DE3650706T2 - Substituierte Dicarboxypyridin-Verbindungen - Google Patents

Substituierte Dicarboxypyridin-Verbindungen

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Description

  • Diese Erfindung liegt auf den Gebieten der Chemie und Biologie und betrifft eine Gruppe von arylsubstituierten Pyridinverbindungen und deren Verwendung als Zwischenprodukte im Bezug auf Komponenten von fluoreszierende Chelatmarkierungen für Fluoreszenzassay-Techniken.
  • Fluoreszenzassay-Techniken finden eine zunehmende Anwendung in chemischen, biochemischen und medizinischen Analysen. Fluoreszenzmeßverfahren sind von sich aus extrem empfindlich. Die Empfindlichkeit von Fluoreszenzassays ist in der Praxis jedoch durch das Vorkommen von Hintergrundfluoreszenz eingeschränkt.
  • US-A-4,150,295 und 4,058,732 und ein auf den Seiten 67- 80 erscheinendes Kapitel in Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Herausgeber Knapp et al. (1978, Elsevier/North Holland Biomedical Press) offenbaren das allgemeine Konzept, daß Hintergrundfluoreszenz relativ kurzlebig ist und daß man als eine gemessene fluoreszierende Spezies vorteilhaft Materialien mit einer langlebigeren Fluoreszenz verwenden kann. Diese Arbeit stellt ferner heraus, daß man bei Verwendung einer intermittierenden Anregungsquelle und einer zeitgekoppelten Messung der Fluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz während der Messung der gewünschten Fluoreszenz im wesentlichen vermeiden oder zurückdrängen könnte.
  • Chelate von Seltenerdelementen wurden auf dem Gebiet als Materialien mit einer langlebigen Fluoreszenz identifiziert. Solche Materialien umfassen ein Seltenerdmetallion wie Terbium oder Europium, das Chelate bildet mit einem oder mehreren Liganden wie Aminopolysäuren (siehe US-A- 4,352,751 von Wieder und Wollenberg), "Heteroatom enthaltenden Gruppen" einschließlich Iminodiacetat-substituierten Phenolen, Coumarinen und Phenanthrolinen (siehe Eastman Kodak EP-A-0058875) und aromatischen Diketonen (siehe DE-A- 2,628,158), um eine Anzahl an repräsentativen Veröffentlichungen herauszustellen.
  • Der Stand der Technik erkennt, daß die folgenden Eigenschaften in einer chelatbildenden Gruppe gewünscht sind.
  • 1. Sie sollte einen stabilen Chelatkomplex mit dem Seltenerdelement bilden - d. h. mit einer Stabilitätskonstante (log K) von 17 oder mehr.
  • 2. Der fluoreszierende Chelatkomplex mit dem Seltenerdelement sollte eine langlebige Fluoreszenz besitzen, das heißt, eine Fluoreszenz, die in nicht nennenswertem Maß abgeklungen ist, wenn die Hintergrundinterferenz bereits abgeklungen ist.
  • 3. Die Fluoreszenzanregung sollte bei so langen Wellenlängen wie möglich stattfinden - vorzugsweise bei 300 nm oder größer, um so eine Interferenz zu vermeiden, die üblicherweise in biologischen Proben bei Wellenlängen von ungefähr 270 nm stattfindet.
  • 4. Der fluoreszierende Komplex sollte eine intensive Emission besitzen - d. h. er sollte eine hohe Quantenausbeute besitzen.
  • Zusätzlich sollten die Materialien Löslichkeit, chemische Stabilität und andere Eigenschaften besitzen, die mit der Natur der Proben (für gewöhnlich wäßrige Proben) mit der die Materialien verwendet werden kompatibel sind.
  • Trotz dieser Erkenntnis auf dem Gebiet mangelt es den zuvor beschriebenen Materialien im allgemeinen zumindest in gewissem Maße an einer oder mehrerer dieser Eigenschaften. Zum Beispiel stellt EP-A-0068875 heraus, daß die Fluoreszenz von Reagenzien wie aromatischen Diketonen (DE-A- 2,628,158) aufgrund eines Problems der "wäßrigen Stabilität" gequencht wird, während die phenolaromatischen Ketone, Coumarine und Phenanthroline (welche EP-A-0068875 speziell offenbart) einen Mangel an chemischer Stabilität und eine geringere Quantenausbeute aufgewiesen haben. Als eine Folge dieser Mängel wurde noch kein in großem Umfang anwendbares Reagenziensystem für Fluoreszenzassay-Techniken hergestellt.
  • Was benötigt wird, ist ein fluoreszierendes Chelatsystem, das diese Eigenschaften besser erfüllt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Zwischenprodukte für die Herstellung einer Familie von substituierten Pyridinderivaten, die in langlebige fluoreszierende Spezies mit Seltenerdmetallen eingebaut werden können. Verweise auf die allgemeine Klasse von substituierten Pyridinderivaten umfassen US-A-4,008,239, 3,970,662 und 3,907,808 ebenso wie Carbeteas und Williams, J. Heterocycl. Chern., 11(5), 819 (1974); Weller und Luellen, Tetrahedron Letters, Band 22, Nr. 44, S. 4381-84 (1981); Weller, Luellen und Weller J. Org. Chem., 47, 4803-06 (1982); J. C. Martin, J. Org. Chem., Band 47, S. 3761-3763 (1982); Chem. Abstr., Band 62, Nr. 12, Spalte 14619 (1965); und Beilsteins Handbuch der Organischen Chemie, 4. Auflage, E 3/4, Band 22, Teil 3, S. 2626 (1979). Die oben angegebene EP-A-0068875 ist ebenfalls von Interesse.
  • 2,6-Bis[N,N-di(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridin, das mit einem substituierten Aryl ringsubstituiert ist, ist eine Gruppierung, die für eine Verwendung als einen Liganden bei der Bildung von fluoreszierenden Chelaten besonders attraktiv ist (siehe die parallele EP-A-0 195 413).
  • Diese substituierten Pyridingruppierungen werden in Moleküle eingebaut, um so die Moleküle durch Fluoreszenz nachweisbar zu machen.
  • Eine spezielle, mit einem substituierten Aryl substituierte 2,6-[N,N-Bis-(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridin- Gruppierung besitzt die Formel
  • wobei n und n' unabhängig gleich 1 oder 2 sind, Ar ein Aryl ist, n" eine ganze Zahl ist, die gleich der Zahl an verfügbaren Bindungsstellen am Ar ist, M gleich Wasserstoff oder ein Metallion ist, und jeder der n" R und R' und R" unabhängig ausgewählt ist aus Wasserstoff; Elektronenabgebenden Gruppen, einschließlich niederem Alkoxy, niederem Alkyl, Amino, Dialkylamino, Aryl und Aryloxy; und einer verbindenden Gruppe, die eine kovalente Bindung einschließt, und einer überbrückenden Gruppe, die in der Lage ist, eine Verknüpfung mit dem Rest des Moleküls zur Verfügung zu stellen, unter der Voraussetzung, daß mindestens einer der n" R eine Elektronen-abgebende Gruppe ist und daß mindestens einer der R', R" und der n" R eine mit dem Rest des Moleküls verbindende Gruppe ist.
  • Der Rest des Moleküls kann ein biologisch aktives Material umfassen, das heißt, eine Hälfte eines biospezifischen (z. B. immunologischen) Paars, um auf diese Weise die Durchführung von biospezifischen Assays zu ermöglichen.
  • Diese Materialien bieten den Vorteil, daß sie Anregungswellenlängen besitzen, die bei 280 nm oder höher liegen, wobei Anregungswellenlängen von 310 nm bis 325 nm oder höher möglich sind, um so eine Hintergrundinterferenz zu vermeiden. Frühere Materialien, die Verschiebungen zu diesen Wellenlängen erreichten, verwendeten Strukturen, in denen aromatische Ringe mit Pyridinringen kondensiert waren. Beim Vergleich mit diesen kondensierten Ringmaterialien besitzen die vorliegenden Gruppierungen wesentlich verbesserte Quantenausbeuten. Zusätzlich sind die Materialien chemisch stabil, wasserlöslich und bilden hochstabile Metallkomplexe.
  • Die vorliegende Erfindung stellt mit einem substituierten Aryl substituierte 2,6-Dicarboxypyridinverbindungen als Zwischenprodukte bei der Herstellung der obigen 2,6-[N,N- Bis(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridin-Gruppierungen zur Verfügung. Die Zwischenverbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen die folgende allgemeine Formel
  • wobei Ar für Aryl steht, n" eine ganze Zahl ist, die gleich der Anzahl der zur Verfügung stehenden Bindungsstellen am Ar ist, wobei jeder der n" R, R' und R" unabhängig aus Wasserstoff; Elektronen-abgebende Gruppen, einschließlich C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-, Amino-, Dialkylamino-, Aryl- (einschließlich Aralkyl-) und Aryloxy- (einschließlich Aralkyloxy-)-gruppen; und verknüpfenden Gruppen ausgewählt ist; und R* und R** unabhängig aus Metallionen, Wasserstoff und C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppen ausgewählt sind, wobei mindestens einer von ihnen ein Metallion ist.
