin）
により増強される（Esmon及びOwen,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA，78;2249−2252,1981）。
びフィブリン溶解活性の発生において重要な役割を演ず
るセリンプロテアーゼのチモーゲン（zymogen）又は前
駆体である。これは肝臓内で単鎖ポリペプチドとして合
成され、この単鎖ポリペプチドはかなりのプロセシング
を受けて、ジスルフィド結合により一体化されたヘビー
鎖（Mr＝40,000）及びライト鎖（Mr＝21,000）から成る
２本鎖分子となる。循環する２本鎖中間体が、ヘビー鎖
のアミノ末端からの12−残基ペプチドのスロンビン介在
開裂により、“活性化されたプロテインC"（APC）とし
て知られている生物学的に活性な形態の分子に転換され
る。この開裂反応は、インビボにおいて、内皮細胞コフ
ァクターであるスロンボモジュリン（thrombomodulin）
により増強される（Esmon及びOwen,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA，78;2249−2252,1981）。
プロテインＣはビタミンＫ−依存性グリコプロテイン
であって、約９残基のγ−カルボキシグルタミン酸（Gl
a）及び１当量のβ−ヒドロキシアスパラギン酸を含有
し、これらはそれぞれグルタミン酸残基及びアスパラギ
ン酸残基の翻訳後修飾によって形成される。プロテイン
Ｃ中の特定のγ−カルボキシグルタミン酸残基の翻訳後
形成はビタミンＫを必要とする。これらの異常なアミノ
酸残基はカルシウムイオンに結合し、そしてこの蛋白質
とホスホリピドとの相互作用を担当すると信じられ、こ
の相互作用はプロテインＣの生物学的活性を必要とす
る。
であって、約９残基のγ−カルボキシグルタミン酸（Gl
a）及び１当量のβ−ヒドロキシアスパラギン酸を含有
し、これらはそれぞれグルタミン酸残基及びアスパラギ
ン酸残基の翻訳後修飾によって形成される。プロテイン
Ｃ中の特定のγ−カルボキシグルタミン酸残基の翻訳後
形成はビタミンＫを必要とする。これらの異常なアミノ
酸残基はカルシウムイオンに結合し、そしてこの蛋白質
とホスホリピドとの相互作用を担当すると信じられ、こ
の相互作用はプロテインＣの生物学的活性を必要とす
る。
他のビタミンＫ−依存性血漿蛋白質、例えばファクタ
ーVII、ファクターIX、及びファクターＸの凝固促進作
用と異り、活性化されたプロテインＣは限定された蛋白
質分解によるファクターVa及びファクターVIIIaの不活
性化を介して凝固過程の制御物質として機能する。プロ
テインＣによるファクターVa及びVIIIへの不活性化は酸
性ホスホリピド及びカルシウムイオンの存在に依存す
る。プロテインＳはAPCにより触媒されるファクターVa
の蛋白質分解を促進することによりこの活性を制御する
ことが報告されている（Walker,J.Biol.Chem.255:5521
−5524,1980）。
ーVII、ファクターIX、及びファクターＸの凝固促進作
用と異り、活性化されたプロテインＣは限定された蛋白
質分解によるファクターVa及びファクターVIIIaの不活
性化を介して凝固過程の制御物質として機能する。プロ
テインＣによるファクターVa及びVIIIへの不活性化は酸
性ホスホリピド及びカルシウムイオンの存在に依存す
る。プロテインＳはAPCにより触媒されるファクターVa
の蛋白質分解を促進することによりこの活性を制御する
ことが報告されている（Walker,J.Biol.Chem.255:5521
−5524,1980）。
プロテインＣはまた、組織型プラスミノーゲンアクチ
ベーターの作用と関連付けられている（Kisiel及びFuji
kawa,Bahring Inst.Mitt.73:29−42,1983）。ウシAPCの
イヌへの注入はプラスミノーゲンアクチベーター活性の
増加をもたらす（Comp及びEsmon,J.Clin.Invest. 68:1
221−1228,1981）。最近の研究（Sakata等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA，82:1121−1125,1985）は培養された内皮
細胞へのAPCの添加が条件調節された培地中でのフィブ
リン溶解活性の急速で投与量依存的な増加を導き、細胞
によるウロキナーゼ関連及び組織型プラスミノーゲンア
クチベーターの両者の活性の増加を反映することを示し
ている。
ベーターの作用と関連付けられている（Kisiel及びFuji
kawa,Bahring Inst.Mitt.73:29−42,1983）。ウシAPCの
イヌへの注入はプラスミノーゲンアクチベーター活性の
増加をもたらす（Comp及びEsmon,J.Clin.Invest. 68:1
221−1228,1981）。最近の研究（Sakata等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA，82:1121−1125,1985）は培養された内皮
細胞へのAPCの添加が条件調節された培地中でのフィブ
リン溶解活性の急速で投与量依存的な増加を導き、細胞
によるウロキナーゼ関連及び組織型プラスミノーゲンア
クチベーターの両者の活性の増加を反映することを示し
ている。
先天性のプロテインＣ欠損は再発性血栓性疾患と関連
し（Broekmans等，New Eng.J.Med. 309:340−344,198
3;及びSeligsohn等，New Eng.J.Med. 310:559−562,19
84）、そして遺伝子的不調又は外傷、例えば肝臓病又は
外科手術から生ずるであろう。この状態は一般に経口抗
凝固剤により治療される。プロテインＣ含有正常血漿の
注入によっても有利な結果が得られた（Gardiner及びGr
iffin,Prog.in Hematology,Brown,Grune及びStratton
編，ニューヨク，13:256−278を参照のこと）。さら
に、若干の研究者は、プロテインＣの抗凝固活性が血栓
性不調、例えば静脈血栓症の治療において有用であるこ
とを見出している（WO85/00521）。世界の幾つかの地域
で、16,000の個体中およそ１個体がプロテインＣ欠損を
示すことが予想される。さらに、プロテインＣの完全な
欠損は新生児においては致命的である。
し（Broekmans等，New Eng.J.Med. 309:340−344,198
3;及びSeligsohn等，New Eng.J.Med. 310:559−562,19
84）、そして遺伝子的不調又は外傷、例えば肝臓病又は
外科手術から生ずるであろう。この状態は一般に経口抗
凝固剤により治療される。プロテインＣ含有正常血漿の
注入によっても有利な結果が得られた（Gardiner及びGr
iffin,Prog.in Hematology,Brown,Grune及びStratton
編，ニューヨク，13:256−278を参照のこと）。さら
に、若干の研究者は、プロテインＣの抗凝固活性が血栓
性不調、例えば静脈血栓症の治療において有用であるこ
とを見出している（WO85/00521）。世界の幾つかの地域
で、16,000の個体中およそ１個体がプロテインＣ欠損を
示すことが予想される。さらに、プロテインＣの完全な
欠損は新生児においては致命的である。
天然プロテインＣは凝因子濃縮物から（Marlar等，Bl
ood，59:1067−1072）又は血漿から（Kisiel,前掲）精
製することができるが、出発材料の限定された入手可能
性及び血漿中でのプロテインＣの低い濃度のために、こ
の方法は複雑で高価な方法である。従って、ヒト血液に
由来する生成物の療法的使用は、例えば肝炎ウイルス、
サイトメガロウイルス、又は後天性免疫不全症候群（AI
DS）の原因剤による病気の伝染の危険を有する。血栓性
疾患の治療におけるプロテインＣの臨床的適用の可能性
の観点から、プロテインＣ及び活性化されたプロテイン
Ｃの有用な量の製造が明らかに重要である。
ood，59:1067−1072）又は血漿から（Kisiel,前掲）精
製することができるが、出発材料の限定された入手可能
性及び血漿中でのプロテインＣの低い濃度のために、こ
の方法は複雑で高価な方法である。従って、ヒト血液に
由来する生成物の療法的使用は、例えば肝炎ウイルス、
サイトメガロウイルス、又は後天性免疫不全症候群（AI
DS）の原因剤による病気の伝染の危険を有する。血栓性
疾患の治療におけるプロテインＣの臨床的適用の可能性
の観点から、プロテインＣ及び活性化されたプロテイン
Ｃの有用な量の製造が明らかに重要である。
〔問題点を解決するための手段〕 要約すれば、この発明は、ヒト−プロテインＣ又は活
性化されたヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び
／又は生物学的活性を有する蛋白質をコードするDNA配
列を開示する。さらに、この発明は、哺乳類宿主細胞DN
Aに組み込まれることができ、プロモーター、及びこれ
に続きその下流にあるヒト−プロテインＣ又は活性化さ
れたヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び／又は
活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含
有し、このヌクレオチド配列の転写が前記プロモーター
により指令される発現ベクターを開示する。このヌクレ
オチド配列に続きその下流にポリアデニレーションシグ
ナルが存在する。１つの具体例においては、この発現ベ
クタは、前記ヌクレオチド配列とポリアデニレーション
シグナルとの間に位置する選択マーカーを含有し、この
選択マーカーの転写は前記プロモーターにより指令され
る。発現ベクターはまた１セットのRNAスプライシング
部位を含有することができる。
性化されたヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び
／又は生物学的活性を有する蛋白質をコードするDNA配
列を開示する。さらに、この発明は、哺乳類宿主細胞DN
Aに組み込まれることができ、プロモーター、及びこれ
に続きその下流にあるヒト−プロテインＣ又は活性化さ
れたヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び／又は
活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含
有し、このヌクレオチド配列の転写が前記プロモーター
により指令される発現ベクターを開示する。このヌクレ
オチド配列に続きその下流にポリアデニレーションシグ
ナルが存在する。１つの具体例においては、この発現ベ
クタは、前記ヌクレオチド配列とポリアデニレーション
シグナルとの間に位置する選択マーカーを含有し、この
選択マーカーの転写は前記プロモーターにより指令され
る。発現ベクターはまた１セットのRNAスプライシング
部位を含有することができる。
この発明の関連する観点は、活性化されたヒト−プロ
テインＣと実質的に同じ生物学的活性を活性化後に有す
る蛋白質を発現するためにトランスフェクトされた哺乳
類細胞を開示する。この哺乳類細胞は哺乳類宿主細胞DN
Aに組み込まれ得る発現ベクターによりトランスフェク
トされ、この発現ベクターは、プロモーター、並びにこ
れに続きその下流に存在する、ヒト−プロテインＣと実
質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋白質をコード
するヌクレオチド配列を含有する。１つの具体例におい
て、選択マーカーが細胞に導入され、そして安定にトラ
ンスフェクトされた細胞が選択される。活性化されたヒ
ト−プロテインＣと実質的に同じ生物学的活性を有する
蛋白質を発現するために形質転換された哺乳類細胞も開
示される。
テインＣと実質的に同じ生物学的活性を活性化後に有す
る蛋白質を発現するためにトランスフェクトされた哺乳
類細胞を開示する。この哺乳類細胞は哺乳類宿主細胞DN
Aに組み込まれ得る発現ベクターによりトランスフェク
トされ、この発現ベクターは、プロモーター、並びにこ
れに続きその下流に存在する、ヒト−プロテインＣと実
質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋白質をコード
するヌクレオチド配列を含有する。１つの具体例におい
て、選択マーカーが細胞に導入され、そして安定にトラ
ンスフェクトされた細胞が選択される。活性化されたヒ
ト−プロテインＣと実質的に同じ生物学的活性を有する
蛋白質を発現するために形質転換された哺乳類細胞も開
示される。
この発明の他の観点は、活性化されたヒト−プロテイ
ンＣと実質的に同じ生物学的活性を活性化後に有する蛋
白質の製造方法を開示する。この方法は、（ａ）ヒト−
プロテインＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を有す
る蛋白質をコードする配列を含んで成る発現ユニットを
哺乳類宿主細胞に導入し；（ｂ）この哺乳類宿主細胞を
適当な培地中で増殖せしめ；そして（ｃ）前記発現ユニ
ットによりコードされておりそして前記哺乳類宿主細胞
によって生産された蛋白質生成物を単離することを含ん
で成る。この方法によって製造された蛋白質生成物も開
示される。活性化されたヒト−プロテインＣと実質的に
同じ構造及び／又は生物学的活活を有する蛋白質の製造
方法も開示される。
ンＣと実質的に同じ生物学的活性を活性化後に有する蛋
白質の製造方法を開示する。この方法は、（ａ）ヒト−
プロテインＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を有す
る蛋白質をコードする配列を含んで成る発現ユニットを
哺乳類宿主細胞に導入し；（ｂ）この哺乳類宿主細胞を
適当な培地中で増殖せしめ；そして（ｃ）前記発現ユニ
ットによりコードされておりそして前記哺乳類宿主細胞
によって生産された蛋白質生成物を単離することを含ん
で成る。この方法によって製造された蛋白質生成物も開
示される。活性化されたヒト−プロテインＣと実質的に
同じ構造及び／又は生物学的活活を有する蛋白質の製造
方法も開示される。
この発明において記載される蛋白質は、血液強固の制
御を含む活性療法物質として使用することができる。さ
らに、これらの蛋白質は、適当な医薬組成物を提供する
ために生理的に許容される担体及び／又は稀釈剤と混合
することができる。
御を含む活性療法物質として使用することができる。さ
らに、これらの蛋白質は、適当な医薬組成物を提供する
ために生理的に許容される担体及び／又は稀釈剤と混合
することができる。
この発明の他の観点は、詳細な記載及び図面への言及
によって明らかになるであろう。
によって明らかになるであろう。
この発明を記載するに先立って以下に使用する用語の
定義を記載するのが発明の理解のために有用であろう。
定義を記載するのが発明の理解のために有用であろう。
生物学的活性：生物学的内容物（すなわち生物体又はイ
ンビトロ模倣物）中の分子により行われる１つの機能又
は１セットの機能である。蛋白質の生物学的活性は触媒
活性とエフェクター活性とに分けることができる。ビタ
ミンＫ−依存性血漿蛋白質の触媒活性は基質の活性化又
は不活性化をもたらす他の血漿蛋白質基質の特異的蛋白
質分解的開裂を含む。エフェクター活性は生物学的に活
性な分子のカルシウムもしくは他の小分子への、大分
子、例えば蛋白質への、又は細胞への特異的結合を含
む。エフェクター活性はしばしば生理的条件下での触媒
活性を増強し、又はそのために必須である。
ンビトロ模倣物）中の分子により行われる１つの機能又
は１セットの機能である。蛋白質の生物学的活性は触媒
活性とエフェクター活性とに分けることができる。ビタ
ミンＫ−依存性血漿蛋白質の触媒活性は基質の活性化又
は不活性化をもたらす他の血漿蛋白質基質の特異的蛋白
質分解的開裂を含む。エフェクター活性は生物学的に活
性な分子のカルシウムもしくは他の小分子への、大分
子、例えば蛋白質への、又は細胞への特異的結合を含
む。エフェクター活性はしばしば生理的条件下での触媒
活性を増強し、又はそのために必須である。
プロテインＣについては、生物学的活性はその抗凝固
性及びフィブリン溶解性により特徴付けられる。プロテ
インＣは、活性化された場合、ホスホリピド及びカルシ
ウムの存在下でファクターVa及びファクターVIIIaを不
活性化する。プロテインＳはこの機能の制御に関与する
ようである（Walker,前掲）。活性化されたプロテイン
Ｃはまたフィブリン溶解を増強し、この効果はプラスミ
ノーゲンアクチベーター阻害物質のレベルを低下せしる
