DE3751269T2

DE3751269T2 - Expression des biologisch aktiven Faktors XIII.

Info

Publication number: DE3751269T2
Application number: DE3751269T
Authority: DE
Inventors: Earl W Davie; Julie Ann Holly; Akitada Ichinose; Gary E Parker; Ronald L Seale
Original assignee: University of Washington; Zymogenetics Inc
Current assignee: University of Washington; Zymogenetics Inc
Priority date: 1986-09-19
Filing date: 1987-09-18
Publication date: 1995-09-14
Anticipated expiration: 2007-09-19
Also published as: ATE121776T1; JP2002223756A; JP2667405B2; EP0268772A2; DK491487D0; EP0268772B1; DK175919B1; JP3077121B2; AU615634B2; JP3299192B2; JP3450844B2; AU7869487A; DK491487A; CA1341577C; JPS63164890A; JPH09327296A; DE3751269D1; JPH11127873A; EP0268772A3

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Faktor XIII und seinen Analogen im allgemeinen, und genauer gesagt, die Expression von biologisch aktivem Faktor XIII und Analogen desselben in transformierten oder transfizierten Wirtszellen.

Hintergrundtechnik

Blutgerinnung ist ein Prozeß, der aus einer komplexen Wechselwirkung verschiedener Blutbestandteile oder -faktoren besteht, die letztendlich zu einem Fibrin-Gerinnsel führt. Allgemein sind die Blutbestandteile, die an dem teilnehmen, was als die Gerinnungs-"Kaskade" bezeichnet worden ist, Proenzyme oder Zymogene, enzymatisch inaktive Proteine, die durch die Wirkung eines Aktivators, selbst ein aktivierter Gerinnungsfaktor, zu proteolytischen Enzymen umgewandelt werden. Gerinnungsfaktoren, die solch eine Umwandlung durchlaufen haben, werden allgemein als "aktivierte Faktoren" bezeichnet und werden durch die Hinzufügung eines "a" bezeichnet (z.B. XIIIa).
Ein Bestandteil des Blutgerinnungssystems ist Faktor XIII (auch bekannt als Fibrin-stabilisierender Faktor, Fibrinoligase oder Plasma-Transglutaminase), ein Plasma-Glykoprotein, das in Blut als ein Proenzym zirkuliert. Während der letzten Stadien der Blutgerinnung wandelt Thrombin die Proenzym-Form von Faktor XIII zu einer Zwischenform um, die dann in der Gegenwart von Calcium-Ionen dissoziiert, um die aktive Form des Enzyms zu produzieren, die als Faktor XIIIa bezeichnet wird. Thrombin katalysiert die Polymerisation von Fibrin durch γ- Dimerisation, gefolgt von α-Polymerisation, was zu einem nicht-kovalenten Fibrin-Gerinnsel führt, das durch Faktor XIIIa zu einem quervernetzten Gerinnsel mit beträchtlicher mechanischer Festigkeit umgewandelt wird (R. Chen & R.F. Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66: 472-479, 1970); J.J. Pisano et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 202: 98-113, 1972). Faktor XIIIa ist eine Transglutaminase, welche die Quervernetzung von Fibrin-Polymeren durch die Bildung von intermolekularen &epsi;(γ- Glutamyl)lysin-Bindungen katalysiert. Diese Quervernetzungsreaktion erfordert das Vorhandensein von Calcium-Ionen (L. Lorand et al., Prof. Hemost. Thromb. 5:245-290, 1980; J.E. Folk und J.S. Finlayson, Adv. Prot. Chem. 31:1-133, 1977).
In vivo katalysiert Faktor XIIIa Quervernetzungsreaktionen zwischen anderen Proteinmolekülen. Zum Beispiel katalysiert Faktor XIIIa auch die Quervernetzung der γ-Kette von Fibrin an α&sub2;-Plasmin-inhibitor und Fibronectin sowie die Quervernetzung von Kollagen und Fibronectin, die mit der Wundheilung in Zusammenhang stehen kann (Y. Sakata und N. Aoki, J. Clin. Invest. 65:290-297, 1980; D.F. Mosher, J. Biol. Chem. 250:6614- 6621, 1975; D.F. Mosher und P.E. Chad, J. Clin. Invest. 64:781-787, 1979; Folk und Finlayson, aaO.; Lorand et al., aaO.). Der kovalente Einbau von α&sub2;-Plasmininhibitor in das Fibrin-Netzwerk kann die Widerstandsfähigkeit des Gerinnsels gegenüber Lyse erhöhen (Lorand et al., aaO.).
In Plasma sind der beste Aminogruppen-Donor und Aminogruppen- Akzeptor für Faktor XIIIa α&sub2;-Plasmininhibitor bzw. Fibrin (T. Tamaki und N. Aoki, J. Biol. Chem. 257:14767-14772, 1982; F. Carmassi und S.I. Chung, Prog. Fibrinolysis 6:281-285, 1983). Mangel in entweder Faktor XIII oder α&sub2;-Plasmininhibitor führen zu "verzögerter Blutung", obgleich die Primärhämostase bei diesen Personen normal ist (Lorand et al., aaO.). So wird eine Rolle für sowohl Faktor XIII als auch α&sub2;-Plasmidinhibitor beim Schutz von Fibrin-Gerinnseln vor der Verdauung durch Plasmin vorgeschlagen.
Faktor XIII(Mr = ~320 kD)-Zymogen zirkuliert im Blut als ein Komplex mit Fibrinogen (C.S. Greenberg und M.A. Shuman, J. Biol. Chem. 257:6096-6101, 1982). Faktor XIII ist ein Tetramer (a&sub2;b&sub2;), das aus zwei a-Untereinheiten (Mr = ~75 kD) und zwei b- Untereinheiten (Mr = ~80 kD) besteht (S.I. Chung et al., J. Biol. Chem. 249:940-950. 1974). Die a-Untereinheit enthält die katalytische Stelle des Enzyms, während die Auffassung besteht, daß die b-Untereinheit die a-Untereinheit stabilisiert oder die Aktivierung von Faktor XIII reguliert (Folk und Finlayson, aaO.; L. Lorand et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 56:914-922, 1974). Während der Aktivierung von Faktor XIII zu Faktor XIIIa führt die Spaltung durch Thrombin zur Freisetzung eines Aktivierungspeptids (Mr = 4 kD) vom Amino-Terminus jeder der a-Untereinheiten (Schwartz et al., J. Biol. Chem. 248: 1395-1407, 1973). Die Aminosäuresequenzen des Aktivierungspeptids und die Region der A-Kette, die die katalytische Stelle enthält, sind bestimmt worden (T. Takagi und R.F. Doolittle, Biochem. 13:750-756, 1974; J.J. Holbrook et al., Biochem. J. 135:901-903, 1973).
Gegenwärtige Behandlungspraktiken für Patienten mit Faktor XIII-Mangel umfassen allgemein Ersetzungstherapie mit Plasma oder Plasmaderivaten oder mit einem Rohplazenta-Faktor-XIII- Konzentrat (Lorand et al., aaO.; Frobisch et al., Dtsch. Med. Wochenschr. 97:449-502, 1972; Kuratsuji et al., Haemostasis 11:229-234, 1982). Dieses Konzentrat erfordert die Verwendung einer relativ großen Menge von diversem menschlichen Plasma oder Plazentagewebe als Ausgangsmaterial. Außerdem ist es schwierig sicherzustellen, daß Konzentrate, die aus gepooltem menschlichen Plasmagewebe gewonnen sind, frei von viraler oder anderer Kontamination sind. Zusätzlich ist die Reinigung von großen Mengen von Plazenta-Faktor XIII-Konzentrat schwierig und teuer.
Vor kurzem ist ein Faktor XIII-Konzentrat bei Patienten mit Störungen der postoperativen Wundheilung (Mishima et al., Chirurg 55:803-808, 1984; Baer et al., Zentrabl. Chir. 105:642-651, 1980) und Skleroderma (Delbarre et al., Lancet 2:204, 1981). Außerdem ist Faktor XIII als eine Komponente von Gewebeklebern verwendet worden (U.S. -Patente 4,414,976; 4,453,939; 4,377,572; 4,362,567 und 4,298,598) und ist zur Verwendung in antifibrinolytischer Therapie zur Prävention von postoperativer Blutung und bei der Behandlung von subarachnoidalem Hämatom, Colitis ulcerosa und allgemeiner Wundheilung vorgeschlagen worden. Diese potentiellen Anwendungen von Zubereitungen von menschlichem Faktor XIII liefern zusätzliche Anreize für die Produktion von rekombinantem Faktor XIII.
Folglich besteht ein Bedürfnis auf diesem Gebiet nach einem Verfahren zur Herstellung von relativ großen Mengen von reinen Zubereitungen von Faktor XIII. Die vorliegende Erfindung befriedigt dieses Bedürfnis durch die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie, die erfolgreich das Problem viraler Kontamination eliminiert und gleichzeitig eine konsistente, homogene und wirtschaftliche Quelle für aktiven Faktor XIII bereitstellt, um Patienten mit Faktor XIII-Mangel und andere zu behandeln.

Offenbarung der Erfindung

Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen, die für Proteine mit im wesentlichen derselben biologischen Aktivität wie Faktor XIII kodieren.
Die Erfindung stellt eine DNA-Sequenz zur Verfügung, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog zur a'-Untereinheit von Faktor XIII ist, wobei die Sequenz die Sequenz von Figur 1 von bp 202 bis bp 2283 umfaßt, sowie eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog zur a'-Untereinheit von Faktor XIII ist, wobei die Sequenz eine DNA-Sequenz umfaßt, die für die Aminosäuresequenz von Figur 1 kodiert, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731.
Zusätzlich ist auch ein Expressionsvektor, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz gemäß dem vorstehenden Absatz folgt, offenbart und beansprucht.
Wirtszellen, die mit einem Expressionsvektor gemäß dem vorstehenden Absatz transfiziert sind, sind ebenfalls offenbart. Die Wirtszelle kann eine prokaryontische Wirtszelle oder eine eurkaryontische Wirtszelle sein, wobei Hefe-Wirtszellen und Säugetier-Wirtszellen besonders bevorzugte eurkaryontische Wirtszellen sind.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins zur Verfügung, das, bei Dissoziation, die biologische Aktivität von Faktor XIIIa besitzt, welches umfaßt:
Einführen eines Expressionsvektors, der einen Transkriptionspromotor, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog zur a'-Untereinheit von Faktor XIII ist, umfassen die Aminosäuresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731, und einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog zur b'-Untereinheit von Faktor XIII ist, in eine Wirtszelle,
Kultivieren besagter Wirtszelle; und
Isolieren des Proteins aus besagter Wirtszelle, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität von Faktor XIIIa, welches umfaßt:
Einführen eines Expressionsvektors, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog zur ap Untereinheit von Faktor XIII ist, umfassend die Aminostouresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731, in Wirtszellen;
Kultivieren besagter Wirtszellen;
Isolieren von Polypeptid aus besagten Wirtszellen; und
Dimerisieren des Polypeptids, um Homodimere zu bilden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Expressionsvektor bereit, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Protein mit der Struktur und biologischen Aktivität der a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII oder der a'-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731, wobei besagte DNA-Sequenz im wesentlichen frei von 3' nicht-translatierten Sequenzen ist, die normalerweise mit besagter DNA-Sequenz assoziiert sind; sowie eine Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transfiziert ist, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Protein mit der Struktur und biologischen Aktivität der a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII oder der a'-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38 und endend mit Methionin, Nummer 731, wobei besagte DNA-Sequenz im wesentlichen frei von 3' nicht-translatierten Sequenzen ist, die normalerweise mit besagter DNA-Sequenz assoziiert sind; und ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität von menschlichem Faktor XIII, welches umfaßt: Einführen eines Expressionsvektors, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Protein mit der Struktur und biologischen Aktivität der a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII oder der a'-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731, wobei besagte DNA-Sequenz im wesentlichen frei von 3' nicht-translatierten Sequenzen ist, die normalerweise mit besagter DNA-Sequenz assoziiert sind; Kultivieren besagter Wirtszelle; und Isolieren des von besagter DNA- Sequenz kodierten Proteins aus besagter Wirtszelle.
Zusätzlich zur Offenbarung von Proteinen, die mit den oben kurz beschriebenen Verfahren hergestellt werden, ist die vorliegende Erfindung auch auf eine Anzahl von pharmazeutischen Zusammensetzungen gerichtet, die eine wirksame Menge eines Proteins, das gemäß jedem der oben kurz beschriebenen Verfahren hergestellt ist, und ein physiologisch annehmbares Trägermittel oder Verdünnungsmittel umfassen.
Andere Aspekte der Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beiliegenden Zeichnungen deutlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 veranschaulicht die Nukleotidsequenz der cDNA, die für die a- und die a'-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII kodiert, und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen dieser Untereinheiten. Die Aminosäuren mit den Nummern -30 bis -1 scheinen eine in-frame-Sequenz darzustellen, während diejenigen mit den Nummern +1 (Serin) bis +731 (Methionin) die Aminosäuren darstellen, die in der reifen a-Untereinheit vorliegen. Die Aminosäuren mit den Nummern +38 (Glycin) bis +731 (Methionin) stellen die Aminosäuren dar, die in der reifen a'-Untereinheit vorliegen.
Die aktive Stelle Cys an Rest +315 ist eingekreist. Der gebogene Pfeil zeigt die Stelle der Spaltung durch eine Verarbeitungsprotease (wie etwa eine MET-Aminopeptidase), die das reife Protein erzeugt, mit einem amino-terminalen Ser. Der gerade Pfeil identifiziert die Spaltungsstelle für die Umwandlung der a-Untereinheit von Faktor XIII in die a'-Untereinheit von Faktor XIII durch Thrombin. Reste, die mit ausgefüllten Rhomben markiert sind, sind potentielle Asn-verknüpfte Glykosylierungsstellen an Asn-X-Ser- oder Asn-X-Thr-Sequenzen. Die offenen Rhomben identifizieren Asn-Reste mit wenig oder keinem Kohlehydrat.
Figur 2 veranschaulicht die Nukleotidsequenz der cDNA, die für die b-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII kodiert, und die vorhergesagte Aminosäuresequenz. Die Aminosäuren mit den Nummern -19 bis -1 stellen einen Teil einer Leader-Sequenz dar, während diejenigen mit den Nummern +1 (Glutamat) bis +641 (Threonin) die Aminosäuren darstellen, die in der reifen b- Untereinheit vorliegen.
Die Aminosäurereste, die mit einem Strich darüber versehen sind, wurden auch durch Aminosäuresequenzanalyse bestimmt. (Die Reste 394, 536, 537 wurden jedoch nicht mit dieser Analyse identifiziert). Reste, die mit ausgefüllten Rhomben markiert sind, sind potentielle Asn-verknüpfte Glykosylierungsstellen an Asn-X-Ser-Sequenzen, während der mit einem offenen Rhombus markierte Rest eine potentielle Asn-verknüpfte Glykosylierungsstelle einer Asn-X-Cys-Sequenz ist. Die Nukleotidsequenzen, die dem Polyadenylierungssignal und dem poly(A)- Schwanz entsprechen, sind in Kästchen dargestellt.
Figur 3 veranschaulicht einen Vergleich der Amimosäuresequenz in den Wiederholungen 4, 5 und 6 der b-Untereinheit von Faktor XIII mit den fünf Wiederholungen im β&sub2;-Glykoprotein I, den drei Wiederholungen in der Ba-Kette von Faktor B von menschlichem Komplement und menschlicher Haptoglobin α¹-Kette. Vier oder mehr identische Reste in derselben Position sind eingekästelt. Lücken wurden eingeschoben, um maximale Ausrichtung zu erhalten. Die Zahlen vor jeder Wiederholung identifizieren die Restenummer der ersten Aminosäure in jeder Wiederholung.
Figur 4 veranschaulicht die Ausrichtung der zehn Aminosäure-Wiederholungen, die in der b-Untereinheit von Faktor XIII vorliegen. Die Wiederholungen wurden in vier Gruppen subklassifiziert, einschließlich Wiederholungen 1, 2 und 3; 4, 5 und 6; 7 und 9; und 8 und 10. Die Zahlen vor jeder Wiederholung identifizieren die Restenummer der ersten Aminosäure in jeder Wiederholung. Zwei oder mehr identische Reste an derselben Position jeder Gruppe von Wiederholungen wurden eingekästelt. Lücken wurden eingeschoben, um maximale Ausrichtung zwischen den zehn wiederholten Segmenten zu erhalten.
Figur 5 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pMVR1.
Figur 6 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pAT-1.
Figur 7 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pTRK4c und seines Derivats pRS185.
Figur 8 veranschaulicht die Konstruktion von pRS201 und die Mutagenesen, die zur Konstruktion der Plasmide pRS202 und pRS203 führen.
Figur 9 veranschaulicht die Konstruktion der Hefe-Expressionsvektoren pRS216 und pRS217.
Figur 10 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid von pRS111, das die Codon-optimierte MFα1-Signalpeptid-Sequenz mit der natürlichen Glu-Ala-Glu-Ala- und HindIII-Sequenz umfaßt.
Figur 11 veranschaulicht die Konstruktion von pRS220 und pRS231.

Beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung

Vor der Darlegung der Erfindung kann es für ein Verständnis derselben hilfreich sein, Definitionen bestimmter Begriffe, die im folgenden verwendet werden sollen, anzugeben.
Biologische Aktivität: Eine Funktion oder ein Satz von Funktionen, die (der) von einem Molekül in einem biologischen Zusammenhang ausgeführt wird (d.h. in einem Organismus oder einer in-vitro-Reproduktion). Biologische Aktivitäten von Proteinen können in katalytische und Effektor-Aktivitäten unterteilt werden. Katalytische Aktivitäten von Gerinnungsfaktoren umfassen allgemein die Aktivierung anderer Faktoren durch die spezifische Spaltung von Vorläufern. Effektor-Aktivitäten schließen spezifische Bindung des biologisch aktiven Moleküls an Calcium oder andere kleine Moleküle, an Makromoleküle, wie etwa Proteine, oder an Zellen ein. Effektor-Aktivität erhöht häufig die katalytische Aktivität unter physiologischen. Bedingungen oder ist hierfür wesentlich. Katalytische und Effektor- Aktivitäten können in einigen Fällen in derselben Domäne eines Proteins liegen.
Wie oben angemerkt, ist die biologische Aktivität von menschlichem Faktor XIII durch seine Fähigkeit gekennzeichnet, Blutgerinnsel durch Quervernetzung von Fibrin-Polymeren durch die Bildung intermolekularer E(γ-Glutamyl)lysin-Bindungen zu stabilisieren. Faktor XIII kann Fibrin auch an andere Moleküle quervernetzen, wie etwa α&sub2;-Plasmininhibitor. Faktor XIII-Zymogen ist ein Tetramer, das aus vier Untereinheiten besteht, zwei a-Untereinheiten und zwei b-Untereinheiten, die durch nicht-kovalente Wechselwirkungen verknüpft sind. Die Disulfidbindungen zwischen den Ketten können bei der a-Untereinheit fehlenl obgleich die b-Untereinheit 20 Disulfidbindungen innerhalb der Kette zu enthalten scheint.
Faktor XIII wird durch eine zweistufige Reaktion aktiviert. Zunächst spaltet Thrombin ein kurzes Peptid (Aktivierungspeptid) von Amino-Terminus jeder der a-Untereinheiten ab, was zur Struktur a'&sub2;b&sub2; führt. Diese Zwischenstruktur dissoziiert in der Gegenwart von Calcium-Ionen, was die inaktive b&sub2;-Untereinheit und die katalytische a'&sub2;-Untereinheit liefert (R.D. Cooke, Biochem. J. 141:683-691, 1974). Man glaubt, daß die b-Untereinheiten die a-Untereinheiten schützen und stabilisieren und im Überschuß in Plasma vorhanden sind. Die a&sub2;-Untereinheit wird in Megakaryocyten, Blutplättchen, Plazenta, Uterus, Milz, Prostata und Makrophagen gefunden (S.I. Chung, aaO.; T.H. Kiesselbach und R.H. Wagner, Ann. N.Y. Acad. Sci. 202:318-328, 1972; P. Henriksson et al., J. Clin. Invest. 76:528-534, 1985; L. Muszbek et al., Thromb. Res. 31:401-410, 1985). Endogene b- Untereinheiten scheinen durch Infusion Zuge führten Plazenta-Faktor XIII in Plasma zu stabilisieren.
Weder die a- noch die b-Untereinheit von Faktor XIII sind von Fachleuten auf diesem Gebiet vor den hierin beschriebenen Arbeiten eingehend sequenziert worden. Die Sequenz des Aktivierungspeptids, das aus der a-Untereinheit freigesetzt wird, sowie die Aminosäuresequenz der Region um die katalytische Stelle der a-Untereinheit sind zuvor berichtet worden (Takagi & Doolittle, aaO.; Holbrook et al., aaO.). Die einzige Aminosäuresequenzinformation, die bisher für die b-Untereinheit von Faktor XIII verfügbar gewesen ist, ist die amino-terminale Sequenz Glu-Glx-Lys-Pro (Takagi und Doolittle, aaO.). Faktor XIII ist somit im Vergleich zu anderen Blutgerinnungsfaktoren sehr schlecht charakterisiert. Als ein Ergebnis ist sehr wenig über die Gene bekannt, die Faktor XIII kodieren.
Die vorliegende Erfindung offenbart DNA-Sequenzen, die für Polypeptide kodieren, die funktionell homolog zu den a-, ap - und b-Untereinheiten von menschlichem Faktor XIII sind. Die vollständigen a- und b-Untereinheiten von menschlichem Faktor XIII und die entsprechenden Aminostouresequenzen der a- und b- Untereinheiten sind offenbart. Der a-Untereinheit fehlen Disulfidbindungen und sie enthält sehr wenig, wenn überhaupt, Kohlehydrat. Zusätzlich ist eine post-translationale Modifikation von Faktor XII die Acetylierung des Amino-Terminus der a- Kette. Biologisch aktiver Faktor XIII kann in prokaryontischen sowie eukaryontischen Zellen exprimiert werden.
cDNA von menschlichem Faktor XIII kann aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek isoliert werden, hergestellt aus einer geeigneten Quelle von Boten-RNA. Eine Quelle von a-Untereinheit- mRNA sind menschliche Plazentazellen. Eine cDNA-Bibliothek aus dieser Quelle kann mit affinitätsgereinigtem Antikörper gegen die a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII und/oder mit einer Oligonukleotidsonde, die einer Aminosäuresequenz des Aktivierungspeptids entspricht, gescreent werden. Eine bevorzugte Quelle von b-Untereinheit-mRNA ist menschliche Leber-mRNA. Eine cDNA-Bibliothek aus dieser Quelle kann mit affinitätsgereinigtem Antikörper gegen die a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII gescreent werden. Wenn unvollständige cDNA-Klone durch dieses Screeningverfahren identifiziert werden, kann es wünschenswert sein, die cDNA-Bibliothek unter Verwendung der 5'- oder 3'-Enden von partiellen Klonen erneut zu screenen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann es wünschenswert sein, Cystein in der Aminosäuresequenz von Faktor XIII durch Serin zu ersetzen. Das Vorhandensein von freien Sulfhydrylgruppen kann zu Oxidation von Faktor XIII führen und so eine unerwünschte Instabilität des Proteins erzeugen. Im allgemeinen kann Cystein unter Verwendung oligonukleotid-gerichteter ortsspezifischer Mutagenese, wie z.B. von Zoller et al. beschrieben (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983; Zoller und Smith, DNA 3:479-488, 1984; Kunkel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492, 1985), durch Serin ersetzt werden. Polymorphe Unterschiede innerhalb der DNA-Sequenzen können existieren und daher stellen die hierin angegebenen Sequenzen ein Beispiel für ein Allel zur Verfügung. Es sollte jedoch angemerkt werden, daß diese polymorphen Unterschiede immer noch zu Polypeptiden führen, die funktionell homolog zu den a-, a'- und b-Untereinheiten von Faktor XIII sind. Die a-Kette von Faktor XIII kann zytoplasmatisch (vs. sekretiert) in Hefe- Wirtszellen produziert werden, aufgrund der Fähigkeit von Hefezellen, aminoterminale Serinreste von zytoplasmatischen Proteinen zu acetylieren, und aufgrund der Knappheit von Disulfidbindungen in der a-Kette. Sekretion der a-Untereinheit von Faktor XIII aus Hefe-Wirtszellen wird jedoch die Reinigung des Proteins erleichtern.
Wenn eine Vollängen-DNA-Sequenz, die ein Polypeptid kodiertl das funktionell homolog zur a-Untereinheit, a'-Untereinheit oder der b-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII ist, erhalten worden ist, wird dann die DNA-Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert. Expressionsvektoren, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, werden außerdem einen Promotor umfassen, der operabel mit der DNA-Sequenz verknüpft ist, die a-, a'- oder b-Polypeptide kodiert. Es ist bevorzugt, daß Expressionsvektoren außerdem einen Replikationsursprung sowie Nukleotidsequenzen umfassen, die Expressionsniveaus regulieren und/oder erhöhen, in Abhängigkeit von der ausgewählten Wirtszelle. Geeignete Expressionsvektoren können aus Plasmiden oder Viren gewonnen werden oder können Elemente von beiden enthalten. Die Selektion geeigneter Vektoren und ihrer Komponenten-Nukleotidsequenzen wird den Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein.
Die a- oder a'-Untereinheit kann auch zusammen mit der b-Untereinheit in einer rekombinanten Zelle exprimiert werden. Zu diesem Zweck werden zwei Expressionseinheiten in die Wirtszelle eingeführt. Die Expressionseinheiten können auf verschiedenen Vektoren mit verschiedenen selektionierbaren Markern oder, vorzugsweise, auf einem einzigen Expressionsvektor liegen. Die letztere Strategie bietet den Vorteil der Bereitstellung gleicher Kopienzahlen der zwei Expressionseinheiten.
Bevorzugte prokaryontische Wirtszellen zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung sind Stämme der Bakterien Escherichia coli, obgleich Bacillus und andere Gattungen ebenfalls brauchbar sind. Techniken zum Transformieren dieser Wirte und zum Exprimieren fremder Gene, die in ihnen kloniert sind, sind auf diesem Gebiet gut bekannt (siehe z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Vektoren, die zur Expression fremder Gene in bakteriellen Wirten verwendet werden, werden im allgemeinen einen selektionierbaren Marker enthalten, wie etwa ein Gen für Antibiotikaresistenz, und einen Promotor, der in der Wirtszelle funktioniert. Geeignete Promotoren schließen die trp- (Nichols und Yanof sky, Meth.Enzymol. 101:155-164, 1983), lac- (Casadaban et al., J. Bacteriol. 143:971-980, 1980) und Phage λ-Promotorsysteme (Queen, J. Mol. Appl. Genet. 2:1-10, 1983) ein. Plasmide, die zum Transformieren von Bakterien brauchbar sind, schließen pBR322 (Bolivar et al., Gene 2:95-113, 1977), die pUC-Plasmide (Messing, Meth. Enzymol. 101:20-77, 1983; Vieira und Messing, Gene 19:259-268, 1982), pCQV2 (Queen, aaO.) und Derivate derselben ein. Plasmide können sowohl virale als auch bakterielle Elemente enthalten.
Eurkaryontische Mikroorganismen, wie etwa die Hefe Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pompe oder Fadenpilze (z.B. Aspergillus spp., Neurospora spp.), können auch als Wirtszellen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Techniken zum Transformieren von Hefe sind in der Literatur gut bekannt und sind z.B. von Beggs (Nature 275:104-108, 1978) beschrieben worden. Aspergillus-Spezies können gemäß bekannten Verfahren transformiert werden, z.B. demjenigen von Yelton et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1740-1747, 1984). Geeignete Hefe-Expressionsvektoren schließen YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1035-1039, 1979), YIP5 (Struhl et al., aaO.), YEp13 (Broach et al., Gene 8:121-133, 1979), pJDB248 und pJDB219 (Beggs, aaO.) und Derivate derselben ein. Solche Vektoren werden im allgemeinen einen selektionierbaren Marker einschließen, wie etwa den Nährstoffmarker LEU2, der Selektion in einem Wirtsstamm ermöglicht, der eine leu2-Mutation trägt, oder können ein "essentielles Gen" als einen selektionierbaren Marker einschließen (Kawasaki und Bell, EP 171 142). Ein solcher bevorzugter essentieller Genmarker ist das POT1-Gen von Schizosaccharomyces pombe, das stabile Plasmid- Erhaltung in einer TPI-defizitären Wirtszelle, die in reichem Medium kultiviert wird, bereitstellt. Bevorzugte Promotoren, die in Hefe-Expressionsvektoren brauchbar sind, schließen Promotoren aus Hefe-Glykolyse-Genen (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:12073-12080, 1980; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434, 1982; Kawasaki, U.S.-Patent Nr. 4,599,311) oder Alkoholdehydrogenase-Genen (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al. (Hrg.), S. 335, Plenum, New York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101:192-201, 1983; Russel et al., Nature 302:652-654, 1983) ein. In dieser Hinsicht sind besonders bevorzugte Promotoren der TPI1-Promotor, der GAL10-Promotor und der ADH2-4c-Promotor. Zusätzlich ist es wünschenswert, ein Transkriptionsterminationssignal, wie etwa den TPI1-Terminator, in den Expressionvektor einzuschließen. Um die Reinigung von Polypeptiden, die in einem Hefe-Transformanten produziert sind, zu erleichtern, kann eine Signalsequenz, vorzugsweise aus einem Hefe-Gen, das ein sekretiertes Protein kodiert, an die Kodierungssequenz für das interessierende Protein gebunden werden. Eine besonders bevorzugte Signalsequenz ist die Präpro-Region des MFα1-Gens (Kurjan und Herskowitz, Cell 30:933- 943, 1982; Kurjan et al., U.S.-Patent 4,546,082). Ein anderes bevorzugtes Signalpeptid ist ein Signalpeptid mit 19 Resten, konstruiert gemäß den Regeln von von Heijne (Eur. J. Biochem. 133:17-21, 1983; J. Mol. Biol. 184:99-105, 1985; Nucleic Acids Res. 14:4683-4690, 1986).
Höhere eurkaryontische Zellen können auch als geeignete Wirtszellen in der vorliegenden Erfindung dienen, wobei kultivierte Säugetierzellen bevorzugt sind. Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugetierzellen werden einen Promotor umfassen, der in der Lage ist, die Transkription eines fremden Gens zu steuern, das in eine Säugetierzelle eingeführt ist. Besonders bevorzugte Promotoren sind der Mäuse-Metallothionein-1(MT-1)- Promotor (Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983) oder der major-late-Promotor von Adenovirus 2. Ebenfalls eingeschlossen in solchen Expressionsvektoren ist ein Polyadenylierungssignal, das flußabwärts der DNA-Sequenz-Insertionsstelle angeordnet ist. Das Polyadenylierungssignal kann dasjenige des klonierten Gens sein oder kann von einem heterologen Gen abgeleitet werden. Andere Sequenzen, wie etwa Verstärker und RNA- Spleißsignale, können ebenfalls eingeschlossen sein. Die Konstruktion von Expressionsvektoren liegt innerhalb der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmannes auf diesem Gebiet.
Klonierte DNA-Sequenzen können dann in kultivierte Zellen durch z.B. Calciumphosphat-mediatisierte Transfektion eingeführt werden (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Coraro und Pearson, Somat. Cell Genet. 7:603, 1981; Graham und Van der Eb, Virol. 52:456, 1973). Ein Niederschlag aus DNA und Calciumphosphat wird gebildet und dieser Niederschlag wird auf die Säugetierzellen aufgetragen. Einige der Zellen nehmen die fremde DNA auf und halten sie innerhalb der Wirtszelle für mehrere Tage. Eine kleine Fraktion dieser Zellen (typischerweise etwa eine in 10&sup4;) integriert die heterologe DNA in das Genom. Um diese Integranten zu identifizieren, wird im allgemeinen ein Gen, das einen selektionierbaren Phänotyp verleiht (ein selektionierbarer Marker), zusammen mit dem interessierenden Gen in die Zellen eingeführt. Bevorzugte selektionierbare Marker schließen Gene ein, die Resistenz gegenüber Medikamenten verleihen, wie etwa Neomycin, Hygromycin und Methotrexat. Selektionierbare Marker können in die Zelle auf einem separaten Expressionsvektor zur selben Zeit wie das interessierende Gen eingeführt werden oder sie können auf demselben Expressionsvektor eingeführt werden. Alternative Transfektionstechniken, wie etwa Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), können ebenfalls verwendet werden.
Die Kopienzahl der integrierten Gensequenz kann durch Amplifikation mit Medikamentenselektion auf den selektionierbaren Marker erhöht werden. Die Medikamentenkonzentration wird schrittweise erhöht, mit Selektion resistenter hellen in jedem Schritt. Durch Selektion auf erhöhte Kopienzahl klonierter Sequenzen können Expressionsniveaus beträchtlich erhöht werden.
Die selektionierten Wirtszellen werden in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet und der rekombinante Faktor XIII kann gemäß Standardverfahren isoliert werden. Kurz gesagt wird Faktor XIII durch DEAE-Cellulose-Chromatographie isoliert, gefolgt von Fraktionierung auf einer Sepharose-6B-Säule. Die Säule wird mit geeignetem Puffer eluiert, wie etwa 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, das 1 mM EDTA enthält. Der aktive Peak wird durch Ausfällung mit 40 % Ammoniumsulfat konzentriert. Alternativ können Verfahren wie Immunaffinitätschromatographie oder HPLC eingesetzt werden.
Eine Anwendung der mit den hierin beschriebenen Verfahren produzierten Proteine ist als pharmazeutische Zusammensetzungen.
Die Proteine können in einer geeigneten Weise gereinigt und formuliert werden, was zu einer geeigneten Konzentration in Relation zum bestimmten zu behandelnden Wirt führt. Physiologisch annehmbare Trägermittel oder Verdünnungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Kochsalzlösung und gepufferte Kochsalzlösung, können ebenfalls eingesetzt werden. Solch eine pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer Anzahl von unterschiedlichen Wegen verabreicht werden. Die Proteine können auch zur Formulierung von Gewebeklebern verwendet werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angeboten.