  • Bevorzugte Verbindungen sind solche, bei denen einer von R* und R** gleich Wasserstoff oder eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe ist. Bevorzugt sind auch solche Verbindungen, bei denen Ar gleich Phenyl ist und mindestens einer der n" R eine C&sub1;-C&sub4;-Alkoxygruppe ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der obigen 2,6-Dicarboxypyridinverbindungen als Zwischenprodukte bei der Herstellung von durch Fluoreszenz nachweisbaren Molekülen, die eine mit einem substituierten Aryl substituierte 2,6-[N,N-Bis(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridin- Gruppierung umfassen.
    • Die substituierten Pyridingruppierungen
  • Die substituierten Pyridingruppierungen, die aus den Zwischenprodukten gemäß dieser Erfindung erhältlich sind, werden in die Moleküle eingebaut, um so die Moleküle zu durch Fluoreszenz nachweisbaren, arylsubstituierten 2,6- Bis[N,N-di(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridinen zu machen. Die Arylsubstituenten sind selbst vorzugsweise mit mindestens einer Elektronen-abgebenden Gruppe substituiert. Diese Materialien können in der folgenden allgemeinen Formel I dargestellt werden.
  • In dieser Formel sind n und n' ganze Zahlen, entweder 1 oder 2, und sind vorzugsweise dieselbe ganze Zahl, und wei ter vorzugsweise gleich 1. Der Pyridinring trägt Substituenten R', R" und -Ar-(R)n". Die R'- und R"-Substituenten können Wasserstoffe; Elektronen-abgebende Gruppen wie niedere Alkoxygruppen, das heißt, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffen, insbesondere Methoxy oder Ethoxy; niedere Alkyle, das heißt, Alkyle mit 1 bis 4 Kohlenstoffen wie Methyl, Ethyl, n- und iso-Propyle und dergleichen; Aminogruppen; Alkyl, d. h. Mono- und Di-, und insbesondere Dialkylamino, zum Beispiel Dialkylaminogruppen, wobei jedes der Alkyle 1 bis 4 Kohlenstoffe besitzt wie Dimethylamino; Aryle mit 6 Kohlenstoffen und Aralkyle mit bis zu 9 Kohlenstoffen wie Phenyl oder Benzyl und dergleichen, unter der Einschränkung, daß solche Aryle mit dem Pyridinring verbunden, aber nicht kondensiert sind, und Aryloxy-Gruppen oder Aralkyloxy-Gruppen mit bis zu 9 Kohlenstoffatomen wie Phenyloxy- oder Benzyloxystrukturen; und eine verknüpfende Gruppe, die eine kovalente Bindung einschließt, und eine überbrückende Gruppe, die in der Lage ist, eine Verknüpfung mit dem Rest des Moleküls zur Verfügung zu stellen, sein, was beschrieben wird.
  • Der Ar-(R)n"-Substituent am Pyridinring ist ein Aryl, das selbst n" R-Substituenten enthält. Das Aryl ist vorzugsweise entweder ein Phenyl- oder ein Naphthylring. Die Zahl n" ist eine ganze Zahl, die der Anzahl an kovalenten Bindungsstellen entspricht, die am Ar-Substituenten verfügbar sind, d. h. 5 im Fall von Phenyl oder 7 im Fall von Naphthyl. Die R-Substituenten der Ar-Gruppe können aus denselben Gruppen wie die R'- und R"-Substituenten ausgewählt sein.
  • Somit können die Ar-Rn"-Substituenten strukturell z. B. durch die folgenden allgemeinen Formeln dargestellt werden
  • und
  • wobei
  • die kovalente Bindung zu dem Pyridinring ist, abhängig davon, ob die Ar-Einheit ein Phenyl oder Naphthyl ist. Phenyl ist die bevorzugte Ar-Einheit.
  • Bevorzugte arylsubstituierte Pyridine können ausführlicher durch eine kombinierte Struktur der folgenden allgemeinen Formel dargestellt werden
  • wobei R', R", die R, M und n und n' wie zuvor definiert sind. Materialien, bei denen der Ar-(R)n in der Position 4 am Pyridin gebunden ist, d. h. para zu dem Pyridinstickstoff, sind bevorzugt. Bevorzugt sind auch Materialien, bei denen die verknüpfende Gruppe im Gegensatz zu R' oder R" eine der R ist und wobei eine oder beide von R' und R" Wasserstoffe sind, und wobei insbesondere von ein bis drei der R gleich C&sub1;-C&sub4;-Alkoxygruppen sind und der Rest der R gleich Wasserstoff sind.
  • Die arylsubstituierten Pyridingruppierungen können mit anderen Gruppen verknüpft sein. Diese Verknüpfung kann entweder durch eine kovalente Bindung oder durch irgendeine andere verknüpfende Gruppe erreicht werden, von denen eine aus den R', R" oder R, insbesondere eine aus den R besteht. Diese Verknüpfung ermöglicht es den fluoreszierenden Pyridingruppierungen, eine biologisch aktive biospezifische Gruppe zu markieren.
  • Wenn die Verknüpfung durch eine verknüpfende Gruppe erreicht wird, sollte diese R-Gruppe eine aktive oder bindungsfähige Stelle wie ein Amin, ein Hydroxyl, ein Carboxyl, ein Ester oder dergleichen vorweisen, um die Kopplung der biospezifischen Gruppe zu erleichtern. Beispiele solcher verknüpfbarer R-Gruppen sind die Aminogruppe (-NH&sub2;), Alkyle mit endständigem primärem und sekundärem Amin wie -CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2; oder
  • , Aryle und Aryloxygruppen mit endständigem primärem und sekundärem Amin wie
  • , und die Isomeren davon;
  • Hydroxylgruppen enthaltende Alkyle wie -CH&sub2;-CH&sub2;-OH,
  • , und Hydroxylgruppen enthaltende Aryle und
  • Aryloxygruppen wie
  • and
  • Andere geeignete Funktionalitäten zur Ausbildung einer Bindung mit der biospezifischen Gruppe umfassen Amide, Amidine, Thioamide, Harnstoffe, Thioharnstoffe, Guanidine, Diazos, Thioether, Carbonsäure- und Phosphorsäureester und -thioester und andere kovalente Verknüpfungen, wie sie auf dem Gebiet bekannt sind. Eine bevorzugte verknüpfende Gruppe ist die einfache Aminogruppe. Die verknüpfenden Gruppen können direkt an die biologisch aktive Gruppe koppeln oder können durch einen bifunktionalen Spacer verknüpft sein, wie einem Bestandteil der Gruppe -CO(CH&sub2;)&sub4;-, -CS-,
  • - CO(CH&sub2;)&sub8;NHCOCH&sub2;ON= , -COCH&sub2;ON= , -CO(CH&sub2;)&sub5;NHCO(CH&sub2;)&sub6;CO-,
  • - CO(CH&sub2;)&sub2;SS(CH&sub2;)&sub2;CO-,
  • - CSNH(CH&sub2;)&sub3;N(CH&sub2;CH&sub2;)&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NHCO(CH&sub2;)&sub6;CO-,
  • - CSNH(CH&sub2;)&sub3;N(CH&sub2;CH&sub2;)&sub2;N(CH&sub2;)&sub3;NHCO(CHOH)&sub2;CO-,
  • - CSNH(CH&sub2;)&sub3;N(CH&sub2;CH&sub2;)&sub3;NHCOCH&sub2;ON=. Solche verknüpfenden Gruppen sind repräsentativ und können Wechselwirkungen zwischen dem fluoreszierenden Pyridin und den biospezifischen Gruppen verändern und beeinflussen.
    • Die biospezifische Gruppe
  • Wie oben angemerkt, ist in vielen vorteilhaften Anwendungen eine biologisch aktive, d. h. biospezifische Gruppe, mit dem substituierten Pyridin verknüpft. Die Begriffe "biospezifische Gruppe" und "biologisch aktive Gruppe" werden in einem breiten Sinn verwendet, um alle Molekülstrukturen einzuschließen, die andere Molekülspezien "spezifisch erkennen" oder damit "spezifisch reagieren" oder "spezifisch wechselwirken". Solche Gruppen können immunologisch spezifische Gruppen wie Antikörper und deren entsprechende Antigene oder Haptene, Hormone und deren Rezeptoren, Bindungspaare wie das Biotin-Avidin-Paar und dergleichen einschließen. Sie können auch Nukleinsäuresequenzen einschließen, die spezifisch mit ihren komplementären Sequenzen hybridisieren.
