DE3537176C2 - Gewebeplasminogenaktivator und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Gewebeplasminogenaktivator und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft einen Gewebeplasminogenaktivator und
ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Die Blockierung des Blutstroms im Gefäßsystem durch Bildung
von Blutpfropfen ist eine der häufigsten Krankheits- und
Todesursachen. Am folgenschwersten ist dabei die Unterbre
chung der Blutzufuhr zum Herzen (Herzattacke, zum Gehirn
(Gehirnschlag) und zur Lunge (Lungenembolie). Zur Bekämpfung
dieser Probleme wird eine Gruppe von biologischen Verbindun
gen, den sogenannten Plasminogenaktivatoren, eingesetzt,
welche die Blutpfropfen abbauen, was als fibrinolytisches
System bekannt ist. Über verschiedene Mechanismen erzeugen
die Plasminogenaktivatoren das aktive Enzym Plasmin, das
seinerseits das Fibrinnetzwerk eines Blutpfropfens unter
Bildung löslicher Produkte abbaut. Die beiden im Handel
erhältlichen, für die Thrombolysetherapie in Frage kommenden
Arzneimittel, die als Plasminogenaktivatoren wirken, sind
Streptokinase, ein Bakterienprotein, und Urokinase, eine aus
menschlichem Urin isolierte Serinprotease. Beide Arznei
mittel haben jedoch einen erheblichen Nachteil - sie wirken
nicht spezifisch auf Blutpfropfen. Neben Fibrin bauen sie
nämlich auch noch Blutproteine, wie Fibrinogen, Prothrombin,
Faktor V und Faktor VIII ab, was zu inneren Blutungen als
Nebenwirkung der Behandlung führen kann. Die Verabreichung
von Streptokinase und Urokinase erfolgt daher gewöhnlich
durch unmittelbare Einführung in den Pfropfen über einen
Katheter. Da dieses Verfahren kompliziert ist, wird es nur
selten angewandt.
Andererseits sind die Plasminogenaktivatoren aus normalen
und Tumorgeweben extrahiert worden und werden gegenwärtig je
nach der Quelle, aus der sie stammen, eingeteilt in Plasmi
nogenaktivatoren vom Urokinasetyp (uPA) und Plasminogen
aktivatoren vom Gewebetyp (tPA). Letztere scheinen im Ver
gleich zu den ersteren eine höhere Affinität zu Fibrin
aufzuweisen. Es ist daher wünschenswert, zur Verbesserung
der Versorgung mit einer Vielzahl von tPA diese durch gen
technische Methoden herzustellen.
Pennica et al. (Nature, 301: 214-221, 1983) haben die DNS-
Kodierungssequenz einer in E. coli geklonten tPA-cDNS unter
Verwendung von mRNS aus Melanomzellen (nach Bowes) beschrie
ben. Wallen et al. (Eur. J. Biochem., 132: 681-686, 1983)
haben zwei Varianten der einkettigen Form von Plasminogen
aktivatoren aus einer menschlichen Melanomzellinie (nach
Bowes) gereinigt und gekennzeichnet. Die partielle Aminosäu
resequenz-Analyse der beiden Varianten hat ergeben, daß
diese sich darin unterscheiden, daß eine davon am N-Terminus
zusätzlich drei Aminosäurereste aufweist. Diese zusätzliche
Tripeptidsequenz, Gly-Ala-Arg, wurde, wie sich herausstell
te, vom Molekül durch Plasmin abgespalten, wodurch die
kürzere Variante entstand, die eine aminoendständige Amino
säuresequenz aufweist, die derjenigen entspricht, die von
der von Pennica et al. beschriebenen Nucleotidsequenz abge
leitet wurde.
