DE3537176C2 - Gewebeplasminogenaktivator und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Gewebeplasminogenaktivator und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die Blockierung des Blutstroms im Gefäßsystem durch Bildung von Blutpfropfen ist eine der häufigsten Krankheits- und Todesursachen. Am folgenschwersten ist dabei die Unterbre­ chung der Blutzufuhr zum Herzen (Herzattacke, zum Gehirn (Gehirnschlag) und zur Lunge (Lungenembolie). Zur Bekämpfung dieser Probleme wird eine Gruppe von biologischen Verbindun­ gen, den sogenannten Plasminogenaktivatoren, eingesetzt, welche die Blutpfropfen abbauen, was als fibrinolytisches System bekannt ist. Über verschiedene Mechanismen erzeugen die Plasminogenaktivatoren das aktive Enzym Plasmin, das seinerseits das Fibrinnetzwerk eines Blutpfropfens unter Bildung löslicher Produkte abbaut. Die beiden im Handel erhältlichen, für die Thrombolysetherapie in Frage kommenden Arzneimittel, die als Plasminogenaktivatoren wirken, sind Streptokinase, ein Bakterienprotein, und Urokinase, eine aus menschlichem Urin isolierte Serinprotease. Beide Arznei­ mittel haben jedoch einen erheblichen Nachteil - sie wirken nicht spezifisch auf Blutpfropfen. Neben Fibrin bauen sie nämlich auch noch Blutproteine, wie Fibrinogen, Prothrombin, Faktor V und Faktor VIII ab, was zu inneren Blutungen als Nebenwirkung der Behandlung führen kann. Die Verabreichung von Streptokinase und Urokinase erfolgt daher gewöhnlich durch unmittelbare Einführung in den Pfropfen über einen Katheter. Da dieses Verfahren kompliziert ist, wird es nur selten angewandt.

Andererseits sind die Plasminogenaktivatoren aus normalen und Tumorgeweben extrahiert worden und werden gegenwärtig je nach der Quelle, aus der sie stammen, eingeteilt in Plasmi­ nogenaktivatoren vom Urokinasetyp (uPA) und Plasminogen­ aktivatoren vom Gewebetyp (tPA). Letztere scheinen im Ver­ gleich zu den ersteren eine höhere Affinität zu Fibrin aufzuweisen. Es ist daher wünschenswert, zur Verbesserung der Versorgung mit einer Vielzahl von tPA diese durch gen­ technische Methoden herzustellen.

Pennica et al. (Nature, 301: 214-221, 1983) haben die DNS- Kodierungssequenz einer in E. coli geklonten tPA-cDNS unter Verwendung von mRNS aus Melanomzellen (nach Bowes) beschrie­ ben. Wallen et al. (Eur. J. Biochem., 132: 681-686, 1983) haben zwei Varianten der einkettigen Form von Plasminogen­ aktivatoren aus einer menschlichen Melanomzellinie (nach Bowes) gereinigt und gekennzeichnet. Die partielle Aminosäu­ resequenz-Analyse der beiden Varianten hat ergeben, daß diese sich darin unterscheiden, daß eine davon am N-Terminus zusätzlich drei Aminosäurereste aufweist. Diese zusätzliche Tripeptidsequenz, Gly-Ala-Arg, wurde, wie sich herausstell­ te, vom Molekül durch Plasmin abgespalten, wodurch die kürzere Variante entstand, die eine aminoendständige Amino­ säuresequenz aufweist, die derjenigen entspricht, die von der von Pennica et al. beschriebenen Nucleotidsequenz abge­ leitet wurde.