  • Die biospezifischen Gruppen können ausgewählt sein, um an ein Zielmolekül zu binden oder anderweitig damit zu assoziieren, oder können ausgewählt sein, um die Zielmoleküle nachzuahmen oder einzuschließen, um so in der biospezifischen Reaktion mit dem Ziel zu konkurrieren.
  • Wie zuvor angemerkt, kann das biologisch aktive Material (MB) in der Formel an R' oder an R" positioniert sein, ist jedoch vorzugsweise als eines der R gebunden, um so fluoreszenzmarkierte biospezifische Reagenzien der folgenden Formel zu ergeben
  • wobei Mg, M, n, n', n" wie zuvor beschrieben sind und die R, R' R" jeweils unabhängig aus Wasserstoff und Elektronenabgebenden Gruppen ausgewählt sind.
  • Gleichermaßen kann ein bevorzugtes fluoreszenzmarkiertes biospezifisches Reagens die folgende Formel besitzen
  • wobei M ein Metallion oder Wasserstoff ist, n* eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, Alk ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffen ist und MB ein biologisch aktives Material ist.
    • Das Zielmolekül
  • Wenn eine biospezifische Gruppe vorhanden ist, kann dessen Zielmolekül oder Analyt ein monoepitopisches oder polyepitopisches Material sein. Es kann ohne Einschränkungen aus Materialien wie Arzneimitteln, Metaboliten, natürlichen Produkten, Pestiziden und Verunreinigungen von Luft und Wasser ausgewählt sein. Zum Zweck der Veranschaulichung können aufgelistet werden Arzneimittel, die Digoxin, Digitoxin, Phenytoin, Theophyllin, Gentamicin und Tobramycin einschließen; Alkaloide wie Morphin, Heroin, Kokain, Ergotalkaloide und dergleichen; Steroide wie die Steroidhormone, die Östrogene und Androgene einschließen, zum Beispiel Estriol, und entzündungshemmende Steroide, zum Beispiel Cortisol; Lactame wie die Barbiturate, die Phenobarbital einschließen; Aminoalkylbenzole wie die Amphetamine; Vitamine, Prostaglandine wie F&sub2;alpha und E, Antibiotika und dergleichen, kurze Peptidsequenzen oder Aminosäuren wie Thyroxin, Triiodothyronin und Oxytocin. Repräsentative Verunreinigungen und Pestizide umfassen PCB, Dioxin, halogenierte Biphenyle, Carbamate, Thiophosphite, Phosphatester und deren Metaboliten. Solche Materialien können hinsichtlich des Molekulargewichts von ungefähr 50 bis ungefähr 1000 reichen.
  • Das Zielmolekül kann auch ein polymeres Material wie ein Protein oder eine andere Poly(aminosäure), eine Polynukleinsäure oder ein Polysaccharid sein. Ein solches Proteinmaterial kann aus einer beliebigen der Klassen von Proteinen genommen werden, welche ohne Einschränkungen Globuline, Albumine, Lipoproteine, Glykoproteine, Historie und dergleichen, hypersensitive Proteine einschließlich Albumin. die Immunoglobuline wie IgE, Fibrinogen, Transferin, die verschiedenen komplementären Faktoren, die Tumormarker wie CEA (karzinoembrionisches Antigen) und PAP, die verschiedenen Blutgerinnungsfaktoren und Proteinhormone einschließlich beta-hCG, FSH, Gastrin, LH und Prolactin; Insulin, Thyrotropin, Gonadotropin und dergleichen einschließen. Beispiele von biospezifischen Polysacchariden sind solche, die von Mikroorganismen stammen, wie solche, die mit verschiedenen Spezies von Salmonella, Straptococcus und Klebstella assoziiert sind. Andere Ziele umfassen ohne Einschränkung Materialien, die für infektiöse Krankheitsbedingungen wie eine Infektion mit Hepatitis oder Rubella verantwortlich sind.
  • Andere äquivalente Materialien, wie die ausführlicher im Stand der Technik aufgelisteten (siehe US-A-4,193,983, Spalten 7-11), könnten ebenfalls zusammen mit den vorliegenden Fluorophoren verwendet werden.
    • Nicht verknüpfte Produkte
  • Zusätzlich zu den gerade beschriebenen Verbindungen, bei denen eine der R-, R'- oder R"-Gruppen eine Verknüpfung mit einer biospezifischen, biologisch aktiven Gruppe darstellt, gibt es andere Materialien derselben allgemeinen Struktur der Formeln I und III, die keine Verknüpfung zu einem biospezifischen Material enthalten, das heißt, wo alle der R, R' und R" Wasserstoffe oder Elektronen-abgebene Gruppen sind. Solche Materialien, insbesondere die der Formeln I und III, bei denen M gleich Wasserstoff ist, sind als Chelatbildner für Metalle brauchbar und ergeben, wenn sie mit Seltenerdmetallen Chelate bilden, eine fluoreszierende Spezies, die als ein Indikator für eine quantitative oder qualitative Fluoreszenzmessung von Seltenerdmetallionen in Lösungen dienen können.
    • Die Seltenerdmetalle
  • Die arylsubstituierten Pyridine bilden langlebige fluoreszierende Komplexe mit Seltenerdmetallen einschließlich Terbium, Dysprosium, Europium, Samarium und Neodym in der Form ihrer Ionen. Terbium und Europium (Tb&spplus;&spplus;&spplus; und Eu&spplus;&spplus;&spplus;) sind bevorzugte Seltenerdmetallionen.
  • Die zwischen dem Metallion (M) und den Tetrasäureliganden gebildeten Komplexe sind im allgemeinen Chelatkomplexe mit 1 : 1 an äquimolarem Metall: Ligand. Sie werden strukturell durch die nachfolgende Struktur dargestellt.
    • Präparative Verfahren
  • Die mit einem substituierten Aryl substituierten 2,6- Dicarboxypyridinverbindungen der vorliegenden Erfindung und die entsprechenden 2,6-[N,N-Bis(carboxyalkyl)aminoalkyl]- pyridin-Gruppierungen können durch eines aus zwei Verfahren hergestellt werden. Das erste Verfahren ist bevorzugt, wenn die Endstruktur keine reaktiven Amin-Funktionalitäten oder andere funktionelle Gruppen, die mit den verwendeten Reagenzien nicht verträglich sind, enthält. Das zweite ermöglicht es, daß solche Gruppen enthalten sind.
  • Das erste Verfahren umfaßt
  • A. Umsetzen eines geeignet substituierten Benzaldehyds oder Naphthaldehyds mit mindestens zwei Molen an 2-Acylfuran, um ein 1,5-Di(2-furyl)-1,5-pentandion zu ergeben;
  • B. Umwandeln des Produkts aus A zu dem entsprechenden Di(furyl)pyridin durch Umsetzen mit Hydroxylamin in flüssiger Phase bei erhöhter Temperatur, wie von 40ºC bis 170ºC, insbesondere von 80ºC bis 150ºC;
  • C. Oxidieren des Produkts aus B zu der entsprechenden Pyridin-2,6-dicarbonsäure durch Kontakt mit einem Oxi dationsmittel in einer organischen flüssigen Phase. Ein Beispiel dieser Oxidation ist, die Verwendung eines Überschusses an Kaliumpermanganat in einem Alkanol bei von ungefähr 50ºC bis ungefähr 100ºC während 30 bis 120 Minuten;
  • D. Umwandeln der Pyridin-2,6-dicarbonsäure zu dem Diamid, welches durchgeführt werden kann unter Verwendung eines Überschusses an Oxalylchlorid, gefolgt von Ammoniumhydroxid bei niedriger bis Umgebungstemperatur;
  • E. Umwandeln des Diamids zu dem Dinitril durch Umsetzen mit einem Dehydratisierungsmittel wie Essigsäureanhydrid, Trifluoressigsäureanhydrid oder dergleichen bei einer Temperatur von ungefähr -10ºC bis +35ºC;
  • F. Reduzieren des Dinitrils zu dem Diamin, welches katalytisch unter Verwendung eines Edelmetallkatalysators und molekularem Wasserstoff in der Gegenwart von Spuren an Säure durchgeführt werden kann;
  • G. Koppeln von Estergruppen an die Aminogruppen, welches erreicht werden kann durch eine Umsetzung mit einem Alkylhalogenacetat, zum Beispiel einem Alkylbromacetat, in der Gegenwart von 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin oder einer anderen geeigneten Base; und
  • H. Umwandeln der Estergruppen zu Säuren durch Verseifen mit einer anorganischen Base wie einem Alkalimetallcarbonat oder -hydroxid bei gemäßigten Temperaturen wie von ungefähr 5ºC bis ungefähr 45ºC. Es ist verständlich, daß einige Trenn- und Reinigungsschritte vorhanden sind, die nicht berichtet wurden, die jedoch tatsächlich ebenfalls ausgeführt werden.
