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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von
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Liganden in biclogäschen Flüssigkeiten, wie Serum, Plasma, Rückenmarkflüssigkeit,
Amnionflüssigkeit und Urin, sowie Reagentien zur Durchführung dieses Verfahrens.
Insbesondere betrifft die Erfindung einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay und
in diesem Verfahren als Tracer anwendbare Reagentien. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay
der Erfindung vereinigt die Spezifität eines Immunoassays mit der Geschwindigkeit
und der Zweckmässigkeit von Fluoreszenzpolarisationsmethoden und erlaubt die Bestimmung
der Menge eines in einer Probe vorhandenen spezifischen Liganden.
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Immunoassays auf der Basis einer kompetitiven Bindung zur Messung
von Liganden beruhen auf der Konkurrenz zwischen einem Liganden in einer Testprobe
und einem markierten Reagens, das als Tracer bezeichnet wird, um eine begrenzte
Anzahl von Rezeptorbindungsstellen an für den Liganden und Tracer spezifischen Antikörpern.
Die Konzentration des Liganden in der Probe bestimmt die Tracermenge, die eine spezifische
Bindung mit einem Antikörper eingeht.
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Die Menge des gebildeten Tracer-Antikörper-Konjugats kann quantitativ
gemessen werden und ist umgekehrt proportional zur Menge des Liganden in der Testprobe.
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Im allgemeinen beruhen Fluoreszenzpolarisationsverfahren auf dem Prinzip,
dass eine fluoreszierend markierte Verbindung bei Anregung durch linear polarisiertes
Licht Fluoreszenz emittiert, deren Polarisationsgrad in umgekehrter Beziehung zur
Rotationsgeschwindigkeit steht.
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Wird somit ein Molekül, z.B. ein Tracer-Antikörper-Konjugat mit einer
fluoreszierenden Markierung, mit linear olarisiertem Licht angeregt, so bleibt das
emittierte zieht stark polarisiert, da der Fluorophor im Zeitraum
zwischen
der Absorption und Emission des Lichts am Rotieren gehindert wird. Wenn eine "freie"
Tracerverbindung (d.h. nicht an einen Antikörper gebunden) durch linear polarisiertes
Licht angeregt wird, ist ihre Drehung wesentlich rascher als beim entsprechenden
Tracer-Antikörper-Konjugat und die Moleküle orientieren sich willkürlich'er, so
dass das emittierte Licht depolarisiert wird. Die Fluoreszenzpolarisation erlaubt
somit eine Messung der bei einem Immunoassay auf der Basis einer kompetitiven Bindung
gebildeten Menge eines Tracer-Antikörper-Konjugats.
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Es sind verschiedene fluoreszierend markierte Verbindungen bekannt.
Die US-PS 3 998 943 beschreibt die Herstellung eines fluoreszierend markierten Insulinderivats
unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) als fluoreszierende Markierung
und eines fluoreszierend markierten Morphinderivats unter Verwendung von 4-Aminofluoresceinhydrochlorid
als fluoreszierende Markierung. Carboxyfluorescein wurde ebenfalls für analytische
Bestimmungen eingesetzt. R.F. Chen, Anal. Lett., Bd. 10, (1977), S. 787 beschreibt
die Verwendung von Carboxyfluorescein zur Ermittlung der Aktivität von Phospholipase.
Hierbei erfolgt jedoch keine Konjugation von Carboxyfluorescein im Sinne der vorliegenden
Erfindung, vielmehr ist es in Lecithin-Liposomen eingekapselt und fluoresziert nur
wenn es durch Hydrolyse von Lecithin freigesetzt wird.
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Beim erfindungsgemässen Verfahren zur Bestimmung von Liganden in einer
Probe wird die Probe mit einem biologisch verträglichen Salz eines Tracers der allgemeinen
Formel I
in der R ein Ligandenanaloges mit einer einzelnen reaktiven primären oder sekundären
Aminogruppe bedeutet, die an das Carbonylkohlenstoffatom von Carboxyfluorescein
gebunden ist, wobei das Ligandenanaloge mit dem Liganden mindestens ein gemeinsames
Epitop aufweist, so dass sie durch einen gemeinsamen Antikörper spezifisch erkennbar
sind, und einem Antikörper, der spezifisch den Liganden und den Tracer erkennen
kann, vermischt und anschliessend die Menge des Tracer-Antikörper-Konjugats durch
eine Fluoreszenzpolarisationstechnik als Mass für die Konzentration des Liganden
in der Probe bestimmt.