Obwohl bisher in Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) eine Anzahl heterologer Proteinprodukte expressiert worden ist, kann nicht vorhergesagt werden, ob auch ähnliche Ergebnisse für andere Proteine erzielt werden können. Die Expression heterologer Gene in transformierten Zellen beruht auf einer Anzahl von Wechselwirkungen zwischen der Wirtszelle und den Fremdgenen, assoziierten Regulationsgenen und den Genproduk­ ten. Derartige Wechselwirkungen werden teilweise durch die Wirtsspezies definiert. Genspezifische Wechselwirkungen umfassen das Codon-usage-bias, die Erkennung von Promotor- und Terminatorsignalen sowie die Stabilität und die Kopien­ zahl der extrachromosomalen Elemente (z. B. von Plasmiden), welche die Fremdgene tragen. Proteinspezifische Wechselwir­ kungen umfassen enzymatische Modifikationen der Protein­ produkte, wie Verarbeitung der Precursorformen, Glykosylie­ rung, Entstehung der Disulfidbindung usw. Außerdem können die einzelnen Arten von Wirtsorganismen sich noch in ihrer Fähigkeit, heterologe Genprodukte zu sezernieren, vonein­ ander unterscheiden.

Je nach dem konkreten in Frage kommenden Wirt-Produkt-System sind derartige spezifische Modifikationen wünschenswert oder unerwünscht. Die einzelnen Arten können sich hinsichtlich ihrer Toleranz gegenüber der Anwesenheit von Fremdproteinen oder den für die Erzeugung oder Isolierung eines konkreten Proteins erforderlichen Kulturbedingungen im großtechnischen Umfang voneinander unterscheiden. Native Genprodukte können in manchen Fällen das gewünschte Produkt verunreinigen, was die Reinigung verteuert und/oder schwierig macht.

Es wurde daher nach einem Verfahren zur Erzeugung von Plas­ minogenaktivatoren im eukaryotischen Organismus Saccharomy­ ces cerevisiae und in anderen Hefen zur Ermittlung der genannten Wechselwirkung und zu ihrer Nutzung für die groß­ technische Produktion von Plasminogenaktivatoren gesucht. Im allgemeinen können diese Wirt-Produkt-Wechselwirkungen nicht a priori vorhergesagt werden und erfordern intensive For­ schungsarbeit im Labor bzw. eine Produktion in großtechni­ schem Umfang.

Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Gewebeplasminogenakti­ vator (tPA) in Hefe.

Die Erfindung betrifft den menschlichen Gewebeplasminogen­ aktivator (tPA) aus Melanomzellen nach Bowes, der dadurch gekennzeichnet ist, daß folgende Asparagin-Reste in Gluta­ minreste umgewandelt sind:
Asparagin-117, Asparagin-184, Asparagin-448, Asparagin-117 und Asparagin-448, sowie Asparagin-184 und Asparagin 448.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators in Hefe, bei dem man eine durch ein DNS-Gebilde transformierte Hefekultur züchtet, wobei das Gebilde einen Hefegenpromotor und eine DNS-Sequenz enthält, die den Gewebeplasminogenaktivator kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß tPA-Mutanten kodierende DNS mit ein-, zwei- oder dreifachen Mutationen durch Substitution der tPA-Kodierungssequenzen in pDR1298 aufgebaut werden und zwar die Plasmide

• 1) pDR1601 mit einer Mutation bei Asn-117;
• 2) pDR1602 mit einer Mutation bei Asn-184;
• 3) pDR1603 mit einer Mutation bei Asn-448;
• 4) pDR1604 mit Mutationen bei Asn-117 und -448;
• 5) pDR1605 mit Mutationen bei Asn-184 und -448;
• 6) pDR1606 mit drei Mutationen,

wobei die Expression der DNS-Sequenz unter der Kontrolle des Promotors erfolgt, und daß das Gebilde ferner eine zwischen dem Promotor und der DNS-Sequenz angeordnete Leadersequenz aufweist.