BEISPIELE

Sofern nicht anders angegeben, wurden molekularbiologische Standard-Verfahren verwendet.
Restriktionsendonukleasen, Exonuklease BAL-31 und T&sub4;-DNA-Ligase wurden von Bethesda Research Laboratories oder New England Biolabs erhalten. Das Klenow-Fragment von Escherichia coli- DNA-Polymerase, bakterielle alkalische Phosphatase, ATP, Desoxynukleotide, Didesoxynukleotidtriphosphate, M13mp10, M13mp11, M13mp18, M13mp19, pUC9 und pUC19 wurden von Bethesda Research Laboratories erhalten. Eine menschliche Plazenta- CDNA-Bibliothek wurde von Clontech Lab., Inc. (Palo Alto, Calif.) erhalten. Na¹²&sup5;I und ³²P-markierte Nukleotide und [α³&sup5;S]dATP wurden von New England Nuclear oder Amersham erhalten. Normales menschliches Plasma wurde geliefert von dem Pacific Northwest Red Cross Blood Service, Portland, Oregon.
Faktor XIII wurde aus menschlichem Plasma gemäß dem Verfahren von C.G. Curtis und L. Lorand, Meth. Enzymol. 45:177-191, 1976, gereinigt. Es wurde in der Gegenwart von Thrombin in Faktor XIIIa umgewandelt und das Thrombin wurden dann durch Hirudin inaktiviert. Die a'- und b-Untereinheiten wurden durch Gelfiltration auf einer Bio-Gel-A-5m-Säule gemäß dem Verfahren von Chung et al., aaO., fraktioniert.
Polyklonale Antikörper gegen die a'-Untereinheit und die b- Untereinheit von Faktor XIII wurden in Kaninchen gezüchtet und die Immunglobulin-Fraktionen wurden gereinigt durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung, DEAE-Sephadex-Säulenchromatographie und Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Sepharose- Säule mit immobilisiertem Antigen.
Oligonukleotide wurden auf einem Model 30A-Synthesizer von Applied Biosystems (Foster City, Calif.) synthetisiert und auf Polyacrylamid-Gelen gereinigt.

BEISPIEL I

Klonierung einer cDNA die die a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII kodiert

A. Screening auf cDNA, die die a-Untereinheit von Faktor XIII kodiert

Eine λgt11-Expressionsbibliothek, die cDNAs enhielt, die aus menschlicher Plazenta-mRNA hergestellt waren, wurde auf die a- Untereinheit von menschlichem Faktor XIII gescreent. Ein ¹²&sup5;I- markierter affinitätsgereinigter Kaninchen-Antikörper (spezifische Aktivität = 6 X 10&sup6; cpm/ug) wurde verwendet, um Filter zu screenen, die Phagen enthielten, plattiert mit einer Dichte von 1,5 X 10&sup5; Plaques pro 150 mm-Platte. Sechs positive Klone wurden durch Screening von ungefähr 3 X 10&sup6; Phagen isoliert und jede positive Phage wurde Plaque-gereinigt.
Plaque-gereinigte Klone wurden dann mit der folgenden ³²P-markierten Oligonukleotidsonde gescreent: 5'CTC CAC GGT GGG CAG GTC GTC CTC G3'. Diese Sonde kodiert für die Aminosäuresequenz von Ala-Glu-Asp-Asp-Leu-Pro-Thr-Val-Glu, die im Aktivierungspeptid der a-Untereinheit vorliegt (Takagi und Doolittle, aaO.). Die Nukleotidsequenz für die Sonde wurde durch Verwendung der häufigsten Codonnutzung für Aminosäuren für eine Anzahl unterschiedlicher menschlicher Proteine ausgewählt (Chen und Barker, Trends in Genetics 1:221-223, 1985). Das Oligonukleotid wurde mit ³²P bis zu einer spezifischen Aktivität von 1,1 X 10&sup8; cpm/ug markiert.

B. DNA-Sequenzierung von cDNA-Inserts

Phagen-DNA wurde hergestellt aus positiven Klonen durch das Flüssigkulturlyseverfahren (T.J. Silhavy et al., in Experiments with Gene Fusions, CSH Laboratory, N.Y., S. 140-141, 1984), gefolgt von Zentrifugation und Ausbilden von Banden auf einem Cäsiumchlorid-Stufengradienten. cDNA-Inserts wurden durch Verdauung der Phagen-DNA mit EcoRI-Endonuklease isoliert und die 5'- und 3'-Enden von jedem Insert wurden sequenziert. Einer der Klone mit einem großen cDNA-Insert (λHFXIIIa3.77, ATCC No. 40261) wurde für weitere Sequenzanalyse ausgewählt. Dieses Insert enthielt drei interne EcoRI-Stellen, was zu vier cDNA-Fragmenten bei Verdauung der Phagen-DNA mit EcoRI führte. Diese Fragmente und mehrere zusätzliche Restriktionsfragmente wurden in Plasmid pUC9 oder pUC19 subkloniert. Zusätzliche Restriktionsfragmente aus anderen cDNA-Inserts wurden in M13mp10, M13mpll, M13mp18 und M13mp19 subkloniert, um überlappende Sequenzen zu erhalten. Die cDNA-Inserts wurden dann mit dem Didesoxy-Verfahren (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977) unter Verwendung von [α³&sup5;S]dATP und Puffergradienten-Gelen (M.D. Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3963-3965, 1983) sequenziert. Verdauungen mit Nuklease BAL-31 wurden durchgeführt, um fünf zusätzliche Fragmente zu erzeugen, die überlappende Sequenzen mit den Eco-RI-Restriktionsfragmenten lieferten.
Die Sequenz von 3.831 Basenpaaren aus diesen überlappenden Klonen und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind in Figur 1 dargestellt. Diese DNA-Sequenz kodiert für die gesamte Aminosäuresequenz der reifen a-Untereinheit von menschlichen Faktor xIII, der im Blut zirkuliert. Die a-Untereinheit besteht aus 731 Aminosäuren, beginnend mit einer amino-terminalen Sequenz aus Ser-Glu-Thr-Ser. Diese amino-terminale Sequenz wurde früher von Takagi und Doolittle, aaO. berichtet. Dem carboxylterminalen Met (Nukleotide 2281-2283) folgen ein Stop-Codon (TGA), 1.535 Basenpaare nicht-kodierende Sequenz und ein potentielles Polyadenylierungs- oder Verarbeitungssignal AATAAA. Die Polyadenylierungssequenz wurde 15 Nukleotide flußaufwärts vom poly(A)-Schwanz aus 10 Nukleotiden lokalisiert. Der poly(A)-Schwanz war nur in einem zweiten cDNA-Klon vorhanden, bezeichnet mit λHFXIIIa3.82.
Das cDNA-Insert in λHFXIIIa3.77 kodiert auch für 30 Aminosäurereste, die eine in-frame-Sequenz zu kodieren scheinen. Spaltung der Bindung zwischen Met und Ser durch eine Verarbeitungsprotease, um reifen Faktor XIII zu liefernl würde eine zusätzliche Verarbeitungsprotease(n) erfordern, um das reife Protein mit einem amino-terminalen Ser zu liefern. Dieser würde eine Acetylierungsreaktion folgen, die zur Bildung von Acetyl-Serin am amino-terminalen Ende des reifen Proteins führen würde (Takagi und Doolittle, aaO.; S. Nakamura et al., J. Biochem. 78:1247-1266, 1975).
Ein Unterschied in der Nukleotidsequenz für die a-Untereinheit von Faktor XIII wurde an drei Positionen gefunden, als ein Vergleich der cDNA-Inserts in Regionen durchgeführt wurde, in denen überlappende Sequenzen erhalten wurden. Die Nukleotide 2038, 2041 und 2727 enthielten A, C bzw. I in λHFXIIIa3.77 (Figur 2), während λHFXIIa3,82 G, G und A in denselben Positionen enthielt. Diese Unterschiede führen zu einer Veränderung in zwei Aminosäuren (Ile 650 und Gln 651 zu Val und Glu) und könnten einen Polymorphismus darstellen, der zur Mikroheterogenität in der a-Untereinheit von Faktor XIII beiträgt (P.G. Board und M. Coggan, Hum. Genet. 59:135-136, 1981).