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Gegenstand der Erfindung sind ferner bestimmte neue Tracer und biologisch
verträgliche Salze davon, die sich als Reagentien beim vorstehend erwähnten Verfahren
eignen. Die Verfahren und Tracer der Erfindung eignen sich insbesondere zur quantitativen
Bestimmung der Konzentrationen von therapeutischen Arzneistoffen in Serum und Plasma.
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Der Ausdruck "Ligand" bezieht sich auf ein Molekül, insbesondere auf
ein niedermolekulares Hapten, mit einer eineinen
reaktiven Aminogruppe,
für das ein Rezeptor, im allgemeinen ein Antikörper, erhalten oder gebildet werden
kann. Derartige Haptene sind proteinfreie Körper, im allgemeinen von geringem Molekulargewicht,
die nach Verabreichung an Tiere durch Injektion keine Antikörperbildung induzieren,
jedoch auf Antikörper reagieren. Antikörper gegen Haptene werden im allgemeinen
erhalten, indem man zunächst die Haptene mit einem Protein konjugiert und das konjugierte
Produkt einem Tier injiziert. Die erhaltenen Antikörper werden nach herkömmlichen
Verfahren zur Isolation von Antikörpern isoliert.
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Mit dem erfindungsgemässen Verfahren lassen sich Liganden innerhalb
eines grossen Molekulargewichtsbereichs bestimmen.
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Obgleich hochmolekulare Liganden bestimmbar sind, wird das Verfahren
der Erfindung im allgemeinen zur Bestimmung von Liganden von geringem Molekulargewicht,
im allgemeinen in einem Bereich von 50 bis 4000, bevorzugt. Besonders bevorzugt
ist die Bestimmung von Liganden mit einem Molekulargewichtsbereich von 100 bis 2000.
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Die Tracer der Erfindung umfassen Verbindungen der allgemeinen Formel
I, in der das durch R wiedergegebene- Ligandenanaloge Reste mit einem Molekulargewichtsbereich
von 50 bis 11000 einschliesst. Bei den bevorzugten Tracern der Erfindung handelt
es sich um Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der das durch R wiedergegebene
Ligandenanaloge Reste mit einem Molekulargewichtsbereich von 100 bis 2000 umfasst.
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Spezielle Beispiele für Liganden mit einer einzelnen reaktiven Aminogruppe,
die gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren bestimmbar sind, sind Steroide, wie
Östron, Östradiol, Cortison, Testosteron, Progesteron, Chenodesoxycholsäure,
Digoxin,
Cholsäure, Digitoxin, Desoxycholsäure , Ii tt(JQhfl 1 säuren und deren Ester und
Amide ; Vitamine, wie B12 und F'olsäure; Thyroxin, Trijodthyronin, Histamin, Serotonin,
Prostaglandine, wie PGE, PGF und PGA; Antiasthmatika, wie Theophyllin; antineoplastische
Mittel, wie Doxorubicin und Methotrexat;Antiarrhythmika, wie Disopyramid, Lidocain,
Procainamid, Propranolol, Chinidin und N-Acetylprocainamid; Anticonvulsiva, wie
Phenobarbital, Phenytoin, Primidon, Valproasäure, Carbamazepin und Ethosuximid;
Antibiotika, wie Penicilline, Cephalosporine und Vancomycin; Antiarthritika, wie
Salicylat; Antidepressiva unter Einschluss von tricyclischen Verbindungen, wie Nortriptylin,
Amitriptylin, Imipramin und Desipramin; sowie ähnliche Verbindungen und deren Stoffwechselprodukte.
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Weitere Liganden, die sich erfindungsgemäss bestimmen lassen, sind
missbräuchlich verwendete Arzneistoffe, wie Morphin, Heroin, Hydromorphon, Oxymorphon,
Metapon, Codein, Hydrocodon, Dihydrocodein, Dihydrohydroxycodeinon, rholcodin, Dextromethorphan,
Phenazocin und Deonin sowIe 4-ren Metabolite.