Obwohl bisher in Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) eine
Anzahl heterologer Proteinprodukte expressiert worden ist,
kann nicht vorhergesagt werden, ob auch ähnliche Ergebnisse
für andere Proteine erzielt werden können. Die Expression
heterologer Gene in transformierten Zellen beruht auf einer
Anzahl von Wechselwirkungen zwischen der Wirtszelle und den
Fremdgenen, assoziierten Regulationsgenen und den Genproduk
ten. Derartige Wechselwirkungen werden teilweise durch die
Wirtsspezies definiert. Genspezifische Wechselwirkungen
umfassen das Codon-usage-bias, die Erkennung von Promotor-
und Terminatorsignalen sowie die Stabilität und die Kopien
zahl der extrachromosomalen Elemente (z. B. von Plasmiden),
welche die Fremdgene tragen. Proteinspezifische Wechselwir
kungen umfassen enzymatische Modifikationen der Protein
produkte, wie Verarbeitung der Precursorformen, Glykosylie
rung, Entstehung der Disulfidbindung usw. Außerdem können
die einzelnen Arten von Wirtsorganismen sich noch in ihrer
Fähigkeit, heterologe Genprodukte zu sezernieren, vonein
ander unterscheiden.
Je nach dem konkreten in Frage kommenden Wirt-Produkt-System
sind derartige spezifische Modifikationen wünschenswert oder
unerwünscht. Die einzelnen Arten können sich hinsichtlich
ihrer Toleranz gegenüber der Anwesenheit von Fremdproteinen
oder den für die Erzeugung oder Isolierung eines konkreten
Proteins erforderlichen Kulturbedingungen im großtechnischen
Umfang voneinander unterscheiden. Native Genprodukte können
in manchen Fällen das gewünschte Produkt verunreinigen, was
die Reinigung verteuert und/oder schwierig macht.
Es wurde daher nach einem Verfahren zur Erzeugung von Plas
minogenaktivatoren im eukaryotischen Organismus Saccharomy
ces cerevisiae und in anderen Hefen zur Ermittlung der
genannten Wechselwirkung und zu ihrer Nutzung für die groß
technische Produktion von Plasminogenaktivatoren gesucht. Im
allgemeinen können diese Wirt-Produkt-Wechselwirkungen nicht
a priori vorhergesagt werden und erfordern intensive For
schungsarbeit im Labor bzw. eine Produktion in großtechni
schem Umfang.
Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung
eines Verfahrens zur Herstellung von Gewebeplasminogenakti
vator (tPA) in Hefe.
Die Erfindung betrifft den menschlichen Gewebeplasminogen
aktivator (tPA) aus Melanomzellen nach Bowes, der dadurch
gekennzeichnet ist, daß folgende Asparagin-Reste in Gluta
minreste umgewandelt sind:
Asparagin-117, Asparagin-184, Asparagin-448, Asparagin-117 und Asparagin-448, sowie Asparagin-184 und Asparagin 448.
Asparagin-117, Asparagin-184, Asparagin-448, Asparagin-117 und Asparagin-448, sowie Asparagin-184 und Asparagin 448.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung
des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators in Hefe, bei
dem man eine durch ein DNS-Gebilde transformierte Hefekultur
züchtet, wobei das Gebilde einen Hefegenpromotor und eine
DNS-Sequenz enthält, die den Gewebeplasminogenaktivator
kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß tPA-Mutanten
kodierende DNS mit ein-, zwei- oder dreifachen Mutationen
durch Substitution der tPA-Kodierungssequenzen in pDR1298
aufgebaut werden und zwar die Plasmide
- 1) pDR1601 mit einer Mutation bei Asn-117;
- 2) pDR1602 mit einer Mutation bei Asn-184;
- 3) pDR1603 mit einer Mutation bei Asn-448;
- 4) pDR1604 mit Mutationen bei Asn-117 und -448;
- 5) pDR1605 mit Mutationen bei Asn-184 und -448;
- 6) pDR1606 mit drei Mutationen,
wobei die Expression der DNS-Sequenz unter der Kontrolle des
Promotors erfolgt, und daß das Gebilde ferner eine zwischen
dem Promotor und der DNS-Sequenz angeordnete Leadersequenz
aufweist.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Vektor", "Plasmid" und "DNS-
Gebilde" sind untereinander austauschbar. Alle diese Aus
drücke bezeichnen ein DNS-Molekül, das vom Menschen so
modifiziert wurde, daß es DNS-Segmente enthält, die in einer
Weise miteinander kombiniert und aneinander angrenzend
angeordnet wurden, wie sie sonst in der Natur nicht vorkom
men, oder einen Klon eines solchen Moleküls. Gewöhnlich
enthalten derartige Vektoren genetische Information, die bei
der Transformierung in einen Wirtsorganismus, wobei wenig
stens ein Gen im Wirtsorganismus exprimiert werden soll,
ihre eigene Replikation gewährleistet, sowie andere geneti
sche Elemente, die für die Expression des interessierenden
Gens erforderlich sind, wie Promotoren, Transkriptionsini
tiationssites und Transkriptionsterminatoren. Die Vektoren
können außerdem noch Sequenzen zur Steuerung der Expression
des (der) zu erprimierenden Gens (Gene) enthalten.