C. Aminosäuresequenzierung

Aminosäuresequenzanalysen wurden auch an Bromcyan-Fragmenten der a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII durchgeführt. Kurz gesagtl wurden 10 mg Faktor XIII über Nacht gegen 5 % HCOOH dialysiert und das Dialysat wurden mit Ammoniumhydroxid auf pH 4,0 eingestellt. Der Niederschlag, der mit der a-Untereinheit angereichert war (83 % a- und 17 % a'-Untereinheiten) wurde S-carboxymethyliert und mit Bromcyan verdaut. Die resultierenden Fragmente wurden durch Gelfiltration auf einer Sephadex G-50 Superfine-Säule unter Verwendung von 5 % HCOOH getrennt und weiter auf einem Waters-HPLC-System unter Verwendung einer Ultrapore C3-Umkehrphasen- säule (Altex) gereinigt. Der eingesetzte Gradient bestand aus 0,1 % Trifluoressigsäure als einer mobilen Phase und 0,8 % Trifluoressigsäure in 80 % Acetonitril als einem Modifikator der mobilen Phase. Die Säule wurde bei einem Durchfluß von 1,5 ml/min laufengelassen und der Eluent wurde durch Extinktion bei 214 nm überwacht.
Elf der achtzehn Bromcyan-Fragmentel die aus der cDNA erwartet wurden, wurden isoliert. Peptide, die aus der B-Untereinheit stammten (A. Ichinose et al., Biochem. A2: 4633-4638, 1986), wurden leicht identifiziert und von den restlichen Peptiden abgetrennt, die aus der a-Untereinheit stammten. Sequenzanalyse von jedem der gereinigten Bromcyan-Fragmente wurden mit einem automatisierten Sequenator von Beckman, Model 890C, mit dem Verfahren von P. Edman und G. Begg, Eur. J. Biochem. 1:80- 91, 1967, durchgeführt. PTH-Aminosäuren wurden durch komplementäre Umkehrphasensäulensysteme identifiziert (L.H. Ericsson et al., in Solid Phase Methods in Protein Sequence Analysis, A. Previero und M.A. Coletti-Previero (Hrg.), S. 13-142, 1977; J.L. Glajch et al., J. Chromatogr. 318:23-29, 1985). Insgesamt 363 Reste wurden eindeutig identifiziert (Reste mit einem Strich darüber in Figur 1). Diese Aminosäuresequenzen stimmten vollständig überein mit denjenigen, die durch die cDNA vorhergesagt wurden.
Die aus der cDNA vorhergesagte Proteinsequenz schließt sechs potentielle Asn-verknüpfte Glykosylierungsstellen mit einer Sequenz von Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr ein. Diese Asn-Reste sind in den Positionen 17, 46, 541, 556, 613 und 686 angeordnet. Zwei von diesen Asn-Resten haben wenig oder kein Kohlehydrat, da Asn in Position 630 und 686 leicht durch die Aminosäuresequenzanalyse identifiziert wurde. Außerdem wurde Kohlehydrat von Takagi und Doolittle (aaO.) nicht berichtet in Asn 17. Da die a-Untereinheit von Faktor XIII nur 1,5 % Kohlehydrat enthält, ist es auch möglich, daß die Positionen 46, 541 und 556 wenig oder kein Kohlehydrat enthalten könnten. Eine partielle Glykosylierung von einigen dieser Asn-Reste könnte jedoch zur Mikroheterogenitat der a-Untereinheit von Faktor XIII beitragen (Board und Coggan, aaO.).
Die a-Untereinheit von Faktor XIII besteht aus 731 Aminosäureresten mit der folgenden Zusammensetzung: Ala&sub3;&sub7;, Arg&sub4;&sub5;, Asn&sub4;&sub0;, Asp&sub4;&sub7;, 1/2Cys&sub9;, Gln&sub2;&sub7;, Glu&sub4;&sub8;, Gly&sub5;&sub0;, His&sub1;&sub4;, Ile&sub3;&sub9;, Leu&sub4;&sub8;, Lys&sub3;&sub8;, Met&sub1;&sub9;, Phe&sub3;&sub2;, Pro&sub3;&sub3;, Ser&sub4;&sub5;, Acetyl-Ser&sub1;, Thr&sub4;&sub5;, Trp&sub1;&sub5;, Tyr&sub2;&sub9;, Val&sub7;&sub0;. Die relative Molekülmasse des Polypeptidteils des Moleküls wurde zu 80.488 berechnet. Die Addition von 1,5 % Kohlehydrat ergibt eine relative Molekülmasse von ungefähr 81.700 für jede der a-Untereinheiten von menschlichem Faktor XII. Dies steht in guter Übereinstimmung mit dem Wert von 75.000, der durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese geschätzt ist (Chung et al., aaO.).
Die Aktivierung von Faktor XIII durch Thrombin beruht auf der Abspaltung eines Aktivierungspeptids vom Amino-Terminus von jeder der a-Untereinheiten des Moleküls (Schwartz et al., aaO.). Die amino-terminale Sequenz der a-Untereinheit von Faktor XIII, abgeleitet von allen sechs cDNA-Klonen, war dieselbe wie diejenige, die von Takagi und Doolittle (aaO.) berichtet worden ist, mit der Ausnahme eines zusätzlichen Val an Rest 34. Dementsprechend sagen die cDNA-Daten ein Aktivierungspeptid mit 37 statt 36 Aminosäuren vorher. Die a-Untereinheit von Faktor XIII vom Rind enthält einen Leu-Rest in Position 34 statt eines Val und das Aktivierungspeptid ist ebenfalls 37 Aminosäuren lang (Nakamura et al., aaO.).
Der carboxyl-terminale Rest der a-Untereinheit von Faktor XIII wurde als Met identifiziert, welches derselbe ist wie derjenige des Rinder-Moleküls. Sowohl die amino- als auch die carboxyl-terminalen Sequenzen der a-Untereinheit von Faktor XIII sind jedoch vollständig verschieden von denjenigen von Gewebe-Transglutaminase (J.M. Connellan et al., J. Biol. Chem. 249:1093-1098, 1972).
Die Aminosäuresequenzen der aktiven Stellen von Plasma-Faktor XIII und Gewebe-Transglutaminase sind als Gly-Gln-Cys-Trp bzw. Tyr-Gly-Gln-Cys-Trp identifiziert worden (Cooke, aaO.; J.E. Folk und P.W. Cole, J. Biol. Chem. 241:3238-3240, 1966). Die vorliegenden Ergebnisse aus cDNA- und Aminosäuresequenz-Analysen zeigen, daß die Sequenz der aktiven Stelle Tyr-Gly-Gln-Cys-Trp bei Rest Tyr 311 beginnt.
DNA-Sequenzen wurden mit einem Computerprogramm von Textco (W. Lebanon, N.H.) unter Verwendung eines Apple MacIntosh-Computers analysiert. Eine Computer-unterstützte Analyse unter Verwendung eines Dayhoff-Programms (M.O. Dayhoff et al., Meth. Enzymol. 91:524-545, 1983) zeigte, daß die Aminosäuresequenz für die a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII einzigartig ist, und es wurde wenig signifikante Homologie mit irgendeinem anderen Protein gefunden, abgesehen von der aktiven Stelle von Transglutaminase und geringfügiger Sequenzhomologie mit der y-Untereinheit von Acetylcholin-Rezeptor.

BEISPIEL II

Klonierung einer cDNA, die die b-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII kodiert

A. Screening einer cDNA-Bibliothek

Eine λgt11-Expressionsbibliothek, die aus menschlicher LebermRNA hergestellte cDNAs enthielt, wurde auf die b-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII unter Verwendung eines 1251-markierten, affinitätsgereinigten Kaninchen-Antikörpers gescreent. Der gereinigte Antikörper wurde mit Na¹²&sup5;I bis zu einer spezifischen Aktivität von 4 X 10&sup6; cpm/ug markiert und wurde verwendet. um Filter zu screenen, die Phagen enthielten, plattiert mit einer Dichte von 1,5 X 10&sup5; Plaques pro 150 mm- Platte. Neun positive Klone wurden durch Screening von 2 x 10&sup6; Phagen isoliert und jede wurde Plaque gereinigt.

B. DNA-Sequenzierung von cDNA-Inserts

Phagen-DNA wurde hergestellt aus positiven Klonen mit dem Flüssigkultur-Lyseverfahren (Silhavy et al., aaO.), gefolgt von Zentrifugation und Ausbilden von Banden auf einem Cäsiumchlorid-Stufengradienten. Der Klon mit dem größten cDNA-Insert (ungefähr 2,2 Kilobasen) wurde mit λHFXIIIb2.2 bezeichnet und wurde für weitere Studien ausgewählt. Die Phagen-DNA aus λXHFXIIIb2.2 wurde mit EcoRI geschnitten, um das 2,2 kb lange cDNA-Insert zu isolieren. Dieses Fragment wurden in Plasmid pUC9 subkloniert, das durch Verdauung mit EcoRI linearisiert worden war, um Plasmid pUC9b2.2 (ATCC No. 40260) zu konstruieren. Geeignete Restriktionsfragmente aus dem Insert wurden dann in M13mp10 oder M13mp18 zur Sequenzierung mit dem Didesoxyverfahren (Sanger et al., aaO.) unter Verwendung von [α³&sup5;S]dATP und Puffergradientengelen (Biggin et al., aaO.) subkloniert. Gesteuerte Verdauungen mit Nuklease BAL-31 wurden durchgeführt, um geeignete Fragmente zu erzeugen, was überlappende Sequenzen mit den Restriktionsfragmenten lieferte. Alle Sequenzbestimmungen wurden auf beiden DNA-Strängen wenigstens dreimal ausgeführt.
Es wurde festgestellt, daß das cDNA-Insert aus 2.180 Basenpaaren bestand, die für die gesamte Aminosäuresequenz für die b- Untereinheit von Faktor XIII, der im Blut zirkuliert, kodieren (Figur 2). Die reife b-Untereinheit besteht aus 641 Aminosäuren, beginnend mit amino-terminalem Glu (Nukleotide 56-58). Die amino-terminale Sequenz Glu-Glx-Lys-Pro für die b-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII wurde früher von Takagi und Doolittle (aaO.) bestimmt und wurde durch die vorliegende Erfindung verlängert. Dem carboxyl-terminalen Thr (Nukleotide 1979-1981) folgen ein Stop-Codon (TAG), 187 Basenpaare nichtkodierender Sequenz und ein poly(A)-Schwanz mit 9 Basenpaaren. Das Polyadenylierungs- oder Verarbeitungssignal AATAAA wurde 19 Nukleotide flußaufwärts vom poly(A)-Schwanz identifiziert.
Der cDNA-Klon kodiert auch für 19 Aminosäurereste, die einen Teil eines Leader-Peptids darstellen. Die partielle Leader- Sequenz mit 19 Aminosäuren schließt einen typischen hydrophoben Kern und einen Ala-Rest an Position -1 und Leu an Position -3 ein. Diese Reste sind konsistent mit der "-1- und -3-Regel", in der die -1-Position in Signal-Sequenzen überwiegend von Ala besetzt ist (D. Perlman und H.O. Halvorson, J. Molec. Biol. 167:391-409, 1983; G. von Heijne, J. Molec. Biol. 173:243-251, 1984). Aminosäuresequenzanalyse des intakten Proteins wurde dann in einem Beckman-Sequenator ausgeführt und 19 Aminosäuren wurden identifiziert. Dies verlängerte die aminoterminale Sequenz, die ursprünglich von Takagi und Doolittle, aaO, berichtet worden war.

C. Aminosäuresequenzierung

Aminosäuresequenzanalysen wurden auch auf Bromcyan-Fragmenten der b-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII durchgeführt, Faktor XIII wurde gemäß dem Verfahren von Curtis und Lorand aaO., aus menschlichem Plasma gereinigt. Nach Inkubation mit Thrombin wurde die b-Untereinheit von Faktor XIII von der a- Untereinheit durch Gelfiltration getrennt. Die gereinigte b- Untereinheit (10 mg) wurde dann S-pyridylethyliert (M. Friedman et al., J. Biol. Chem. 245:3868-3871, 1970) und mit Bromcyan verdaut. Die resultierenden Fragmente wurden getrennt und gereinigt gemäß dem in Beispiel I.C. oben beschriebenen Verfahren.
Neun der zehn Bromcyan-Fragmente, die aus der Aminosäuresequenz erwartet wurden, die aus der cDNA erhalten wurde, wurden isoliert und entsprachen den Bromcyan-Fragmenten 1-4 und 6-10, numeriert vom amino-terminalen zum carboxyl-terminalen Ende des Proteins (Figur 3). Jedes dieser Fragmente wurde dann einer Aminosäuresequenzanalyse unterzogen, wie in Beispiel I.C. beschrieben, und insgesamt 299 Reste wurden eindeutig identifiziert. Diese Aminosäuresequenzen standen in völliger Übereinstimmung mit denjenigen, die durch die cDNA- und die aminoterminale Sequenzanalyse des intakten Proteins vorhergesagt wurden.
Die b-Untereinheit von Faktor XIII besteht aus 641 Aminosäureresten und hat folgende Zusammensetzung:
Ala&sub1;&sub7;, Arg&sub2;&sub6;, Asn&sub3;&sub0;, Asp&sub2;&sub2;, 1/2Cys&sub4;&sub0;, Gln&sub2;&sub0;, Glu&sub6;&sub0;, Gly&sub4;&sub8;, His&sub1;&sub8;, Ile&sub2;&sub9;, Leu&sub4;&sub7;, Lys&sub4;&sub4;, Met&sub9;, Phe&sub2;&sub0;, Pro&sub4;&sub1;, Ser&sub4;&sub5;, Thr&sub4;&sub4;, Trp&sub1;&sub0;, Tyr&sub4;&sub2;, Val&sub2;&sub9;. Die relative Molekülmasse des Polypeptidteils wurde zu 69.973 berechnet. Die Addition von 8,5 % Kohlehydrat ergibt eine relative Molekülmasse von ungefähr 76.500 für jede der b- Untereinheiten von menschlichem Faktor XIII. Dies steht in guter Übereinstimmung mit dem Wert von 80.000, der durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese geschätzt worden ist (Schwartz et al., aaO.; Chung et al., aaO.).
Die aus der cDNA vorhergesagte Proteinsequenz schließt zwei potentielle Asn-verknüpfte Glykosylierungsstellen mit der Sequenz Asn-Tyr-Ser und Asn-Gly-Ser, beginnend mit den Aminosäureresten 142 bzw. 525, ein. Zusätzlich ist eine dritte potentielle Kohlehydratbindungsstelle in der Sequenz Asn-Arg-Cys, beginnend bei Rest 252, vorhanden. Die Bindung von Kohlehydratketten an Asn-Reste in einer Sequenz Asn-X-Cys wurde zuerst in Protein C von Rindern berichtet (J. Stenflo und P. Fernlund, J. Biol. Chem. 257: 12180-12185, 1982) und später in menschlichem von-Willebrand-Faktor (K. Titani et al., Biochem. 25:3171-3184, 1986). Die unterschiedliche Glykosylierung dieser Asn-Reste kann teilweise verantwortlich für die Mikroheterogenität der b-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII sein (C.G. Curtis et al., Biochem. 13:3774-3780, 1974; P.G. Board, Am. J. Hum. Genet. 32:348-353, 1980). The 20 potentiellen Disulfidbindungen, die durch die cDNA identifiziert worden sind, die für die b-Untereinheit von Faktor XIII kodiert, stehen in ziemlich guter Übereinstimmung mit dem 16 bis 17 Disulfidbindungen, über die früher berichtet wurde (Chung et al., aaO.), Der b-Untereinheit von Faktor XIII fehlen freie-SH-Gruppen.
Die Aminosäuresequenz der b-Untereinheit von Faktor XIII zeigt das Vorliegen beträchtlicher interner Gen-Duplikation, die 10 repetitive Sequenzen mit ungefähr 60 Aminosäuren umfaßt. Die repetitiven Sequenzen wurden in vier getrennte Gruppen unterklassifiziert (Figur 4). Die Identitäten innerhalb der Gruppen 1, 2, 3 und 4 betrugen 34-42 %, 34-42 %, 38 % bzw. 41 %. Obgleich die Identitäten unter den vier Gruppen von Wiederholungen offensichtlich geringer sind als jede interne Identität, zeigen hohe Ausrichtungsbewertungen unter Verwendung des Dayhoff-Programms (Dayhoff et al., aaO.), daß diese vier Gruppen sich von einem Prototyp aus entwickelt haben. Zum Beispiel waren die Ausrichtungsbewertungen 7,7 zwischen den Wiederholungen 3 und 4, 12,1 zwischen den Wiederholungen 5 und 7 und 3,4 zwischen den Wiederholungen 6 und 8. Die 10 Wiederholungen (1-10) sind aufeinanderfolgend über 98 % des Moleküls ausgerichtet und schließen die Aminosäurereste 1 bis 626 ein. Eine kurze Sequenz mit 15 Aminosäuren (Reste 627 bis 641) im Anschluß an die letzte Wiederholung am Carboxyl-Ende des Moleküls war nicht homolog mit den Wiederholungen 1-10.
Computer-unterstützte Analyse unter Verwendung eines Dayhoff-Programms zeigte, daß die wiederholten Sequenzen der b-Untereinheit von Faktor XIII Mitglieder einer Familie von Wiederholungen sind, die sehr ähnlich zu den drei wiederholten Sequenzen sind, die in der Ba-Kette von Faktor B von menschlichem Komplement vorliegen (J.E. Mole et al., J. Biol. Chem. 259:3407-3412, 1984), fünf wiederholten Segmenten in menschlichem β&sub2;-Glykoprotein I (J. Lozier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3640-3644, 1984) [ein Protein, das dentisch ist zu aktiviertem Protein C-Bindungsprotein (W.M. Canfield und W. Kisiel, J. Clin. Invest. 70:1260-1272, 1982)] und menschlicher Haptoglobin-α¹-Kette (A. Kurosky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA in 77:3388-3392, 1980). Diese Sequenzhomologie ist in Figur 3 dargestellt. Das vierte Segment des β&sub2;-Glykoproteins I, das zweite Segment von Komplement-Faktor Ba und menschliche Haptoglobin-α¹-Kette zeigen die höchsten Ausrichtungsbewertungen (11, 8,0 bzw. 4,2) mit Wiederholung 6 der b-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII. Diese Daten zeigen, daß diese vier Proteine eine gemeinsame Herkunft teilen und möglicherweise während der Evolution aus einem Exon-Shuffling entstanden sind.
Die Anordnung von fünf Disulfidbindungen in den fünf homologen Segmenten in β&sub2;-Glykoprotein I ist bestimmt worden, und es ist gezeigt worden, daß sie zwischen den ersten und dritten und den zweiten und vierten Cys-Resten in jedem Segment auftreten (Lozier et al., aaO.). So scheint es wahrscheinlich, daß eine ähnliche Paarung mit den Disulfidbindungen in den zehn Wiederholungen in der b-Untereinheit von Faktor XIII auftritt.