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Die Tracer der Erfindung liegen im allgemeinen in einem Gleichgewicht
zwischen dem sauren und dem icnisierten Zustand vor, wobei die ionisierte Form im
erfindungsgemässen Verfahren wirksam ist. Somit umfasst die Erfindung die Tracer
sowohl in der sauren als auch in der ionisierten Form, wobei sie aus Zweckmässigkeitsgründen
in den StruK-turformeln in der sauren Form angegeben werden. Liegen die Tracer der
Erfindung in ihrer ionisierten Form vor, so handelt es sich um biologisch verträgliche
Salze. Unter biologisch verträglichen Salzen" sind Salze, wie Natrium-, Kalium-,
Ammoniumsalze und dergl. zu verstehen, die es ermöglichen, dass die erfindungsgemässen
Tracer bei Anwendung im erfindungsgemässen Verfahren in ionisierter Form vorliegen
können.
Im allgemeinen liegen die Tracer der Erfindung in Lösung als Salze vor, wobei das
spezielle Salz durch den verwendeten Puffer bedingt ist, beispielsweise liegen die
Tracer in Gegenwart von Natriumphospatpuffer im allgemeinen in ionisierter Form
als Natriumsalze vor.
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Die Tracer der Erfindung. umfassen ein durch R wiedergegebenes Ligandenanaloges,
das an einen Carboxyfluoresceinrest der allgemeinen Formel II
gebunden ist.
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Der Ausdruck Ligandenanaloges betrifft einen ein- oder mehrwertigen
Rest, von dem ein wesentlicher Anteil die gleiche räumliche und polare Organisation
wie der Ligand aufweist, so dass eine od-er mehrere Determinanten oder epitopen
Stellen definiert werden, die in der Lage sind, mit dem Liganden um die bindenden
Stellen eines Rezeptors zu konkurrieren. Ein Charakteristikum für ein derartige
Ligandenanaloges besteht darin, dass es eine so grosse
strukturelie
Ähnlichkeit mit mit dem Frage stehenden Liganden aufweist, so dass es durch den
Antikörper gegen ?::en Liganden erkannt werden kann. Meistens weist das Ligandenanaloge
in einem beträchtlichen Anteil der Moleküloberfläche die gleiche Struktur und Ladungsverteilung
(räumliche und polare Organisation) wie der in Frage stehende Ligand auf. Da häufig
die bindende Stelle für ein Hapten bei der Herstellung des Antigens zur Bildung
von Antikörpern die gleiche ist, die zur Verknüpfung mit dem Liganden verwendet
wird, liegt der gleiche Teil des Ligandenanalogen, der die Schablone für den Antikörper
darstellt, im Ligandenanalogen im Tracer frei.
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Im allgemeinen leitet sich die Klasse der durch P, wiedergegebenen
Ligandenanalogen von den entsprechenden Liganden durch Entfernung eines reaktiven
Wasserstoffatoms, d.h.
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eines an ein reaktives Amin (primär oder sekundär) gebundenen Wasserstoffatoms,oder
durch Hildung eines Ami noderivats des Liganden ab, wobei eine Iminogruppe
an der Stelle der Bindung an den Carboxyfluoresceinrest eine oder mehrere ursprünglich
im Liganden vorhandene Atome ersetzt. Spezielle Beispiele für Liganden, die nach
Entfernung eines reaktiven Wasser stoffatoms durch R wiedergegebene Ligandenanaloge
bilden können,sind Procainamid, Thyroxin und Chinidin. Beispiele für Liganden, deren
Aminoderivate sich als Ligandenanaloge eignen, sind Theophyllin, Valproasäure (valproic
acid), Phenobarbital, Phenytoin, Primidon, Disopyramiå, Digoxin, Chloramphenicol,
Salicylat, Acetaminophen, Carbamazepin, Desipramin und Nortriptylin. Ferner kann
ein Ligand strukturell durch Einführung oder Entfernung von
einer
oder mehrere funktionellen Gruppen unter Bildung eines Ligandenanalogen modifiziert
werden, wobei die erforderlichen epitopen Stellen zur Bindung an einen Antikörper
erhalten bleiben. Derartige modifizierte Ligandenanaloge sind jedoch durch eine
Iminogruppe an den Carboxyfluoresceinrest gebunden.
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Die Tracer der Erfindung werden im allgemeinen nach an sich bekannten
Verfahren hergestellt. Beispie]sweise wird eine Verbindung der allgemeinen Formel
111 R - X (III) in der R die vorstehende Bedeutung hat und X ein reaktives Wasserstoffatom
bedeutet, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IV
in der R Hydroxyl oder einen aktiven Ester bedeutet und die Carboxylgruppe vorzugsweise
an die 4- oder 5-Stellung des Benzoesäurerings gebunden ist, in Gegenwart eines
inerten
I.ösungsmittels behandelt, wodurch man eine Verbindung
der al]gemeinen Formel I erhält.