Der Ausdruck "Expression" wird in der Anmeldung im üblichen
Sinne verwendet und bedeutet die Bedingung, bei der ein
durch ein Gen im Wirtsorganismus kodiertes Proteinprodukt
vom Organismus synthetisiert wird. Die Anwesenheit eines
konkreten Gens mit sämtlichen erforderlichen Steuerungs
bereichen im Wirtsorganismus bedeutet nicht a priori, daß
das Gen unbedingt exprimiert wird. Es kann eine Reihe von
Gründen vorliegen, von denen viele noch nicht vollständig
geklärt sind, die dafür verantwortlich sind, daß ein Gen in
einem transformierten Organismus nicht exprimiert wird.
Außerdem kann selbst dann, wenn ein gewisser Expressions
grad vorliegt, noch nicht mit Sicherheit das Ausmaß der
Expression vorhergesagt werden. So kann es zwar in manchen
Fällen zu einer Expression kommen, diese kann jedoch so
gering sein, daß das Proteinprodukt nicht in einer ausrei
chenden Menge produziert wird.
Der Ausdruck "Leadersequenz" bezieht sich auf den Teil eines
Gens, der das Signalpeptid oder ein Pre-Propeptid kodiert.
Ein Signalpeptid dirigiert ein frisch synthetisiertes Pro
tein auf einen zellulären Sekretionsweg und wird gewöhnlich
vom Proteinrest während dieses Prozesses abgespalten. Bin
Pre-Propeptid wird im allgemeinen zu einem späteren Zeit
punkt des Sekretionsprozesses entfernt. Der Ausdruck "Lea
dersequenz" kann sich in der Anmeldung auch auf Teile einer
natürlich vorkommenden Leadersequenz beziehen.
Für die Expression heterologer Proteine in Hefe ist es
wünschenswert, daß die Expression unter der Kontrolle eines
der Hefe eigenen Promotors erfolgt. Ein bevorzugter Promotor
ist die Promotorregion des Gens der Hefe-Triosephosphatiso
merase (TPI) (Alber und Kawasaki, J. Molec. Appl. Genet. 1:
419-434, 1982). Ein Vorteil der Verwendung des Hefe-TPI-
Promotors ist der, daß ein hoher Transkriptionsgrad erzielt
werden kann, so daß ein erheblicher Anteil des von den
Hefezellen produzierten Gesamtproteins für die Erzeugung des
gewünschten Proteins verwendet werden kann.
Es können aber auch andere Promotorsequenzen für die Steue
rung der Produktion von tPA in einer transformierten Kultur
von S. cerevisiae durch Modifizierung der erfindungsgemäßen
Vektoren zum Einbau dieser Promotoren verwendet werden.
Derartige für erfindungsgemäße Zwecke in Frage kommende
Promotoren sind solche von Genen von S. cerevisia., welche
für Alkohol-Dehydrogenase-I (Ammerer, Meth. in Enzymology
101: 192-201, 1983), Alkohol-Dehydrogenase-II (Williamson et
al., Nature 283: 214-216, 1980), Pyruvatkinase, Phospho
glukoseisomerase, Phosphoglyceratmutase, Hexokinase-1,
Hexokinase-2, Glukokinase, Phosphofruktokinase, Aldolase
usw. oder Teile davon kodieren.