  • Im Herstellungsverfahren 2 werden die ersten drei Schritte im wesentlichen wie in Verfahren 1 durchgeführt, mit der Änderung, daß der Arylaldehyd, d. h. Benzaldehyd oder Naphthaldehyd, eine Nitrogruppe trägt, wo am Ende ein Aminosubstituent gewünscht ist, oder eine andere Gruppe trägt, die mit den nachfolgenden Reaktionen des Verfahrens 1 nicht kompatibel ist. Das Produkt dieser drei Stufen ist eine Nitrophenyl- oder Nitronaphthyl-Pyridin-2,6-dicarbonsäure mit verschiedenen R-, R'- und R"-Substituenten, die wie gewünscht sein können und somit an den Ausgangsmaterialien vorhanden sind.
  • Im Schritt D des zweiten Verfahrens werden die beiden Carbonsäuregruppen selektiv reduziert; das heißt, sie werden unter Bedingungen reduziert, die nicht die Nitrogruppe reduzieren. Eines der Reduktionsmittel, das dies tut, ist Boran. Diese Reduktion kann durchgeführt werden unter Verwendung eines Überschusses an Boran und unter moderaten Temperaturen und trockenen Bedingungen. Dies ergibt das Dicarbinol, das der Dicarbonsäure entspricht.
  • E. Das Dicarbinol wird dann mit einem Reagens umgesetzt, das die Carbinolfunktionalitäten zu Alkylhalogeniden umwandelt. Thionylbromid in einem molaren Überschuß wird diese Umwandlung bei erhöhten Temperaturen wie 50ºC bis 125ºC bewerkstelligen, um ein Produkt zu ergeben, welches das gewünschte Nitroarylpyridin ist, das in der 2- und 6-Position relativ zu dem Pyridinstickstoff mit Alkylbromiden substituiert ist.
  • F. In diesem Schritt wird das Alkylbromid-substituierte Pyridin mit einem Iminodiessigsäurediester umgesetzt, um die beiden Bromidgruppen durch Iminodisäure-Funktionalitäten zu ersetzen. Dies kann durchgeführt werden unter Verwendung einer Base wie 1,8- Bis(dimethylamino)naphthalin und einer gemäßigten Temperatur wie von ungefähr 25ºC bis ungefähr 55ºC und einer inerten Atmosphäre. Dies ergibt den Tetraester.
  • G. Die vier Estergruppen können dann entfernt werden, indem die im Schritt H des Verfahrens 1 aufgezeigten Verseifungsbedingungen verwendet werden.
  • H. In dem letzten Schritt dieses Verfahrens wird die Nitrogruppe an dem Arylsubstituenten zu einem Amin reduziert. Dies kann katalytisch unter Verwendung eines Edelmetallkatalysators und von molekularem Wasserstoff durchgeführt werden. Repräsentative Katalysatoren schließen Platin oder Palladium auf Aluminiumoxid oder Kohlenstoff ein. Wasserstoffdrücke können von ungefähr atmosphärischem Druck bis zu einigen Atmosphären, d. h. 1-10 Atmosphären, reichen, und Temperaturen von ungefähr Umgebungstemperatur bis ungefähr 75ºC werden im allgemeinen verwendet, um die gewünschte selektive Reduktion zu erreichen. Dies stellt die gewünschten aminosubstituierten Pyridinmaterialien zur Verfügung. Falls gewünscht können äquivalente Herstellungsverfahren verwendet werden. Es kann zum Beispiel eine Aminofunktionalität durch eine Modifikation des Verfahrens 1 eingeführt werden, wobei das Produkt des Schritts G mit rauchender Salpetersäure nitriert wird und die so eingeführte Nitrogruppe danach wie in Verfahren 2 reduziert wird.
    • Verwendung der Produkte
  • Die aus den Zwischenprodukten erhältlichen Produkte dieser Erfindung besitzen eine breite Anwendbarkeit als Liganden zur Chelatbildung von Seltenerdmetallen. Die so gebildeten Chelate sind fluoreszierend und stellen somit ein Verfahren zur Messung von Seltenerdionengehalten von Materialien zur Verfügung. Die hierin beschriebenen substituierten Pyridine sind insbesondere als ihre Seltenerdmetallchelate in einer Vielzahl von Assayverfahren brauchbar, bei denen ihre Fluoreszenzeigenschaften es ihnen er lauben, als Markierungen für biospezifische Moleküle zu dienen. Typischerweise wird ein Ligand oder Chelat dieser Erfindung mit einer reaktiven funktionellen Gruppe hergestellt, wie einer Isothiocyanat-, Amino-, Imidat-, Diazo- oder anderen geeigneten Gruppe, die mit einer geeigneten reaktiven Gruppe eines biospezifischen Moleküls umgesetzt wird, wie einem Antikörper, Antigen, Hapten oder einem anderen Zielmolekül. Der somit markierte Bestandteil eines Bindungspaars von biospezifischen Molekülen kann in jeder einer Vielzahl von Assaymethodiken verwendet werden, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind, einschließlich von kompetitiven Bindungsassays und immunometrischen Assays vom Sandwich-Typ.
    • BEISPIELE
  • Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben.
    • Beispiel 1
  • Herstellung von
    • A. Herstellung von 5-Di(2-furyl)-3-phenyl-1,5-pentandion
  • Benzaldehyd 62,6 g (60 ml) (0,59 mol)
  • 2-Acetylfuran, 85% 165 g (150 ml) (1,27 mol)
  • Kaliumhydroxid, 85% 35 g (0,53 mol)
  • Die KOH wird in Methanol (ungefähr 600 ml) unter Erwärmen und Rühren aufgelöst. Die Lösung wird leicht gekühlt und es wird eine Mischung des Aldehyds und Furans auf einmal zugegeben. Die Mischung wird auf 60ºC erwärmt und während 45-60 Minuten gerührt. Es entwickelt sich anfänglich eine grüne Färbung, die sich schnell zu braun verdunkelt. Die Reaktionsmischung verfestigt sich zu einer Masse aus orangebraunen Kristallen. Es wird Ethanol zugegeben (ungefähr 150 ml) und der Feststoff wird aufgebrochen. Die Mischung wird über Nacht gekühlt und die Produktkristalle werden durch Filtration gewonnen und mit eiskaltem Ethanol (ungefähr 400 ml) gewaschen, gefolgt von einem Waschen mit Pentan (ungefähr 200 ml). Die Kristalle werden im Vakuum bei 80ºC getrocknet. Ausbeute an Pentandion 103,5 g oder 57,3%.
    • B. Herstellung von 4-Phenyl-2,6-di(2-furyl)pyridin
  • 1,5-Di(2-furyl)-3-phenyl-
  • 1,5-pentandion 143 g
  • Hydroxylaminhydrochlorid 129 g (Aldrich 102337)
  • n-Butanol 1600 ml (Sigma 13F-5070)
  • Das wie in Schritt A und in einer Wiederholung davon hergestellte "Dion", das Hydroxylamin und das Butanol werden in einem 5 l-Dreihalskolben, der mit einem mechanischen Rührer und einem Kühler ausgestattet ist, vereint und während 5 Stunden unter Rückfluß gehalten, gekühlt und während ungefähr 60 Stunden gerührt. Die resultierende schwarze Lösung wird in 2 l an 15% NaOH gegossen und mit Toluol (1 l) extrahiert. Die organische Schicht wird mit entionisiertem Wasser (1 · 200 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und an einem Rotationsverdampfer konzentriert. Der dicke Rückstand wird in CH&sub2;Cl&sub2; (ungefähr 250 ml) aufgenommen. Es wird Hexan (ungefähr 250 ml) zu der resultierenden Lösung gegeben, die durch Silicagel filtriert wird und mit 1 : 1 CH&sub2;Cl&sub2;/Hexan (ungefähr 500 ml) eluiert wird. Das Filtrat wird konzentriert, es wird Ethanol (ungefähr 200 ml) zugegeben und die Mischung wird in Eis gekühlt. Eine Filtration der resultierenden Kristalle und ein Waschen mit eiskaltem Ethanol (ungefähr 200 ml) und ein Trocknen im Vakuum bei Umgebungstemperatur ergibt eine erste Ausbeute an Kristallen von ungefähr 65 g. Das Filtrat wird konzentriert, gereinigt und gekühlt, um eine zweite Ausbeute von 13,6 g an Kristallen zu ergeben.