BEISPIEL III

Klonierung und Subklonierung von Promotoren

A. Konstruktion von pMVR1

Plasmid pMVRI, das als die Quelle für den TPI1-Promotor in anschließenden Vektorkonstruktionen verwendet wird, umf aßt den TPI1-Promotor, eine Alpha-1-Antitrypsin(AAT)-cDNA und den TPI1-Terminator im Vektor pIC7RI*. Plasmid pMVR1 wurde wie folgt konstruiert (Figur 5). Plasmid pIC7 (Marsh et al., Gene 32: 481-486, 1984) wurde mit Eco RI verdaut, die Fragmentenden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment stumpfendig gemacht und die lineare DNA unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase rezirkularisiert. Das resultierende Plasmid wurde verwendet, um E coli- Stamm RRI zu transformieren. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten hergestellt und auf den Verlust der EcoRI-Stelle gescreent. Ein Plasmid mit dem richtigen Restriktionsmuster wurde mit pIC7RI* bezeichnet. Das TPI1-Promotorfragment wurde aus Plasmid pTPIC10 (Alber und Kawasaki, aaO.)erhalten. Dieses Plasmid wurde an der einzigen Kpn I-Stelle innerhalb des TPI1- Gens geschnitten und die TPI1-Kodierungsregion wurde durch Behandlung mit Nuklease BAL-31 entfernt. Kinasierte Eco RI- Linker (GGAATTCC) wurden zum Fragment zugegeben, das dann mit Bgl II und Eco RI verdaut wurde, um ein 0,9 kb langes TPI1- Promotorfragment zu liefern. Dieses Fragment wurde an Plasmid YRp7' (Stinchcomb et al., Nature 282:39-43, 1979) gebunden, das mit Bgl II und Eco RI geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid, pTE32, wurde mit Eco RI und Bam HI gespalten, um einen Teil des Tetracyclinresistenz-Gens zu entfernen. Das linearisierte Plasmid wurde dann durch die Addition eines kinasierten Eco RI-Bam HI-Oligonukleotid-Adaptors (5' AAT TCA TGG AG 3' und 5' GAT CCT CCA TG 3') rezirkularisiert. Das resultierende Plasmid, pTEA32, wurde mit Bgl II und Eco RI verdaut, um das 900 bp lange TPI1-Promotorfragment zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit pIC19H (Marsh et al., aaO.) verknüpft, das durch Verdauung mit Bgl II und Eco RI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid wurde mit pICTPI bezeichnet. Plasmid pFATPOT (hinterlegt als ein S. cerevisiae- Transformant in Stamm E18, ATCC No. 20699) wurde mit Sph I und Hind III verdaut, um das 1.750 bp lange Fragment zu isolierenen, das den partiellen TPI1-Promotor, eine cDNA, die menschliches Alpha-1-Antitrypsin kodiert, und den TPI1-Terminator umfaßt. Plasmid pICTPI wurde mit Nar I und Sph I verdaut, um das 1,1 kb lange Fragment zu isolieren, das den partiellen TPI1-Promotor und die lacZ'-Kodierungssequenz umfaßt. Plasmid pIC7RI* wurde mit Hind III und Nar I verdaut, um das 2,5 kb lange Vektorfragment zu isolieren. Das pIC7RI*-Fragment, das partielle TPI1-Promotorfragment, gewonnen aus pICTPI, und das 1,75 kb lange Fragment, gewonnen aus Plasmid pFATPOT, wurden in einer dreiteiligen Ligation verknüpft, um Plasmid pMVR1 herzustellen.

B. Konstruktion von pTRK4c

Der ADH2-4C-Promotor wurde aus den Plasmiden pBR322-ADR2-BSa (V.M. Williamson et al., Cell 23:605-614, 1981) und YRp7-ADR3- 4C (D.W. Russell et al., aaO.) gewonnen. Eine Eco RI-Stelle wurde genau 3' zum Translationsstartcodon des ADH2-Promotors gelegt, gewonnen aus Plasmid pBR322-ADR2-BSa durch in-vitro- Mutagenese. Im Anschluß an die Mutagenese wurden 5'-Flankierungssequenzen, die den ADH2-4C-Phänotyp verleihen, verwendet, um die analogen Sequenzen des ADH2-Promotors zu ersetzen. Das 2,2 kb lange Bam HI-Fragment aus pBR322-ADR2-BSa, das das ADH2-Strukturgen und 5'-Flankierungssequenzen enthielt, wurde mit M13mp19 ligiert, das mit BamHI linearisiert worden war. Die Orientierung des Inserts wurde durch Restriktionsanalyse bestimmt. Einzelsträngige Matrizen-DNA wurde aus dem resultierenden Phagenklon hergestellt. Ortsspezifische in-vitro-Mutagenese (M.J. Zoller und M. Smith, DNA 3:479-488, 1984) wurde auf der Matrize durchgeführt, unter Verwendung von Oligonukleotid ZC237 (Tabelle 1), für das Loop-out des Strukturteils des ADH2-Gens, unter Verschmelzen der 5'-Flankierungssequenz, einschließlich des Translationsstartsignals mit der Eco RI- Stelle des M13mp19-Polylinkers. Die Replikativform der mutagenisierten Phage wurde hergestellt und mit Bam HI und Eco RI geschnitten, um das 1,2 kb lange Promotorfragment zu isolieren. Dieses Fragment wurde in pUC13 ligiert, das durch Verdauung mit Bam HI und Eco RI linearisiert worden war, um Plasmid p237WT zu erzeugen. Um den p237WT-Promotor zur "Promotor-up"- Mutante ADH2-4C umzuwandeln, wurde ein 1,1 kb langes Bam HI-Sph I-Teilpromotorfragment aus YRp7-ADR in das Vektorfragment von p237WT subkloniert, das mit Bam HI und Sph I geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid wurde mit p237-4C bezeichnet. Tabelle 1
Bezugnehmend auf Figur 6, wurde der ADH2-Promotor aus p237WT modifiziert, um einen "universellen" ADH2-Promotor zu schaffen. Der Promotor wurde zunächst in Plasmid pCPOT (hinterlegt bei ATCC als ein Transformant von E. coli-Stamm HB101, ATCC No. 39685) subkloniert, das die gesamte 2-Mikron-Plasmid-DNA, das leu2-d-Gen, pBR322-Vektorsequenzen und das Schizosaccharomyces pompe-POT1-Gen umfaßt. Plasmid pCPOT wurde vollständig mit Bam HI und Sal I verdaut, um das ungefähr 10 kb lange lineare Vektorfragment zu isolieren. Plasmid pMVR1 (Beispiel III.A.) wurde mit Eco RI und Xho I geschnitten, um das 1,5 kb lange AAT-cDNA-TPI1-Terminatorfragment zu isolieren. Das 1,2 kb lange ADH2-Promotorfragment wurde aus Plasmid p237WT als ein Bam HI-Eco RI-Fragment isoliert und mit dem 1,5 kb langen AAT-cDNA-TPI1-Terminatorfragment und dem linearisierten pCPOT in einer dreiteiligen Ligation ligiert, um das Plasmid zu liefern, das mit pAT-1 bezeichnet wurde.
Der in Plasmid pAT-1 vorliegende ADH2-Promotor wurde dann modifiziert, um einen "universellen" Promotor zu schaffen, indem das Translationsstartcodon entfernt und der Promotor an eine Eco RI-Stelle gebunden wurde. Plasmid pAT-1 wurde mit Sph I und Bam HI verdaut, um das 190 bp lange Fragment zu isolieren, das den ADH2-Promotor von der Sph I-Stelle bis zur Bam HI- Stelle der AAT-cDNA umfaßte. Dieses Fragment wurde in M13mp18 ligiert, das durch Verdauung mit Bam HI und Sph I linearisiert worden war. Ein positiver Klon wurde durch Restriktionsanalyse bestätigt. Matrizen-DNA wurde aus dem positiven Klan hergestellt. Oligonukleotid ZC410 (Tabelle 1) wurde konstruiert, um das ADH2-Translationsstartsignal und die pUC18-Polylinkersequenzen zu ersetzen durch eine einzige Eco RI-Stelle, verknüpft mit dem M13mp18-Polylinker an der Sma I-Stelle. Die Matrize wurde einer in-vitro-Mutagenese unter Verwendung der Zwei-Primer-Methode (Zoller und Smith, aaO., 1984) unter Verwendung der Oligonukleotide ZC410 und ZC87 (Tabelle 1) unterzogen. Positive Klone wurden durch Didesoxysequenzierung durch den Fusionspunkt hindurch bestätigt. Zur Erleichterung der Manipulation wurde das 175 bp lange mutagenisierte Sph I-Eco RI-Promotorfragment in pUC19 ligiert, das mit Sph I und Eco RI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid, bezeichnet mit p410ES, umfaßte den 3'-Teil eines "universellen" ADH2-Promotors.
Ein "universeller" ADH2-4C-Promotor wurde unter Verwendung des mutagenisierten ADH2-Promotorfragmentes aus p410ES und des ADH2-4C-Promotorfragmentes aus p237-4C konstruiert. Plasmid p410ES wurde mit Sph I und Eco RI verdaut, um das 175 bp lange partielle ADH2-Promotorfragment zu isolieren. Plasmid p237-4C wurde mit Bam HI und Sph I geschnitten, um das 1 kb lange partielle ADH2-Promotorfragment zu isolieren. Der ADH2-4C-Promotor wurde in einer dreiteiligen Ligation mit dem Bam HI-Sph I-Promotorfragment aus p237-4C, dem Sph I-Eco RI-Promotorfragment aus p410ES und pUC13, das durch Verdauung mit Bam HI und Eco RI linearisiert worden war, rekonstruiert. Das resultierende Plasmid, p410-4C, umfaßte einen "universellen" ADH2-4C- Promotor.
Wie veranschaulicht in Figur 7, wurde der "universelle" Promotor aus Plasmid p410-4C verwendet, um den TPI1-Promotor, der in Plasmid pMVR1 vorliegt (Beispiel III.A) , zu ersetzen. Plasmid p410-4C wurde mit Bam HI und Eco RI geschnitten, um das 1,2 kb lange ADH2-4C-Promotorfragment zu isolieren. Plasmid pMVRI wurde mit Bam HI und Eco RI geschnitten, um das 1,2 kb lange ADH2-4C-Promotorfragment zu isolieren. Plasmid pMVR1 wurde vollständig mit Eco RI verdaut und partiell mit Bgl II verdaut, um das 4,2 kb lange AAT-TPI1-Terminator-Vektorfragment zu isolieren. Diese zwei Fragmente wurden ligiert, um das mit pTRK4c bezeichnete Plasmid zu bilden.

BEISPIEL IV

Konstruktion des Vektors pEAS102

Plasmid pEAS102, das Teile der Vektoren YIp5 und pJDB207 umfaßt, wurde wie folgt konstruiert. Plasmid pJDB207 (J.D. Beggs, Proceedings of Alfred Benzon Symposium 16:383-389, "Molecular Genetics in Yeast," Kopenhagen, Dänemark, 1981), ein Derivat von pJDB219 (J.D. Beggs, Nature 275:104-108, 1978), wurde mit Bam HI und Pst I verdaut, um das 4,4 kb lange Fragment zu isolieren, das das leu2-d-Gen und 2-Mikron-DNA und pBR322-Sequenzen umfaßt. Plasmid YIp5 (Struhl et al., aaO.) wurde partieller Verdauung mit Pst I und vollständiger Verdauung mit Bam HI unterzogen, um das 4,3 kb lange Fragment zu isolieren, das das URA-Gen und pBR322-Sequenzen umfaßt. Diese zwei Fragmente wurden ligiert und das resulierende Plasmid wurde mit pEAS102 bezeichnet (veranschaulicht in Figur 9).

BEISPIEL V

Expression der a-Untereinheit von Faktor XIII in Hefe

A. Konstruktion von pRS202

Die cDNA der a-Untereinheit von Faktor XIII (asFXIII) wurde durch in-vitro-Mutagenese modifiziert, um die 3'-Nichtkodierungsregion durch eine Xho I-Stelle zu ersetzen (Figur 8). Zur Erleichterung der Manipulation wurde das 3,8 kb lange asFXIII- cDNA-Insert, das in Phagenklon λHFXIIIa3.82 enthalten war, in pUC18 subkloniert. Der Phagenklon λHFXIIIa3.82 wurde vollständig mit Pst I verdaut, um das 2,3 kb lange Fragment zu isolieren, das die asFXIII-cDNA umfaßte. Dieses Fragment wurde mit pUC18 ligiert, das durch Verdauung mit Pst I linearisiert worden war. Es wurde festgestellt, daß das resultierende Plasmid, pUC18 #9, das 2,3 kb lange Pst I-Insert in der anti-sense-Orientierung besaß. Das asFXIII-cDNA-Insert, das in pUC18 #9 vorlag, umfaßte 19 bp 5' zum Translationsstart, die asFXIII-Kodierungsregion und 120 bp 3' zum Translationsstop.
Das asFXIII-cDNA-Insert wurde dann isoliert und in den Vektor pUC118 (erhalten von J. Vieira und J. Messing, Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, Piscataway, NJ) subkloniert. Das 2,3 kb lange asFXIII-Insert wurde durch Verdauung mit Pst I aus pUC18 #9 isoliert, in die pUC118-Pst I-Stelle subkloniert und in E. coli-Stamm JM109 transformiert. Ein positiver Klan, der das 2,3 kb lange asFXIII-Insert in der anti-sense- Orientierung enthielt, wurde mit pRS201 bezeichnet.
Die 120 bp lange 3' nicht-translatierte Region der asFXIII- cDNA wurde entfernt und eine Xho I-Stelle 3' zum Translationsstopcodon durch ortsgerichtete Mutagenese inseriert. Plasmid pRS201 wurde in E. coli-Stamm MV1193 transformiert und einzelsträngige Matrizen-DNA wurde isoliert. Oligonukleotid ZC1113 (Tabelle 1) wurde konstruiert, um die 3' nicht-translatierte Region im Anschluß an die asFXIII-Kodierungssequenz zu entfernen und eine Xho I-Stelle 3 zum Translationsstop einzuführen. Die einzelsträngige Matrize von pRS201 wurde einer in-vitro- Mutagenese mit dem Verfahren von Zoller und Smith (1984, aaO.) unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids ZC1113 unterzogen. Ein positiver Klonl der durch Restriktionsanalyse bestätigt wurde, wurde mit pRS202 bezeichnet.