Die hier verwendeten Ausdrücke "Vektor", "Plasmid" und "DNS- Gebilde" sind untereinander austauschbar. Alle diese Aus­ drücke bezeichnen ein DNS-Molekül, das vom Menschen so modifiziert wurde, daß es DNS-Segmente enthält, die in einer Weise miteinander kombiniert und aneinander angrenzend angeordnet wurden, wie sie sonst in der Natur nicht vorkom­ men, oder einen Klon eines solchen Moleküls. Gewöhnlich enthalten derartige Vektoren genetische Information, die bei der Transformierung in einen Wirtsorganismus, wobei wenig­ stens ein Gen im Wirtsorganismus exprimiert werden soll, ihre eigene Replikation gewährleistet, sowie andere geneti­ sche Elemente, die für die Expression des interessierenden Gens erforderlich sind, wie Promotoren, Transkriptionsini­ tiationssites und Transkriptionsterminatoren. Die Vektoren können außerdem noch Sequenzen zur Steuerung der Expression des (der) zu erprimierenden Gens (Gene) enthalten.

Der Ausdruck "Expression" wird in der Anmeldung im üblichen Sinne verwendet und bedeutet die Bedingung, bei der ein durch ein Gen im Wirtsorganismus kodiertes Proteinprodukt vom Organismus synthetisiert wird. Die Anwesenheit eines konkreten Gens mit sämtlichen erforderlichen Steuerungs­ bereichen im Wirtsorganismus bedeutet nicht a priori, daß das Gen unbedingt exprimiert wird. Es kann eine Reihe von Gründen vorliegen, von denen viele noch nicht vollständig geklärt sind, die dafür verantwortlich sind, daß ein Gen in einem transformierten Organismus nicht exprimiert wird. Außerdem kann selbst dann, wenn ein gewisser Expressions­ grad vorliegt, noch nicht mit Sicherheit das Ausmaß der Expression vorhergesagt werden. So kann es zwar in manchen Fällen zu einer Expression kommen, diese kann jedoch so gering sein, daß das Proteinprodukt nicht in einer ausrei­ chenden Menge produziert wird.

Der Ausdruck "Leadersequenz" bezieht sich auf den Teil eines Gens, der das Signalpeptid oder ein Pre-Propeptid kodiert. Ein Signalpeptid dirigiert ein frisch synthetisiertes Pro­ tein auf einen zellulären Sekretionsweg und wird gewöhnlich vom Proteinrest während dieses Prozesses abgespalten. Bin Pre-Propeptid wird im allgemeinen zu einem späteren Zeit­ punkt des Sekretionsprozesses entfernt. Der Ausdruck "Lea­ dersequenz" kann sich in der Anmeldung auch auf Teile einer natürlich vorkommenden Leadersequenz beziehen.

Für die Expression heterologer Proteine in Hefe ist es wünschenswert, daß die Expression unter der Kontrolle eines der Hefe eigenen Promotors erfolgt. Ein bevorzugter Promotor ist die Promotorregion des Gens der Hefe-Triosephosphatiso­ merase (TPI) (Alber und Kawasaki, J. Molec. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982). Ein Vorteil der Verwendung des Hefe-TPI- Promotors ist der, daß ein hoher Transkriptionsgrad erzielt werden kann, so daß ein erheblicher Anteil des von den Hefezellen produzierten Gesamtproteins für die Erzeugung des gewünschten Proteins verwendet werden kann.

Es können aber auch andere Promotorsequenzen für die Steue­ rung der Produktion von tPA in einer transformierten Kultur von S. cerevisiae durch Modifizierung der erfindungsgemäßen Vektoren zum Einbau dieser Promotoren verwendet werden. Derartige für erfindungsgemäße Zwecke in Frage kommende Promotoren sind solche von Genen von S. cerevisia., welche für Alkohol-Dehydrogenase-I (Ammerer, Meth. in Enzymology 101: 192-201, 1983), Alkohol-Dehydrogenase-II (Williamson et al., Nature 283: 214-216, 1980), Pyruvatkinase, Phospho­ glukoseisomerase, Phosphoglyceratmutase, Hexokinase-1, Hexokinase-2, Glukokinase, Phosphofruktokinase, Aldolase usw. oder Teile davon kodieren.