ことにより介在されると信じられる（van Hinsbergh
等，Blood 65:441−451,1985）。後でさらに十分に記
載するように、プロテインＣ遺伝子のエクソンVII及びV
IIIによりコードされるプロテインＣのその部分はその
触媒活性を主として担当するであろう。
性及びフィブリン溶解性により特徴付けられる。プロテ
インＣは、活性化された場合、ホスホリピド及びカルシ
ウムの存在下でファクターVa及びファクターVIIIaを不
活性化する。プロテインＳはこの機能の制御に関与する
ようである（Walker,前掲）。活性化されたプロテイン
Ｃはまたフィブリン溶解を増強し、この効果はプラスミ
ノーゲンアクチベーター阻害物質のレベルを低下せしる
ことにより介在されると信じられる（van Hinsbergh
等，Blood 65:441−451,1985）。後でさらに十分に記
載するように、プロテインＣ遺伝子のエクソンVII及びV
IIIによりコードされるプロテインＣのその部分はその
触媒活性を主として担当するであろう。
プレ−プロペプチド：幾つかの蛋白質のアミノ末端に存
在し、そして一般にトランスロケーション中にその蛋白
質から開裂されるアミノ酸配列である。プレ−プロペプ
チドはその蛋白質を細胞の分泌経路に向ける配列（シグ
ナル配列）を含んで成り、そして疎水性アミノ酸のコア
の存在により特徴付けられる。これらはまたプロセシン
グシグナルを含む。この明細書において使用する場合、
“プレ−プロペプチド”なる語はまた天然プレ−プロペ
プチドの部分を意味する。
在し、そして一般にトランスロケーション中にその蛋白
質から開裂されるアミノ酸配列である。プレ−プロペプ
チドはその蛋白質を細胞の分泌経路に向ける配列（シグ
ナル配列）を含んで成り、そして疎水性アミノ酸のコア
の存在により特徴付けられる。これらはまたプロセシン
グシグナルを含む。この明細書において使用する場合、
“プレ−プロペプチド”なる語はまた天然プレ−プロペ
プチドの部分を意味する。
“発現ユニット":注目の蛋白質をコードする主たるヌク
レオチド配列を、該主たるヌクレオ配列の転写を指令し
そして制御する他のヌクレオチド配列に共に含んで成る
DNA構成である。発現ユニットは少なくとも、前記の主
たるヌクレオチド配列、並びに該主たるヌクレオチド配
列の上流に位置しそして作用可能に（operably）連結さ
れているプロモーター配列及び下流に位置するポリアデ
ニレーションシグナルから成る。発現の効率を増強する
ために追加の遺伝子要素が含まれることもできる。
レオチド配列を、該主たるヌクレオ配列の転写を指令し
そして制御する他のヌクレオチド配列に共に含んで成る
DNA構成である。発現ユニットは少なくとも、前記の主
たるヌクレオチド配列、並びに該主たるヌクレオチド配
列の上流に位置しそして作用可能に（operably）連結さ
れているプロモーター配列及び下流に位置するポリアデ
ニレーションシグナルから成る。発現の効率を増強する
ために追加の遺伝子要素が含まれることもできる。
発現ベクター：特に、注目の蛋白質をコードするDNA配
列をプロモーター及び該蛋白質の発現を促進するための
他の配列と共に含有するDNA分子である。発現ベクター
はさらに、宿主細胞中でのその複製をもたらす遺伝情報
を含有する。組換DNAのために一般に使用される発現ベ
クターの例はプラスミド及び幾つかのウイルスである。
但し、発現ベクターはこれら両者の要素を含有すること
もできる。これらはまた選択マーカーを含有することが
できる。
列をプロモーター及び該蛋白質の発現を促進するための
他の配列と共に含有するDNA分子である。発現ベクター
はさらに、宿主細胞中でのその複製をもたらす遺伝情報
を含有する。組換DNAのために一般に使用される発現ベ
クターの例はプラスミド及び幾つかのウイルスである。
但し、発現ベクターはこれら両者の要素を含有すること
もできる。これらはまた選択マーカーを含有することが
できる。
前記のごとく、プロテインＣは肝臓において生産さ
れ、そしてその生合成のためにビタミンＫを要求する。
ビタミンＫは、ライト鎖のアミノ末端領域中の特定のγ
−カルボキシグルタミン酸の形成のために必要である。
これらのアミノ酸残基は翻訳後修飾によって形成され、
そしてホスホリピドへのカルシウム介在結合のために必
要とされる。さらに、プロテインＣは、やはり翻訳後修
飾によって形成される１個のβ−ヒドロキシアスパラギ
ン酸を含有する。しかしながら、このアミノ酸残基の役
割は知られていない。
れ、そしてその生合成のためにビタミンＫを要求する。
ビタミンＫは、ライト鎖のアミノ末端領域中の特定のγ
−カルボキシグルタミン酸の形成のために必要である。
これらのアミノ酸残基は翻訳後修飾によって形成され、
そしてホスホリピドへのカルシウム介在結合のために必
要とされる。さらに、プロテインＣは、やはり翻訳後修
飾によって形成される１個のβ−ヒドロキシアスパラギ
ン酸を含有する。しかしながら、このアミノ酸残基の役
割は知られていない。
プロテインＣの活性が特定のグルタミン酸残基のγ−
カルボキシル化を含む翻訳後修飾に依存し、そして特定
のアスパラギン酸残基のヒドロキシル化にも依存するか
もしれないという事実があれば、微生物中でのプロテイ
ンＣのクローニング及び発現を介して活性な生成物が生
成することはできそうにない。
カルボキシル化を含む翻訳後修飾に依存し、そして特定
のアスパラギン酸残基のヒドロキシル化にも依存するか
もしれないという事実があれば、微生物中でのプロテイ
ンＣのクローニング及び発現を介して活性な生成物が生
成することはできそうにない。
従って、この発現は、γ−カルボキシル化されてお
り、そして活性化されたヒト−プロテインＣの生物学的
活性を活性化後に有する蛋白質を、永久的に該蛋白質を
発現するようにトランスフェクトされた哺乳類細胞を用
いて製造する方法を提供する。
り、そして活性化されたヒト−プロテインＣの生物学的
活性を活性化後に有する蛋白質を、永久的に該蛋白質を
発現するようにトランスフェクトされた哺乳類細胞を用
いて製造する方法を提供する。
この発明はさらに、γ−カルボキシル化されておりそ
して活性化を必要としないで、活性化されたヒト−プロ
テインＣの生物学的活性を有する蛋白質を製造する方法
を提供する。
して活性化を必要としないで、活性化されたヒト−プロ
テインＣの生物学的活性を有する蛋白質を製造する方法
を提供する。
ウシ−プロテインＣのライト鎖及びヘビー鎖は配列決
定されている（Fernlund及びStenflo,J.Biol.Chem.，25
7:12170−12179,1982;及びStenflo及びFernlund,J.Bio
l.Chem.，257:12180−12190,1982）。ヒト−プロテイン
Ｃの単離及び特徴付けはKisiel,J.Clin.Invest.，64:76
1−769,1979により記載されている。アミノ末端アスパ
ラギン酸残基を除き、ヒト−プロテインＣのヘビー鎖の
アミノ末端配列はウシの蛋白質のヘビー鎖中に存在する
最初の８個のアミノ酸と異る。ヒトの酵素及びウシの酵
素の両者の抗凝固活性は高度に種特異的であることが見
出された。種特異性はプロテインＳにより介在されると
信じられる（Walker,Thromb.Res. 22:321−327,198
1）。しかしながら、ヒト及びウシの蛋白質は相互に、
並びにプロスロンビン、ファクターVII、ファクターIX
及びファクターＸを包含する他のビタミンＫ−依存性血
漿蛋白質と、かなりの全体的構造的類似性を示す。類似
性は、ライト鎖中のGla残基の存在及びヘビー鎖中の活
性部位セリン、並びにライト鎖のアミノ末端領域中の他
のアミノ酸配列の類似を包含する。
定されている（Fernlund及びStenflo,J.Biol.Chem.，25
7:12170−12179,1982;及びStenflo及びFernlund,J.Bio
l.Chem.，257:12180−12190,1982）。ヒト−プロテイン
Ｃの単離及び特徴付けはKisiel,J.Clin.Invest.，64:76
1−769,1979により記載されている。アミノ末端アスパ
ラギン酸残基を除き、ヒト−プロテインＣのヘビー鎖の
アミノ末端配列はウシの蛋白質のヘビー鎖中に存在する
最初の８個のアミノ酸と異る。ヒトの酵素及びウシの酵
素の両者の抗凝固活性は高度に種特異的であることが見
出された。種特異性はプロテインＳにより介在されると
信じられる（Walker,Thromb.Res. 22:321−327,198
1）。しかしながら、ヒト及びウシの蛋白質は相互に、
並びにプロスロンビン、ファクターVII、ファクターIX
及びファクターＸを包含する他のビタミンＫ−依存性血
漿蛋白質と、かなりの全体的構造的類似性を示す。類似
性は、ライト鎖中のGla残基の存在及びヘビー鎖中の活
性部位セリン、並びにライト鎖のアミノ末端領域中の他
のアミノ酸配列の類似を包含する。
この発明においては、λgtll cDNAライブラリーをヒ
ト肝臓mRNAから調整した。次に、このライブラリーをヒ
ト−プロテインＣに対する125Iラベル化抗体を用いてス
クリーニングした。抗体反応性クローンをさらに、λgt
llベクター中でのβ−ガラクトシダーゼとプロテインＣ
との融合蛋白質の合成について分析した。
ト肝臓mRNAから調整した。次に、このライブラリーをヒ
ト−プロテインＣに対する125Iラベル化抗体を用いてス
クリーニングした。抗体反応性クローンをさらに、λgt
llベクター中でのβ−ガラクトシダーゼとプロテインＣ
との融合蛋白質の合成について分析した。
クローンの１つが抗体プローブとの強いシグナルを与
え、そして約1400bpの挿入部を含有することが見出され
た。DNA挿入部のDNA配列分析により、Fernlund及びSten
flo（J.Biol.Chem.，257:12170−12179;J.Biol.Chem.，
257:12180−12190）により決定されたウシ−プロテイン
Ｃの大部分と高度に相同性を示す予想通りのアミノ酸配
列が示された。
え、そして約1400bpの挿入部を含有することが見出され
た。DNA挿入部のDNA配列分析により、Fernlund及びSten
flo（J.Biol.Chem.，257:12170−12179;J.Biol.Chem.，
257:12180−12190）により決定されたウシ−プロテイン
Ｃの大部分と高度に相同性を示す予想通りのアミノ酸配
列が示された。
DNA挿入部は、ライト鎖のアミノ酸64から始まり、完
全なヘビー鎖コード領域を含み、そして終止コドンに進
む、プロテインＣのコード領域のほとんどを含んでい
た。さらに、ヘビー鎖の終止コドンに続き、３′非コー
ド配列の294塩基対及び９塩基対のポリ（Ａ）テイルが
存在した。プロセシング及びポリアデニレーションシグ
ナルＡ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−ＡがこのcDNA挿入部中のポリ
（Ａ）テイルから13塩基対上流に存在した。この配列
は、２個の可能性あるポリアデニレーション部位の１つ
であった。
全なヘビー鎖コード領域を含み、そして終止コドンに進
む、プロテインＣのコード領域のほとんどを含んでい
た。さらに、ヘビー鎖の終止コドンに続き、３′非コー
ド配列の294塩基対及び９塩基対のポリ（Ａ）テイルが
存在した。プロセシング及びポリアデニレーションシグ
ナルＡ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−ＡがこのcDNA挿入部中のポリ
（Ａ）テイルから13塩基対上流に存在した。この配列
は、２個の可能性あるポリアデニレーション部位の１つ
であった。
cDNA配列はまた位置156−157にジペプチドLys−Argを
含有していた。これはヘビー鎖からライト鎖を隔離し、
そして蛋白質分解的開裂によるプロセシングの過程で除
去され、２本鎖分子の分泌をもたらす。スロンビンによ
る活性化の際、ヒト−プロテインＣのヘビー鎖はアルギ
ニン−169とロイシン−170の間で開裂され、活性化ペプ
チドをもたらす（第２図）。
含有していた。これはヘビー鎖からライト鎖を隔離し、
そして蛋白質分解的開裂によるプロセシングの過程で除
去され、２本鎖分子の分泌をもたらす。スロンビンによ
る活性化の際、ヒト−プロテインＣのヘビー鎖はアルギ
ニン−169とロイシン−170の間で開裂され、活性化ペプ
チドをもたらす（第２図）。
同様の方法により、プレ−プロペプチド及びプロテイ
ンＣの初めの23個のアミノ酸のためのコード配列を欠く
第２のcDNAを単離した。このcDNAをハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして用い、コード配列の残りをλシャロ
ン4A中のヒトゲノムDNAライブラリィから得た（Foster
など.,Proc.Natl.Acad.Sei.USA 82:4673〜4677,198
5）。プロテインＣ遺伝子のためのオーバーラップ挿入
部を含む、３種の異なるλシャロンファージを単離し
た。
ンＣの初めの23個のアミノ酸のためのコード配列を欠く
第２のcDNAを単離した。このcDNAをハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして用い、コード配列の残りをλシャロ
ン4A中のヒトゲノムDNAライブラリィから得た（Foster
など.,Proc.Natl.Acad.Sei.USA 82:4673〜4677,198
5）。プロテインＣ遺伝子のためのオーバーラップ挿入
部を含む、３種の異なるλシャロンファージを単離し
た。
３種のファージクローン上のエクソンの位置を、上記
の1400bpのcDNAから製造されたプローブを用いる。これ
らのクローンの消化物のサザンブロットハイブリダィゼ
ーションによって決定した。これらのクローン中のゲノ
ムDNA挿入部を、単一の及び二重の制限酵素による消
化、及びこれに続くアガロースゲル電気泳動、サザンブ
ロッティング及びヒトプロテインＣのためにcDNAに由来
する放射性標識された５′及び３′プローブに対するハ
イブリダイゼイションによって、第３図に示されるよう
にマッピングした。
の1400bpのcDNAから製造されたプローブを用いる。これ
らのクローンの消化物のサザンブロットハイブリダィゼ
ーションによって決定した。これらのクローン中のゲノ
ムDNA挿入部を、単一の及び二重の制限酵素による消
化、及びこれに続くアガロースゲル電気泳動、サザンブ
ロッティング及びヒトプロテインＣのためにcDNAに由来
する放射性標識された５′及び３′プローブに対するハ
イブリダイゼイションによって、第３図に示されるよう
にマッピングした。
DNA配列決定研究を、チェインターミネーター法（did
eoxy chain−termination method）を用いて行なった。
第４図に示されるように、ヒト−プロテインＣのための
遺伝子のヌクレオチド配列は、およそ11kbのDNAにわた
る。これらの研究はさらに、42個のアミノ酸の潜在的な
プレ−プロペプチドを表わす。−１〜−20の領域におけ
るウシ−プロテインＣのプレ−プロペプチドとの相同性
に基づいて、位置−10のAla残基の後のプレプロ配列が
シグナルペプチダーゼによって開裂されるらしい。成熟
タンパク質へのプロセシングは、アミノ末端のプロペプ
チドを除去するために残基−１の後の、並びにＬ鎖及び
Ｈ鎖を連結するLys−Argジペプチドを除去するために残
基155及び157での追加のタンパク分解性開裂を含む。こ
の最終プロセシングは、155個のアミノ酸のＬ鎖及び262
個のアミノ酸のＨ鎖をもたらす。
eoxy chain−termination method）を用いて行なった。
第４図に示されるように、ヒト−プロテインＣのための
遺伝子のヌクレオチド配列は、およそ11kbのDNAにわた
る。これらの研究はさらに、42個のアミノ酸の潜在的な
プレ−プロペプチドを表わす。−１〜−20の領域におけ
るウシ−プロテインＣのプレ−プロペプチドとの相同性
に基づいて、位置−10のAla残基の後のプレプロ配列が
シグナルペプチダーゼによって開裂されるらしい。成熟
タンパク質へのプロセシングは、アミノ末端のプロペプ
チドを除去するために残基−１の後の、並びにＬ鎖及び
Ｈ鎖を連結するLys−Argジペプチドを除去するために残
基155及び157での追加のタンパク分解性開裂を含む。こ
の最終プロセシングは、155個のアミノ酸のＬ鎖及び262
個のアミノ酸のＨ鎖をもたらす。
プロテインＣの遺伝子は、25〜885ヌクレオチドのサ
イズ範囲の８個のエクソン、及び92〜2668ヌクレオチド
のサイズ範囲の７個のイントロンから成る。エクソンＩ
及びエクソンIIの一部は、42個のアミノ酸のプレ−プロ
ペプチドをコードする。エクソンIIの残る部分、エクソ