    • C. 4-Phenyl-2,6-pyridindicarbonsäure
  • Das Difurylpyridinprodukt aus Schritt B wird mit Permanganat oxidiert.
  • Produkt aus Schritt B 23 mmol
  • KMnO&sub4; 45,4 g
  • t-Butanol 1500 ml
  • Wasser 300 ml
  • Das Butanol (ungefähr 1 l) wird in einen Dreihalskolben gegeben, der mit einem mechanischen Rührer, einem Mantel und einem Kühler ausgestattet ist. Das Produkt aus Schritt B wird zugegeben und mit dem verbleibenden t-Butanol in den Kolben gespült. Die Mischung wird erwärmt und gerührt, bis eine Lösung resultiert; dann wird das H&sub2;O zugegeben, und wenn die Temperatur ungefähr 75ºC erreicht, wird das KMnO&sub4; portionsweise während ungefähr 30 Minuten zugegeben. Die Mischung wird während 90 Minuten unter Rückfluß gehalten. Alkohol wird mittels eines Wasserstrahlvakuums abdestil liert und der heiße Rückstand wird durch Celite® filtriert und mit heißem 1 : 1 t-BuOH/H&sub2;O gewaschen. Alles restliches KMnO&sub4; wird mit NaHSO&sub3; verbraucht und die Lösung wird an einem Rotationsverdampfer (ungefähr 65ºC) auf ungefähr 150 ml konzentriert. Nach einem Ansäuern mit 2N HCl (25 ml) werden die resultierenden Kristalle der gewünschten 4-Phenyl-2,6- pyridincarbonsäure filtriert, gewaschen und getrocknet.
    • D. 4-Phenyl-2,6-pyridindicarboxamid
  • 4-Phenyl-2,6-pyridindicarbonsäure 21,5 mmol
  • Oxalylchlorid 4,8 ml
  • Methylenchlorid 80 ml
  • Dimethylformamid 5 Tropfen
  • Die Pyridindicarbonsäure wird zu einem 100 ml-Zweihalskolben mit CH&sub2;Cl&sub2;, DMF und einem Rühreranker gegeben. Der Kolben wird mit einem CaSO&sub4;-Trockenrohr verschlossen und in Eis gekühlt. Während ungefähr 5 Minuten wird dann das Oxalylchlorid aus einer Spritze zugegeben und während ungefähr 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wird an einem Rotationsverdampfer konzentriert, um das feste Säurechlorid zu ergeben; es wird Benzol (150 ml) zugegeben und durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand wird im Vakuum getrocknet. Das Säurechlorid wird während 5-10 Minuten unter Rühren zu NH&sub4;OH, 28%, (50 ml) gegeben, während einer Stunde gerührt, filtriert und mit Wasser gewaschen und getrocknet, um das gewünschte Amid zu ergeben.
    • E. 4-Phenyl-2,6-pyridindicarbonitril
  • 4-Phenyl-2,6-pyridindicarboxamid 17,5 mmol
  • p-Dioxan 170 ml
  • Pyridin 11,3 ml
  • Trifluoressigsäureanhydrid 11,0 ml
  • Die ersten drei Zutaten werden in einem 250 ml-Kolben mit einem Rühreranker vereint. Der Kolben wird unter Argon verschlossen, in Eis gekühlt, bis gefrorenes Dioxan vorhanden ist (10º). Das Anhydrid wird während ungefähr 10 Minuten (Temperatur ungefähr 15ºC) zugegeben und die Mischung wird während zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende dunkle Lösung wird in Wasser gegossen und dann dreimal mit Portionen von 150 ml an Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und am Rotationsverdampfer zu einer dunklen Lösung konzentriert, welche dann in Methylenchlorid aufgenommen und mit zusätzlichem Methylenchlorid durch Siliciumdioxid eluiert wird. Der Eluent wird zu einem Feststoff konzentriert und getrocknet, um das gewünschte Dicarbonitril zu ergeben.
    • F. 4-Phenyl-2,6-di(aminomethyl)pyridin
  • 4-Phenyl-2,6-pyridindicarbonitril 13,5 mmol
  • Ethanol mit 2% HClO&sub4; 370 ml
  • 10% Palladium auf Kohlenstoff 3,7 g
  • Das Nitril wird in dem Ethanol, zu dem 10,5 ml an 70% HClO&sub4; gegeben wurden, suspendiert und die Mischung wird in eine Parr-Flasche übertragen. Die Flasche wird mit Stickstoff gespült und der Katalysator wird zugegeben. Die Flasche wird dann mit 0,28 MPa (40 psi) mit Wasserstoff unter Druck gesetzt. Nach 30 Minuten wird die Flasche geöffnet und die Flüssigkeit entnommen und zu einer dunklen Flüssigkeit konzentriert. Durch Zugabe der Flüssigkeit zu Diethylether und Filtrieren wird ein gelber Feststoff gewonnen. Der Perchloratsalzfeststoff wird an einer Vakuumpumpe getrocknet. Dieses Aminoperchlorat wird dann in ungefähr 30 ml an Wasser aufgelöst und zu 40% NaOH gegeben. Das resultierende freigesetzte Amin wird mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und an einer Vakuumpumpe zu einem dunklen Öl konzentriert.
    • G. 4-Phenyl-2,6-bis[N,N-di(methoxycarbonylmethyl)aminomethyl]pyridin
  • Amin aus Schritt F 12,0 mmol
  • 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin 10,3 g
  • Methylbromacetat 7,35 g
  • Acetonitril 130 ml
  • Die Base wird in einen Kolben gegeben. Das Amin wird in Acetonitril aufgenommen und damit in den Kolben gegeben. Es wird ein Rühreranker zugegeben und die Mischung wird bei 45ºC bis zu ihrer Homogenität gerührt. Dann wird das Methylbromacetat in 40 ml an Acetonitril zugetropft, wobei das System unter Argon gehalten wird. Nach ungefähr 16 Stunden bei ungefähr 45ºC wird das Produkt in 150 ml an Wasser und 1,5 ml an 0,1 M Zitronensäure gegossen. Diese Mischung wird dann mit Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden gewaschen, getrocknet, konzentriert, erneut gelöst und durch Siliciumdioxid filtriert. Das Produkt wird mittels Silicagelchromatographie gereinigt, wobei Ethylacetat/Methylenchlorid als Lösungsmittel verwendet wird.
    • H. Verseifung des Tetraesters
  • Der Tetraester aus Schritt G wird verseift, indem er in 1 : 1 Methanol/Wasser gegeben wird und ein molarer Überschuß an K&sub2;CO&sub3; zugegeben wird und bei Raumtemperatur während 2,5 Stunden gerührt wird. Die Lösung wird dann auf pH 7 angesäuert und getrocknet, um die gewünschte Tetrasäure zu ergeben, deren Identität mittels NMR bestätigt wird.
    • Beispiel 2
  • Die Herstellung aus Beispiel 1 wird im wesentlichen wiederholt, mit der Änderung, daß in Schritt A eine äquivalente Menge an 2,4-Dimethoxybenzaldehyd im Austausch für das Benzaldehyd verwendet wird, so daß das gebildete Zwischenprodukt 4-(2,4-Dimethoxyphenyl)-2,6-pyridincarbonsäure ist und das Endprodukt die analoge 2,4-Dimethoxy- Verbindung des Produkts aus Schritt H des Beispiels 1 ist. Die erhaltenen Ausbeuten für einige der verschiedenen Schritte sind wie folgt
  • Schritt A 95%
  • Schritt B 72%
  • Schritt E 84%
  • des gewünschten Produkts 4-(2,4-Dimethoxyphenyl)-2,6-bis- [N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]pyridin.
    • Beispiele 3-17
  • Die Herstellung aus Beispiel 1 wird im wesentlichen fünfzehnmal wiederholt, mit der Änderung, daß der Benzaldehyd durch eine äquivalente molare Menge der folgenden substituierten Benzaldehyde ersetzt wird:
  • Beispiel Nr. Analoger Benzaldehyd
  • 3 4-Methoxybenzaldehyd
  • 4 3,4-Dimethoxybenzaldehyd
  • 5 3,4,5-Trimethoxybenzaldehyd
  • 6 2,5-Dimethoxybenzaldehyd
  • 7 2,4,5-Trimethoxybenzaldehyd
  • 8 4-Ethoxybenzaldehyd
  • 9 2,4-Dipropoxybenzaldehyd
  • 10 2-Ethoxy-4-methoxybenzaldehyd
  • 11 4-Benzyloxybenzaldehyd
  • 12 3-Methoxy-4-benzyloxybenzaldehyd
  • 13 3,4-Methylendioxybenzaldehyd
  • 14 2-Methoxy-4-benzyloxybenzaldehyd
  • 15 2,4-Dimethoxybenzaldehyd
  • 16 2,4,6-Trimethoxybenzaldehyd
  • 17 3-Methoxy-4-(4-nitrobenzyloxy)benzaldehyd
  • Mit diesen verschiedenen Benzaldehyden werden die entsprechenden 2,6-Pyridindicarbonsäure-Zwischenprodukte und Tetrasäure-Endprodukte erzielt.