Die erfindungsgemäßen DNS-Gebilde enthalten ferner vorzugs
weise eine Transkriptionsterminatorsequenz im 3′-Bereich des
tPA-Strukturgens. Ein derartiger bevorzugter Terminator ist
der des TPI-Gens von S. cerevisiae.
Für die Steuerung der Expression und Sekretion des tPA aus
der Wirtszelle in Frage kommende Vektoren enthalten zusätz
lich auch noch Gensequenzen, welche die sekretorischen
Signale kodieren, wie z. B. den Pre-Pro-Bereich des durch das
Gen MFα1 kodierten α-Faktors des Matingpheromons der Hefe
(Kurjan und Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982) oder die
Signalpeptidregionen der Hefegene PHO5, SUC2 und BAR1, sowie
die Pre-Pro-Region des tPA-Gens selbst.
Die erfindungsgemäß beschriebenen, in S. cerevisiae trans
formierten Vektoren steuern die Erzeugung eines Proteins mit
der Aktivität des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators.
Die erfindungsgemäß hergestellten Proteine können die Se
quenz einer der beiden vorherrschenden Formen von natürlich
vorkommendem tPA aufweisen oder die Aminosäuresequenz kann
so abgeändert sein, daß sie ein Protein ergibt, das die
biologische Aktivität des tPA beibehält, jedoch auch noch
andere wünschenswerte Eigenschaften aufweist. So z. B. können
die Glykosylierungsabschnitte durch abschnittspezifische
Mutagenese zur Verminderung der Glykosylierung des in der
Hefe erzeugten tPA-Polypeptids modifiziert werden. Eine
derartige Modifikation kann zu einer verbesserten Expression
und/oder zu erhöhter spezifischer Aktivität führen. Außerdem
können auch noch z. B. aufgrund von genetischem Polymorphis
mus natürlich vorkommende Varianten vorliegen.
Mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformierte Hefezellen
können unter Standardkulturbedingungen gezüchtet werden. Ein
bevorzugtes Kulturmedium ist mit Glukose bei einer Konzen
tration von 2 bis 6% supplementiertes -leu-Medium. Besonders
bevorzugt enthält dieses Medium außerdem noch zur Einstel
lung des pH auf 5,0 bis 6,0 während der Züchtung einen
Puffer. Besonders bevorzugte Puffer sind dabei 0,1 M Kalium
hydrogenphthalat (pH 5,5) und 0,1 M Natriumsukzinat (pH
5,5).
Der erfindungsgemäß hergestellte tPA kann verschieden stark
glykosyliert werden oder kann unglykosyliert bleiben. Da die
Anwesenheit von Kohlenhydraten, die fibrinolytische Aktivi
tät stört, kann es sich in manchen Fällen als wünschenswert
erweisen, sie in vitro zu entfernen. Eine bevorzugte Methode
zur Entfernung von Kohlenhydraten ist die Behandlung mit
Endoglykosidase H.
Erfindungsgemäß wurden die üblichen biochemischen Techniken
angewandt. Die verwendeten Restriktionsendonukleasen stamm
ten von Bethesda Research Laboratories, New England BioLabs,
und Boehringer Mannheim Biochemicals und wurden entsprechend
den Herstellervorschriften verwendet, im allgemeinen unter
Zusatz von Pankreas-RNase (10 µg/ml). Die T4-DNS-ligase
stammte von Bethesda Research Laboratories und Boehringer
Mannheim und wurde entsprechend den Herstellervorschriften
verwendet. Die M13- und pUC-Wirtsstämme und -vektoren (mit
Ausnahme von pUC18 und pUC19) stammten von Bethesda Research
Laboratories. Die M13-Klonung erfolgte wie von Messing
beschrieben (Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1983). Die DNS-
Polymerase-I (Klenow-Fragment) wurde wie von Maniatis et al.
beschrieben verwendet (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die E. coli-
Kulturen wurden nach der Methode von Bolivar et al. trans
formiert (gene 2: 95-113, 1977). Die S. cervisiae-Kulturen
wurden nach Beggs′ Methode (Nature 275: 104-108, 1978) in
ihrer nach MacKay modifizierten Form (Meth. in Enzymology,
101 : 325, 1983) transformiert.