Die erfindungsgemäßen DNS-Gebilde enthalten ferner vorzugs­ weise eine Transkriptionsterminatorsequenz im 3′-Bereich des tPA-Strukturgens. Ein derartiger bevorzugter Terminator ist der des TPI-Gens von S. cerevisiae.

Für die Steuerung der Expression und Sekretion des tPA aus der Wirtszelle in Frage kommende Vektoren enthalten zusätz­ lich auch noch Gensequenzen, welche die sekretorischen Signale kodieren, wie z. B. den Pre-Pro-Bereich des durch das Gen MFα1 kodierten α-Faktors des Matingpheromons der Hefe (Kurjan und Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982) oder die Signalpeptidregionen der Hefegene PHO5, SUC2 und BAR1, sowie die Pre-Pro-Region des tPA-Gens selbst.

Die erfindungsgemäß beschriebenen, in S. cerevisiae trans­ formierten Vektoren steuern die Erzeugung eines Proteins mit der Aktivität des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators.

Die erfindungsgemäß hergestellten Proteine können die Se­ quenz einer der beiden vorherrschenden Formen von natürlich vorkommendem tPA aufweisen oder die Aminosäuresequenz kann so abgeändert sein, daß sie ein Protein ergibt, das die biologische Aktivität des tPA beibehält, jedoch auch noch andere wünschenswerte Eigenschaften aufweist. So z. B. können die Glykosylierungsabschnitte durch abschnittspezifische Mutagenese zur Verminderung der Glykosylierung des in der Hefe erzeugten tPA-Polypeptids modifiziert werden. Eine derartige Modifikation kann zu einer verbesserten Expression und/oder zu erhöhter spezifischer Aktivität führen. Außerdem können auch noch z. B. aufgrund von genetischem Polymorphis­ mus natürlich vorkommende Varianten vorliegen.

Mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformierte Hefezellen können unter Standardkulturbedingungen gezüchtet werden. Ein bevorzugtes Kulturmedium ist mit Glukose bei einer Konzen­ tration von 2 bis 6% supplementiertes -leu-Medium. Besonders bevorzugt enthält dieses Medium außerdem noch zur Einstel­ lung des pH auf 5,0 bis 6,0 während der Züchtung einen Puffer. Besonders bevorzugte Puffer sind dabei 0,1 M Kalium­ hydrogenphthalat (pH 5,5) und 0,1 M Natriumsukzinat (pH 5,5).

Der erfindungsgemäß hergestellte tPA kann verschieden stark glykosyliert werden oder kann unglykosyliert bleiben. Da die Anwesenheit von Kohlenhydraten, die fibrinolytische Aktivi­ tät stört, kann es sich in manchen Fällen als wünschenswert erweisen, sie in vitro zu entfernen. Eine bevorzugte Methode zur Entfernung von Kohlenhydraten ist die Behandlung mit Endoglykosidase H.

Erfindungsgemäß wurden die üblichen biochemischen Techniken angewandt. Die verwendeten Restriktionsendonukleasen stamm­ ten von Bethesda Research Laboratories, New England BioLabs, und Boehringer Mannheim Biochemicals und wurden entsprechend den Herstellervorschriften verwendet, im allgemeinen unter Zusatz von Pankreas-RNase (10 µg/ml). Die T4-DNS-ligase stammte von Bethesda Research Laboratories und Boehringer Mannheim und wurde entsprechend den Herstellervorschriften verwendet. Die M13- und pUC-Wirtsstämme und -vektoren (mit Ausnahme von pUC18 und pUC19) stammten von Bethesda Research Laboratories. Die M13-Klonung erfolgte wie von Messing beschrieben (Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1983). Die DNS- Polymerase-I (Klenow-Fragment) wurde wie von Maniatis et al. beschrieben verwendet (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die E. coli- Kulturen wurden nach der Methode von Bolivar et al. trans­ formiert (gene 2: 95-113, 1977). Die S. cervisiae-Kulturen wurden nach Beggs′ Methode (Nature 275: 104-108, 1978) in ihrer nach MacKay modifizierten Form (Meth. in Enzymology, 101 : 325, 1983) transformiert.