    • Beispiel 18 (Referenzbeispiel)
  • Dieses Beispiel zeigt den Einbau eines Amino- Substituenten am Phenylring. Schritte A, B und C aus Beispiel 1 werden wiederholt, mit der Änderung, daß anstelle des Benzaldehyds eine äquimolare Menge an 3-Nitrobenzaldehyd verwendet wird. Dies stellt 4-(3- Nitrophenyl)-2,6-pyridindicarbonsäure zur Verfügung.
    • D. 4-(3-Nitrophenyl)-2,6-pyridindimethanol
  • Disäure wie oben 28,8 g (0,1 mol)
  • Boran/THF-Komplex 288 ml, 1 molar
  • Die Disäure wird in einen trockenen 2 l-Kolben mit 1000 ml an THF und einem Rühreranker gegeben. Es wird ein Trockenrohr aufgesetzt und der Kolben wird mit Argon überschichtet. Der Boran/THF-Komplex wird dann allmählich während 20-30 Minuten unter kräftigem Rühren bei Raumtemperatur zugegeben. Das Rühren wird während vier Stunden fortgeführt und dann wird der Überschuß an Boran mit verdünnter HCl (20 ml an 6 N und 85 ml an H&sub2;O) hydrolysiert. Es werden dann 60 ml an 10% Na&sub2;CO&sub3; zugegeben und die Lösung wird an einem Rotationsverdampfer konzentriert. Der Rückstand wird zu wäßrigem Bicarbonat gegeben und dreimal mit Ethylacetat extrahiert, die Extrakte werden getrocknet und abgestrippt, um das gewünschte Diol als einen orangen Feststoff zu erhalten.
    • E. 4-(3-Nitrophenyl)-2,6-bis(brommethyl)pyridin
  • Diol aus Schritt D 9,1 g (35 mmol)
  • Thionylbromid 7,0 ml (90 mmol)
  • Das Diol aus Schritt D wird in einen Kolben gegeben und es werden ungefähr 20 ml an Methylenchlorid zugegeben, gefolgt von dem Thionylbromid. Der Kolben wird mit einem Einlaßadapter verschlossen und in ein Ölbad bei 80ºC gegeben. Das Methylenchlorid und HBr werden abgelassen und es verbleibt ein viskoser Rückstand. Dieser wird in wäßriges Na&sub2;CO&sub3; gegeben und dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden getrocknet, konzentriert, mit Methylenchlorid verdünnt und durch Siliciumdioxid filtriert. Das Filtrat wird gesammelt und eingedampft, um das gewünschte Dibromid zu ergeben.
    • F. 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-4-(3-nitrophenyl)pyridintetramethylester
  • Dibromid aus Schritt E 3,44 g (8,9 mmol)
  • Iminodiessigsäuredimethylester 2,88 g
  • 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin 3,76 g
  • Acetonitril 140 ml
  • Die Base wird in einen Kolben gegeben. Der Iminodiester wird mit dem Acetonitril vermischt und zugegeben. Der Kolben wird mit Argon überschichtet und auf 45º erwärmt. Dann wird das Dibromid in einer Lösung in THF während 60-90 Minuten unter Magnetrühren zugegeben. Nach 18 Stunden wird die Mischung gekühlt und bei Raumtemperatur während ungefähr zwei Tagen gerührt. Die Mischung wird zu Benzol gegeben, filtriert, mit 0,1 M Zitronensäure und Wasser gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die Lösung wird dann zu einem Öl konzentriert, mit Methylenchlorid aufgenommen und mit Ethylacetat/Methylenchlorid, gefolgt von Ethylacetat als Eluent, zweimal durch Silicagel geleitet. Es werden Fraktionen genommen, und das gewünschte Material wird isoliert und zu einem bernsteinfarbenen Öl konzentriert.
    • G. Reduktion der Nitrogruppe zum Amin
  • Nitrotetramethylester
  • aus Schritt F 2,7 g (4,94 mmol)
  • 5% Palladium auf Kohlenstoff 2,7 g
  • Ethylalkohol 300 ml
  • Die Nitroverbindung wird in einen 1 l-Kolben mit 300 ml an Ethanol gegeben. Der Kolben wird mit Stickstoff gespült und der Katalysator wird zugegeben. Der Kolben wird dann mit Wasserstoff auf 0,1 MPa (1 atm) unter Druck gesetzt. Nach einer Stunde wird die Reaktionsmischung filtriert und das Filtrat durch Rotationsverdampfen zu einem gelben Öl konzentriert. Das Öl wird als der Aminotetramethylester entsprechend dem Produkt aus Schritt F bestimmt.
    • H. Verseifung
  • Die Estergruppen des Aminotetramethylesters aus Schritt G werden unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 1 verseift. Dies ergibt die gewünschte 3-Aminotetrasäure.
    • Beispiel 19 A. Herstellung des 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-4-(4-nitrophenyl)pyridintetramethylesters
  • Es wird rauchende Salpetersäure (0,03 ml, 0,4325 mmol) bei Raumtemperatur zu einer Lösung von Trifluormethansulfonsäure in Methylenchlorid (4 ml) gegeben. Nach einem Rühren während 5 Minuten wird langsam bei 0ºC eine Lösung des 2,6-Bis-[N,N-di(carboxymethyl)- aminomethyl]-4-phenylpyridintetramethylesters wie aus Schritt G des Beispiels 1 (86 mg, 0,173 mmol) zugegeben. Man läßt die Lösung sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührt kontinuierlich während einer Stunde. Die Reaktionsmischung wird dann auf Eis gegossen und die Mischung wird mit Natriumcarbonat neutralisiert. Eine Extraktion mit Methylenchlorid, gefolgt von einem Trocknen über Natriumsulfat und einem Eindampfen, ergibt 90 mg an Rohprodukt.
    • B. Herstellung des 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-4-(4-aminophenyl)pyridintetramethylesters
  • Das Rohprodukt aus der obigen Reaktion (90 mg, 0,17 mmol) wird in Ethanol (13 ml) gelöst, es werden 50 mg an 10% Pd/C zugegeben und die Mischung wird bei Raumtemperatur unter 0,1 MPa (eine Atmosphäre) an Wasserstoff während einer Stunde gerührt. Der Katalysator wird durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wird verdampft, um 60 mg der 4-Aminoverbindung zu ergeben. Die 3-Aminoverbindung (51 mg) wird auf ähnliche Weise aus 70 mg (0,129 mmol) der entsprechenden 3-Nitroverbindung, die über das Herstellungsverfahren 2 hergestellt wurde, hergestellt. Diese Herstellung ist im wesentlichen wie in Beispiel 18 aufgezeigt. Falls gewünscht, können diese oder ähnliche Arylpyridine mit Aminosubstraten an ihren Arylringen mit Thiophosgen unter Bedingungen umgesetzt werden, die für die Umsetzung von Thiophosgen mit Arylaminen bekannt sind, um das Amin zu einem Isothiocyanat umzuwandeln, welches wiederum an ein Amin-haltiges Zielmolekül ankoppeln kann.
    • C. Konjugation von 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-4-(4- und 3-aminophenyl)pyridintetramethylestern an Theophyllin-8-buttersäure
  • Es wird Isobutylchlorformiat (0,02 ml, 0,117 mmol) zu einer Lösung von Theophyllin-8-buttersäure (31,3 mg, 0,117 mmol) in Dimethylformamid (1,5 ml), welche Triethylamin (0,20 ml, 0,117 mmol) enthält, bei 0ºC unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Nach 0,5 Stunden bei 0ºC wird langsam eine Lösung des 4-Amins (60 mg, 0,117 mmol) in Chloroform zugegeben. Die Lösung wird während 17 Stunden bei 0-5ºC gerührt und dann werden die Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt, um 103 mg an Rohprodukt zurückzulassen. Das Material wird chromatographiert über Silicagel mit Chloroform: Methanol (9 : 1) und über ein C-18-Silicagel mit umgekehrten Phasen mit Methanol : Wasser (7 : 3), um 60 mg (67% Ausbeute) des gewünschten Produkts zu ergeben. Die entsprechende 3-Aminoverbindung (51 mg, 0,01 mmol) wird auf vergleichbare Weise behandelt, um 50 mg an Material zu ergeben, welches das Theophyllinderivat an der 3-Position konjugiert hat.