ンIII,エクソンIV,エクソンＶ及びエクソンVIの一部は
プロテインＣのＬ鎖をコードする。エクソンVIの残る部
分，エキソンVII及びエキソンVIIIはプロテインＣのＨ
鎖をコードする。ヒト−プロテインＣのアミノ酸配列及
びDNA配列は第２図に示されている。
イズ範囲の８個のエクソン、及び92〜2668ヌクレオチド
のサイズ範囲の７個のイントロンから成る。エクソンＩ
及びエクソンIIの一部は、42個のアミノ酸のプレ−プロ
ペプチドをコードする。エクソンIIの残る部分、エクソ
ンIII,エクソンIV,エクソンＶ及びエクソンVIの一部は
プロテインＣのＬ鎖をコードする。エクソンVIの残る部
分，エキソンVII及びエキソンVIIIはプロテインＣのＨ
鎖をコードする。ヒト−プロテインＣのアミノ酸配列及
びDNA配列は第２図に示されている。
プロテインＣのための遺伝子中のイントロンの位置
は、種々の機能ドメインの間に主として存在する。エク
ソンIIは、プレ−プロペプチドの高度に保存された領域
及びγ−カルボキシグルタミン酸（Gla）ドメインにわ
たる。エクソンIIIは、Gla及び成長因子ドメインを連結
する８個のアミノ酸を含む。エクソンIV及びＶはそれぞ
れ、潜在的な成長因子ドメインを表わし、他方エクソン
VIは、活性化ペプチドを含む連結領域を包含する。エク
ソンVII及びVIIIは、すべてのセリンプロテアーゼに典
型的な触媒ドメインを包含する。
は、種々の機能ドメインの間に主として存在する。エク
ソンIIは、プレ−プロペプチドの高度に保存された領域
及びγ−カルボキシグルタミン酸（Gla）ドメインにわ
たる。エクソンIIIは、Gla及び成長因子ドメインを連結
する８個のアミノ酸を含む。エクソンIV及びＶはそれぞ
れ、潜在的な成長因子ドメインを表わし、他方エクソン
VIは、活性化ペプチドを含む連結領域を包含する。エク
ソンVII及びVIIIは、すべてのセリンプロテアーゼに典
型的な触媒ドメインを包含する。
ヒト−プレプロプロテインＣのためのアミノ酸配列及
び仮の構造が第５図に示されている。プロテインＣはLy
s−Aryジペプチドなしに示されており、このジペプチド
はＬ鎖及びＨ鎖を連結するものである。７個のイントロ
ン（Ａ〜Ｇ）の位置は実線によって示されている。既知
のタンパク分解性開裂部位の両端に存在するアミノ酸は
円で囲んである。◆は、潜在的な炭水化物結合部位を示
す。Ｌ鎖、活性化ペプチド及びＨ鎖中の第１のアミノ酸
は番号１から始まる。この番号は第２図及び第４図に示
される番号とは異なる。
び仮の構造が第５図に示されている。プロテインＣはLy
s−Aryジペプチドなしに示されており、このジペプチド
はＬ鎖及びＨ鎖を連結するものである。７個のイントロ
ン（Ａ〜Ｇ）の位置は実線によって示されている。既知
のタンパク分解性開裂部位の両端に存在するアミノ酸は
円で囲んである。◆は、潜在的な炭水化物結合部位を示
す。Ｌ鎖、活性化ペプチド及びＨ鎖中の第１のアミノ酸
は番号１から始まる。この番号は第２図及び第４図に示
される番号とは異なる。
炭水化物の付着部位は、第５図の番号スキームに従え
ば、Ｌ鎖中の残基97及びＨ鎖中の残基79,144及び160に
位置する。炭水化物部分は、Asnに共有結合される。ほ
とんどの場合、炭水化物の付着環境は、Asn−Ｘ−Ser又
はAsn−Ｘ−Thr（ここでＸ−は任意のアミノ酸である）
によって表わされ得る。
ば、Ｌ鎖中の残基97及びＨ鎖中の残基79,144及び160に
位置する。炭水化物部分は、Asnに共有結合される。ほ
とんどの場合、炭水化物の付着環境は、Asn−Ｘ−Ser又
はAsn−Ｘ−Thr（ここでＸ−は任意のアミノ酸である）
によって表わされ得る。
上に示されるように、プロテインＣは、凝固過程にお
いて調節の役割を演ずる。エクソンVII及びVIIIによっ
てコードされる触媒ドメインは、一定の血漿タンパク質
（すなわち、因子Va及びVIIIa）を特異的に開裂するセ
リンプロテアーゼ活性を有し、それらの活性化又は不活
性化をもたらす。この選択的タンパク分解の結果、プロ
テインＣは抗凝固活性及びフィブイン溶解活性を示す。
いて調節の役割を演ずる。エクソンVII及びVIIIによっ
てコードされる触媒ドメインは、一定の血漿タンパク質
（すなわち、因子Va及びVIIIa）を特異的に開裂するセ
リンプロテアーゼ活性を有し、それらの活性化又は不活
性化をもたらす。この選択的タンパク分解の結果、プロ
テインＣは抗凝固活性及びフィブイン溶解活性を示す。
ゲノムクローン中の介在配列の存在のために、ゲノム
配列及びcDNA配列を単に連結し、完全なコード配列を提
供することは、許容できる発現ユニットを構成するため
に十分ではない。従って、ゲノムクローンを用いて発現
ユニットを構成する場合、下にさらに十分に記載されて
いる理由のために、これらの介在配列を削除することが
必要である。
配列及びcDNA配列を単に連結し、完全なコード配列を提
供することは、許容できる発現ユニットを構成するため
に十分ではない。従って、ゲノムクローンを用いて発現
ユニットを構成する場合、下にさらに十分に記載されて
いる理由のために、これらの介在配列を削除することが
必要である。
５′コード領域はまた、他の方法によっても得ること
ができ、そしてそれ故に、介在配列を削除する必要性が
ないであろう。５′コード領域は、既存のcDNA又はゲノ
ムクローンに由来するプローブを用いての追加のライブ
ラリーを検索することによって得ることができる。この
方法を用いて、完全な長さのcDNAを単離した。さらに、
ビタミンＫ−依存性血漿タンパク質のアミノ末端部分
は、それらの各自のカルシウム結合活性を担当する。こ
の機械的類似性の結果として、これらの分子のカルシウ
ム結合ドメインを取り換えることができ、そして結果と
して生じる分子の触媒ドメインに特徴的な活性をなお保
持することができる。たとえば、1985年４月17日に出願
されたアメリカ特許出願番号第724,311号に記載されて
いるように、IX因子のアミノ−末端部分（カルシウム結
合ドメイン）を、アミノ酸36でVII因子に連結し、VII因
子の活性を有するタンパク質を得ることができる。VII
因子,IX因子,X因子，プロトロンビン及びプロテインＳ
は、このアミノ−末端配列の相同性をプロテインＣと共
有する。従って、これらの任意のタンパク質のための遺
伝子の５′−コード領域を含むクローン化された配列
を、プロテインＣの遺伝子の対応する配列と交換するこ
とができるでる。さらに、適切なコード配列を、いくつ
かのビタミンＫ依存性血漿タンパク質の既知のアミノ酸
配列又はこの明細書に開示されているゲノムプロテイン
Ｃのエクソンの配列に基づいて合成することができる。
合成ヌクレオチド配列を製造するための技法は当業界に
おいて良く知られている。たとえば、オーバーラップす
るオリゴヌクレオチドのセットを合成し、そして対にア
ニーリングしてオーバーラップする接着末端を有する二
重鎖断片を得ることができる。次に、これらの断片を任
意の制限と同様に連結することができるであろう。次
に、この得られる合成断片を、便利な制限部位において
cDNAに連結する。この結合配列を、必要な場合、オリゴ
ヌクレオチド指令突然変異誘発によって変形することが
できる。
ができ、そしてそれ故に、介在配列を削除する必要性が
ないであろう。５′コード領域は、既存のcDNA又はゲノ
ムクローンに由来するプローブを用いての追加のライブ
ラリーを検索することによって得ることができる。この
方法を用いて、完全な長さのcDNAを単離した。さらに、
ビタミンＫ−依存性血漿タンパク質のアミノ末端部分
は、それらの各自のカルシウム結合活性を担当する。こ
の機械的類似性の結果として、これらの分子のカルシウ
ム結合ドメインを取り換えることができ、そして結果と
して生じる分子の触媒ドメインに特徴的な活性をなお保
持することができる。たとえば、1985年４月17日に出願
されたアメリカ特許出願番号第724,311号に記載されて
いるように、IX因子のアミノ−末端部分（カルシウム結
合ドメイン）を、アミノ酸36でVII因子に連結し、VII因
子の活性を有するタンパク質を得ることができる。VII
因子,IX因子,X因子，プロトロンビン及びプロテインＳ
は、このアミノ−末端配列の相同性をプロテインＣと共
有する。従って、これらの任意のタンパク質のための遺
伝子の５′−コード領域を含むクローン化された配列
を、プロテインＣの遺伝子の対応する配列と交換するこ
とができるでる。さらに、適切なコード配列を、いくつ
かのビタミンＫ依存性血漿タンパク質の既知のアミノ酸
配列又はこの明細書に開示されているゲノムプロテイン
Ｃのエクソンの配列に基づいて合成することができる。
合成ヌクレオチド配列を製造するための技法は当業界に
おいて良く知られている。たとえば、オーバーラップす
るオリゴヌクレオチドのセットを合成し、そして対にア
ニーリングしてオーバーラップする接着末端を有する二
重鎖断片を得ることができる。次に、これらの断片を任
意の制限と同様に連結することができるであろう。次
に、この得られる合成断片を、便利な制限部位において
cDNAに連結する。この結合配列を、必要な場合、オリゴ
ヌクレオチド指令突然変異誘発によって変形することが
できる。
完全なコード配列を代表するクローンを得た場合、必
要ならば、その適切な領域を連結し、目的とするコード
配列を形成することができる。１又は複数のライブラリ
ーから得られた断片を適切な制限エンドヌクレアーゼに
より切断し、そして正しい方向に酵素により一緒に連結
する。断片及び特定の選択された制限エンドヌクレアー
ゼに依存して、欠失突然変異誘発の“ループアウト”
（loop out）方法により又は制限エントヌクレアーゼに
よる開裂及び突然変異誘発の組み合せにより不所望のDN
A配列を除去することが必要であろう。そのようにして
得られた配列は、好ましくは、連続するオープンリーデ
ィングフレームの形で存在すべきである。すなわち、高
等な真核生物の遺伝子に一般的に見出される介在配列
（イントロン）を欠くべきである。クローン化された遺
伝子中でのイントロンの存在は、その遺伝子配列が哺乳
類宿主細胞中に導入される場合、mRNAの異常なスプライ
シング及び／又は遺伝子発現の低下した効率又は増幅に
基づく不安定性を導びく場合がある。このコード配列
は、本発明に従って生成されたプロテインＣの正しいプ
ロセシング及び分泌を促進するために、さらにプレ−プ
ロペプチドをコードすることが好ましい。このプレ−プ
ロペプチドは、プロテインＣ又は他の分泌されるプロテ
イン、たとえばIX因子、VII因子又はプロスロンビンの
それであることができる。
要ならば、その適切な領域を連結し、目的とするコード
配列を形成することができる。１又は複数のライブラリ
ーから得られた断片を適切な制限エンドヌクレアーゼに
より切断し、そして正しい方向に酵素により一緒に連結
する。断片及び特定の選択された制限エンドヌクレアー
ゼに依存して、欠失突然変異誘発の“ループアウト”
（loop out）方法により又は制限エントヌクレアーゼに
よる開裂及び突然変異誘発の組み合せにより不所望のDN
A配列を除去することが必要であろう。そのようにして
得られた配列は、好ましくは、連続するオープンリーデ
ィングフレームの形で存在すべきである。すなわち、高
等な真核生物の遺伝子に一般的に見出される介在配列
（イントロン）を欠くべきである。クローン化された遺
伝子中でのイントロンの存在は、その遺伝子配列が哺乳
類宿主細胞中に導入される場合、mRNAの異常なスプライ
シング及び／又は遺伝子発現の低下した効率又は増幅に
基づく不安定性を導びく場合がある。このコード配列
は、本発明に従って生成されたプロテインＣの正しいプ
ロセシング及び分泌を促進するために、さらにプレ−プ
ロペプチドをコードすることが好ましい。このプレ−プ
ロペプチドは、プロテインＣ又は他の分泌されるプロテ
イン、たとえばIX因子、VII因子又はプロスロンビンの
それであることができる。
いくつかの環境下で、活性なプロテインＣを直接的に
生成することが望ましく、それによって、インビトロ又
はインビボのいづれかでタンパク質生成物を活性化する
必要性が除去されるであろう。プロテインＣの成熟及び
活性化に関与する開裂部位は既知である（Foster及びDa
vie,前記）。ACPをコードする配列を、オリゴヌクレオ
チド指令欠失突然変異誘発により活性化ペプチドをコー
ドする領域を削除することによって構成することができ
る。次に、この得られるタンパク質は、分泌経路のタン
パク分解プロセシングによって活性化されるであろう。
生成することが望ましく、それによって、インビトロ又
はインビボのいづれかでタンパク質生成物を活性化する
必要性が除去されるであろう。プロテインＣの成熟及び
活性化に関与する開裂部位は既知である（Foster及びDa
vie,前記）。ACPをコードする配列を、オリゴヌクレオ
チド指令欠失突然変異誘発により活性化ペプチドをコー
ドする領域を削除することによって構成することができ
る。次に、この得られるタンパク質は、分泌経路のタン
パク分解プロセシングによって活性化されるであろう。
次に、プロテインＣ又は活性化されたプロテインＣの
ためのコード配列を適切な発現ベクターに導入し、今度
はこれを哺乳類細胞系をトランスフェクトするために用
いる。
ためのコード配列を適切な発現ベクターに導入し、今度
はこれを哺乳類細胞系をトランスフェクトするために用
いる。
本発明の実施において使用するための発現ベクター
は、哺乳類細胞中に導入された外来性遺伝子を転写を指
令することができるプロモーターを含むであろう。ウィ
ルスプロモーターは、転写を指令する効率のために好ま
しい。特に好ましいプロモーターは、アデノウィルス２
からの主要後期プロモーター（major late promotor）
である。そのような発現ベクターはまた、好ましくは、
プロモーターから下流であってプロテインＣ配列のため
の挿入部位から上流に、又はプロテインＣ配列それ自体
内に位置するRNAスプライス部位のセットを含むであろ
う。好ましいRNAスプライス部位は、アデノウィルス遺
伝子及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得ることがで
きる。また、挿入部位の下流に位置するポリアデニル化
シグナルを、発現ベクター中に含む。ウィルスのポリア
デニル化シグナル、たとえばSV40からの初期又は後期ポ
リアデニル化シグナル又はアデノウィルス5ETb領域から
のアデニル化シグナルが特に好ましい。特に好ましい態
様においては、発現ベクターはまた、非コードウィルス
性リーダー配列、たとえばプロモーター及びRNAスプラ
イス部位の間に位置するアデノウィルス２の３分節系リ
ーダーを含む。好ましいベクターはまた、エンハンサー
配列、たとえばSV40のエンハンサー、及びアデノウィル
スVA RNAをコードする配列を含むことができる。
は、哺乳類細胞中に導入された外来性遺伝子を転写を指
令することができるプロモーターを含むであろう。ウィ
ルスプロモーターは、転写を指令する効率のために好ま
しい。特に好ましいプロモーターは、アデノウィルス２
からの主要後期プロモーター（major late promotor）
である。そのような発現ベクターはまた、好ましくは、
プロモーターから下流であってプロテインＣ配列のため
の挿入部位から上流に、又はプロテインＣ配列それ自体
内に位置するRNAスプライス部位のセットを含むであろ
う。好ましいRNAスプライス部位は、アデノウィルス遺
伝子及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得ることがで
きる。また、挿入部位の下流に位置するポリアデニル化
シグナルを、発現ベクター中に含む。ウィルスのポリア
デニル化シグナル、たとえばSV40からの初期又は後期ポ
リアデニル化シグナル又はアデノウィルス5ETb領域から
のアデニル化シグナルが特に好ましい。特に好ましい態
様においては、発現ベクターはまた、非コードウィルス
性リーダー配列、たとえばプロモーター及びRNAスプラ
イス部位の間に位置するアデノウィルス２の３分節系リ
ーダーを含む。好ましいベクターはまた、エンハンサー
配列、たとえばSV40のエンハンサー、及びアデノウィル
スVA RNAをコードする配列を含むことができる。
次に、クローン化された遺伝子配列を、リン酸カルシ
ウム介在トランスフェクションによって、培養された哺
乳類細胞中に導入することができる（Wiglerなど.,Cell
14:725,1978;Graham及びVan cler Eb,Virology 52;45
6,1973）。DNA及びリン酸カルシウムから沈降物が形成
され、そしてこの沈降物が細胞に適用される。細胞のい