B. Konstruktion von Plasmid pRS217

Wie in Figur 9 dargestellt, wurde das 2,2 kb lange asFXIII- cDNA-Fragment aus Plasmid pRS202 hinter den ADH2-4C-Promotor gelegt und in Plasmid pEAS102 gelegt (Beispiel IV). Plasmid pTRK4c (Beispiel III.B.) wurde vollständig mit Eco RI und Sal I verdaut, um das 4 kb lange Fragment zu isolieren, das den ADH2-4C-Promotor, den TPI1-Terminator und die pIC7RI* -Vektorsequenzen umfaßte. Die Oligonukleotide ZC1056 und ZC1057 (Tabelle 1) wurden konstruiert, um einen Adaptor mit einem Eco RI- Adhäsivende, einer Bgl II-Stelle und einem Pst I-Adhäsivende zu bilden. Das Eco RI-Adhäsivende des Adaptors zerstört, bei Ligation an ein anderes Eco RI-Adhäsivendel die Eco RI-Stelle. Die Oligonukleotide ZC1056 und ZC1057 wurden kinasiert und anneliert, um den Eco RI-Adaptor zu bilden. Das 2,2 kb lange Pst I-Xho I-asFXIII-Fragment, das aus Plasmid pRS202 isoliert worden war (Beispiel V.A.), wurde mit dem ZC1056/1057-Adaptor und dem 4 kb langen pTRK4c-Fragment in einer dreiteiligen Ligation verknüpft. Das resultierende Plasmid wurde mit pRS215 bezeichnet.
Die Expressionseinheit, die in pRS215 vorliegt, wurde in den Hefevektor pEAS102 gelegt. Plasmid pEAS102 wurde vollständig mit Hind III verdaut, gefolgt von einer Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase, um Rezirkularisierung zu verhindern. Plasmid pRS215 wurde mit Hind III verdaut, um die 3,5 kb lange Expressionseinheit zu isolieren, die den ADH2-4C-Promotor, die asFXIII-cDNA und den TPI1-Terminator umfaßt. Diese zwei Fragmente wurden miteinander ligiert, um Plasmid pRS217 zu schaffen.
Plasmid pRS217 wurde in Saccharomyces cerevisiae-Stamm XV794- 7-IC (MATa ade2-1 leu2-3 leu2-113 ura3 Δpep4::TPI1-CAT cir&spplus;) unter Verwendung des Verfahrens, das im wesentlichen von Beggs beschrieben ist (Nature 275:104-108, 1978), transformiert. Transformanten wurden auf die Fähigkeit selektioniert, auf synthetischem Medium zu wachsen, dem Uracil fehlte (-UraD).
Expression der a-Untereinheit von Faktor XIII aus dem pRS217- Plasmid, transformiert in den Stamm XV794-7-1C, wurde erreicht, indem die Transformanten zunächst über Nacht in 5 ml - UraD gezüchtet wurden. Die Übernacht-Kulturen wurden in 1 Liter -UraD eingeimpft und für 48 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die Kulturen wurden zentrifugiert, um die Zellpellets zu ernten, die einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei -80ºC aufbewahrt wurden.
Die Zellpellets wurden auf aktive a-Untereinheit von Faktor XIII getestet, wie beschrieben in Beispiel XI. XV794-7-1C-Zellen, die mit pRS217 transformiert worden waren, produzierten 50 mg/l a-Untereinheit von Faktor XIII.

C. Konstruktion von Plasmid pRS216

Wie in Figur 9 dargestellt, wurde das 2,2 kb lange asFXIII- cDNA-Fragment aus Plasmid pRS202 hinter den TPI1-Promotor gelegt und in Plasmid pEAS102 (Beispiel IV) inseriert. Plasmid pMVR1 (Beispiel III.A.) wurde vollständig mit Eco RI und Sal I verdaut, um das 3,7 kb lange Fragment zu isolieren, das den TPI1-Promotor, den TPI1-Terminator und die pIC7RI* -Vektorsequenzen umfaßt. Plasmid pRS202 (Beispiel V.A.) wurde mit Pst I und Xho I verdaut, um das 2,2 kb lange asFXIII-Fragment zu isolieren. Das 2,2 kb lange asFXIII-Fragment, der kinasierte und annelierte ZC1056/1057-Adaptor (Beispiel V.B.) und das linearisierte pMVR1 wurden in einer dreiteiligen Ligation verknüpft, um Plasmid pRS214 zu schaffen.
Die in pRS214 vorliegende Expressionseinheit wurde in den Hefevektor pEAS102 gelegt. Plasmid pEAS102 wurde durch Verdauung mit Hind III linearisiert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, um Rezirkularisierung zu verhindern. Plasmid pRS214 wurde mit Hind III verdaut, um die 3,2 kb lange Expressionseinheit zu isolieren, die den TPI1-Promotor, die asFXIII-cDNA und den TPI1-Terminator umfaßt. Diese zwei Fragmente wurden miteinander ligiert, um das Plasmid pRS216 zu schaffen.
Hefe-Wirtszellen wurden transformiert und gezüchtet, wie oben beschrieben. XV794-7-1C, transformiert mit pRS216, produzierte 10 mg/l aktive a-Untereinheit von Faktor XIII, wie getestet in Beispiel XI.

BEISPIEL VII

Sekretion der a-Untereinheit von Faktor XIII aus Hefe

A. Konstruktion von Plasmid pRS203

Um Expressionseinheiten zu konstruieren, die in der Lage sind, die Sekretion des Proteins der a-Untereinheit von FXIII zu steuern, wurde die asFXIII-cDNA verändert, um eine Hind III- Stelle 3' zur Translationsstartstelle für die Insertion von Sekretionssignalsequenzen zu inserieren. Oligonukleotid ZC1206 (Tabelle 1) wurde konstruiert, um die 19 bp 5'-translatierte DNA zu entfernen und eine Hind III-Stelle 3' zur Translationsstartstelle zu inserieren. Einzelsträngige Matrizen-DNA wurde aus E. coli-Stamm MV1193, transformiert mit pRS202 (Beispiel V.A.), hergestellt. Die Matrize wurde einer in-vitro-Mutagenese unter Verwendung von ZC1206 und des von Zoller und Smith (1984, aaO.) beschriebenen Verfahrens unterzogen. Ein positiver Klan, der durch Restriktionsanalyse bestätigt wurde, wurde mit pRS203 bezeichnet (Figur 8).

B. Konstruktion von optimierter MFα1

Die Codon-optimierte MFα1-Signalpeptidsequenz wurde aus einem Expressionsvektor erhalten, der das Gen für den Insulinvorläufer B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) (Markussen et al., EP 164,529) enthielt. Ein Eco RI-Xba 1-Fragment, welches das MFα1-Signalpeptid und Insulinsequenzen aus pMT610 (Markussen et al., aaO.) umfaßte, wurde in mit Eco RI, Xba I verdauten pUCII8 kloniert (Figur 10) und einzelsträngige Matrizen-DNA wurde hergestellt. Diese Matrize wurde dann unter Verwendung des von Zoller und Smith (1984, aaO.) beschriebenen Verfahrens unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids ZC862 (Tabelle I) mutagenisiert. Die Mutagenese führte zur Schaffung einer Sst I-Stelle am 3'-Ende der MFα1-Signalpeptidsequenz. Ein positiver Klan, der eine Sst I-Stelle 3' zur MFα1-Signalpeptidsequenz enthielt, wurde ausgewählt und mit pKP23 bezeichnet. Die MFα1-Signalpeptidsequenz wurde aus Plasmid pKP23 entfernt und in pIC19H (Marsh et al., Gene 31:481-485, 1984) subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit pKP24 bezeichnet.
Plasmid pB12, das den TPI1-Promotor; die MFα1-Signalpeptidsequenz; eine DNA-Sequenz, die die B-Kette von menschlichem PDGF kodiert; den TPI1-Terminator und die pIC19H-Vektorsequenzen umfaßt, wurde mit Eco RI und Xba I verdaut, um das Fragment zu isolieren, das das MFα1-Signalpeptid und die B-Kette von PDGF kodiert. Plasmid pK10, das die TPI1-Promotor-MFα1-Signalsequenz-V-SIS-TPI1-Terminator-Expressionseinheit, inseriert in einen pBR322-Vektor, dem eine Eco RI-Stelle fehlt, umfaßt, wurde mit Eco RI und Xba I verdaut, um die MFα1-Signalsequenz und die Sequenz der B-Kette zu entfernen. Das Vektorfragment von pKP10 wurde mit dem aus Plasmid pB12 gewonnenen Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid pKP26 wurde mit Eco RI und Sst I verdaut, um das Fragment zu isolieren, das den TPI1-Promotor, die V-SIS-Sequenz, den TPI1-Terminator und die pBR322- Vektorsequenzen umfaßt. Plasmid pKP24 wurde mit Eco RI und Sst I verdaut, um das Fragment zu isolieren, das die Codon-optimierte MFα1-Signalpeptidsequenz kodiert. Das Fragment, das das Kodon-optimierte MFα1-Signalpeptid kodiert, und das Eco RI-Sst I-Vektorfragment von pKP26 wurden verknüpft, um Plasmid pKP28 zu schaffen.
Die Sst I-Stelle, die in die MFα1-Signalpeptidsequenz eingeführt worden war, um die Konstruktion von pKP28 zu erleichtern, wurde dann entfernt, um die Wildtyp-Kodierungssequenz wiederherzustellen. Plasmid pKP28 wurde mit Eco RI und Xba I verdaut, um das Fragment zu isolieren, das die Codon-optimierte MFα1-Signalpeptidsequenz und die B-Kette von PDGF kodiert. Dieses Fragment wurde in pUC118 kloniert, das durch Verdauung mit Eco RI und Xba I linearisiert worden war. Einzelsträngige Matrize wurde isoliert und die Matrize wurde mit dem von Zoller und Smith (1984, aaO.) beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Oligonukleotid ZC1019 (Tabelle 1) mutagenisiert. Ein richtig mutagenisiertes Plasmid wurde mit pKP32 bezeichnet.
Die Codon-optimierte MFα1-Signalpeptidsequenz, die in Plasmid pKP32 vorliegt, wurde durch fin-vitro-Mutagenese modifiziert, um die natürliche Glu-Ala-Glu-Ala-Sequenz und Hind III-Stelle, die in der MFα1-Signalsequenz zu finden ist, einzuführen. Einzelsträngige Matrizen-DNA, hergestellt aus pKP321 wurde unter Verwendung von ZC1059 (Tabelle 1) mit dem von Zoller und Smith (1984, aaO.) beschriebenen Verfahren mutagenisiert. DNA aus positiven Kolonien wurde mit Hind III geschnitten, um auf die Einführung einer Hind III-Stelle am 3'-Ende der Signalsequenz zu screenen. Die Klone wurden dann sequenziert, um die Mutagenese weiter zu bestätigen. Ein positiver Klan mit der richtigen Sequenz für das Codon-optimierte MFα1-Signalpeptid, enthaltend die natürliche Glu-Ala-Glu-Ala-Sequenz und Hind III- Stelle, wurde mit pRS111 bezeichnet. Das mutagenisierte MFα1-Signalpeptid wurde in den Vektor pUC118 subkloniert. Plasmid pRS111 wurde mit Hind III verdaut, um die Seqeunz der B-Kette zu eliminieren. Das Plasmid wurde rezirkularisiert und mit pRS112 bezeichnet (Figur 10).
C. Konstruktion von Vektoren für die Sekretion der a-Untereinheit von Faktor XIII aus Hefe unter Verwendung des MFα1-Signalpeptids
Um eine Expressionseinheit zu konstruieren, die den ADH2-4C- Promotor, das Codon-optimierte MFα1-Signalpeptid, die asFXIII- cDNA und den TPI1-Terminator umfaßt, wurde Plasmid pTRK4c als die Quelle für den ADH2-4CPromotor und TPI1-Terminator verwendet. Plasmid pTRK4c wurde mit Eco RI und Sal I verdaut, um das 4 kb lange Fragment zu isolieren, das den ADH2-4C-Promotor, den TPI1-Terminator und die pIC7RI*-Vektorsequenzen umfaßt. Plasmid pRS203 (Beispiel VIII.A.) wurde mit Hind III und Xho I verdaut, um das 2,2 kb lange asFXIII-cDNA-Fragment zu isolieren. Plasmid pRS112 wurde mit Eco RI und Hind III verdaut, um das 0,34 kb lange MFα1-Promotorfragment zu isolieren. Das pTRK4c-Fragment wurde mit dem asFXIII-cDNA-Fragment und dem MFα1-Signalpeptid in einer dreiteiligen Ligation verknüpft. Das resultierende Plasmid wurde mit pRS231 bezeichnet (Figur 11).
Die Expressionseinheit, die im Plasmid pRS231 vorliegt, wurde in die Vektoren YEp13 und pEAS102 inseriert. Plasmid pRS231 wurde mit Xho I verdaut, um die 5 kb lange Expressionseinheit zu isolieren. Dieses Fragment wurde an YEp13 ligiert, das durch Verdauung mit Xho I linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid wurde mit pRS233 bezeichnet. Das 5 kb lange Xho I-Fragment, das aus pRS231 isoliert worden war, wurde in pEAS102 ligiert, das durch Verdauung mit Sal I linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid wurde mit pRS232 bezeichnet.
Die oben beschriebenen Plasmide werden, im wesentlichen wie von Beggs (1978, aaO.) beschrieben, in einen geeigneten Hefewirt, wie etwa Stamm XV794-7-1C, transformiert. Transformierte Zellen werden selektioniert und auf synthetischem Medium, dem Uracil fehlt (-UraD), gehalten. Transformanten werden in 5 ml -UraD eingeimpft und über Nacht bei 30ºC gezüchtet. Die Übernacht-Kultur wird verwendet, um 1 l -UraD zu beimpfen. Die 1 l-Kultur wird gezüchtet, wie oben beschrieben. Die Kulturen werden dann zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und die Überstandsfraktionen werden geerntet. Die Überstände werden auf das Vorhandensein der a-Untereinheit von Faktor XIII unter Verwendung des Verfahrens, das in Beispiel XI.B. beschrieben ist, getestet.