    • D. Herstellung von 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-4-[4-(theophyllin-8-butyramido)phenyl]pyridintetrasäure
  • Der Tetramethylester (34 mg, 0,045 mmol) aus dem vorherigen Schritt wird in Methanol (2 ml), das 0,2 ml an 1 N Natriumhydroxid enthält, gelöst und während drei Stunden unter Rückfluß erwärmt. Die Lösung wird dann in einem Eisbad gekühlt und mit 1 N HCl angesäuert und eingedampft, um das Rohprodukt zu ergeben. Eine Reinigung über Umkehrphasen-Säulenchromatographie in Methanol : Wasser (6 : 4) ergibt 14 mg der Tetrasäure. Eine Verseifung von 40 mg (0,05 mmol) der analogen 3-substituierten Verbindung ergibt 14,6 mg ihrer Tetrasäure nach einer Umkehrphasenchromatographie.
    • E. Herstellung von Chelaten
  • Die Tetrasäuren aus Abschnitt D werden getrennt in 0,01 M Natriumboratlösung zu einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; M aufgelöst. Dann wird zu jeder eine äquimolare Menge an wäßrigem Terbiumchlorid gegeben und die Mischungen werden einige Minuten stehengelassen. Fluoreszenzmessungen werden durchgeführt und bestätigen, daß 1 : 1 molare Chelatkomplexe der Tetrasäuren und des Terbiums gebildet wurden und daß solche Komplexe fluoreszieren und stabil sind.
    • F. Ein homogener Fluoreszenz-Immunoassay für Theophyllin durch eine Verstärkung der Fluoreszenz beim Binden von markiertem Theophyllin an Antikörper
  • Es wird ein Assay für Theophyllin durchgeführt, indem man das Terbiumchelat des obigen Fluorophor-markierten Theophyllin-Tracers (d. h. 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)- aminomethyl]-4-[4-(theophyllin-8-butyramido)phenyl]- pyridinterbiumchelat) mit Theophyllinstandards für eine Bindung an Antitheophyllin-Antikörper konkurrieren läßt. Das markierte Theophyllin erfährt beim Binden an einen Antikörper eine Verstärkung seiner Fluoreszenz, und diese Verstärkung ist proportional zu der Menge an gebundenem markiertem Theophyllin und umgekehrt proportional zu der Menge an in der Probe vorhandenem Theophyllin. Der Assay wird in Polystyrolröhrchen (12 · 15 mm) durchgeführt, zu denen 1 ml eines 0,01 M Natriumboratpuffers mit pH 8,5 gegeben wurde. Diesem folgte die Zugabe von 10 ul an 1 uM Tracer (8,7 ng) und 10 ul an Theophyllinstandard (0, 5,4, 16,2, 54 und 540 ng) Eine Zugabe von 25 jal an ungefähr 0,3 uM Antitheophyllin-Antikörper in 0,01 M Borat, welches 0,1 M Natriumchlorid und 1% an normalem Humanserum enthält (Endkonzentration im Assayröhrchen ungefähr 7,5 nM), führt zu einer Zunahme der beobachteten Fluoreszenz von entsprechend 400%-50% für die verschiedenen Standards. Dies entspricht B/B&sub0;-Werten von 80, 64, 53 und 14% für entsprechend die 5,4, 16,2, 54 und 540 ng Standards (B/B&sub0; ist das Verhältnis der Bindungsaktivität, wenn ein Konkurrent vorhanden ist, im Vergleich mit der Menge, die gebunden ist, wenn kein Konkurrent vorhanden ist).
    • Beispiel 20 A. Herstellung von 0-Benzylvanillin
  • Vanillin 100,4 g (0,66 mol) Aldrich
  • Benzylchlorid 84,0 g (77 ml; 0,66 mol)
  • Kaliumcarbonat 115 g
  • Aceton 2 l
  • 18-Krone-6 3 g
  • Die obigen Materialien werden in einem 3 l-Dreihalsrundkolben vereint, der mit einem Mantel, Kühler und einem mechanischen Rührer ausgestattet ist. Die Mischung wird während 70 Stunden unter Rückfluß gerührt. Während der ersten 24 Stunden wird sie hellgelb und verändert sich am dritten Tag unter Rückfluß zu einer hellgelbbraunen Färbung. Es wird dann ungefähr 1 l an Aceton abdestilliert und der Rückstand wird unter Rühren auf gestoßenes Eis (ungefähr 2 l) und Wasser (ungefähr 500 ml) gegossen. Die Lösung wird geimpft, um einen festen Niederschlag zu ergeben, den man während ungefähr 20 Minuten stehenläßt, dann filtriert, mit EtOH (0ºC, 400 ml) wäscht und im Vakuum trocknet, um 120 g des gewünschten Produkts zu ergeben, was einer Ausbeute von ungefähr 75% entspricht.
    • B. 2,6-Di(2-furyl)-4-(3-methoxy-4-benzyloxyphenyl)pyridin
  • O-Benzylvanillin
  • (aus Abschnitt A) 31,5 g (0,13 mol)
  • Acetylfuran 43 g (0,39 mol) Aldrich
  • Methanol 300 ml
  • Die obigen Materialien werden in einem 500 ml-Kolben vereinigt und bis zur Homogenität (ungefähr 20 Minuten) erwärmt und bei ungefähr 55ºC gerührt. Dann werden ungefähr 5 ml an 20% KOH/MeOH zugegeben und das Erwärmen und Rühren wird während 45-60 Minuten fortgeführt. Dann werden weitere 15 ml an 20% KOH/MeOH zugegeben, die Kolbenöffnung wird leicht abgedeckt und der Inhalt wird während ungefähr 16 Stunden erwärmt und gerührt. Das Produkt wird mit 6 N HCl (ungefähr 10 ml) angesäuert und am Rotationsverdampfer bei ungefähr 55ºC konzentriert.
  • Dann werden 22 g an Hydroxylaminhydrochlorid und 250 ml an n-Butylalkohol zugegeben und die Mischung wird während 3 Stunden unter Verwendung eines Mantels unter Rückfluß gehalten. Das Butanol wird am Rotationsverdampfer bei ungefähr 65ºC entfernt und der Rückstand wird in Wasser (ungefähr 200 ml) gegossen, mit 6 N NaOH (60 ml) basisch gemacht und mit Toluol (2 · 200 ml) extrahiert. Die Extrakte werden mit H&sub2;O (ungefähr 100 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und am Rotationsverdampfer bei ungefähr 65ºC zu einem schwarzen Öl konzentriert. Dieses wird durch Silicagel (ungefähr 200 g) filtriert und mit 1 : 1 CH&sub2;Cl&sub2;/Hexan (ungefähr 1 l) eluiert. Das Eluat wird zu einem Öl konzentriert. Das Öl wird erneut einer Siliciumdioxid-Filtration unterzogen, erneut zu einem Öl konzentriert und nochmals durch Siliciumdioxid (ungefähr 200 g) filtriert, wobei diesmal mit Toluol/CH&sub2;Cl&sub2; 9 : 1 (ungefähr 1 l) eluiert wird. Dieses Eluat wird zu einem bernsteinfarbenen Öl konzentriert, das in EtOH (ungefähr 50 ml) aufgelöst und erneut zu einem Öl konzentriert wird. Die Produktausbeute beträgt ungefähr 25 g.
    • C. 4-(3-Methoxy-4-benzyloxyphenyl)-2,6-pyridindicarbonsäure
  • Difurylpyridin (aus Abschnitt B) 19 g (0,045 mol)
  • t-Butylalkohol 3 l
  • entionisiertes Wasser 0,6 l
  • Kaliumpermanganat 93 g
  • Es wird dem Verfahren aus Abschnitt C von Beispiel 1 mit den folgenden Änderungen gefolgt: Nach einer KMnO&sub4;- Zugabe wird die Mischung während 1 ½ Stunden erwärmt und gerührt. Dann wird der t-BuOH abdestilliert. Nach einem Konzentrieren auf ungefähr 200 ml wird das Produkt mit 2 N HCl (ungefähr 50 ml) angesäuert. Es bildet sich ein kanariengelber Niederschlag, der mit wenigen Millilitern an Wasser verdünnt, filtriert und mit kaltem Wasser (ungefähr 50 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet wird, um 15,2 g an Produkt zu ergeben, was ungefähr 90% Ausbeute entspricht.