くらかは、DNAを取り込み、そして数日間それを細胞内
に保持する。これらの細胞の少部分（典型的には、1
0-4）は、ゲノム中にDNAを組込む。これらの組込み体を
同定するために、選択可能な表現型（選択マーカー）を
与える遺伝子を、一般的に、注目の遺伝子と一緒に細胞
中に導入する。好ましい、選択マーカーは、薬剤、たと
えばネオマイシン、ヒグロマイシン、又はメトトレキセ
ートに対して耐性を与える遺伝子を含む。選択マーカー
を、注目の遺伝子と同時に、別のプラスミド上で細胞中
に導入することができ、又はそれらを、同じプラスミド
上で導入することができる。同じプラスミド上で導入さ
れる場合、選択マーカー及び注目の遺伝子は異なるプロ
モーター又は同じプロモーターの制御下に存在すること
ができる。１つの態様においては、選択マーカーを、プ
ロテインＣをコードする配列を含む同じプラスミド上
に、両配列が同じプロモーターによって制御されるよう
に配置する（ジシストロン性メッセージとして知られて
いる配置）。このタイプの構成物は当業界において既知
である（たとえば、ヨーロッパ特許公開第117,058
号）。“キャリアーDNA"として知られている追加のDNA
を、細胞中に導入される混合物中に添加することもまた
有利であろう。細胞がDNAを取り込んだ後、しばらくの
間、典型的には１〜２日間増殖を許容にし、注目の遺伝
子の発現を始める。次に、安定した状態で選択マーカー
を発現する細胞の増殖のためについて選択するために薬
物選択を適用する。そのような細胞のクローンを、プロ
テインＣの発現についてスクリーンすることができる。
ウム介在トランスフェクションによって、培養された哺
乳類細胞中に導入することができる（Wiglerなど.,Cell
14:725,1978;Graham及びVan cler Eb,Virology 52;45
6,1973）。DNA及びリン酸カルシウムから沈降物が形成
され、そしてこの沈降物が細胞に適用される。細胞のい
くらかは、DNAを取り込み、そして数日間それを細胞内
に保持する。これらの細胞の少部分（典型的には、1
0-4）は、ゲノム中にDNAを組込む。これらの組込み体を
同定するために、選択可能な表現型（選択マーカー）を
与える遺伝子を、一般的に、注目の遺伝子と一緒に細胞
中に導入する。好ましい、選択マーカーは、薬剤、たと
えばネオマイシン、ヒグロマイシン、又はメトトレキセ
ートに対して耐性を与える遺伝子を含む。選択マーカー
を、注目の遺伝子と同時に、別のプラスミド上で細胞中
に導入することができ、又はそれらを、同じプラスミド
上で導入することができる。同じプラスミド上で導入さ
れる場合、選択マーカー及び注目の遺伝子は異なるプロ
モーター又は同じプロモーターの制御下に存在すること
ができる。１つの態様においては、選択マーカーを、プ
ロテインＣをコードする配列を含む同じプラスミド上
に、両配列が同じプロモーターによって制御されるよう
に配置する（ジシストロン性メッセージとして知られて
いる配置）。このタイプの構成物は当業界において既知
である（たとえば、ヨーロッパ特許公開第117,058
号）。“キャリアーDNA"として知られている追加のDNA
を、細胞中に導入される混合物中に添加することもまた
有利であろう。細胞がDNAを取り込んだ後、しばらくの
間、典型的には１〜２日間増殖を許容にし、注目の遺伝
子の発現を始める。次に、安定した状態で選択マーカー
を発現する細胞の増殖のためについて選択するために薬
物選択を適用する。そのような細胞のクローンを、プロ
テインＣの発現についてスクリーンすることができる。
組み込まれた遺伝子配列のコピ数を、一定の選択マー
カー（たとえば、メトトレキセートに対して耐性を与え
るジヒドロホレートレダクターゼ）を用いることによっ
て増幅を介して増加せしめることができる。選択マーカ
ーを、注目の遺伝子と一緒に細胞中に導入し、そして薬
物による選択を行なう。次に、薬物の濃度をしだいに増
し、そしておのおのの段階で耐性の細胞を選択する。ク
ローン化された配列の増加したコピー数について選択す
ることによって、コードされたタンパク質の発現レベル
を実質的に増大することができる。
カー（たとえば、メトトレキセートに対して耐性を与え
るジヒドロホレートレダクターゼ）を用いることによっ
て増幅を介して増加せしめることができる。選択マーカ
ーを、注目の遺伝子と一緒に細胞中に導入し、そして薬
物による選択を行なう。次に、薬物の濃度をしだいに増
し、そしておのおのの段階で耐性の細胞を選択する。ク
ローン化された配列の増加したコピー数について選択す
ることによって、コードされたタンパク質の発現レベル
を実質的に増大することができる。
本発明により製造されたプロテインＣを、Kisiel及び
Davie（前記）の方法の変法によって精製することがで
きる。プロテインＣを含む培地をクエン酸ナトリウム及
び塩化バリウムと混合し、そして沈降物を集める。その
沈降物を洗浄し、再溶解し、そして硫酸アンモニウムに
より再沈降せしめ、次にリン酸ナトリウム−ベンズアミ
ジン中に溶解し、透析し、そしてDEAE−Sephadex A−50
カラムにかける。プロテインＣを含有するピーク（プロ
スロンビンもまた含んでいる）を、さらに、ヘパリン−
アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィー
（Comp及びEsmon,Boold 54:1272,1979）又は免疫吸着
法によって精製する。
Davie（前記）の方法の変法によって精製することがで
きる。プロテインＣを含む培地をクエン酸ナトリウム及
び塩化バリウムと混合し、そして沈降物を集める。その
沈降物を洗浄し、再溶解し、そして硫酸アンモニウムに
より再沈降せしめ、次にリン酸ナトリウム−ベンズアミ
ジン中に溶解し、透析し、そしてDEAE−Sephadex A−50
カラムにかける。プロテインＣを含有するピーク（プロ
スロンビンもまた含んでいる）を、さらに、ヘパリン−
アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィー
（Comp及びEsmon,Boold 54:1272,1979）又は免疫吸着
法によって精製する。
本発明により製造されたプロテインＣを、Ｈ鎖のアミ
ノ末端からの活性化ペプチドの除去によって活性化する
ことができる。活性化を、α−スロンビン（Marlarな
ど.,Blood 59:1067〜1072,1982），トリプシン（Marla
rなど.,前記），又はRussellのマムシの毒のＸ因子活性
剤を用いて行なうことができる。
ノ末端からの活性化ペプチドの除去によって活性化する
ことができる。活性化を、α−スロンビン（Marlarな
ど.,Blood 59:1067〜1072,1982），トリプシン（Marla
rなど.,前記），又はRussellのマムシの毒のＸ因子活性
剤を用いて行なうことができる。
次の例を要約すれば、例１はヒト−プロテインＣをコ
ードするDNA配列のクローニングを記載する。例２は、
例１中で単離された配列からのプロテインＣのための完
全な長さのコード配列の造成法記載する。例３は、プロ
テインC DNAのための発現ベクターの造成法を記載す
る。例４は、トランスフェクトされた哺乳類細胞を用い
てのプロテインＣの製造を記載する。例５は、プロテイ
ンＣをコードする完全な長さのcDNA及びトランスフェク
トされた哺乳類細胞中でのその発現を記載する。
ードするDNA配列のクローニングを記載する。例２は、
例１中で単離された配列からのプロテインＣのための完
全な長さのコード配列の造成法記載する。例３は、プロ
テインC DNAのための発現ベクターの造成法を記載す
る。例４は、トランスフェクトされた哺乳類細胞を用い
てのプロテインＣの製造を記載する。例５は、プロテイ
ンＣをコードする完全な長さのcDNA及びトランスフェク
トされた哺乳類細胞中でのその発現を記載する。
例 他に断らない限りは、ベテスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ（Bethesda Research Laboratories;BRL）および
ニュー・イングランド・バイオラブス（New England Bi
olabs）から得た制限エンドヌクレアーゼおよび他のDNA
修飾酵素〔例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、子牛
アルカリホスファターゼ、クレノー（Klenow）DNAポリ
メラーゼ、T4ポリヌクレオチドリガーゼ）を製造業者に
よる指示の通りに使用する。
リーズ（Bethesda Research Laboratories;BRL）および
ニュー・イングランド・バイオラブス（New England Bi
olabs）から得た制限エンドヌクレアーゼおよび他のDNA
修飾酵素〔例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、子牛
アルカリホスファターゼ、クレノー（Klenow）DNAポリ
メラーゼ、T4ポリヌクレオチドリガーゼ）を製造業者に
よる指示の通りに使用する。
オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステム
ズ・モデル380A DNA合成材（Applied Biosystems Model
380A DNA synthesizer）で合成し変成ゲル上でのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製することがで
きる。イー・コリ（E. coli）細胞は、マニアチス（Mani
atis）等〔モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory M
anual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1982年〕に
よって記載されている如くに形質転換することができ
る。M13およびpUCクローニングベクターおよび宿主株は
BRLから得た。
ズ・モデル380A DNA合成材（Applied Biosystems Model
380A DNA synthesizer）で合成し変成ゲル上でのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製することがで
きる。イー・コリ（E. coli）細胞は、マニアチス（Mani
atis）等〔モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory M
anual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1982年〕に
よって記載されている如くに形質転換することができ
る。M13およびpUCクローニングベクターおよび宿主株は
BRLから得た。
例１ ヒト−プロテインＣをコードするDNA配列のクローニン
グ ヒト−プロテインＣの一部をコードするcDNAはフォス
ター（Foster）およびダヴィー（Davie）（前掲）によ
って記載されているように調整した。簡単に言えば、常
法によってヒト−肝臓mRNAからλgtll cDNAライブラリ
ーを調製した。クローンは、ヒト−プロテインＣに対す
る、125I−ラベルしたアフィニティー精製抗体を用いて
スクリーニングし、ファージは、平板リセート（lysat
e）法〔マニアチス（Maniatis）等、前掲〕、それに続
く塩化セシウムグラジエントでのバンド形成によってポ
ジティヴクローンから調製した。cDNA挿入部は、Eco RI
を用いて取り出し、プラスミドpUC9中にサブクローン化
した〔ヴィエイラ（Vieira）およびメッシング（Messin
g）、ジーン（Gene）19:259〜268頁、1982年〕。制限断
片をファージベクターM13mp10およびm13mp11中にサブク
ローン化し〔メッシング（Messing）、メス．イン．エ
ンザイモロジー（Meth.in Enzymology）101:20〜77頁、
1983年〕、ジデオキシ法〔サンガー（Sanger）等、プロ
ク．ナトル．アカド．サイ.USA（Proc.Natl.Acad.Sci U
SA）74:5463〜5467頁、1977年〕によって配列決定し
た。ヒト−プロテインＣの既知の配列〔キシエル（Kisi
el）、前掲〕に相当し、そしてライト鎖のアミノ酸64で
始まりヘビー鎖を通って３′非コード領域に伸びている
プロテインＣをコードするDNAを含有するクローンを選
択した。このクローンをλHC1375と名付けた。アミノ酸
24からプロテインＣをコードする第２のcDNAクローンを
同定した。このクローンからの挿入部をpUC9中にサブク
ローン化し、このプラスミドをpHC6Lと名付けた（第１
図）。このクローンは、ヘビー鎖コード領域、終止コド
ンおよび３′非コード領域を含むプロテインＣの主たる
部分をコードする。
グ ヒト−プロテインＣの一部をコードするcDNAはフォス
ター（Foster）およびダヴィー（Davie）（前掲）によ
って記載されているように調整した。簡単に言えば、常
法によってヒト−肝臓mRNAからλgtll cDNAライブラリ
ーを調製した。クローンは、ヒト−プロテインＣに対す
る、125I−ラベルしたアフィニティー精製抗体を用いて
スクリーニングし、ファージは、平板リセート（lysat
e）法〔マニアチス（Maniatis）等、前掲〕、それに続
く塩化セシウムグラジエントでのバンド形成によってポ
ジティヴクローンから調製した。cDNA挿入部は、Eco RI
を用いて取り出し、プラスミドpUC9中にサブクローン化
した〔ヴィエイラ（Vieira）およびメッシング（Messin
g）、ジーン（Gene）19:259〜268頁、1982年〕。制限断
片をファージベクターM13mp10およびm13mp11中にサブク
ローン化し〔メッシング（Messing）、メス．イン．エ
ンザイモロジー（Meth.in Enzymology）101:20〜77頁、
1983年〕、ジデオキシ法〔サンガー（Sanger）等、プロ
ク．ナトル．アカド．サイ.USA（Proc.Natl.Acad.Sci U
SA）74:5463〜5467頁、1977年〕によって配列決定し
た。ヒト−プロテインＣの既知の配列〔キシエル（Kisi
el）、前掲〕に相当し、そしてライト鎖のアミノ酸64で
始まりヘビー鎖を通って３′非コード領域に伸びている
プロテインＣをコードするDNAを含有するクローンを選
択した。このクローンをλHC1375と名付けた。アミノ酸
24からプロテインＣをコードする第２のcDNAクローンを
同定した。このクローンからの挿入部をpUC9中にサブク
ローン化し、このプラスミドをpHC6Lと名付けた（第１
図）。このクローンは、ヘビー鎖コード領域、終止コド
ンおよび３′非コード領域を含むプロテインＣの主たる
部分をコードする。
λHC1375からのcDNA挿入部をα−32P dNTPを用いてニ
ックトランスレーションし、これを用いてウー（Woo）
によって改変された〔メス．イン．エンザイモロジー
（Meth.in Enzymology）68:381〜395頁、1979年〕、ベ
ントン（Benton）およびデイヴィス（Davis）のプラー
クハイブリダイゼーション法（サイエンス196:181〜182
頁、1977年）により、ファージλシャロン4A中のヒト−
ゲノムライブラリーをプローブした〔マニアチス（Mani
atis）等、セル（Cell）15:687〜702頁、1978年〕。ポ
ジティブクローンを単離したプラーク精製した〔フォス
ター（Foster）等、プロク．ナトル．アカド．サイ.USA
（Proc.Natl.Acad.Sei.USA）82:4673〜4677頁、1985
年、参考に引用〕。ポジティブクローンから調製したフ
ァージDNA〔シルハヴィー（Silhavy）等、エクスペリメ
ンツ・ウィズ・ジーン・フュージョン（Experiments wi
th Gene Fusion）中、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1
984年〕をEco RIまたはBgl IIで消化し、ゲノム挿入部
を精製してpUC9内にサブクローン化した。挿入制限断片
をM13ベクター内にサブクローン化し、配列を決定して
その同一性を確認して完全な遺伝子のDNA配列を確立し
た。
ックトランスレーションし、これを用いてウー（Woo）
によって改変された〔メス．イン．エンザイモロジー
（Meth.in Enzymology）68:381〜395頁、1979年〕、ベ
ントン（Benton）およびデイヴィス（Davis）のプラー