D. Konstruktion von Vektoren für die Sekretion der a-Untereinheit von Faktor XIII aus Hefe unter Verwendung eines synthetischen Signalpeptids

Eine Expressionseinheit, die den ADH2-4C-Promotor, ein 19 Aminosäuren langes Signalpeptid, das unter Verwendung der Regeln von von Heijne (aaO.) konstruiert ist, die asFXIII-cDNA und den TPI1-Terminator umf aßt, wurde konstruiert. Die Oligonukleotide ZC1209 und ZC1210 (Tabelle 1) wurden konstruiert, um, wenn sie anneliert sind, einen Adaptor zu bilden, der ein 5'- Pst T-Adhäsivende, eine Sequenz, die ein 19 Aminosäuren langes Signalpeptid kodiert (mit der Aminosäuresequenz Met-Leu-Leu-Gln-Ala-Phe-Leu-Phe-Leu-Leu-Ala-Gly-Phe-Ala-Pro-Gly-Thr-GluAla), und ein 3'-Hind III-Adhäsivende umfaßt. Die Oligonukleotide wurden kinasiert und anneliert unter Verwendung des Verfahrens, das van Maniatis et al. beschrieben ist (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).
Die Quelle für ADH2-4C-Promotor und den TPI1-Terminator war Plasmid pTRK4c (Beispiel III.B.). Plasmid pTRK4c wurde modifiziert, um eine Pst I-Stelle 3, zum ADH2-4C-Promotor zu legen. Plasmid pTRK4c wurde mit Pst 1 und Eco RI verdaut, um das 3,7 kb lange Fragment zu isolieren, das den ADH2-4C-Promotor, den TPI1-Terminator und die pIC7RI*-Vektorsequenzen umfaßt. Der kinasierte, annelierte ZC1056/ZC1057(Beispiel V.B. )-Adaptor wurde mit dem pTRK4c-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit pRS185 bezeichnet (Figur 7). Plasmid pRS185 wurde durch Verdauung mit Pst I und Sal I linearisiert. Plasmid pRS203 (Beispiel VII.A.) wurde mit Hind III und Xho I verdaut, um das 2,2 kb lange asFXIII-cDNA-Fragment zu isolieren, das verknüpft wurde mit dem linearisierten pRS185 und dem kinasierten, annelierten ZC1209/ZC1210-Adaptor, um Plasmid pRS220 zu schaffen (Figur 11).
Die Expressionseinheit, die in Plasmid pRS220 vorliegt, wird in den Vektor pEAS102 (Beispiel IV) kloniert, um Plasmid pRS221 zu schaffen. Plasmid pRS220 wird mit Xho I verdaut, um die 5 kb lange Expressionseinheit zu isolieren. Plasmid pEAS102 wird mit Sal I verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, um Rezirkularisierung zu verhindern. Die 5 kb lange Expressionseinheit wird mit dem linerisierten pEAS102-Vektor ligiert. Das resultierende Plasmid, bezeichnet mit pE220, umfaßt den ADH2-4C-Promotor, den Adaptor, der das 19 Aminosäuren lange synthetische Signalpeptid kodiert, die asFXIIT-cDNA, den TPI1-Terminator und die pEAS102-Vektorsequenzen.
Hefezellen werden transformiert und kultiviert wie oben beschrieben. Das Vorhandensein von a-Untereinheit von Faktor III wird unter Verwendung des Testverfahrens, das in Beispiel XI.B. beschrieben ist, bestimmt.

BEISPIEL IX

Expression der a'-Untereinheit von Faktor XIII

Die a-Untereinheit von Faktor XIII wird zu der a'-Untereinheit über eine Thrombin-Spaltung aktiviert, die 37 Aminosäuren vom Amino-Terminus des Proteins abspaltet. Die asFXIII-cDNA wird verändert, um die Sequenzen zu entfernen, die die amino-terminalen 37 Aminosäuren kodieren. Einzelsträngige Matrizen-DNA wurde aus Plasmid pRS202 (Beispiel V.A.) hergestellt, das die asFXIII-cDNA im Vektor pUC118 umf aßt. Ein Oligonukleotid wird konstruiert, um die 5'-Sequenzen zu entfernen, die das 37 bp lange Aktivierungspeptid kodieren, und es durch eine Eco RIStelle zu ersetzen, gefolgt von Sequenzen, die ein Initiations-Methionin kodieren, das in frame mit GGC bei +38 der asFXIII-cDNA-Kodierungsregion verknüpft ist. Dieses Oligonukleotid wird verwendet, um die einzelsträngige Matrizen-DNA aus pRS202 unter Verwendung des von Zoller und Smith (aaO.) beschriebenen Verfahrens zu mutagenisieren. Die resultierende Sequenz kodiert den amino-terminalen Teil der a'-Untereinheit (a'sFXIII) mit einer Eco RI-Stelle 5' zum Initiations-Methionin-Codon, der an das Codon gebunden ist, das Aminosäure +38 kodiert. Replikativform-DNA, hergestellt aus der mutagenisierten Phage, wird mit Eco RI und Xho I verdaut, um die a'sFXIII- cDNA zu isolieren.
Ein Expressionsvektor, der den ADH2-4C-Promotor, die a'sFXIII- cDNA und den TPI1-Terminator umf aßt, wird konstruiert. Die Quelle für den ADH2-4C-Promotor und den TPI1-Terminator ist Plasmid pTRK4c (Beispiel III.B.). Plasmid pTRK4c wird mit Eco RI und Sal I verdaut, um das 4 kb lange Fragment zu isolieren, das den ADH2-4C-Promotor, den TPI1-Terminator und die pIC7RI*- Vektorsequenzen umfaßt. Dieses linearisierte Vektorfragment wird mit dem Eco RI-Xho I-a'sFXIII-cDNA-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid wird mit pa'TRK4c bezeichnet.
Die Expressionseinheit, die in pa'TRK4c vorliegt, wird in den Hefevektor pEAS102 gelegt. Das a'sFXIII-cDNA-Fragment wird aus Plasmid pa'TRK4c durch Verdauung mit Hind III isoliert. Das a'sFXIII-cDNA-Fragment wird mit Plasmid pEAS102 verknüpft, das durch Verdauung mit Hind III linearisiert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden ist, um Rezirkularisierung zu verhindern. Die Ligationsmischung wird in E. coli- Stamm RRI transformiert. Plasmid-DNA, hergestellt aus den resultierenden Transformanten, wird durch Restriktionsanalyse analysiertl um die Orientierung des Inserts zu bestimmen. Ein positiver Klon wird mit pa'EAS102 bezeichnet.
Hefezellen werden transformiert und kultiviert, wie oben beschrieben. a-Untereinheit von Faktor XIII wird unter Verwendung des in Beispiel XI.B. beschriebenen Verfahrens getestet.

BEISPIEL X

Expression der b-Untereinheit von Faktor XIII

A. Expression in Hefe

Sekretion der b-Untereinheit von Faktor XIII wird erreicht durch Bindung der MFα1-Signalpeptidsequenz an die Kodierungssequenz für die reife Form der b-Untereinheit von Faktor XIII. Die Fusion zwischen der Codon-optimierten MFα1-Signalpeptidsequenz, die in Plasmid pKP24 (Beispiel VIll.A.) vorliegt, und der cDNA der b-Untereinheit von Faktor XIII (FXIIIb) umfaßt in-vitro-Mutagenese. Plasmid pKP24, das die Codon-optimierte MFai-Signalpeptidsequenz mit einer nach dem Codon, das Aminosäure 81 der MFα1-Signalpeptidfrequenz kodiert, inserierten Sst I-Stelle umfaßt, wird mit Bam HI und Sst I verdaut, um die MFα1-Signalpeptidsequenz zu isolieren. Das 2, 2 kb lange Eco RI-FXIIIb-cDNA-Fragment, das aus dem Phagenklon λHFXIIIb2.2 isoliert worden ist, wird in pUC118 subkloniert, der durch Verdauung mit Eco RI linearisiert worden ist. Die Ligationsmischung wird in E. coli-Stamm JM83 transformiert. Plasmid-DNA wird aus den Transformanten hergestellt und wird mit Stu I und Sst I verdaut, um die Orientierung des Inserts zu bestimmen. Ein positiver Klon, bezeichnet mit pFXIIIb, umfaßt die FXIII-cDNA in der anti-sense-Orientierung im Hinblick auf das lacZ'-Gen. Plasmid pFXIIIb wird durch Verdauung mit Bam HI und Sst I linearisiert und an das Fragment der Codonoptimierten MFα1-Signalpeptidsequenz, die aus pKP24 isoliert worden ist, ligiert. Das resultierende Plasmid wird mit p118FXIIIb bezeichnet.
Ein synthetisches Oligonukleotid wird konstruiert für das Loop-out der Sequenzen zwischen der Sst I-Stelle und der Sequenz, die die reife FXIIIb-Untereinheit kodiert, und zur Insertion der natürlichen Sequenzen, die die Aminosäuren 82-85 von MFα1 kodieren. Plasmid p118FxIIIb wird in E. coli-Stamm MV1193 transformiert. Einzelsträngige Matrizen-DNA, hergestellt aus einem Transformanten, wird einer in-vitro-Mutagenese gemäß Standardverfahren unterzogen. Positive Klone werden sequenziert und durch Restriktionsanalyse analysiertl um die Mutagenese zu bestätigen. Ein richtig mutagenisierter Klon wird mit pMFFXIIIb bezeichnet.
Die FXIIIb-cDNA, die in pMFFXIIIb vorliegt, wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids mutagenisiert, das die 3'-Flankierungssequenz entfernen und eine Xba I-Stelle 3' zum Stap-Codon inserieren wird. Einzelsträngige Matrizen-DNA wird aus E. coli-Stamm MV1193 hergestellt, der mit pMFFXIIIb transformiert worden ist. Die einzelsträngige Matrize wird einer in-vitro-Mutagenese unterzogen. Positive Klone werden sequenziert und durch Restriktionsanalyse analysiert, um die Mutagenese zu bestätigen. Ein richtig mutagenisierter Klon wird mit pMFFXIIIbX bezeichnet.
Das Insert, das in Plasmid pMFFXIIIbX vorliegt, wird hinter den TPI1-Promotor gelegt, der in Plasmid pMVR1 (Beispiel III.A.) vorliegt. Plasmid pMVR1 wird mit Eco RI und Xba I verdaut, um das 4 kb lange Fragment zu isolieren, das den TPI1- Promotor, den TPI1-Terminator und die pIC7RI*-Vektorsequenzen umfaßt. Plasmid pMFFXIIIbX wird mit Eco RI und Xba I verdaut, um das Fragment zu isolieren, das die MFα1-Signalpeptidsequenz und die FXIIIb-cDNA umfaßt. Dieses Fragment wird mit dem pMVR1-Fragment ligiert und das resultierende Plasmid wird mit pMVR1FXIIIb bezeichnet.
Die Expressionseinheit, die in Plasmid pMVR1FXIIIb vorliegt, wird in den Hefevektor YEp13 subkloniert. Plasmid pMVR1FxIIIb wird mit Sst I verdaut, um die 3,2 kb lange Expressionseinheit zu isolieren. Dieses Fragment wurde an YEp13 ligiert, das durch Verdauung mit Sst I linearisiert worden ist. Die Ligationsmischung wird in E. coli-Stamm RRI transformiert. Plasmid-DNA, hergestellt aus den Transformanten, wird durch Restriktionsanalyse analysiert, um die Orientierung des Inserts zu bestimmen. Positive Klone werden mit pYEFXIITb1 bezeichnet, was einen Klan mit der Transkriptionsrichtung des Tnserts in derselben Orientierung wie das LEU2-Gen spezifiziert, und mit pYEFXIIIb2, mit dem Insert in der entgegengesetzten Orientierung.
Die Plasmide pYEFXIIIb1 und pYEFXIIIb2 werden in geeignete Hefe-Wirtszellen transformiert und die Zellen werden kultiviert, wie oben beschrieben.