Der Gewebeplasminogenaktivator enthält vier potentielle
Glykosylierungsabschnitte (As-Sequenz Asn-X-(Ser Thr)). Gemäß
Pohl et al. (Biochemistry 23: 3701-3707, 1984) werden drei
dieser Abschnitte (Asn-117, -184 und -448) in aus Melanom
zellen nach Bowes erhaltenem tPA glykosyliert. Der vierte
Abschnitt (Asn-218) ist in Bowes tPA nicht glykosyliert.
Der in Hefe erzeugte Plasminogenaktivator erweist sich
aufgrund der Western blot-Analyse als stark glykosyliert.
Dieser Umstand kann die Eignung des Produktes für die Be
handlung des Menschen beeinträchtigen, da dieser es als
Fremdprotein erkennen könnte. Es wird daher eine Methode zur
Erzeugung modifizierter Formen von tPA in transformierter
Hefe bereitgestellt, wobei die modifizierten Proteine ver
glichen mit dem nicht modifizierten in Hefe erzeugten tPA
verminderte Glykosylierung aufweisen, die biologische Akti
vität dabei jedoch erhalten bleibt. Die modifizierten Plas
minogenaktivatoren weisen außerdem ein vermindertes Potenti
al an antigenen Eigenschaften im Hinblick auf den Menschen
auf. Durch Umwandlung der Asn-Reste an den Glykosylierungs
abschnitten in andere Aminosäurereste kann die Glykosylie
rung blockiert werden. Besonders bevorzugt ist dabei die
Umwandlung der Asn-Reste in Gln-Reste. Außerdem können zur
Blockierung der Glykosylierung von in Hefe erzeugtem Protein
auch noch andere Abänderungen in der Sequenz durchgeführt
werden. So z. B. kann ein Prolinrest in der zweiten Stellung
der Sequenz Asn-X-(Ser Thr) die Glykosylierung in Hefe verhin
dern (Marshall, Biochem. Soc. Symp. 40: 17-26, 1974). In
dieser Position können auch noch weitere Substitutionen
durchgeführt werden. Auch kann die dritte Aminosäure des
Glykosylierungsabschnitts abgeändert werden.
Abänderungen in der den tPA kodierenden DNS-Sequenz können
nach der Methode der abschnittspezifischen Mutagenese im
wesentlichen nach Zoller und Smith, Manual for Advanced
Techniques in Molecular Clonin Course, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1983, durchgeführt werden. Zur Modifizierung
eines oder mehrerer Glykosylierungsabschnitte können die
Abänderungen in den Nucleotiden einzeln oder in Kombination
miteinander erfolgen. Außerdem können mutierte Sequenzen
durch Restriktion von Vektoren mit Restriktionsendonukleasen
unter Durchführung von Mutationen und Verbindung der so
erhaltenen Fragmente zu den gewünschten Produkten kombiniert
werden. Auch können in einer einzigen Mutagenesestufe mehre
re Abänderungen durchgeführt werden. In einer bevorzugten
Ausführungsform werden zusätzliche Nucleotidsubstitutionen
durchgeführt, welche die natürlich vorkommenden Kodone an
den Glykosylierungsabschnitten in die bevorzugten Hefekodone
umwandeln.
Die geklonte tPA-cDNS wurde in zwei Fragmente subgeklont, um
eine abschnittspezifische Mutagenese vorzubereiten. Um den
5′-Bereich der tPA-Sequenz zu erhalten, wurde ca. 1 µg des
Plasmids pDR1296 zwei Stunden bei 37°C mit einer Einheit von
Bgl II in einem Bgl II-Puffer (BRL) abgespalten. Danach
wurde eine Einheit von Eco RI zugefügt und nach einer zu
sätzlichen Inkubationszeit von 10 und 20 Minuten wurden
aliquote Mengen entfernt. Die DNS-Fragmente wurden auf einem
1%igen Agarosegel isoliert und das 1086 bp-Bgl II-partiell-
Eco RI-Fragment wurde durch eine NA-45 DEAE-Membrane (Fa.