クハイブリダイゼーション法（サイエンス196:181〜182
頁、1977年）により、ファージλシャロン4A中のヒト−
ゲノムライブラリーをプローブした〔マニアチス（Mani
atis）等、セル（Cell）15:687〜702頁、1978年〕。ポ
ジティブクローンを単離したプラーク精製した〔フォス
ター（Foster）等、プロク．ナトル．アカド．サイ.USA
（Proc.Natl.Acad.Sei.USA）82:4673〜4677頁、1985
年、参考に引用〕。ポジティブクローンから調製したフ
ァージDNA〔シルハヴィー（Silhavy）等、エクスペリメ
ンツ・ウィズ・ジーン・フュージョン（Experiments wi
th Gene Fusion）中、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1
984年〕をEco RIまたはBgl IIで消化し、ゲノム挿入部
を精製してpUC9内にサブクローン化した。挿入制限断片
をM13ベクター内にサブクローン化し、配列を決定して
その同一性を確認して完全な遺伝子のDNA配列を確立し
た。
pHCλ6LのcDNA挿入部をニックトランスレーション
し、これを用いてファージλシャロン4Aライブラリーを
プローブした。cDNAの５′および３′末端から調製した
プローブにハイブリダイズする１個のゲノムクローンを
同定した。このファージクローンをEco RIで消化して、
プロテインＣ遺伝子の５′末端に対応する4.4kb断片をp
UC9中にサブクローン化した。得られた組換プラスミド
をpHCR4.4と名付けた。完全DNA配列分析によって、pHCR
4.4中の挿入部が1263bp（塩基対）のイントロンによっ
て分離される70〜167bpのエクソンを２つ含んでいるこ
とが示された。第１のエクソンはアミノ−42〜−19をコ
ードし、第２のエクソンはアミノ酸−19〜37をコードす
る。配列分析によって、完全プロテインＣ遺伝子のDNA
配列が確認された。
し、これを用いてファージλシャロン4Aライブラリーを
プローブした。cDNAの５′および３′末端から調製した
プローブにハイブリダイズする１個のゲノムクローンを
同定した。このファージクローンをEco RIで消化して、
プロテインＣ遺伝子の５′末端に対応する4.4kb断片をp
UC9中にサブクローン化した。得られた組換プラスミド
をpHCR4.4と名付けた。完全DNA配列分析によって、pHCR
4.4中の挿入部が1263bp（塩基対）のイントロンによっ
て分離される70〜167bpのエクソンを２つ含んでいるこ
とが示された。第１のエクソンはアミノ−42〜−19をコ
ードし、第２のエクソンはアミノ酸−19〜37をコードす
る。配列分析によって、完全プロテインＣ遺伝子のDNA
配列が確認された。
上記したように、次には、ゲノムクローンを用いて本
発明において使用するのに満足なコード配列を造成する
ために、イントロンを除去することが必要である。
発明において使用するのに満足なコード配列を造成する
ために、イントロンを除去することが必要である。
例２ プロテインＣの完全長コード配列の造成 プレ−プロペプチドを包含するプロテインＣの完全長
コード配列を、cDNA及びゲノムクローンの適当な断片を
結合せしめることによって造成した。これは、イントロ
ンをゲノムクローン（pHCR4.4）から取り除き、そして
融合されたエクソンを都合の良い制限部位でcDNA（pHC
λ6Lから）に結合させることによって達成した。次い
で、所望とするゲノム:cDNA結合を、オリゴヌクレオチ
ド指令欠失突然変異誘発によって不所望の配列をループ
・アウトさせることによって形成した。
コード配列を、cDNA及びゲノムクローンの適当な断片を
結合せしめることによって造成した。これは、イントロ
ンをゲノムクローン（pHCR4.4）から取り除き、そして
融合されたエクソンを都合の良い制限部位でcDNA（pHC
λ6Lから）に結合させることによって達成した。次い
で、所望とするゲノム:cDNA結合を、オリゴヌクレオチ
ド指令欠失突然変異誘発によって不所望の配列をループ
・アウトさせることによって形成した。
プラスミドpHCλ6L、pUC9のEco RI部位においてクロ
ーニングされたプロテインＣ部分的cDNAを含有していた
（第１図）。cDNA挿入部を２個の断片としてサブクロー
ニングし、ゲノムクローンからの最も５′−側のコード
領域に結合させるためのそれを調製した。プラスミドpH
Cλ6LをEco RI及びSal Iで消化し、そして次に反応混合
物をフェノール及びCHCl3で抽出し、エタノールで沈殿
させた。得られたDNA断片を連結緩衝液中で再懸濁さ
せ、そしてT4DNAリガーゼを添加した。連結混合物を15
℃で14時間にわたってインキュベートした。E.コリ JM
83の形質転換のために連結混合物のアリコートを使用
し、そしてＸ−gal含有LB寒天上に細胞をプレートし
た。白色のコロニーを選び出し、そしてプラスミドDNA
を調製した。このDNAを制限酵素消化によって分析し、
よってDNAの３′部分（約1450bp挿入部）及びcDNAの
５′部分（約65bp挿入部）を含有するクローンを同定し
た。これらのクローンを、それぞれp9C3′及びp9C5′と
して表示する（図６）。
ーニングされたプロテインＣ部分的cDNAを含有していた
（第１図）。cDNA挿入部を２個の断片としてサブクロー
ニングし、ゲノムクローンからの最も５′−側のコード
領域に結合させるためのそれを調製した。プラスミドpH
Cλ6LをEco RI及びSal Iで消化し、そして次に反応混合
物をフェノール及びCHCl3で抽出し、エタノールで沈殿
させた。得られたDNA断片を連結緩衝液中で再懸濁さ
せ、そしてT4DNAリガーゼを添加した。連結混合物を15
℃で14時間にわたってインキュベートした。E.コリ JM
83の形質転換のために連結混合物のアリコートを使用
し、そしてＸ−gal含有LB寒天上に細胞をプレートし
た。白色のコロニーを選び出し、そしてプラスミドDNA
を調製した。このDNAを制限酵素消化によって分析し、
よってDNAの３′部分（約1450bp挿入部）及びcDNAの
５′部分（約65bp挿入部）を含有するクローンを同定し
た。これらのクローンを、それぞれp9C3′及びp9C5′と
して表示する（図６）。
cDNAから失われている５′コード領域は、ゲノムクロ
ーンpHCR4.4のエクソンＩ及びII中に含まれている。こ
のプラスミドは、約4400塩基対（bp）の挿入部を含有し
ており、そしてイントロンＢ中に位置するEco RI部位の
ところでその３′末端上で終端している。
ーンpHCR4.4のエクソンＩ及びII中に含まれている。こ
のプラスミドは、約4400塩基対（bp）の挿入部を含有し
ており、そしてイントロンＢ中に位置するEco RI部位の
ところでその３′末端上で終端している。
コード配列をPHCR4.4から除去するため、プラスミド
をPst I及びEco RIで消化し、そして得られた断片をア
ガロースゲル電気泳動法によって分離した。エクソンＩ
及びIIを含有する約2540bpの断片をゲルから単離し、そ
してCTABで抽出した（Langridgeら，Analyt.Btochem.10
3;264,1980）。この断片、５′Ｐ−Ｒと呼ぶ、をpUC9中
にサブクローニングしてプラスミドp5′Ｐ−Ｒを製造し
た（第７図）。
をPst I及びEco RIで消化し、そして得られた断片をア
ガロースゲル電気泳動法によって分離した。エクソンＩ
及びIIを含有する約2540bpの断片をゲルから単離し、そ
してCTABで抽出した（Langridgeら，Analyt.Btochem.10
3;264,1980）。この断片、５′Ｐ−Ｒと呼ぶ、をpUC9中
にサブクローニングしてプラスミドp5′Ｐ−Ｒを製造し
た（第７図）。
p5′Ｐ−Ｒ中のイントロン（イントロンＡと呼ぶ）を
２段階法で除去した（第７図）。プラスミドをApa Iで
消化したところ、イントロン内のユニーク部位で切断が
おこり、３′オーバーハング末端が残留した。次いで、
線状化したプラスミドをBal31エキソヌクレアーゼ又はT
4ポリマーゼで処理して約400bpをそれぞれの末端から除
去し、そして得られた断片末端をS1ヌクレアーゼで平滑
末端化した。この線状化プラスミドをリガーゼで再環化
し、そしてE.コリ JM83の形質転換のために使用した。
プラスミドDNAを抽出し、そしてイントロンＡ中のSma I
及びSst I制限部位の存在に関して分析し、また、300〜
400bpに減らしたSma T−Sst T断片を有するプラスミド
を選び出し、p5′ＰΔaRと表示した。
２段階法で除去した（第７図）。プラスミドをApa Iで
消化したところ、イントロン内のユニーク部位で切断が
おこり、３′オーバーハング末端が残留した。次いで、
線状化したプラスミドをBal31エキソヌクレアーゼ又はT
4ポリマーゼで処理して約400bpをそれぞれの末端から除
去し、そして得られた断片末端をS1ヌクレアーゼで平滑
末端化した。この線状化プラスミドをリガーゼで再環化
し、そしてE.コリ JM83の形質転換のために使用した。
プラスミドDNAを抽出し、そしてイントロンＡ中のSma I
及びSst I制限部位の存在に関して分析し、また、300〜
400bpに減らしたSma T−Sst T断片を有するプラスミド
を選び出し、p5′ＰΔaRと表示した。
イントロンＡの残りを、Zoller及びSmith（Manual fo
r Advanced Techniques in Molecular Cloning Coures,
Cold Spring Harbor Laboratory,1983）により２プライ
マー法に関して記載されるのと本質的に同様にしてオリ
ゴヌクレオチド指令欠失突然変異誘発によって除去し
た。p5′ＰΔaRをPst I及びEco RIで消化し、そしてプ
ロテインＣ断片を、Pst I及びEco RIで消化したM13mp9
中にサブクローニングした。正鎖ファージDNAを鋳型と
して調製し、そしてオリゴヌクレオチドmut−１（第１
表）にアニールした。この突然変異誘発オリゴヌクレオ
チドは、連結されるべきエクソンＩ及びII配列に対して
相補的な配列を含有する。M13ユニバーサル配列プライ
マーを同じ鋳型上で３′〜mut−１にアニールした。こ
のプライマーをT4リガーゼの存在においてDNAポリメラ
ーゼＩ（Klenow断片）及びヌクレオシドトリホスフェー
トを使用して延長した。得られた２デュプレックスDNA
環をE.コリ JM103に形質転換し、そして得られたプラ
ークを厳密なハイブリダイゼーション条件の下で、32p
−標識された突然変異誘発オリゴヌクレオチドをプロー
ブとして使用して、スクリーニングした。ポジティブプ
ラークからのDNAを単離し、そしてオリゴヌクレオチド
プライマー１（第１表）を使用して配列決定した。この
プライマーはエクソンII中にプライムし、欠失連結をま
たぐDNA配列の決定が可能になった。エクソンＩ及びII
の正しいインフレーム融合を有する分子が選らばれた。
Pst I−Eco RI断片を、M13の複製形から、制限エンドヌ
クレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって
単離し、そしてpUC9中にサブクローニングしてプラスミ
ドp5′Ｉ−IIを作製する（第７図）。
r Advanced Techniques in Molecular Cloning Coures,
Cold Spring Harbor Laboratory,1983）により２プライ
マー法に関して記載されるのと本質的に同様にしてオリ
ゴヌクレオチド指令欠失突然変異誘発によって除去し
た。p5′ＰΔaRをPst I及びEco RIで消化し、そしてプ
ロテインＣ断片を、Pst I及びEco RIで消化したM13mp9
中にサブクローニングした。正鎖ファージDNAを鋳型と
して調製し、そしてオリゴヌクレオチドmut−１（第１
表）にアニールした。この突然変異誘発オリゴヌクレオ
チドは、連結されるべきエクソンＩ及びII配列に対して
相補的な配列を含有する。M13ユニバーサル配列プライ
マーを同じ鋳型上で３′〜mut−１にアニールした。こ
のプライマーをT4リガーゼの存在においてDNAポリメラ
ーゼＩ（Klenow断片）及びヌクレオシドトリホスフェー
トを使用して延長した。得られた２デュプレックスDNA
環をE.コリ JM103に形質転換し、そして得られたプラ
ークを厳密なハイブリダイゼーション条件の下で、32p
−標識された突然変異誘発オリゴヌクレオチドをプロー
ブとして使用して、スクリーニングした。ポジティブプ
ラークからのDNAを単離し、そしてオリゴヌクレオチド
プライマー１（第１表）を使用して配列決定した。この
プライマーはエクソンII中にプライムし、欠失連結をま
たぐDNA配列の決定が可能になった。エクソンＩ及びII
の正しいインフレーム融合を有する分子が選らばれた。
Pst I−Eco RI断片を、M13の複製形から、制限エンドヌ
クレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって
単離し、そしてpUC9中にサブクローニングしてプラスミ
ドp5′Ｉ−IIを作製する（第７図）。
第８図に示すとおり、cDNAに５′コード領域を連結す
るために、p5′Ｉ−IIの約1277bp PstI−Eco RI断片
を、プラスミドのPst I＋Eco RI消化から単離し、アガ
ロースゲル電気泳動によって精製する。65bpの最も５′
側のcDNA断片をp9C5′のSal I＋Eco RI消化物から単離
し、アクリルアミドゲル上の電気泳動で精製する。２つ
の断片をそれらのEco RI末端で連結し、得られる約1330
bpのPst I−Sal I断片をPst I＋Sl I−消化M13mp9中へ
サブクローニングにする（第８図）。正鎖ファージDNA
を、オリゴヌクレオチド指令欠失変異誘発用の鋳型とし
て作製する。オリゴヌクレオチドmut−２（表１）をこ
の鋳型にアニールし、オリゴヌクレオチドmut−３（表
１）を第２プライマーとして上流にアニールする。この
プライマーを前記のように延長する。オリゴヌクレオチ
ドmut−２は、アミノ酸23〜26をコードするエクソンII
配列をコドン27でcDNAへ融合させることを指令する。第
２プライマー（mut−３）は、翻訳開始点から35bp上流
にEco RI部位を導入する。得られるファージをNco Iお
よびXhoI部位の不存在及び導入されたEco RI部位の存在
についてスクリーニングする。望ましい制限パターンを
示すファージDNAを、プライマー２（表１）を使用して
配列決定し、エクソンIIとcDNAとの間の正しい連結の存
在を確認する。正しい配列をもつファージDNAを選択
し、５′をコード領域を含んでなるPst I−Sal I断片
を、M13組換えファージの複製形から単離する。この断
片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、Pst I及
びSal Iにより消化されたpUC9へ挿入してプラスミドpC
5′endを作製する。
るために、p5′Ｉ−IIの約1277bp PstI−Eco RI断片
を、プラスミドのPst I＋Eco RI消化から単離し、アガ
ロースゲル電気泳動によって精製する。65bpの最も５′
側のcDNA断片をp9C5′のSal I＋Eco RI消化物から単離
し、アクリルアミドゲル上の電気泳動で精製する。２つ
の断片をそれらのEco RI末端で連結し、得られる約1330
bpのPst I−Sal I断片をPst I＋Sl I−消化M13mp9中へ
サブクローニングにする（第８図）。正鎖ファージDNA
を、オリゴヌクレオチド指令欠失変異誘発用の鋳型とし
て作製する。オリゴヌクレオチドmut−２（表１）をこ
の鋳型にアニールし、オリゴヌクレオチドmut−３（表
１）を第２プライマーとして上流にアニールする。この
プライマーを前記のように延長する。オリゴヌクレオチ
ドmut−２は、アミノ酸23〜26をコードするエクソンII
配列をコドン27でcDNAへ融合させることを指令する。第
２プライマー（mut−３）は、翻訳開始点から35bp上流
にEco RI部位を導入する。得られるファージをNco Iお
よびXhoI部位の不存在及び導入されたEco RI部位の存在
についてスクリーニングする。望ましい制限パターンを
示すファージDNAを、プライマー２（表１）を使用して
配列決定し、エクソンIIとcDNAとの間の正しい連結の存
在を確認する。正しい配列をもつファージDNAを選択
し、５′をコード領域を含んでなるPst I−Sal I断片