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Unter dem Ausdruck "aktiver Ester" ist ein Rest zu verstehen, der
leicht in Gegenwart eines Kupplungsmittels vom Carboxykohlenstoffatom entfernt wird.
Derartige, für den Fachmann leicht zu ermittelnde aktive Ester von Carboxyfluorescein
werden durch Umsetzung von Carboxyfluorescein mit einer Verbindung, wie N-Hydroxysuccinimid,
1-Hydroxybenzotriazol-hydrat oder p-Nitrophenol, in Gegenwart eines Kupplungsmittels,
wie Dicyclohexylcarbodiimid, und eines Lösungsmittels hergestellt. Die auf diese
Weise erhaltenen aktiven Ester von Carboxyfluorescein werden anschliessend mit einer
Verbindung der allgemeinen Formel III unter Bildung eines Tracers der allgemeinen
Formel I umgesetzt.
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Ist die Verbindung der allgemeinen Formel III wasseriöslieh, so schreitet
der Reaktionsmechanismus unter direkter Umsetzung von Carboxyfluorescein mit einer
Verbindung der allgemeinen Formel III in wässriger Lösung in Gegenwart eines wasserlöslichen
Carbodiimids, wie 1-Äthyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-carbodimid-hydrochlorid, als
Kupplungsmittel fort.
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Die Temperatur, bei der das Verfahren zur Herstellung der Tracer der
Erfindung abläuft, ist nicht kritisch. Die Temperatur soll für die Einleitung und
Aufrechterhaltung der Reaktion ausreichend sein. Im allgemeinen ist aus Zweckmässigkeitsgründen
und aus wirtschaftlichen Gründen Raumtemperatur ausreichend. Zur Herstellung der
Tracer der Erfindung ist das Verhältnis der Reaktionsteilnehmer nicht eng begrenzt.
Pro 1 Mol einer Verbindung der allgemeinen Formel t 1 sol l te zur Gewährleistung
einer annehmbaren Ausbeute 1 Mol einer Verbindung der allgemeinen Formel III
eingesetzt
werden. Vorzugsweise wird ein ijbersehuss der Verbindung der allgemeinen Formel
III eingesetzt, um die Durchführung der Reaktion zu erleichtern und die Ausbeute
zu verbessern.
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Im Hinblick auf eine leichte Handhabung und auf die Ausbeute an Produkt
wird das Verfahren zur Herstellung der Tracer der Erfindung in Gegenwart eines inerten
Lösungsmittels durchgeführt. Geeignete inerte Lösungsmittel sind solche, die nicht
mit den Ausgangsmaterialien reagieren und für eine ausreichende Lösung dieser Ausgangsmaterialien
sorgen. Beispiele dafür sind Wasser (falls die Verbindung der allgemeinen Formel
III wasserlöslich ist), Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und dergl. Handelt es
sich bei der Verbindung der allgemeinen Formel III um ein reaktives Aminsalz, wird
das Reaktionsgemisch zur. Bildung der freien Base des reaktiven Amins mit einer
entsprechenden Base versetzt. Ein Beispiel hierfür ist Triäthylamin.
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Die Reaktionsprodukte der allgemeinen Formel I werden im allgemeinen
vor ihrem Einsatz im erfindungsgemässen Verfahren dünnschichtchromatographisch oder
säulenchroma tographisch gereinigt.
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Beim erfindungsgemässen Verfahren wird eine den zu bestimmenden Liganden
enthaltende Probe mit einem biologisch verträglichen Salz eines Tracers der allgemeinen
Formel I und einem für Liganden und Tracer spezifischen Antikörper vermischt. Der
in der Probe vorhandene Ligand und der Tracer reagieren unter Bildung von Ligand-Antikörper-
und Tracer-Antikörper-Komplexen um begrenzte Antikörperstellen.
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Hält man die Konzentration an Tracer und Antikörper konstant, so ist
das entstehende Verhältnis von Ligand-Antikörper-Komplex zu Tracer-Antikörper-Komplex
direkt propur
'ti urial zur i-íenge des in dtr Probe vorhandenen
Liganden.