Beispiel Abschnittspezifische Mutagenese des Plasminogenaktivators

Der Gewebeplasminogenaktivator enthält vier potentielle Glykosylierungsabschnitte (As-Sequenz Asn-X-(^Ser _Thr)). Gemäß Pohl et al. (Biochemistry 23: 3701-3707, 1984) werden drei dieser Abschnitte (Asn-117, -184 und -448) in aus Melanom­ zellen nach Bowes erhaltenem tPA glykosyliert. Der vierte Abschnitt (Asn-218) ist in Bowes tPA nicht glykosyliert.

Der in Hefe erzeugte Plasminogenaktivator erweist sich aufgrund der Western blot-Analyse als stark glykosyliert. Dieser Umstand kann die Eignung des Produktes für die Be­ handlung des Menschen beeinträchtigen, da dieser es als Fremdprotein erkennen könnte. Es wird daher eine Methode zur Erzeugung modifizierter Formen von tPA in transformierter Hefe bereitgestellt, wobei die modifizierten Proteine ver­ glichen mit dem nicht modifizierten in Hefe erzeugten tPA verminderte Glykosylierung aufweisen, die biologische Akti­ vität dabei jedoch erhalten bleibt. Die modifizierten Plas­ minogenaktivatoren weisen außerdem ein vermindertes Potenti­ al an antigenen Eigenschaften im Hinblick auf den Menschen auf. Durch Umwandlung der Asn-Reste an den Glykosylierungs­ abschnitten in andere Aminosäurereste kann die Glykosylie­ rung blockiert werden. Besonders bevorzugt ist dabei die Umwandlung der Asn-Reste in Gln-Reste. Außerdem können zur Blockierung der Glykosylierung von in Hefe erzeugtem Protein auch noch andere Abänderungen in der Sequenz durchgeführt werden. So z. B. kann ein Prolinrest in der zweiten Stellung der Sequenz Asn-X-(^Ser _Thr) die Glykosylierung in Hefe verhin­ dern (Marshall, Biochem. Soc. Symp. 40: 17-26, 1974). In dieser Position können auch noch weitere Substitutionen durchgeführt werden. Auch kann die dritte Aminosäure des Glykosylierungsabschnitts abgeändert werden.

Abänderungen in der den tPA kodierenden DNS-Sequenz können nach der Methode der abschnittspezifischen Mutagenese im wesentlichen nach Zoller und Smith, Manual for Advanced Techniques in Molecular Clonin Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983, durchgeführt werden. Zur Modifizierung eines oder mehrerer Glykosylierungsabschnitte können die Abänderungen in den Nucleotiden einzeln oder in Kombination miteinander erfolgen. Außerdem können mutierte Sequenzen durch Restriktion von Vektoren mit Restriktionsendonukleasen unter Durchführung von Mutationen und Verbindung der so erhaltenen Fragmente zu den gewünschten Produkten kombiniert werden. Auch können in einer einzigen Mutagenesestufe mehre­ re Abänderungen durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zusätzliche Nucleotidsubstitutionen durchgeführt, welche die natürlich vorkommenden Kodone an den Glykosylierungsabschnitten in die bevorzugten Hefekodone umwandeln.