を、M13組換えファージの複製形から単離する。この断
片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、Pst I及
びSal Iにより消化されたpUC9へ挿入してプラスミドpC
5′endを作製する。
第９図に示すとおり、プラスミドpC5′endをEco RIお
よびSal Iで消化し、５′プロテインＣ断片をアガロー
スゲル電気泳動およびCTAB抽出によって精製する。cDNA
の残りを、Sal I−Eco RI断片としてp9C3′から単離す
る。２個の断片を、Eco RIで消化したpUC9へ、３方連結
により導入する。連結混合物を使用してE.コリ JM83を
形質転換し、その細胞をLB＋Ｘ−gal上にプレートし、
プラスミドDNAを白色コロニーから単離する。得られる
プラスミドをpMMCと称する。これは、約1500bp Eco RI
断片上にヒト−プロテインＣの完全なコード配列を含ん
でいる。
よびSal Iで消化し、５′プロテインＣ断片をアガロー
スゲル電気泳動およびCTAB抽出によって精製する。cDNA
の残りを、Sal I−Eco RI断片としてp9C3′から単離す
る。２個の断片を、Eco RIで消化したpUC9へ、３方連結
により導入する。連結混合物を使用してE.コリ JM83を
形質転換し、その細胞をLB＋Ｘ−gal上にプレートし、
プラスミドDNAを白色コロニーから単離する。得られる
プラスミドをpMMCと称する。これは、約1500bp Eco RI
断片上にヒト−プロテインＣの完全なコード配列を含ん
でいる。
例３ プロテインＣの発現ベクターの造成 pMMCからプロテインＣコード挿入部をEcoRI断片とし
て取り出し、適当な哺乳類細胞発現ベクターに挿入す
る。典型的なベクターはpD7であり、SV40エンハンサー
とアデノウイルス２主要後期プロモーターと３分節リー
ダーを含む。
て取り出し、適当な哺乳類細胞発現ベクターに挿入す
る。典型的なベクターはpD7であり、SV40エンハンサー
とアデノウイルス２主要後期プロモーターと３分節リー
ダーを含む。
プラスミドpD7はプラスミドpDHFRIIIから作成された
（BerknerおよびSharp,Nue.Acids.Res. 13,841〜857
頁,1985年）。pDHFRIII中のDHER配列のすぐ上流のPst I
部位をBcl I部位に変換した。これは100μｌの緩衝液Ａ
（10mMのトリス（pH8）、10mMのMgCl2,6mMのNaCl,7mMの
β−MSH）中で10μｇのプラスミドを５ユニットのBst I
で10分間37℃にて消化した行なった。DNAをフェノール
抽出し、EtoH沈殿し、10mMのdCTPと16ユニットのT4DNA
ポリメラーゼを含む緩衝液Ｂ（50mMのトリス（pH8）,7m
MのMgCl2,7mMのβ−MSH）40μｌに再懸濁し、そして120
℃で60分間インキュベートした。Eto H沈澱の後に、DNA
を400ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを含む緩
衝液Ｃ（10mMのトリス（pH8）、10mMのMgCl2,1mMのDTT,
1.4mMのATP）14μｌ中で2.5μｇのキナーゼ処理したBCl
Iリンカーに連結した。フェノール抽出とEtOH沈澱の
後、DNAを120μｌの緩衝液Ｄ（75mMのKCl,6mMのトリス
（pH7.5）、10mMのMgCl2,1mMのDTT）に再懸濁し、80ユ
ニットのBcl Iで50℃にて60分間消化し、それからアガ
ロース中で電気泳動させた。そのゲルらFromIIIプラス
ミドDNA（10μｇ）を単離し、50ユニットのT4ポリヌク
レオチドリガーゼを含む緩衝液C 10μｌ中で２時間12℃
にて連結させ、それを用いてE.Coli HB101を形質転換し
た。ポジティブコロニーを迅速DNA調製分析法で特定
し、ポジティブコロニーから調製したプラスミドDNA（p
DHFR′と呼ぶ）をdAM- E.コリに形質転換した。
（BerknerおよびSharp,Nue.Acids.Res. 13,841〜857
頁,1985年）。pDHFRIII中のDHER配列のすぐ上流のPst I
部位をBcl I部位に変換した。これは100μｌの緩衝液Ａ
（10mMのトリス（pH8）、10mMのMgCl2,6mMのNaCl,7mMの
β−MSH）中で10μｇのプラスミドを５ユニットのBst I
で10分間37℃にて消化した行なった。DNAをフェノール
抽出し、EtoH沈殿し、10mMのdCTPと16ユニットのT4DNA
ポリメラーゼを含む緩衝液Ｂ（50mMのトリス（pH8）,7m
MのMgCl2,7mMのβ−MSH）40μｌに再懸濁し、そして120
℃で60分間インキュベートした。Eto H沈澱の後に、DNA
を400ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを含む緩
衝液Ｃ（10mMのトリス（pH8）、10mMのMgCl2,1mMのDTT,
1.4mMのATP）14μｌ中で2.5μｇのキナーゼ処理したBCl
Iリンカーに連結した。フェノール抽出とEtOH沈澱の
後、DNAを120μｌの緩衝液Ｄ（75mMのKCl,6mMのトリス
（pH7.5）、10mMのMgCl2,1mMのDTT）に再懸濁し、80ユ
ニットのBcl Iで50℃にて60分間消化し、それからアガ
ロース中で電気泳動させた。そのゲルらFromIIIプラス
ミドDNA（10μｇ）を単離し、50ユニットのT4ポリヌク
レオチドリガーゼを含む緩衝液C 10μｌ中で２時間12℃
にて連結させ、それを用いてE.Coli HB101を形質転換し
た。ポジティブコロニーを迅速DNA調製分析法で特定
し、ポジティブコロニーから調製したプラスミドDNA（p
DHFR′と呼ぶ）をdAM- E.コリに形質転換した。
pDHFR′（15μｇ）およびpSV40（pML−１のBamHI部位
にクローニングしたBamHI消化SV40DNA）（25μｇ）25ユ
ニットのBcl Iを含む緩衝液D100μｌ中で60分間50℃に
て開裂けした後、50ユニットのBamH Iを添加し、60分間
37℃でさらにインキュベートして、プラスミドpD2′を
作成した。DNA断片をアガロースゲル電気泳動法で分離
し、4.9kbのpDHFR′断片と0.2kbSV40断片を単離した。
これらの断片（200ngのpDHFR′DNAと100ngのSV 40 DN
A）を100ユニットT4ポリヌクレオチドリガーゼを含む緩
衝液C10μｌ中で４時間12℃にてインキュベートし、得
られる造成体（pD2′）を用いてE.コリRRIを形質転換し
た。
にクローニングしたBamHI消化SV40DNA）（25μｇ）25ユ
ニットのBcl Iを含む緩衝液D100μｌ中で60分間50℃に
て開裂けした後、50ユニットのBamH Iを添加し、60分間
37℃でさらにインキュベートして、プラスミドpD2′を
作成した。DNA断片をアガロースゲル電気泳動法で分離
し、4.9kbのpDHFR′断片と0.2kbSV40断片を単離した。
これらの断片（200ngのpDHFR′DNAと100ngのSV 40 DN
A）を100ユニットT4ポリヌクレオチドリガーゼを含む緩
衝液C10μｌ中で４時間12℃にてインキュベートし、得
られる造成体（pD2′）を用いてE.コリRRIを形質転換し
た。
プラスミドpD2′をpBR322領域の“ポイゾン”配列を
除去して変形した（Lusky及びBotchan,Nature 293,79
〜81頁,1981年）。プラスミドpD2′（6.6μｇ）および
プラスミドpML−１（LuskyおよびBotchan,前掲）（４μ
ｇ）を夫夫10ユニットのEco RIおよびNru Iを含む緩衝
液A50μｌ中で２時間37℃にてインキュベートした後、
アガロースゲル電気泳動を行なった。1.7kbのpD2′断片
と1.8kbのpML−１断片を単離し、それら（各50mg）を10
0ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを含む緩衝液2
0μｌ中で２時間12℃にて相互に連結した後、E.コリHB1
01に形質転換した。所望の造成物（pD2と呼ぶ）を含む
コロニーを迅速調製分析法で特定した。次に、10μｇの
pD2を50μｌの緩衝液Ａ中で夫々20ユニットのEco RIお
よびBal IIで２時間37℃にて消化した。DNAをアガロー
ス中で電気泳動させ、所望の、pBR322,3′スプライス部
位、およびポリＡ配列を含む2.8kb断片（断片Ｃ）を単
離した。
除去して変形した（Lusky及びBotchan,Nature 293,79
〜81頁,1981年）。プラスミドpD2′（6.6μｇ）および
プラスミドpML−１（LuskyおよびBotchan,前掲）（４μ
ｇ）を夫夫10ユニットのEco RIおよびNru Iを含む緩衝
液A50μｌ中で２時間37℃にてインキュベートした後、
アガロースゲル電気泳動を行なった。1.7kbのpD2′断片
と1.8kbのpML−１断片を単離し、それら（各50mg）を10
0ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを含む緩衝液2
0μｌ中で２時間12℃にて相互に連結した後、E.コリHB1
01に形質転換した。所望の造成物（pD2と呼ぶ）を含む
コロニーを迅速調製分析法で特定した。次に、10μｇの
pD2を50μｌの緩衝液Ａ中で夫々20ユニットのEco RIお
よびBal IIで２時間37℃にて消化した。DNAをアガロー
ス中で電気泳動させ、所望の、pBR322,3′スプライス部
位、およびポリＡ配列を含む2.8kb断片（断片Ｃ）を単
離した。
pD3を造成するのに用いる残りの断片を作成するため
に、pDHFRIIIを変形してSacII（SstII）部位をHindIII
部位またはKpn I部位に変換した。10μｇのpDHFRIIIを2
0ユニットのSstIIで２時間37℃にて消化した後フェノー
ル抽出およびエタノール沈澱を行なった。再懸濁したDN
Aを10mMのdCTPと16ユニットのT4 DNAポリメラーゼを含
む緩衝液B100μｌ中で60分間12℃にてインキュベート
し、フェノール抽出し、透析し、そしてエタノール沈澱
した。DNA（５μｇ）を400ユニットのT4 DNAリガーゼを
含む緩衝液20μｌ中で10時間12℃にて、50ngのキナーゼ
処理したHindIIIリンカーまたはKpn Iリンカーと連結
し、フェノール抽出し、そしてエタノール沈澱した。50
μｌの緩衝液Ａに再懸濁後、得られるプラスミドを適当
であれば50ユニットのHind IIIまたはKpn Iで消化し、
アガロース中で電気泳動させた。ゲルから単離したDNA
（250ng）を400ユニットのT4 DNAリガーゼを含む緩衝液
C30μｌ中で４時間12℃にて連結し、それを用いてE.コ
リ RRIを形質転換した。得られるプラスミドはpDHFRII
I（Hind III）およびpDHFR III（Kpn I）と指称した。p
DHFRIII（Kpn I）から、Bgl IIおよびKpn Iで消化した
後アガロースゲル電気泳動して700bp Kpn I−Bal II断
片（断片Ａ）を精製した。
に、pDHFRIIIを変形してSacII（SstII）部位をHindIII
部位またはKpn I部位に変換した。10μｇのpDHFRIIIを2
0ユニットのSstIIで２時間37℃にて消化した後フェノー
ル抽出およびエタノール沈澱を行なった。再懸濁したDN
Aを10mMのdCTPと16ユニットのT4 DNAポリメラーゼを含
む緩衝液B100μｌ中で60分間12℃にてインキュベート
し、フェノール抽出し、透析し、そしてエタノール沈澱
した。DNA（５μｇ）を400ユニットのT4 DNAリガーゼを
含む緩衝液20μｌ中で10時間12℃にて、50ngのキナーゼ
処理したHindIIIリンカーまたはKpn Iリンカーと連結
し、フェノール抽出し、そしてエタノール沈澱した。50
μｌの緩衝液Ａに再懸濁後、得られるプラスミドを適当
であれば50ユニットのHind IIIまたはKpn Iで消化し、
アガロース中で電気泳動させた。ゲルから単離したDNA
（250ng）を400ユニットのT4 DNAリガーゼを含む緩衝液
C30μｌ中で４時間12℃にて連結し、それを用いてE.コ
リ RRIを形質転換した。得られるプラスミドはpDHFRII
I（Hind III）およびpDHFR III（Kpn I）と指称した。p
DHFRIII（Kpn I）から、Bgl IIおよびKpn Iで消化した
後アガロースゲル電気泳動して700bp Kpn I−Bal II断
片（断片Ａ）を精製した。
以下のようにしてSV40エンハンサー配列をpDHFR III
（HindIII）に挿入した。50μｇのSV40 DNAを50ユニッ
トのHind IIIを含む緩衝液A 120μｌ中で２時間37℃に
てインキュベートし、Hind III C SV40断片（5089−968
bp）をゲル精製した。プラスミドpDHFRIII（HindIII）
（10μｇ）を250ngの仔ウシ腸ホスファターゼで１時間3
7℃にて処理し、フェノール抽出し、そしてエタノール
沈澱した。線状のプラスミド（50ng）を16μｌの緩衝液
Ｃ中で200ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを用
いて３時間12℃にて250ngのHind IIIC SV40と連結し、
E.Coli HB101に形質転換した。
（HindIII）に挿入した。50μｇのSV40 DNAを50ユニッ
トのHind IIIを含む緩衝液A 120μｌ中で２時間37℃に
てインキュベートし、Hind III C SV40断片（5089−968
bp）をゲル精製した。プラスミドpDHFRIII（HindIII）
（10μｇ）を250ngの仔ウシ腸ホスファターゼで１時間3
7℃にて処理し、フェノール抽出し、そしてエタノール
沈澱した。線状のプラスミド（50ng）を16μｌの緩衝液
Ｃ中で200ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを用
いて３時間12℃にて250ngのHind IIIC SV40と連結し、
E.Coli HB101に形質転換した。
pD3の最終造成のため、断片Ａと断片Ｂ（各50ng）を2
00ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを用いて４時
間12℃にて10ngの断片Ｃと連結し、そしてE.コリRRIの
トランスフェクションを行なった。迅速調製分製法でポ
ジティブコロニーを検出し、pD3の大規模調製を行なっ
た。
00ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを用いて４時
間12℃にて10ngの断片Ｃと連結し、そしてE.コリRRIの
トランスフェクションを行なった。迅速調製分製法でポ
ジティブコロニーを検出し、pD3の大規模調製を行なっ
た。
プラスミドpD3を、Bcl I挿入部位をEco RI部位に変換
してプロテインＣ配列の挿入を受容するように変形す
る。第１に、pD3のアデノウイルス50−１マップユニッ
ト配列の最左端に存在するEco RI部位を、それを慣用の
リンカー手法でBamHI部位に変換して除去することが必
要である。すなわち、プラスミドをEco RIで消化し、線
状化したDNAをT4ポリメラーゼおよび４種全部のデオキ
シヌクレオチドトリホスフェートで処理して平滑末端を
形成する。次にプラスミドをBamHI部位を含むオクトヌ
クレオチドに連結し、DNAをBamHIで消化して余剰のリン
カーを除去し、そして哺乳類細胞発現配列を含む断片を
PML−１のBamHI部位にクローニングする。得られるプラ
スミドをE.コリ HB101に形質転換し、プラスミドDNAを
調製し、正しい変換体を選別する。同様な仕方で、Bcl
I部位を適当なオクトヌクレオチドリンカーを用いてEco
RI部位に変換する。得られるベクターはpD7として知ら
れる。次にpMMCからの1.5kbのプロテインC Eco RI断片
をpD7のEco RI部位に挿入して発現ベクターpD7C（第10
図）を作成する。
してプロテインＣ配列の挿入を受容するように変形す
る。第１に、pD3のアデノウイルス50−１マップユニッ
ト配列の最左端に存在するEco RI部位を、それを慣用の
リンカー手法でBamHI部位に変換して除去することが必
要である。すなわち、プラスミドをEco RIで消化し、線
状化したDNAをT4ポリメラーゼおよび４種全部のデオキ
シヌクレオチドトリホスフェートで処理して平滑末端を
形成する。次にプラスミドをBamHI部位を含むオクトヌ
クレオチドに連結し、DNAをBamHIで消化して余剰のリン