Schleicher & Schuell) gemäß Herstellervorschrift elektroelu
iert. Die 3′ -Kodierungssequenz wurde durch Aufspaltung von
pDR1296 mit Xba I und Eco RI in 0,05 M Tris, pH 7,4, 6 mM
MgCl2 und 0,05 M NaCl erhalten. Die Fragmente wurden auf
einem 1%igen Agarosegel isoliert und das 532 bp-Eco RI-Xba
I-Fragment wurde wie oben eluiert. Die Fragmente wurden mit
CHCl3 extrahiert und mit Phenol und EtOH ausgefällt. Das
gereinigte Bgl II-Eco RI-Fragment wurde dann an das mit Bam
HI + Eco RI gespaltene M13mp8 (Replikationsform oder RF)
dadurch angelagert, daß die beiden Fragmente 5 Stunden bei
Raumtemperatur mit T4DNS-Ligase inkubiert wurden. Das
Eco RI-Xba I-Fragment wurde in gleicher Weise an das von Eco
RI + Xba I aufgespaltene M13mp19 (Replikationsform) angela
gert.
Die rekombinierten Phagenklone wurden für die Transfektion
des kompetenten E. coli JM 101 verwendet. Die Phagen-DNS
wurde von Plaques gereinigt und nach der Dideoxymethode
unter Verwendung des Primers ZC87 sequenziert, um die Anwe
senheit der richtigen cDNS-Sequenz festzustellen.
Die abschnittspezifische Mutagenese wurde an einsträngigen
M13-Matrizen durchgeführt, wobei als mutagene Primer ZC294,
ZC295 und ZC297 (s. Tabelle 2) verwendet wurden, um Änderun
gen bei Asn-117, -184 bzw. -448 zu erzeugen. Die Primer
sollten die Änderung potentieller Glykosylierungsabschnitte
durch Änderung der Asn-Kodons in Gln-Kodons sowie durch
Änderung anderer Kodons von Glykosylierungsabschnitten in
solche, die von Hefe bevorzugt werden, bewirken. Die Primer
wurden mit der Sequenz der Matrizen verglichen, um Bereiche
mit sekundärer Homologie zu vermeiden, welche zu unerwünsch
ten Mutationen führen könnten. Die Glykosylierungsabschnitte
bei Asn-117 und -184 wurden dadurch verändert, daß man als
Matrize die M13mp8-Rekombinante mit dem Bgl II-Eco RI-Ein
schub verwendete. Der Abschnitt bei Asn-448 wurde durch
Verwendung der M13mp19-Rekombinante, die den Eco RI-Xba I-
Einschub enthält, als Matrize verändert. Bei allen Nutagene
sereaktionen wurde als Sekundärprimer der Universal-M13-
Primer ZC87 verwendet. 20 pmol des phosphorylierten mutage
nen Primers und 20 pmol des Sekundärprimers wurden mit 1
pmol der einsträngigen Matrize in 10 µl von 20 mM Tris, pH
7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl und 1 mM DTT vereinigt und 10
Minuten bei 65°C und dann 5 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert und dann auf Eis ausgebracht. Zu der auf diese
Weise gewonnenen DNS wurden 10 µl 20 mM Tris, pH 7,5, 10 mM
MgCl2, 10 mM DTT, enthaltend 1 mM dNTPs, 2,5 Einheiten Kle
now-Polymerase und 3,5 Einheiten DNS-Ligase zugefügt und das
Gemisch 3 Stunden bei 15°C inkubiert. Die DNS wurden dann
für die Transfektion in kompetentes E. coli JM101 verwendet,
wonach die Zellen auf YT-Agar plattiert und bei 37°C inku
biert wurden. Die Plaques wurden dann bei einer Temperatur
des mutagenen Primers von -4°C eine Stunde in einer 6X SSC,
10X-Denhardtschen Lösung vorhybridisiert und dann bei -4°C
in derselben Lösung mit dem 32P-markierten mutagenen Primer
hybridisiert.