Versuchsteil

Die geklonte tPA-cDNS wurde in zwei Fragmente subgeklont, um eine abschnittspezifische Mutagenese vorzubereiten. Um den 5′-Bereich der tPA-Sequenz zu erhalten, wurde ca. 1 µg des Plasmids pDR1296 zwei Stunden bei 37°C mit einer Einheit von Bgl II in einem Bgl II-Puffer (BRL) abgespalten. Danach wurde eine Einheit von Eco RI zugefügt und nach einer zu­ sätzlichen Inkubationszeit von 10 und 20 Minuten wurden aliquote Mengen entfernt. Die DNS-Fragmente wurden auf einem 1%igen Agarosegel isoliert und das 1086 bp-Bgl II-partiell- Eco RI-Fragment wurde durch eine NA-45 DEAE-Membrane (Fa. Schleicher & Schuell) gemäß Herstellervorschrift elektroelu­ iert. Die 3′ -Kodierungssequenz wurde durch Aufspaltung von pDR1296 mit Xba I und Eco RI in 0,05 M Tris, pH 7,4, 6 mM MgCl₂ und 0,05 M NaCl erhalten. Die Fragmente wurden auf einem 1%igen Agarosegel isoliert und das 532 bp-Eco RI-Xba I-Fragment wurde wie oben eluiert. Die Fragmente wurden mit CHCl₃ extrahiert und mit Phenol und EtOH ausgefällt. Das gereinigte Bgl II-Eco RI-Fragment wurde dann an das mit Bam HI + Eco RI gespaltene M13mp8 (Replikationsform oder RF) dadurch angelagert, daß die beiden Fragmente 5 Stunden bei Raumtemperatur mit T₄DNS-Ligase inkubiert wurden. Das Eco RI-Xba I-Fragment wurde in gleicher Weise an das von Eco RI + Xba I aufgespaltene M13mp19 (Replikationsform) angela­ gert.

Die rekombinierten Phagenklone wurden für die Transfektion des kompetenten E. coli JM 101 verwendet. Die Phagen-DNS wurde von Plaques gereinigt und nach der Dideoxymethode unter Verwendung des Primers ZC87 sequenziert, um die Anwe­ senheit der richtigen cDNS-Sequenz festzustellen.

Die abschnittspezifische Mutagenese wurde an einsträngigen M13-Matrizen durchgeführt, wobei als mutagene Primer ZC294, ZC295 und ZC297 (s. Tabelle 2) verwendet wurden, um Änderun­ gen bei Asn-117, -184 bzw. -448 zu erzeugen. Die Primer sollten die Änderung potentieller Glykosylierungsabschnitte durch Änderung der Asn-Kodons in Gln-Kodons sowie durch Änderung anderer Kodons von Glykosylierungsabschnitten in solche, die von Hefe bevorzugt werden, bewirken. Die Primer wurden mit der Sequenz der Matrizen verglichen, um Bereiche mit sekundärer Homologie zu vermeiden, welche zu unerwünsch­ ten Mutationen führen könnten. Die Glykosylierungsabschnitte bei Asn-117 und -184 wurden dadurch verändert, daß man als Matrize die M13mp8-Rekombinante mit dem Bgl II-Eco RI-Ein­ schub verwendete. Der Abschnitt bei Asn-448 wurde durch Verwendung der M13mp19-Rekombinante, die den Eco RI-Xba I- Einschub enthält, als Matrize verändert. Bei allen Nutagene­ sereaktionen wurde als Sekundärprimer der Universal-M13- Primer ZC87 verwendet. 20 pmol des phosphorylierten mutage­ nen Primers und 20 pmol des Sekundärprimers wurden mit 1 pmol der einsträngigen Matrize in 10 µl von 20 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl und 1 mM DTT vereinigt und 10 Minuten bei 65°C und dann 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann auf Eis ausgebracht. Zu der auf diese Weise gewonnenen DNS wurden 10 µl 20 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, enthaltend 1 mM dNTPs, 2,5 Einheiten Kle­ now-Polymerase und 3,5 Einheiten DNS-Ligase zugefügt und das Gemisch 3 Stunden bei 15°C inkubiert. Die DNS wurden dann für die Transfektion in kompetentes E. coli JM101 verwendet, wonach die Zellen auf YT-Agar plattiert und bei 37°C inku­ biert wurden. Die Plaques wurden dann bei einer Temperatur des mutagenen Primers von -4°C eine Stunde in einer 6X SSC, 10X-Denhardtschen Lösung vorhybridisiert und dann bei -4°C in derselben Lösung mit dem ³²P-markierten mutagenen Primer hybridisiert.