B. Expression der b-Untereinheit von Faktor XIII in Säugetierzellen

Die b-Untereinheit von Faktor XIII wird in Säugetierzellen durch Verwendung der Faktor IX(FIX)-Leadersequenz, gebunden an das FXIIIb-Fragment (39 bp) in einem Expressionsvektor, abgeleitet von FTX/VII/pD2, exprimiert. Die FIX-Leadersequenz wurde aus FTX(-G) T pUC13 erhalten, konstruiert wurde, wie unten beschrieben.
Um eine geeignete sekretorische Signalsequenz zu erhalten, wurde eine cDNA, die für menschlichen Faktor TX kodiert, aus einer Bibliothek erhalten, die mit mRNA aus menschlicher Leber hergestellt wurde (Kurachi and Davie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464, 1982). Die Faktor IX-Sequenz wurde aus dem pBR322-Vektor durch Verdauung mit Pst I isoliert und wurde in die Pst-Stelle von pUC13 inseriert. Dieses Plasmid wurde mit FIX-pUC13 bezeichnet. Um die G-reiche Region zu entfernen, die am 5'-Ende des Faktor IX-Inserts als ein Ergebnis der cDNA- Klonierung varliegt, wurde das 5'-Ende des klonierten Fragmentes durch einen synthetischen Oligonukleotid-Adaptor ersetzt. Die Oliganukleotide ZC212 und ZC213 (Tabelle 1) wurden synthetisiert und anneliert, um eine 22 Basenpaare lange Überlappung zu erzeugen, die Fragmentenden eingefüllt und mit geeigneten Restriktionsendnukleasen geschnitten und das resultierende Fragment wurde mit der Faktor IX-Sequenz verknüpft.
Um den Adaptor zu konstruieren, wurden jeweils 100 pMol ZC212 und ZC213 lyophilisiert und in 10 ul von 10 x Kinase/Ligase- Puffer (600 mM Tris pH 8,0, 100 mM MgCl&sub2;, 100 nM DTT) plus 86 ul H&sub2;O erneut suspendiert. Die Annelierungsreaktion wurde bei 65ºC für 10 Minuten durchgeführt; die Mischung wurde langsam auf Raumtemperatur abgekühlt und auf Eis gegeben. Zu dieser Mischung wurden 4 ul 2,5 mM dNTP-Gemisch und 1 ul (8 Einheiten) T&sub4;-DNA-Polymerase zugegeben. Die Reaktion ließ man 45 Minuten bei 14ºC voranschreiten. 10 ul 5 M NH4OAc wurden dann zugegeben; und die DNA wurde einmal mit Phenol/CHCl&sub3;, zweimal mit CHCl&sub3; extrahiert und wurde mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde zentrifugiert und in 100 ul Medium-Salzpuffer (Maniatis et al., aaO., S. 100) erneut suspendiert, mit 9 Einheiten Pst I und 8 Einheiten Cfo I verdaut und wie oben extrahiert.
Die modifizierte Faktor IX-Sequenz wurde dann durch Kombination von 0,16 pMol des synthetischen Pst I-Cfo I-Adaptorfragmentes, 0,14 pMol eines 1,4 kb langen Cfo I-Bam HT-Faktor IX- Fragmentes aus FTX-pUC13 und 0,14 pMol eines 2,7 kb langen Bam HI-Pst I-pUC13-Vektorfragmentes in einer 20 Pl-Reaktion, die 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 0,9 Einheiten T&sub4;-Ligase enthielt, konstruiert. Die Reaktion wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und verwendet, um kompetente E. coli JM83 (Messing, Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH-Veröffentlichung No. 79-99, 2, No. 2, 43-48, 1979) zu transformieren. Die Zellen wurden mit 50 ul 2% X-gal (5-Brom- 4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) auf L-Brühe, die 40 ug/ml Ampicillin enthielt, plattiert und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Weiße Kolonien wurden auf eine andere Platte überführt, die Ampicillin enthielt, und bei 37ºC über Nacht gezüchtet. Die Kolonien wurden auf Whatman 540-Papier übertragen und das Papier für eine Hybridisierung gemäß dem Verfahren von Wallace et al. (Gene 16:21, 1981) vorbereitet, mit der Ausnahme, daß die Übernacht-Inkubation auf Chloramphenicol-Platten weggelassen wurde. Die Papiere wurden bei 44ºC für 2 Stunden in 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,5, 6 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 150 ug/ml E. coli-tRNA inkubiert. Die Papiere wurden mit ³²P- markierten ZC235 (Tabelle 1), einem 14-mer, das spezifisch für die geänderte 5'-Endsequenz ist, sandiert. Hybridisierung mit 1-2 X 10&sup6; cpm pro Filter wurde bei 44ºC im Vorhybridisierungspuffer über Nacht durchgeführt. Die Filter wurden dann dreimal in 6X SSC, 0,1% SDS bei 4ºC und dreimal in 2X SCC, 0,1% SDS bei 44ºC gewaschen und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Zwei positive Klone wurden erhalten. Einer dieser Klone wurde mit FTX(-G) T pUC13 bezeichnet.
Um die Sequenz der geänderten Region des Faktor IX-Teils des FTXEG) T pUC13-Konstruktes zu bestätigen, wurde unter Verwendung des Verfahrens von Wallace et al. (Gene 16:21, 1981) unter Verwendung eines Primers, der mit Polynukleotid-Kinase und γ³²P-ATP mit dem Verfahren von Chaconas et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 60:962, 1975) endmarkiert worden war, direkt auf dem pUC-Plasmid unter Verwendung des BRL-Revers- Primers eine Didesoxysequenzierung durchgeführt. Die Sequenz war wie vorhergesagt.
Plasmid FIX(-G) T pUC13 wurde mit Pst I und Hae III verdaut, um die 39 bp lange FTX-Leadersequenz zu isolieren. Die b-Untereinheit von FXIII wird erhalten aus pFXIIIb. Plasmid pFXIIIb wird mit Eco RI linearisiert und die Enden werden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase stumpfendig gemacht.
Das DNA-Fragment wird dann mit Hind III verdaut, um das 0,14 kb lange FXIIIb-Fragment zu isolieren. Zur Erleichterung der Manipulation werden das 39 bp lange FIX-Leaderfragment und das 0,14 kb lange FXIIIb-Fragment in pUC12 ligiert, das mit Pst I und Hind III linearisiert worden ist. Das resultierende Plasmid wird mit Pst I und Hind III gespalten, um das 0,18 kb lange FIX-FXIIIb-Fusionsfragment zu isolieren. Dieses Fragment wird in M13pm11 ligiert, das mit Pst I und Hind III linearisiert worden ist.
Die FIX-Leadersequenz wird durch ortsgerichtete in-vitro-Mutagenese unter Verwendung eines Oligonukleotids. das konstruiert ist für das Loop-out der intervenierenden Sequenzen zwischen dem Ende des FIX-Leaders und der Glutaminsäure in der reifen Form von FXIIIb, präzise mit FXIIIb verknüpft. Die Replikativform-DNA wird aus der mutagenisierten Phage hergestellt und wird mit Pst I und Hind III geschnitten, um das 0,1 kb lange FIX-FxIIIb-Fusionsfragment zu isolieren. Für die Erleichterung der Manipulation wird dieses Fragment in pUC13 subkloniert, das mit Hind III und Pst I linearisiert worden ist. Das resultierende Plasmid wird mit Hind III und Bam HI verdaut, um das 0,1 kb lange FIX-FXIIIb-Fusionsfragment zu isolieren.
λHFXIIIb2.2 wird mit Hind III und Eco RI geschnitten, um das 2 kb lange 3'-Ende von FXIIIb zu isolieren. Dieses Fragment wird in pUC13 subkloniert, das mit Hind III und Eco RI linearisiert worden ist. Das resultierende Plasmid wird mit Eco RI linearsiert, die Enden mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I stumpfendig gemacht und an kinasierte Bgl TI-Linker ligiert. Überschüssige Bgl II-Linker werden durch Verdauung mit Bgl II eliminiert und das lineare Fragment wird mit T&sub4;-DNA-Ligase rezirkularisiert. Das resultierende Plasmid wird mit Hind III und Bgl II gespalten, um das 2 kb lange FXIIIb-Fragment zu isolieren.
Der FXIIIb-Expressionsvektor wird aus Plasmid FIX/VIIpD2 (ATCC No. 53068) gewonnen. Verdauung von FIX/VII/pD2 mit Bam HI setzt das 5 kb lange FIX/VII-Fragment frei und läßt das pD2- Vektorfragment übrig, das den gesamten Adenovirus-2-Tripartite-Leader, das SV40-Polyadenylierungssignal und pBR322- Vektorsequenzen umfaßt. Dieses Vektorfragment wird mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, um Rezirkularisierung zu verhindern, und in einer dreiteiligen Ligation an das 0,1 kb lange FIX-FXIIIb-Fusionsfragment und das 2 kb lange FXIIIb-Fragment ligiert. Das Plasmid mit dem richtigen Insert wird durch Verdauung mit Bam HI und Hind III bestimmt. Dieses Plasmid wird mit pMFXIIIb bezeichnet.
Das Verfahren, das verwendet wird, um Babyhamsternieren(BHK)- Zellen (erhältlich von American Type Culture Collection, ATCC No. CCL10) mit pMFXIIIb zu transfizieren, ist ähnlich zu veröffentlichten Verfahren (zum Beispiel, Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsara und Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham und Van der Eb, Virol. 52:456, 1973). Die BHK-Zellen werden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, in Dulbecco-Medien (plus 10% hitzeinaktiviertes fetales Kalbsserum und ergänzt mit Glutamin und Penicillin-Streptomycin) in 60 mm-Gewebekultur-Petrischalen bis zu einer Kanfluenz von 20% gezüchtet. Insgesamt 10 ug DNA werden verwendet, um eine 60 mm-Schale zu transfizieren: 3,75 ug pMFXIIIb, 1,25 ug pKO-neo (Southern und Berg, J. Mol. ADDl. Genet. 1:327-341, 1982) und 5 ug Lachssperma-DNA. Die DNAs werden in 0,3 M NaOAc, 75% Ethanol ausgefällt, mit 70% Ethanol gespült und in 20 ug 10 mM Tris- HCl pH 8, 1 mM EDTA erneut gelöst. Die DNA wird mit 440 ul H&sub2;O und 500 ul 280 mM NaCl, 1,5 mM NaHPO4* 12 mM Dextrose, 50 mM HEPES pH 7,12 kombiniert. Sechzig ul 2 M CaCl&sub2; werden tropfenweise zu der obigen Mischung zugegeben und die Lösung bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehengelassen. Die Lösung wird dann zu den Zellen zugegeben und die Zellen für 4 Stunden erneut auf 37ºC gebracht. Das Medium wird entfernt und 5 ml 20% DMSO in Dulbecco's mit Serum werden für 2 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben. Die Schale wird dann zweimal mit frischem Medium schnell gewaschen und in frischem Medium über Nacht inkubiert. Vierundzwanzig Stunden nach Zugabe der DNA wird das Medium entfernt und selektives Medium zugegeben (10 mg/ml G418, 498 ug/mg, Gibco, in Dulbecco's mit Serum). Nach 10 und 13 Tagen werden einzelne Klone, die Zellen repräsentieren, die das pKO-neo-Gen eingebaut haben und somit resistent gegenüber G418 sind auf Platten mit 96 Vertiefungen (oder 24 Vertiefungen) überführt und für Proteintests hochgezüchtet.
Zellen werden in Dulbecco's plus 10% fetalem Kalbsserum gezüchtet. Das Medium wird von den Zellen und Zellbruchstücken durch Zentrifugation abgetrennt und auf Untereinheit b-Polypeptid van Faktor XIII (z.B. mit ELISA) und auf biologische Aktivität getestet. Die Zellen werden von den Platten mit Trypsin entfernt, mit frischem Medium gewaschen, zentrifugiert und bei -20ºC eingefroren. Die Zellpellets werden dann in PBS aufgetaut, pelletiert und in PBS, das 0,25% Triton X-100 enthält, erneut suspendiert. Proben werden verdünnt und auf Polypeptid und Aktivität getestet.

BEISPIEL XI

Beschreibung der Tests

A. Herstellung von Zellpellets

In geeigneter Weise gezüchtete Hefezellen, wie beschrieben in den vorangehenden Abschnitten, wurden zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und das verbrauchte Medium wurde verworfen. Die Zellen wurden pelletiert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden bei -80ºC eingefroren, bevor sie getestet wurden.
Rohe Glasperlen-Lysate wurden aus den gefrorenen Zellpellets hergestellt. Die gewaschenen Zellpellets wurden auf Eis aufgetaut und in einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Sigma, St. Louis, Mo.), 1 mM β-Mercaptoethanal (Sigma) verdünnt. Glasperlen (450-500 um) wurden zu einer Hälfte des Gesamtvolumens zugegeben. Diese Mischung wurde bei voller Geschwindigkeit für eine Minute dreimal verwirbelt, wobei die Proben zwischen den Verwirbelungen auf Eis gekühlt wurden. Die Flüssigkeit wurde aus den Röhrchen mit einer Pasteurpipette entfernt und in ein Mikrofugenröhrchen überführt. Glasperlen wurden einmal im ursprünglichen Volumen PBS, das 1 mM β-Mercaptoethanol (BME) enthielt, gewaschen. Die Perlen wurden eine Minute verwirbelt und die Flüssigkeit wurde mit Pasteurpipette entfernt und mit dem ursprünglichen Lysat gepoolt. Die Lysate wurden dann in einer Eppendarfmikrofuge (Brinkmann, Westbury, N.Y.) bei Höchstgeschwindigkeit für fünf Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig für den Test entfernt.

B. Test auf Faktor XIII-Aktivität

Faktor XIII-Aktivität wird unter Verwendung des im wesentlichen von Curtis und Lorand (aaO.) beschriebenen Verfahrens gemessen. In den Lysaten wird Gesamthefeprotein mit dem Verfahren, das von Lowry et al. beschrieben ist (J. Biol. Chem., 193:265-275, 1951), gemessen. Proben werden auf 10 ug/ml Gesamthefeprotein mit PBS +1 mM BME verdünnt. Standards unter Verwendung kommerziell erhältlichen Faktors XIII (Tabelle 2) werden in schrittweiser Verdünnung in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM Dithiothreit, verdünnt. Fünf ul Probe oder Standard wurden zu 35 ul 50 mM Tris-HCl pH 7,6 und 1 ul Thrombin zugegeben (Tabelle 2). Die Mischungen ließ man bei 37ºC für 30 Minuten inkubieren. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 2 U Hirudin (Sigma) gelöscht. Sechzig ul Reaktionsmischung (Tabelle 2) 37ºC werden zugegeben und die Mischung wird für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 1 ml 7,5% Trichloressigsäure (TCA) gestoppt. Die Proben werden in der Mikrofuge bei Höchstgeschwindigkeit für 5 Minuten geschleudert und die Überstände werden verworfen. Die Pellets werden zweimal mit 7,5% TCA gewaschen. Die Pellets werden dann in 100 ul Eisessig gelöst. Fünf ml Szintillationscocktail (Optifluor, Packard Instruments Co., Downers Grove, Ill.) werden zugegeben und die Proben werden auf dem Szintillationszähler (Beckmann, Palo Alto, Calif.) gezählt. TABELLE 2 Thrombin: Lyophilisiertes Thrombin (Sigma, St. Louis, Mo.) wird in 50% Glycerin, 0,25 M Tris-HCl pH 7,5 bis 1000 U/ml gelöst. Diese Lösung wird bei -20ºC aufbewahrt. Kommerzieller Faktor XIII: N,N-Dimethylcasein: ³H-Histamindihydrochlorid: Reaktionspuffer: Reaktionsmischung: Faktor XIII (Green Cross, Osaka, Japan), gelöst in 1 ml 50% Glycerin, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM Dithiothreit (DTT; Sigma, St. Louis* Mo.). Diese Lösung wird bei -20ºC aufbewahrt. N,N-Dimethylcasein (Sigma, St. Louis, Mo.) wird bis 10 mg/ml in 0,5 M Tris-HCl pH 7,5 gelöst. 1 mCi ³H-Histamin-dihydrochlorid (New England Nuclear, Boston Mass.) wurde in 4 ml 10 mM nicht-markiertem Histamin-dihydrochlorid gelöst. Diese Lösung wird bei -20ºC aufbewahrt. Tris-Base

Claims

1. Eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog zur a'-Untereinheit von Faktor XIII ist, wobei die Sequenz die Sequenz von Figur 1 von bp 202 bis bp 2283 umfaßt.

2. Eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog ist zu der a'-Untereinheit von Faktor XIII, wobei die Sequenz eine DNA-Sequenz umfaßt, die für die Aminosäuresequenz in Figur 1 kodiert, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731.

3. Ein Expressionsvektor, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 folgt.

4. Der Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei besagter Promotor der ADH2-4c-, TPI1-, oder GAL10-Promotor ist.

5. Eine Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 3 oder 4 transfiziert ist.

6. Die Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei besagte Wirtszelle eine Hefe-Wirtszelle ist.

7. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das, bei Dissoziation, die biologische Aktivität von Faktor XIIIa besitzt, welches umfaßt:

Einführen eines Expressionsvektors, der einen Transkriptionspromotor, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog zur a'-Untereinheit van Faktor XIII ist, umfassend die Aminosäuresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731, und einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog zur b-Untereinheit von Faktor XIII ist, in eine Wirtszelle,

Kultivieren besagter Wirtszelle; und

Isolieren des Proteins aus besagter Wirtszelle.

8. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität von Faktor XIITa, welches umfaßt:

Einführen eines Expressionsvektors, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog zur a'- Untereinheit von Faktor XIII ist, umfassend die Aminosäuresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731, in Wirtszellen;

Kultivieren besagter Wirtszellen;

Isolieren von Polypeptid aus besagten Wirtszellen; und

Dimerisieren des Polypeptids, um Homodimere zu bilden.

9. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität von Faktor XIIIa, welches umfaßt:

Einführen eines Expressionsvektors, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Polypeptid kodiert, das funktionell homolog zur a'- Untereinheit van Faktor XIII ist, umfassend die Aminosäuresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731, in eine Wirtszelle;

Kultivieren besagter Wirtszelle; und

Isolieren von Homodimer aus besagter Wirtszelle.

10. Ein Expressionsvektor, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Protein mit der Struktur und biologischen Aktivität der a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII oder der a'-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731, wobei besagte DNA-Sequenz im wesentlichen frei von 3' nicht-translatierten Sequenzen ist, die normalerweise mit besagter DNA-Sequenz assoziiert sind.

11. Eine Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transfiziert ist, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Protein mit der Struktur und biologischen Aktivität der a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII oder der a'-Untereinheit von menschlichem Faktor XIIT kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methianin, Nummer 731, wobei besagte DNA-Sequenz im wesentlichen frei von 3' nicht-translatierten Sequenzen ist, die normalerweise mit besagter DNA-Sequenz assoziiert sind.

12. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität von menschlichem Faktor XIII, welches umfaßt: Einführen eines Expressionsvektors, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, dem flußabwärts eine DNA-Sequenz folgt, die für ein Protein mit der Struktur und biologischen Aktivität der a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIIT oder der a'- Untereinheit von menschlichem Faktor XIII kodiert, umf assend die Aminosäuresequenz von Figur 1, beginnend mit Glycin, Nummer 38, und endend mit Methionin, Nummer 731, in eine Wirtszelle, wobei besagte DNA-Sequenz im wesentlichen frei von 3' nicht-translatierten Sequenzen ist, die normalerweise mit besagter DNA-Sequenz assoziiert sind; Kultivieren besagter Wirtszelle; und Isolieren des von besagter DNA-Sequenz kodierten Proteins aus besagter Wirtszelle.