Die Filter wurden über Nacht der Röntgenstrahlung ausge
setzt. Dann wurde noch ein zusätzlicher Waschvorgang bei
einer um 5°C höheren Temperatur als für die Identifizierung
von Plaquemutanten erforderlich durchgeführt. Die nachste
henden Phageklonmutanten wurden identifiziert:
Nr. 2: M13mp8 mit dem bei Asn-117 eine Mutation enthaltenden Bgl II-Teil-Eco RI-Fragment;
Nr. 10: M13mp8 mit dem bei Asn-184 eine Mutation enthalten den Bgl II-Teil-Eco RI-Fragment;
Nr. 24: M13mp19 mit dem bei Asn-448 eine Mutation enthalten den Eco RI-Xba I-Fragment.
Nr. 2: M13mp8 mit dem bei Asn-117 eine Mutation enthaltenden Bgl II-Teil-Eco RI-Fragment;
Nr. 10: M13mp8 mit dem bei Asn-184 eine Mutation enthalten den Bgl II-Teil-Eco RI-Fragment;
Nr. 24: M13mp19 mit dem bei Asn-448 eine Mutation enthalten den Eco RI-Xba I-Fragment.
Danach wurden tPA Mutanten kodierende DNS mit ein-, zwei- oder
dreifachen Mutationen durch Substitution der tPA-Kodie
rungssequenzen in pDR1298 aufgebaut. Es wurden folgende
Plasmide aufgebaut:
- 1) pDR1601 mit einer Mutation bei Asn-117;
- 2) pDR1602 mit einer Mutation bei Asn-184;
- 3) pDR1603 mit einer Mutation bei Asn-448;
- 4) pDR1604 mit Mutationen bei Asn-117 und -448;
- 5) pDR1605 mit Mutationen bei Asn-184 und -448;
- 6) pDR1606 mit drei Mutationen.
Das Plasmid pDR1601 wurde dadurch aufgebaut, daß man das
Hind III-Teil-Eco RI-Fragment, das die Asn-117-Mutation des
Klons Nr. 2 (RF) enthält, einer ersten Reinigung unterzog
und es dann in mit Hind III + Eco RI restringiertes pUC12
inserierte. Das erhaltene Plasmid wurde dann der Restriktion
mit Xho II und dann teilweise mit Eco RI unterzogen, wonach
das die tPA-Sequenz enthaltende 1086 bp-Fragment gereinigt
wurde. Dieses Fragment wurde dann in einer Dreifachbindung
mit einem 532 bp-Eco RI-Xba I-Fragment aus pDR1296 (mit der
3′-tPA-Sequenz) und dem großen Xba I-Bgl II-Fragment aus
pDR1298 (mit pUC18, TPI-Promotor und MFα1-Sequenzen) ver
bunden, wodurch das Plasmid pDR1601 erzeugt wurde.
Das Plasmid pDR1602 wurde auf ähnliche Weise unter Verwen
dung des Klons Nr. 10 (RF) als Quelle der Mutante 5′-tPA-
Fragmente (Hind III-Teil-Eco RI) erzeugt.
Das Plasmid pDR1603 wurde durch Reinigung des 3′-mutanten
tPA-Fragments (Eco RI-Xba I aus Klon Nr. 24/RF/) und Ver
bindung desselben in einer dreiteiligen Verbindung mit dem
Xba I-Bgl II-Fragment aus pDR1298 und dem Bgl II-Teil-Eco
RI-5′-tPA-Fragient aus pDR1296 aufgebaut.
Das Plasmid pDR1604 wurde, wie für pDR1601 beschrieben,
aufgebaut, wobei das Eco RI-Xba I-Fragment aus Klon Nr. 24
(RF) anstelle des entsprechenden Fragments aus pDR1296
verwendet wurde.
Das Plasmid pDR1605 wurde, wie für pDR1602 beschrieben,
hergestellt, wobei anstelle des entsprechenden Fragments aus
pDR1296 das Eco RI-Xba I-Fragment aus Klon Nr. 24 (RF)
verwendet wurde.