    • D. 4-(3-Methoxy-4-benzyloxyphenyl)-2,6-pyridindicarbonsäurechlorid
  • Disäure (aus Abschnitt C) 6,07 g (0,016 mol)
  • Methylenchlorid 60 ml
  • Oxalylchlorid 3,5 ml
  • Dimethylformamid 4 Tropfen
  • Die Disäure wird in einen 100 ml-Zweihalsrundkolben eingewogen, der mit einem Trockenrohr und einem Septumverschluß ausgestattet ist. Es wird ein Rühreranker zusammen mit dem CH&sub2;Cl&sub2; (ungefähr 60 ml) und 4 Tropfen an DMF zugegeben. Die Mischung wird in Eis gerührt, während langsam aus einer Spritze (Zugabezeit ungefähr 5 Minuten) das Oxalylchlorid (3,5 ml) zugegeben wird. Die Reaktionsmischung wird dann während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Säure geht unter einer Entwicklung von HCl während ungefähr 1 Stunde in Lösung. Die dunkle Lösung wird in einen 250 ml-Kolben überführt und es wird Lösungsmittel am Rotationsverdarnpfer entfernt. Zu dem gelben Rückstand wird Benzol (ungefähr 100 ml) zugegeben und am Rotationsverdampfer entfernt, um 6,65 g eines dunkelgrünen Feststoffs zu erhalten, der das gewünschte Chlorid ist.
    • E. 4-(3-Methoxy-4-benzyloxyphenyl)-2,6-pyridindimethanol
  • Disäurechlorid (aus Abschnitt D) 6,65 g (0,016 mol)
  • Diglym® 300 ml
  • Natriumborhydrid 1,5 g
  • Tetrahydrofuran 20 ml
  • Das NaBH&sub4; wird in einen trockenen 500 ml-Dreihalskolben eingewogen, der mit einem Argoneinlaß, einem Thermometer und einem Aufgabetrichter ausgestattet ist. Es werden ein Rühreranker und Diglym® (ungefähr 300 ml) zugegeben und der Kolben wird mit Argon gespült und auf 0ºC gekühlt. Das Disäurechlorid wird in Diglym® (ungefähr 40 ml) und THF (ungefähr 20 ml) aufgelöst, in den Aufgabetrichter überführt und während ungefähr 15 Minuten (Temperatur 0ºC) tropfenweise unter Rühren und Kühlen dem Kolben zugegeben. Die Mischung wird während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Farbe der Lösung verändert sich während der ersten Stunde von bernsteinfarben zu korallenrot und verblaßt dann während der nächsten Stunde zu einer trüben gelbbraunen Färbung. Das Produkt wird in Wasser (ungefähr 500 ml) und ungefähr 100 ml an 0,1 M wäßriger Zitronensäure gegossen und am Rotationsverdampfer (60ºC) konzentriert. Der Rückstand (ungefähr 500 ml) wird in Wasser (ungefähr 1 l) gegossen und mit Et&sub2;O (4 · 100 ml) extrahiert. Die Extrakte werden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und am Rotationsverdampfer konzentriert, um 4,0 g des gewünschten Diols als einen gelbbraunen Feststoff, der in DMSO löslich ist, zu erhalten.
    • F. 4-(3-Methoxy-4-benzyloxyphenyl)-2,6-di(brommethyl)- pyridin
  • Diol (aus Abschnitt E plus einer Wiederholung) 5,1 g (21,1 mmol)
  • Triphenylphosphin 15,2 g
  • Brom 3,0 ml
  • Das Phosphin wird in einen trockenen 250 ml- Dreihalsrundkolben eingewogen. Es werden CH&sub3;CN (ungefähr 50 ml) und ein Rühreranker zugegeben und der Kolben wird mit einem Septum und einem Argoneinlaß verschlossen. Die Lösung wird in Eis/MeOH auf 0ºC gekühlt und es wird über 20 Minuten Br&sub2; zugetropft. Die Mischung wird während 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Diol wird in CH&sub3;CN (ungefähr 75 ml) suspendiert, zu dem Phosphin-Brom-Komplex überführt, während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und in Wasser (ungefähr 600 ml) gegossen, gefolgt von gesättigter NaHCO&sub3; (ungefähr 150 ml). Diese wäßrige Suspension wird dann mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert (2 · 200 ml). Die Extrakte werden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, durch Silicagel unter Eluieren mit CH&sub2;Cl&sub2; filtriert. Die Eluate werden an einem Rotationsverdampfer zu 2,2 g eines weißen Feststoffs konzentriert, der das gewünschte Dibromid ist und Spuren an Triphenylphosphinoxid enthält.
    • 6. 2,6-Bis[N,N-di(carboxymethyl)aminomethyl]-4-(3-methoxy- 4-benzyloxyphenyl) pyridintetramethylester
  • Dibromid (aus Abschnitt F) 2,15 g (4,5 mmol)
  • Iminodiessigsäuredimethylester 1,45 g (9,0 mmol)
  • 1,8-Bis(dimethylamino)naphthalin 1,94 g
  • Der Iminoester wird in einen trockenen 100 ml- Dreihalskolben eingewogen und die Base und CH&sub3;CN (ungefähr 50 ml) werden zugegeben. Das Dibromid wird in THF (ungefähr 35 ml) gelöst und zu dem Kolben gegeben, wobei über Nacht bei 45ºC unter Argon gerührt wird. Die Reaktionsmischung wird in Wasser (150 ml) und 0,1 M Zitronensäure (ungefähr 150 ml) und EtOAc (ungefähr 150 ml) gegossen. Die EtOAc- Schicht wird abgetrennt, mit 0,1 M Zitronensäure (ungefähr 100 ml), Wasser (ungefähr 100 ml) und Kochsalzlösung (ungefähr 100 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem dicken purpurfarbenen Öl konzentriert. Das Öl wird in CH&sub2;Cl&sub2; aufgelöst und durch Siliciumdioxid (35 g) pfropfenfiltriert. Es wird ein purpurfarbenes Band mit 10% EtOAc in CH&sub2;Cl&sub2; (ungefähr 200 ml) eluiert. Der gewünschte Tetraester wird dann mit 50% EtOAc/CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) und 80% EtOAc/CH&sub2;Cl&sub2; (ungefähr 2090 ml) eluiert. Die Eluatfraktionen, die den Tetraester enthalten, werden zu ungefähr 2,5 g eines Öls konzentriert.
    • H. Verseifung des Tetraesters
  • Der Tetraester aus Schritt G wird unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 1 verseift, um die gewünschte Tetrasäure zu ergeben.
    • Beispiel 21
  • Indem dem allgemeinen Verfahren aus Beispiel 19 gefolgt wird, werden die 4-[4-(oder 3-)Aminophenyl]-2,6-bis[N,N- di(carboxymethyl)aminomethyl]pyridintetraester an Digoxigeninon-3-O-carboxymethyloxim, Phenytoin-3-(8-octansäure) und Cortisol-3-O-carboxymethyloxim gekoppelt, um die konjugierten Materialien zu ergeben. Eine Verseifung der Tetraester ergibt die Tetrasäuren, welche mit Seltenerdmetallen zu den Zielanalyten analoge fluoreszenzmarkierte, immunologisch aktive Verbindungen bildeten.

Claims (5)

1. Mit einem substituierten Aryl substituierte 2,6-Dicarboxypyridin-Verbindung der allgemeinen Formel
wobei Ar für ein Aryl steht, n" eine ganze Zahl ist, welche gleich der Anzahl der zur Verfügung stehenden Bindungsstellen am Ar ist, jeder der n" R, R' und R" unabhängig aus Wasserstoff; Elektronen-abgebenden Gruppen einschließlich C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-, Amino-, Dialkylamino-, Aryl- (einschließlich Aralkyl-) und Aryloxy- (einschließlich Aralkyloxy-) -gruppen; und verknüpfenden Gruppen ausgewählt ist; und R* und R** unabhängig aus Metallionen, Wasserstoff und C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppen ausgewählt sind, wobei mindestens einer von ihnen ein Metallion ist.
2. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei einer von R* und R** Wasserstoff oder eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe ist.
3. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei Ar gleich Phenyl ist, und mindestens einer der n" R eine C&sub1;-C&sub4;-Alkoxygruppe ist.
4. Verwendung der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 als Zwischenprodukte bei der Herstellung von durch Fluoreszenz nachweisbaren Molekülen, welche eine mit einem substituierten Aryl substituierte 2,6-Bis- [N,N-di(carboxyalkyl)aminoalkyl]pyridin-Gruppierung umfassen.
5. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die durch Fluoreszenz nachweisbaren Moleküle zusätzlich biologisch aktives Material umfassen.
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