カーを除去し、そして哺乳類細胞発現配列を含む断片を
PML−１のBamHI部位にクローニングする。得られるプラ
スミドをE.コリ HB101に形質転換し、プラスミドDNAを
調製し、正しい変換体を選別する。同様な仕方で、Bcl
I部位を適当なオクトヌクレオチドリンカーを用いてEco
RI部位に変換する。得られるベクターはpD7として知ら
れる。次にpMMCからの1.5kbのプロテインC Eco RI断片
をpD7のEco RI部位に挿入して発現ベクターpD7C（第10
図）を作成する。
pD5を用いることにより、ポリシストロンメッセージ
からのタンパクＣ配列の発現を可能にするベクターを造
成する。該pD5は５′非コード領域の大部分を欠如して
いるDHFRコード配列を含有するpD3に類似したプラスミ
ドである。DHFR配列を更に変形し、メトトレキセートに
対するその結合親和性を減少する。
からのタンパクＣ配列の発現を可能にするベクターを造
成する。該pD5は５′非コード領域の大部分を欠如して
いるDHFRコード配列を含有するpD3に類似したプラスミ
ドである。DHFR配列を更に変形し、メトトレキセートに
対するその結合親和性を減少する。
ベクターpD5はpD3について記載した方法と同様の方法
で造成され、そしてこれはBam HI部位が異種性DNAの挿
入部位である点およびSV40ポリアデニレーションシグナ
ルを含有するBcl I−BamHI SV40断片がレイトオリエン
テーション（late orientation）にある点においてのみ
pD3と異っている。
で造成され、そしてこれはBam HI部位が異種性DNAの挿
入部位である点およびSV40ポリアデニレーションシグナ
ルを含有するBcl I−BamHI SV40断片がレイトオリエン
テーション（late orientation）にある点においてのみ
pD3と異っている。
DHFR配列は、最初にPstIおよびSstYでpDHFIIIを消化
し次いで400bp DHFR断片を単離することにより変形され
る。これはMIファージベクター中でサブクーロン化され
次いでシモンセンおよびレビンソンにより記載される如
く（Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2495−2499,1983）突然
変異誘発される。誘発はDHFR配列中、１個の塩基対変化
をもたらす。次いで変化させた断片をpDHFRIIIに再挿入
しプラスミドpDHRrIIIを得る。
し次いで400bp DHFR断片を単離することにより変形され
る。これはMIファージベクター中でサブクーロン化され
次いでシモンセンおよびレビンソンにより記載される如
く（Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2495−2499,1983）突然
変異誘発される。誘発はDHFR配列中、１個の塩基対変化
をもたらす。次いで変化させた断片をpDHFRIIIに再挿入
しプラスミドpDHRrIIIを得る。
次いでDHFR配列の５′非コード領域を除去する。プラ
スミドpDHFRrIIIをFnu4HI（これは、約20の部位でプラ
スミドを切断する）で開裂し、次いでT4 DNAポリメラー
ゼ及び全ての４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフ
ェートで処理することにより平滑末端を生じさせる。Ba
m HIリンカーを末端に結合させ、次いで混合物をBam HI
およびNco Iで消化させる。DHFRr cDNAを含む0.6kb Bam
HI−Nco I断片を単離する。プラスミドpDHFRIIIをNco
IおよびBam HIで消化し次いでSV40ポリアデニレーショ
ンシグナルを含む0.2kb断片を単離する。次いで、アー
リーオリエンテーション（early orientation）におい
てポリアデニル化シグナルをDHFRr断片に結合させる。B
am HIで消化後、生成するBam HI断片をpD5のBam HI部位
に挿入し、次いで連結混合物を、E.コリ−HBI01形質変
換するために用いる。プラスミドDNAを調製し次いで制
限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーンする。Ad2
主要後期ウロモーターから転写のため正しい配向でDHFR
r挿入部を有するプラスミドをpD5（DHFRr）と命名す
る。
スミドpDHFRrIIIをFnu4HI（これは、約20の部位でプラ
スミドを切断する）で開裂し、次いでT4 DNAポリメラー
ゼ及び全ての４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフ
ェートで処理することにより平滑末端を生じさせる。Ba
m HIリンカーを末端に結合させ、次いで混合物をBam HI
およびNco Iで消化させる。DHFRr cDNAを含む0.6kb Bam
HI−Nco I断片を単離する。プラスミドpDHFRIIIをNco
IおよびBam HIで消化し次いでSV40ポリアデニレーショ
ンシグナルを含む0.2kb断片を単離する。次いで、アー
リーオリエンテーション（early orientation）におい
てポリアデニル化シグナルをDHFRr断片に結合させる。B
am HIで消化後、生成するBam HI断片をpD5のBam HI部位
に挿入し、次いで連結混合物を、E.コリ−HBI01形質変
換するために用いる。プラスミドDNAを調製し次いで制
限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーンする。Ad2
主要後期ウロモーターから転写のため正しい配向でDHFR
r挿入部を有するプラスミドをpD5（DHFRr）と命名す
る。
プラスミドpD5（DHFRr）を用いてプロテインＣを発現
するため、pMMCをEco RIで消化し次いで1.5kbプロテイ
ンＣ断片を単離する。Eco RI末端を、リンカーの付加に
よりBcl I末端に変換する。プラスミドpD5（DHFRr）をB
am HIで部分消化してDHFRr配列の５′末端でそれを解裂
させ次いでプロテインＣ断片に結合させる。プラスミド
DNAを正しい方向性およびプロテインＣ断片の挿入部に
ついてスクリーニングする。pD5（pc−DHFRr）と命名し
た生成ベクターを第11図に示す。
するため、pMMCをEco RIで消化し次いで1.5kbプロテイ
ンＣ断片を単離する。Eco RI末端を、リンカーの付加に
よりBcl I末端に変換する。プラスミドpD5（DHFRr）をB
am HIで部分消化してDHFRr配列の５′末端でそれを解裂
させ次いでプロテインＣ断片に結合させる。プラスミド
DNAを正しい方向性およびプロテインＣ断片の挿入部に
ついてスクリーニングする。pD5（pc−DHFRr）と命名し
た生成ベクターを第11図に示す。
例４ トランスフェクトされた哺乳動物細胞におけるプロテイ
ンＣの発現 小ハムスターの腎臓細胞（ATCC受託番号CCL10）を、
記載されるのと本質的に同じ方法でpD7Cを用いてトラン
スフェクトする（ウイグラー等,Cell 14;725,1978;カル
サロおよびピアリン,Somatie Cell Gednetics 7:603,19
81;およびGraham and Van der Eb,Virology 52:456,197
3）。細胞を60mm細織胞培養ペトリ皿内のダルベッコ培
地（10％の熱不活性化ウシ胎児血清が加えられ更にグル
タミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンが補足さ
れている）中、37℃、５％CO2でコンフルエンシー20％
に増殖させる。合計10μｇのDNAをトランスフェクトす
るため用いる。１個の60mm皿:3.75μｇのpD7C、1.25μ
ｇのpko−neo（Southern and Berg,J.Mol.Appl.Genet
1:327−341,1982）および５μｇのサケ***DNA。DNAを
0.3MのNaOAcおよび75％エタノール中で沈澱させ、70％
エタノールで洗浄し次いで20μｌの10mMトリス−HCl（p
H8）および1mMMEDTA中に再溶解する。DNAを水440μｌ、
並びに280mMのNaCl,1.5mMのNaHPO4,12mMのデキストロー
スおよび50mMのHEPES（pH7.12）の500μｌと一緒にす
る。250mMのCaCl260μｌを上記混合物に滴加し次いで溶
液を室温で30分間放置する。次いで溶液を細胞に添加
し、細胞を４時間37℃に戻す。培地を除去し次いで血清
を含有するダルベッコ培地の20％DMSO 5mlを２分間室温
で添加する。直ちに培地を２回交換して皿を洗浄し、次
いで新鮮な培地で一夜インキュベートする。DNAを添加
後、24時間目に培地を除去し次いで選択培地（血清を含
有するダルベッコ培地中、10mg/mlのG418,498μ/mg、ギ
ブコ）を添加する。約10〜13日後、pko−neo遺伝子を組
み入れてG418に対して耐性の細胞を代表する個々のクロ
ーンを、96個のウェルを有するプレートに移し次いでプ
ロテインアツセイのため10％ウシ胎児血清を加えたダル
ベッコ培地中で増殖させる。
ンＣの発現 小ハムスターの腎臓細胞（ATCC受託番号CCL10）を、
記載されるのと本質的に同じ方法でpD7Cを用いてトラン
スフェクトする（ウイグラー等,Cell 14;725,1978;カル
サロおよびピアリン,Somatie Cell Gednetics 7:603,19
81;およびGraham and Van der Eb,Virology 52:456,197
3）。細胞を60mm細織胞培養ペトリ皿内のダルベッコ培
地（10％の熱不活性化ウシ胎児血清が加えられ更にグル
タミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンが補足さ
れている）中、37℃、５％CO2でコンフルエンシー20％
に増殖させる。合計10μｇのDNAをトランスフェクトす
るため用いる。１個の60mm皿:3.75μｇのpD7C、1.25μ
ｇのpko−neo（Southern and Berg,J.Mol.Appl.Genet
1:327−341,1982）および５μｇのサケ***DNA。DNAを
0.3MのNaOAcおよび75％エタノール中で沈澱させ、70％
エタノールで洗浄し次いで20μｌの10mMトリス−HCl（p
H8）および1mMMEDTA中に再溶解する。DNAを水440μｌ、
並びに280mMのNaCl,1.5mMのNaHPO4,12mMのデキストロー
スおよび50mMのHEPES（pH7.12）の500μｌと一緒にす
る。250mMのCaCl260μｌを上記混合物に滴加し次いで溶
液を室温で30分間放置する。次いで溶液を細胞に添加
し、細胞を４時間37℃に戻す。培地を除去し次いで血清
を含有するダルベッコ培地の20％DMSO 5mlを２分間室温
で添加する。直ちに培地を２回交換して皿を洗浄し、次
いで新鮮な培地で一夜インキュベートする。DNAを添加
後、24時間目に培地を除去し次いで選択培地（血清を含
有するダルベッコ培地中、10mg/mlのG418,498μ/mg、ギ
ブコ）を添加する。約10〜13日後、pko−neo遺伝子を組
み入れてG418に対して耐性の細胞を代表する個々のクロ
ーンを、96個のウェルを有するプレートに移し次いでプ
ロテインアツセイのため10％ウシ胎児血清を加えたダル
ベッコ培地中で増殖させる。
プロテインＣの分析のため、培地を遠心分離すること
により細胞および細胞破片を分離し、次いでプロテイン
Ｃポリペプチドおよび生物活性について分析する。細胞
をトリプシンを用いて皿から取り出し、新鮮な培地で洗
浄し、遠心分離し更に−20℃で凍結させる。分析用に細
胞ペレットをPBS中で解凍し、ペレット化し、次いで0.2
5％トリトンＸ−100を含有するPBS中に再懸濁させる。
サンプルを希釈し次いでポリペプチドおよび活性を分析
する。
により細胞および細胞破片を分離し、次いでプロテイン
Ｃポリペプチドおよび生物活性について分析する。細胞
をトリプシンを用いて皿から取り出し、新鮮な培地で洗
浄し、遠心分離し更に−20℃で凍結させる。分析用に細
胞ペレットをPBS中で解凍し、ペレット化し、次いで0.2
5％トリトンＸ−100を含有するPBS中に再懸濁させる。
サンプルを希釈し次いでポリペプチドおよび活性を分析
する。
プロテインＣについてのELISAは次のように行う。ヒ
トプロテインＣ（0.1MNa2CO3中5nl/ml、pH9.6）に対す
る抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）200
μｌを、96個のウェルを有するプレートの各ウェル中で
２時間37℃でインキュベートする。次いでウェルをPBS
中、220μｌの、１％ウシ血清アルブミン（BSA）および
0.05％トウィーン20と共に37℃で２時間インキュベート
する。プレートを水で洗い、風乾し、４℃で保存する。
サンプルを分析するため、200μｌのサンプルを抗体で
コートされたウェル中で、室温にて１時間インキュベー
トする。次いでウェルを0.05％トウィーン20を含有する
PBS200μｌで４回洗浄する。56mg/lのMgCl2を含有するp
H9.8のジエタノールアミン緩衝液（１当たり96ml）に
溶解した200μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（3
0mg）をウェルに添加する。酵素反応を37℃で行ない次
いで黄色の展開を、ELISAプレート読みとり器を用い405
nmで監視する。
トプロテインＣ（0.1MNa2CO3中5nl/ml、pH9.6）に対す
る抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）200
μｌを、96個のウェルを有するプレートの各ウェル中で
２時間37℃でインキュベートする。次いでウェルをPBS
中、220μｌの、１％ウシ血清アルブミン（BSA）および
0.05％トウィーン20と共に37℃で２時間インキュベート
する。プレートを水で洗い、風乾し、４℃で保存する。
サンプルを分析するため、200μｌのサンプルを抗体で
コートされたウェル中で、室温にて１時間インキュベー
トする。次いでウェルを0.05％トウィーン20を含有する
PBS200μｌで４回洗浄する。56mg/lのMgCl2を含有するp
H9.8のジエタノールアミン緩衝液（１当たり96ml）に
溶解した200μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（3
0mg）をウェルに添加する。酵素反応を37℃で行ない次
いで黄色の展開を、ELISAプレート読みとり器を用い405
nmで監視する。
キーゼルおよびデビー（Meth.in Enzymology80:320−
332,1981）により記載される如く、スロンビンによりプ
ロテインＣを活性化した後、血漿のカオリン−セファリ
ン凝固時間を延長させるその能力により、該プロテイン
Ｃ生物活性を分析する。
332,1981）により記載される如く、スロンビンによりプ
ロテインＣを活性化した後、血漿のカオリン−セファリ
ン凝固時間を延長させるその能力により、該プロテイン
Ｃ生物活性を分析する。
例５ プロテインＣをコードする完全長cDNAの発現 A.cDNAの単離 プロテインＣのプレ−プロペプチド（第４図のエクソ
ン１）のアミノ酸−42〜19に相当するエクソンを含むゲ
ノムフラグメントを単離し、ニック翻訳し、Gublerおよ
びHoffmanの技法（Gene 25:263〜269、1983年）によ
り、mRNAを用いて、HEPG2細胞から造成されたcDNAライ
ブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用
いた。このセルラインは、ヒト肝細胞から誘導されたも
ので、プロテインＣを合成することが予め示されたもの
であった（FairおよびBahnak、Blood 64:194〜204、19
84年）。ファージgtllのEco RI部位内に挿入されたcDNA
を含む10のポジティブクローンを単離し、プロテインＣ
遺伝子の５′非コード領域に対応するオリゴヌクレオチ
ドプローブによりスクリーニングした。１のクローンも
このプローブによりポジティブであり、その全ヌクレオ
チド配列を決定した。このcDNAは70bpの５′非翻訳配
列、ヒト−プレプロプロテインＣに対する全コード配
列、および第２ポリアデニレーション部位（第２図）に
対応する全３′非コード領域を含んでいた。
ン１）のアミノ酸−42〜19に相当するエクソンを含むゲ