Die Filter wurden über Nacht der Röntgenstrahlung ausge­ setzt. Dann wurde noch ein zusätzlicher Waschvorgang bei einer um 5°C höheren Temperatur als für die Identifizierung von Plaquemutanten erforderlich durchgeführt. Die nachste­ henden Phageklonmutanten wurden identifiziert:
Nr. 2: M13mp8 mit dem bei Asn-117 eine Mutation enthaltenden Bgl II-Teil-Eco RI-Fragment;
Nr. 10: M13mp8 mit dem bei Asn-184 eine Mutation enthalten­ den Bgl II-Teil-Eco RI-Fragment;
Nr. 24: M13mp19 mit dem bei Asn-448 eine Mutation enthalten­ den Eco RI-Xba I-Fragment.

Danach wurden tPA Mutanten kodierende DNS mit ein-, zwei- oder dreifachen Mutationen durch Substitution der tPA-Kodie­ rungssequenzen in pDR1298 aufgebaut. Es wurden folgende Plasmide aufgebaut:

• 1) pDR1601 mit einer Mutation bei Asn-117;
• 2) pDR1602 mit einer Mutation bei Asn-184;
• 3) pDR1603 mit einer Mutation bei Asn-448;
• 4) pDR1604 mit Mutationen bei Asn-117 und -448;
• 5) pDR1605 mit Mutationen bei Asn-184 und -448;
• 6) pDR1606 mit drei Mutationen.

Das Plasmid pDR1601 wurde dadurch aufgebaut, daß man das Hind III-Teil-Eco RI-Fragment, das die Asn-117-Mutation des Klons Nr. 2 (RF) enthält, einer ersten Reinigung unterzog und es dann in mit Hind III + Eco RI restringiertes pUC12 inserierte. Das erhaltene Plasmid wurde dann der Restriktion mit Xho II und dann teilweise mit Eco RI unterzogen, wonach das die tPA-Sequenz enthaltende 1086 bp-Fragment gereinigt wurde. Dieses Fragment wurde dann in einer Dreifachbindung mit einem 532 bp-Eco RI-Xba I-Fragment aus pDR1296 (mit der 3′-tPA-Sequenz) und dem großen Xba I-Bgl II-Fragment aus pDR1298 (mit pUC18, TPI-Promotor und MFα1-Sequenzen) ver­ bunden, wodurch das Plasmid pDR1601 erzeugt wurde.

Das Plasmid pDR1602 wurde auf ähnliche Weise unter Verwen­ dung des Klons Nr. 10 (RF) als Quelle der Mutante 5′-tPA- Fragmente (Hind III-Teil-Eco RI) erzeugt.

Das Plasmid pDR1603 wurde durch Reinigung des 3′-mutanten tPA-Fragments (Eco RI-Xba I aus Klon Nr. 24/RF/) und Ver­ bindung desselben in einer dreiteiligen Verbindung mit dem Xba I-Bgl II-Fragment aus pDR1298 und dem Bgl II-Teil-Eco RI-5′-tPA-Fragient aus pDR1296 aufgebaut.

Das Plasmid pDR1604 wurde, wie für pDR1601 beschrieben, aufgebaut, wobei das Eco RI-Xba I-Fragment aus Klon Nr. 24 (RF) anstelle des entsprechenden Fragments aus pDR1296 verwendet wurde.

Das Plasmid pDR1605 wurde, wie für pDR1602 beschrieben, hergestellt, wobei anstelle des entsprechenden Fragments aus pDR1296 das Eco RI-Xba I-Fragment aus Klon Nr. 24 (RF) verwendet wurde.