Das Plasmid pDR1606 wurde durch Verbindung der Xba I-Bgl II-
Fragments aus pDR1298 mit einem Bgl II-Taq I-Fragment (mit
der Mutation bei Asn-117) aus pDR1601 und einem Teil-Taq I-
Xba I-Fragment (mit Mutationen bei Asn-184 und -448) aus
pDR1605 hergestellt.
Alle Plasmide der pDR1600-Reihe wurden mit Sph I und Xba I
aufgespalten, die tPA-Sequenzen wurden gereinigt und nach
M13mp8 zwecks Sequenzüberprüfung geklont.
Plasmide mit den gewünschten Sequenzen wurden ausgewählt, um
für den Aufbau von Hefeexpressionsvektoren verwendet zu
werden. Die Plasmide pDR1701-1706 wurden aus pDR1601-1606
dadurch gewonnen, daß die Plasmide der pDR1600-Reihe mit
Sph I und Xba I aufgespalten wurden, wonach die tPA-Fragmen
te gereinigt und mit dem Sph I + Xba I-restringierten
pDR1107 verbunden wurden. Die Plasmide der pDR1700-Reihe
wurden dann mit Bam HI und Hind III aufgespalten, wonach die
tPA-Expressionseinheiten in das Bam HI + Hind III-restrin
gierte YEp13 eingefügt wurden, wodurch die Plasmide pDR1801-
1806 entstanden.
Die Plasmide pDR1801, pDR1802, pDR1803 und pDR1804 wurden
für die Transformation des Stammes E8-11c von S. cerevisiae
verwendet. Die transformierten Zellen wurden in einem leu
freien Medium, das 2% Glukose enthielt, bei 30°C in einem
Schüttelkolben unter Rühren mit 250 UpM gezüchtet. Während
der gesamten Züchtungsdauer wurden in Abständen Proben
entnommen und diese nach dem ELISA-Verfahren auf tPA-Poly
peptid und nach dem Fibrinolyseverfahren auf ihre biologi
sche Aktivität hin untersucht. Die erhaltenen Daten wurden
mit den Standarddaten eines gereinigten tPA verglichen. Die
nachstehend angeführten Untersuchungsergebnisse zeigen, daß
jede der drei Einzelabschnittmutationen (pDR1801, 1802 und
1803) eine gesteigerte biologische Aktivität bewirkt (s.
Tabelle 1).
Claims (3)
1. Gewebeplasminogenaktivator aus Melanomzellen nach Bowes,
dadurch gekennzeichnet, daß folgende
Asparagin-Reste in Glutaminreste umgewandelt werden:
Asparagin-117, Asparagin-184, Asparagin-448, Asparagin-117 und Asparagin-448, sowie Asparagin-184 und Asparagin-448.
Asparagin-117, Asparagin-184, Asparagin-448, Asparagin-117 und Asparagin-448, sowie Asparagin-184 und Asparagin-448.
2. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeplasminogenaktivators
in Hefe, bei dem man eine durch ein DNS-Gebilde transformierte
Hefekultur züchtet, wobei das Gebilde einen Hefegenpromotor
und eine DNS-Sequenz enthält, die den Gewebeplasminogenaktiva
tor kodiert, dadurch gekennzeichnet,
daß tpA-Mutanten kodierende DNS mit ein-, zwei- oder dreifa
chen Mutationen durch Substitution der tPA-Kodierungssequenzen
in pDR1298 aufgebaut werden, und zwar die Plasmide
- 1) pDR1601 mit einer Mutation bei Asn-117;
- 2) pDR1602 mit einer Mutation bei Asn-184;
- 3) pDR1603 mit einer Mutation bei Asn-448;
- 4) pDR1604 mit einer Mutation bei Asn-117 und -448;
- 5) pDR1605 mit einer Mutation bei Asn-184 und -448;
- 6) pDR1606 mit drei Mutationen,
wobei die Expression der DNS-Sequenz unter der Kontrolle des
Promotors erfolgt, und daß das Gebilde ferner eine zwischen
dem Promotor und der DNS-Sequenz angeordnete Leadersequenz
aufweist.
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-
1985
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