ノムフラグメントを単離し、ニック翻訳し、Gublerおよ
びHoffmanの技法（Gene 25:263〜269、1983年）によ
り、mRNAを用いて、HEPG2細胞から造成されたcDNAライ
ブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用
いた。このセルラインは、ヒト肝細胞から誘導されたも
ので、プロテインＣを合成することが予め示されたもの
であった（FairおよびBahnak、Blood 64:194〜204、19
84年）。ファージgtllのEco RI部位内に挿入されたcDNA
を含む10のポジティブクローンを単離し、プロテインＣ
遺伝子の５′非コード領域に対応するオリゴヌクレオチ
ドプローブによりスクリーニングした。１のクローンも
このプローブによりポジティブであり、その全ヌクレオ
チド配列を決定した。このcDNAは70bpの５′非翻訳配
列、ヒト−プレプロプロテインＣに対する全コード配
列、および第２ポリアデニレーション部位（第２図）に
対応する全３′非コード領域を含んでいた。
B.発現ベクター造成 プロテインC cDNAの発現がベクターpDX中で達成され
た。このベクターは、pD3（例３に記載）およびpD3′即
ちSV40ポリアデニレーションシグナル（即ち、SV40 Bam
HI〔2533bp〕〜Bcl I〔2770bp〕断片）がレートオリエ
ンテーションにあることを除いてpD3と同一のベクター
から誘導された。従って、pD3′は遺伝子挿入部位とし
てBam部位を含む。
た。このベクターは、pD3（例３に記載）およびpD3′即
ちSV40ポリアデニレーションシグナル（即ち、SV40 Bam
HI〔2533bp〕〜Bcl I〔2770bp〕断片）がレートオリエ
ンテーションにあることを除いてpD3と同一のベクター
から誘導された。従って、pD3′は遺伝子挿入部位とし
てBam部位を含む。
pDXを成生するために、pD3′中のEco RI部位を、Eco
RI開裂、S1ヌクレアーゼとのインキュベーション、およ
び引続くBcl Iリンカーによる連結により、Bcl I部位に
変形した。ポジティブに同定されたコロニーからDNAを
調断し、変化した制限部位を含む1.9kb Xho I−Pst断片
をアガロースゲル電気泳動により調製した。第２の変形
においては、遺伝子を発現ベクター中に挿入するための
位置としてEco RI部位を形成するために、Bcl I開裂pD3
をキナーゼ処理されたEco RI−Bcl Iアダプター（オリ
ゴヌクレオチドZC525、５′GGAATTCT3′、およびZC 52
6、５′GACAGAATTCC3′から造成）と連結した。ポジテ
ィブコロニーを制限エンドヌクレアーゼ分析により同定
し、これからのDNAを用いて変形制限部位を含む2.3kb X
ho I−Pst I断片を単離した。上記の２つのDNA断片をT4
DNAリガーゼととにインキュベートし、E.コリHB101に
形質転換し、制限分析によりポジティブコロニーを同定
した。次いで、pDXと呼ばれる、かかるDNAの調製を行っ
た。このプラスミドは外来性遺伝子の挿入のためのユニ
ークEco RI部位を含む。
RI開裂、S1ヌクレアーゼとのインキュベーション、およ
び引続くBcl Iリンカーによる連結により、Bcl I部位に
変形した。ポジティブに同定されたコロニーからDNAを
調断し、変化した制限部位を含む1.9kb Xho I−Pst断片
をアガロースゲル電気泳動により調製した。第２の変形
においては、遺伝子を発現ベクター中に挿入するための
位置としてEco RI部位を形成するために、Bcl I開裂pD3
をキナーゼ処理されたEco RI−Bcl Iアダプター（オリ
ゴヌクレオチドZC525、５′GGAATTCT3′、およびZC 52
6、５′GACAGAATTCC3′から造成）と連結した。ポジテ
ィブコロニーを制限エンドヌクレアーゼ分析により同定
し、これからのDNAを用いて変形制限部位を含む2.3kb X
ho I−Pst I断片を単離した。上記の２つのDNA断片をT4
DNAリガーゼととにインキュベートし、E.コリHB101に
形質転換し、制限分析によりポジティブコロニーを同定
した。次いで、pDXと呼ばれる、かかるDNAの調製を行っ
た。このプラスミドは外来性遺伝子の挿入のためのユニ
ークEco RI部位を含む。
次に、プロテインC cDNAをEco RI断片としてpDX中に
挿入した。組換プラスミドを制限分析によりスクリーニ
ングしてプロモーター要素に対して正しい方向のプロテ
インＣ挿入部を有するプラスミドを同定し、プラスミド
DNA（pDX/PCと表示される）を正しいクローンから調製
した（第12図）。pDX/PC中のcDNA挿入部は５′非コード
領域中にATGコドンを含むから（第２図）、トランスフ
ェクションおよび発現実験の前にcDNAに対して欠失変異
誘発が行われた。３塩基対の欠失がオリゴヌクレオチド
指令変異誘発の標準操作に従って行われた。変形cDNAを
含むpDXにもとづくベクターをp594と表示した。
挿入した。組換プラスミドを制限分析によりスクリーニ
ングしてプロモーター要素に対して正しい方向のプロテ
インＣ挿入部を有するプラスミドを同定し、プラスミド
DNA（pDX/PCと表示される）を正しいクローンから調製
した（第12図）。pDX/PC中のcDNA挿入部は５′非コード
領域中にATGコドンを含むから（第２図）、トランスフ
ェクションおよび発現実験の前にcDNAに対して欠失変異
誘発が行われた。３塩基対の欠失がオリゴヌクレオチド
指令変異誘発の標準操作に従って行われた。変形cDNAを
含むpDXにもとづくベクターをp594と表示した。
C.cDNA発現 プラスミドp594を燐酸カルシウム沈澱によりCOS細胞
中にトランスフェクトした。４時間後に、新たな培地
（５μg/mlのビタミンＫを補充）を添加した。適当な時
間（通常48または72時間）で、培地を収得し、細胞を回
収し、溶解した。
中にトランスフェクトした。４時間後に、新たな培地
（５μg/mlのビタミンＫを補充）を添加した。適当な時
間（通常48または72時間）で、培地を収得し、細胞を回
収し、溶解した。
培地又は細胞抽出物中に分泌されたプロテインＣを、
ELISAにより、cDNAクローンの初期同定に用いたのと同
一のアフィニティー精製したポリクロナール抗体を用い
て、分析した。分析の結果（第２表）は、プロテインＣ
が実験サンプル中で合成されており、トランスフェクト
された細胞から容易に分泌されたことを示しており、プ
ロテインＣの約90％が培地中に認められた。
ELISAにより、cDNAクローンの初期同定に用いたのと同
一のアフィニティー精製したポリクロナール抗体を用い
て、分析した。分析の結果（第２表）は、プロテインＣ
が実験サンプル中で合成されており、トランスフェクト
された細胞から容易に分泌されたことを示しており、プ
ロテインＣの約90％が培地中に認められた。
組換蛋白のγ−カルボキシル化の程度を評価するため
に、培地のサンプルをクエン酸バリウム沈澱即ち血漿か
らガンマーカルボキシル化蛋白のみを選択的に沈澱させ
るプロセス（Bajaj他、J.Biol.Chem. 256:253〜259、1
981年）に付した。抗原物質の70％以上をクエン酸バリ
ウムにより沈澱させることができた。
に、培地のサンプルをクエン酸バリウム沈澱即ち血漿か
らガンマーカルボキシル化蛋白のみを選択的に沈澱させ
るプロセス（Bajaj他、J.Biol.Chem. 256:253〜259、1
981年）に付した。抗原物質の70％以上をクエン酸バリ
ウムにより沈澱させることができた。
組換プロテインＣを、その凝固を引き延ばす能力を測
定することにより、抗凝固性活性の分析に付した。透析
した培地サンプルをProtac C（American Diagnotica）
により処理してプロテインＣを活性化した。次に、サン
プルをインビトロークロッティングアッセイ（Sugo他、
J.Biol.Chem. 260:10453、1985年）に付し、クロッテ
ィング時間を測定した。組換物質の活性は、天然産のプ
ロテインＣのそれと本質的に同一であることが認められ
た。
定することにより、抗凝固性活性の分析に付した。透析
した培地サンプルをProtac C（American Diagnotica）
により処理してプロテインＣを活性化した。次に、サン
プルをインビトロークロッティングアッセイ（Sugo他、
J.Biol.Chem. 260:10453、1985年）に付し、クロッテ
ィング時間を測定した。組換物質の活性は、天然産のプ
ロテインＣのそれと本質的に同一であることが認められ
た。
以上の説明から、説明のためにこの明細書においては
本発明の特定の態様を記述したけれども、本発明の精神
と範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされ得る
ということが理解されるであろう。従って、本発明は、
特許請求の範囲による場合を除いては、限定して理解さ
れるべきものではない。
本発明の特定の態様を記述したけれども、本発明の精神
と範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされ得る
ということが理解されるであろう。従って、本発明は、
特許請求の範囲による場合を除いては、限定して理解さ
れるべきものではない。
第１図はpHCλ6L中のプロテインC cDNAの部分的制限地
図である。コード領域が中空箱により示されている。 第２図は完全なプロテインC cDNAのヌクレオチド配列及
びプロテインＣの推定されるアミノ酸配列を示す。矢印
は連結（connecting）ジペプチドの除去及びペプチドの
活性化のための開裂部位を示す。 第３図はヒト−プロテインＣをコードするゲノムDNAの
制限酵素地図を示す。線の下の数値は長さをキロベース
（kb）で示す。 第４図はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及びイン
トロンを含む完全ゲノム配列を示す。矢じりはイントロ
ン−エクソン・スプライシング連結部を示す。３′末端
のＡ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ及びＡ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ
のポリアデニレーション又はプロセシング配列箱に囲ま
れており、◆は潜在的な炭水化物付加部位であり； は連結（connecting）ジペプチドのプロセシングのため
の可能性ある開裂部位であり； はプロテインＣが活性化されたプロテインＣに転換さえ
る場合のヘビー鎖中の開裂部位であり；●はポリアデニ
レーション部位である。 第５図はヒト−プロテインＣの構造の概略の二次元モデ
ルを示す。 第６図はプロテインＣの部分的cDNAクローンの５′及び
３′部分のサブクローニングを示す。 第７図は、エクソンＩとエクソンIIとの連結をもたら
す、ゲノムクローンからのイントロンＡの除去を示す。 第８図は第１図のcDNA挿入部の最も５′側部分へのエク
ソンＩ及びIIの融合を示す。 第９図はプロテインＣのための完全コード配列を含んで
成るプラスミドの造成を示す。 第10図は発現ベクターpD7Cを示す。使用されている記号
は、oriアデノウイルス50−１マップユニット配列であ
り;EはSV40エンハンサーであり、;Ad2MLPはアデノウイ
ルス２主要後期プロモーターであり;L1−３はアデノウ
イルス２−３分節系（tripartite）リーダーであり;5′
ssは５′スプライシング部位であり;3′ssは３′スプラ
イシング部位であり;pAはSV40初期ポリアデニレーショ
ンシグナルであり；そして△はpBR322の“ポイゾン”
（poison）配列の除去領域である。 第11図は発現ベクターpD5（PC−DHFRr）を示す。DHFRr
はメトトレキセート耐性変異ジヒドロフォレートラダク
ターゼ遺伝子配列を示し;pAはSV40後期ポリアデニレー
ションシグナルを示す。他の記号は第７図に関して記載
した通りである。 第12図は発現ベクターpDX/pCを示す。使用されている記
号は第11図に関して記載した通りである。
図である。コード領域が中空箱により示されている。 第２図は完全なプロテインC cDNAのヌクレオチド配列及
びプロテインＣの推定されるアミノ酸配列を示す。矢印
は連結（connecting）ジペプチドの除去及びペプチドの
活性化のための開裂部位を示す。 第３図はヒト−プロテインＣをコードするゲノムDNAの
制限酵素地図を示す。線の下の数値は長さをキロベース
（kb）で示す。 第４図はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及びイン
トロンを含む完全ゲノム配列を示す。矢じりはイントロ
ン−エクソン・スプライシング連結部を示す。３′末端
のＡ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ及びＡ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ
のポリアデニレーション又はプロセシング配列箱に囲ま
れており、◆は潜在的な炭水化物付加部位であり； は連結（connecting）ジペプチドのプロセシングのため
の可能性ある開裂部位であり； はプロテインＣが活性化されたプロテインＣに転換さえ
る場合のヘビー鎖中の開裂部位であり；●はポリアデニ
レーション部位である。 第５図はヒト−プロテインＣの構造の概略の二次元モデ
ルを示す。 第６図はプロテインＣの部分的cDNAクローンの５′及び
３′部分のサブクローニングを示す。 第７図は、エクソンＩとエクソンIIとの連結をもたら
す、ゲノムクローンからのイントロンＡの除去を示す。 第８図は第１図のcDNA挿入部の最も５′側部分へのエク
ソンＩ及びIIの融合を示す。 第９図はプロテインＣのための完全コード配列を含んで
成るプラスミドの造成を示す。 第10図は発現ベクターpD7Cを示す。使用されている記号
は、oriアデノウイルス50−１マップユニット配列であ
り;EはSV40エンハンサーであり、;Ad2MLPはアデノウイ
ルス２主要後期プロモーターであり;L1−３はアデノウ
イルス２−３分節系（tripartite）リーダーであり;5′
ssは５′スプライシング部位であり;3′ssは３′スプラ
イシング部位であり;pAはSV40初期ポリアデニレーショ
ンシグナルであり；そして△はpBR322の“ポイゾン”
（poison）配列の除去領域である。 第11図は発現ベクターpD5（PC−DHFRr）を示す。DHFRr
はメトトレキセート耐性変異ジヒドロフォレートラダク
ターゼ遺伝子配列を示し;pAはSV40後期ポリアデニレー
ションシグナルを示す。他の記号は第７図に関して記載
した通りである。 第12図は発現ベクターpDX/pCを示す。使用されている記
号は第11図に関して記載した通りである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 キャスリーン エル．バークナー アメリカ合衆国，ワシントン 98199, シアトル，トゥエンティセカンド アベ ニュ ウエスト 3032 (72)発明者 ドナルド シー．フォスター アメリカ合衆国，ワシントン 98105, シアトル，１，ノースイースト ボート ストリート 1400 (72)発明者 アール ダブリュ．デイビー アメリカ合衆国，ワシントン 98004, ベレブ，ノースイースト トゥエンティ セカンド プレイス 9010 審査官 冨永 みどり (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，81（1984）ｐ．4766−4770
Claims (3)
- 【請求項１】活性化後にヒト−プロテインＣの活性を有
するポリペプチドをコードするDNAであって、次のアミ
ノ酸配列： を有することを特徴とする前記DNA。 - 【請求項２】活性化された後にヒト−プロテインＣの活
性を有するポリペプチドをコードするDNA配列を含んで
成る組換発現ベクターであって、次のアミノ酸配列： を有することを特徴とする、前記組換発現ベクター。 - 【請求項３】プロモーター、これに続き、その下流にあ
る、活性化された後にヒト−プロテインＣの活性を有す
るポリペプチドをコードする前記DNA配列、並びにこれ
に続きその下流にあるポリアデニレーションシグナルを
含有し、前記DNA配列の転写が前記プロモーターにより
指令され、哺乳類宿主細胞のDNAに組み込まれ得る、請
求項２に記載の組換発現ベクター。
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