Das Plasmid pDR1606 wurde durch Verbindung der Xba I-Bgl II- Fragments aus pDR1298 mit einem Bgl II-Taq I-Fragment (mit der Mutation bei Asn-117) aus pDR1601 und einem Teil-Taq I- Xba I-Fragment (mit Mutationen bei Asn-184 und -448) aus pDR1605 hergestellt.

Alle Plasmide der pDR1600-Reihe wurden mit Sph I und Xba I aufgespalten, die tPA-Sequenzen wurden gereinigt und nach M13mp8 zwecks Sequenzüberprüfung geklont.

Plasmide mit den gewünschten Sequenzen wurden ausgewählt, um für den Aufbau von Hefeexpressionsvektoren verwendet zu werden. Die Plasmide pDR1701-1706 wurden aus pDR1601-1606 dadurch gewonnen, daß die Plasmide der pDR1600-Reihe mit Sph I und Xba I aufgespalten wurden, wonach die tPA-Fragmen­ te gereinigt und mit dem Sph I + Xba I-restringierten pDR1107 verbunden wurden. Die Plasmide der pDR1700-Reihe wurden dann mit Bam HI und Hind III aufgespalten, wonach die tPA-Expressionseinheiten in das Bam HI + Hind III-restrin­ gierte YEp13 eingefügt wurden, wodurch die Plasmide pDR1801- 1806 entstanden.

Die Plasmide pDR1801, pDR1802, pDR1803 und pDR1804 wurden für die Transformation des Stammes E8-11c von S. cerevisiae verwendet. Die transformierten Zellen wurden in einem leu­ freien Medium, das 2% Glukose enthielt, bei 30°C in einem Schüttelkolben unter Rühren mit 250 UpM gezüchtet. Während der gesamten Züchtungsdauer wurden in Abständen Proben entnommen und diese nach dem ELISA-Verfahren auf tPA-Poly­ peptid und nach dem Fibrinolyseverfahren auf ihre biologi­ sche Aktivität hin untersucht. Die erhaltenen Daten wurden mit den Standarddaten eines gereinigten tPA verglichen. Die nachstehend angeführten Untersuchungsergebnisse zeigen, daß jede der drei Einzelabschnittmutationen (pDR1801, 1802 und 1803) eine gesteigerte biologische Aktivität bewirkt (s. Tabelle 1).

Tabelle 1

Tabelle 2

Claims (3)

1. Gewebeplasminogenaktivator aus Melanomzellen nach Bowes, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Asparagin-Reste in Glutaminreste umgewandelt werden:
Asparagin-117, Asparagin-184, Asparagin-448, Asparagin-117 und Asparagin-448, sowie Asparagin-184 und Asparagin-448.

2. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeplasminogenaktivators in Hefe, bei dem man eine durch ein DNS-Gebilde transformierte Hefekultur züchtet, wobei das Gebilde einen Hefegenpromotor und eine DNS-Sequenz enthält, die den Gewebeplasminogenaktiva­ tor kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß tpA-Mutanten kodierende DNS mit ein-, zwei- oder dreifa­ chen Mutationen durch Substitution der tPA-Kodierungssequenzen in pDR1298 aufgebaut werden, und zwar die Plasmide

• 1) pDR1601 mit einer Mutation bei Asn-117;
• 2) pDR1602 mit einer Mutation bei Asn-184;
• 3) pDR1603 mit einer Mutation bei Asn-448;
• 4) pDR1604 mit einer Mutation bei Asn-117 und -448;
• 5) pDR1605 mit einer Mutation bei Asn-184 und -448;
• 6) pDR1606 mit drei Mutationen,

wobei die Expression der DNS-Sequenz unter der Kontrolle des Promotors erfolgt, und daß das Gebilde ferner eine zwischen dem Promotor und der DNS-Sequenz angeordnete Leadersequenz aufweist.