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Um wird r,acEI Anregung des Gemisches mit @clarisiertem Licht und
Messung der Polarisation der durch einen Tracer und einen Tracer-Antikörper-Komplex
emittierten Fluoreszenz eine quantitative Bestimmung des Liganden in der Probe möglich.
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Theoretisch ist die Fluoreszenzpolarisation eines nicht mit einem
Antikörper komplexierten Tracers gering und geht nach Null. Nach Komplexieren mit
einem spezifischen Antikörper ernimmt der Tracer-Antikörper-Komplex die Rotation
des Antikörpermolcküls, die geringer ist als die des relativ kleinen Tracermoleküls,
wodurch die beobachtete Po--larisation ansteigt. Konkurriert nun ein Ligand mit
dem Tracer um Antikörperstellen, so ergibt sich für die beobachtete Polarisation
der Fluoreszenz des Tracer-Antikörper-Komplexes ein Wert, der irgendwo zwischen
dem Wert für den Tracer und dem Wert für den Tracer-Antikörper-Komplex liegt. Enthält
eine Probe eine hohe Ligandenkonzentration, so liegt der beobachtete Polarisationswert
näher am Wert des freien Liganden, d.h. er ist gering.
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Enthält die Testprobe eine geringe Ligandenkonzentration, so liegt
der Polarisationswert näher am Wert des gebundenen Liganden, d.h. er ist hoch. Durch
aufeinanderfolgende Anregung des Reaktionsgemisches eines Immunoassays zunächst
mit vertikal und dann mit horizontal polarisiertem Licht und durch Analyse nur der
vertikalen Komponente des emittierten Lichts kann die Polarisation der Fluoreszenz
im Reaktionsgemisch genau bestimmt werden. Die genaue Beziehung zwischen Polarisation
und Konzentration des zu bestimmenden Liganden wird ermittelt, indem man die Polarisationswerte
von Kalibratoren (Eichsubstanzen) mit bekannten Konzentrationen misst. Die Konzentration
des Liganden kann aus einer aufdiese Weise aufgestellten Eichkurve
extrapoliert
werden.
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Der pH-Wert, bei dem das erfindungsgemässe Verfahren durchzuführen
ist, muss ausreichen, dass die Tracer der allgemeinen Formel I in ionisiertem Zustand
vorliegen können.
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Der pH-Wert kann etwa 3 bis 12, insbesondere etwa 5 bis 10 und vorzugsweise
etwa 6 bis 9 betragen. Zur Einstellung und Aufrechterhaltung des pH-Werts während
der Bestimmung können verschiedene Puffer eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind
Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergl. Die Art des verwendeten Puffers
ist für die Erfindung nicht kritisch, jedoch kann bei einer bestimmten Bestimmung
ein spezieller Puffer im Hinblick auf den verwendeten Antikörper und den zu bestimmenden
Liganden bevorzugt sein. Das Kation des Puffers bestimmt im allgemeinen das Kation
des Tracersalzes in der Lösung.
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Das erfindungsgemässe Verfahren wird bei mässigen Temperaturen und
vorzugsweise bei einer konstanten Temperatur durchgeführt. Die Temperatur beträgt
im allgemeinen etwa 0 bis 50 0C und vorzugsweise etwa 15 bis 110 C.
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Die Konzentration des zu bestimmenden Liganden variiert -2 im allgemeinen
von etwa 10 2 bis 10 13 m und insbesondere von etwa 10-4 bis 10-10 m. Höhere Ligandenkonzentrationen
können bestimmt werden, nachdem man die Originalprobe verdünnt hat.
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Neben dem Konzentrationsbereich des in Frage stehenden Liganden bestimmen
Erwägungen, z.B. ob die Bestimmung qualitativ, halbquantitativ oder quantitativ
durchgeführt werden soll, die verwendete Einrichtung und die Eigenschaften von Tracer
und Antikörper im allgemeinen die Konzentration des zu verwendenden Tracers und
Antikörpers. Während die
Konzentration des Liganden in der Probe
den Konzentrationsbereich der anderen Reagentien, d.h. Tracer und Antikörper, (im
allgemeinen unter Optimierung der Empfindlichkeit der Bestimmung) entscheidend sind,
können die einzelnen Reagentienkonzentrationen empirisch festgelegt werden. Entsprechende
Konzentrationen für Tracer und Antikörper kann der Fachmann leicht ermitteln.
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Wie vorstehend erläutert, werden bevorzugte Tracer der Erfindung aus
5-Carboxyfluorescein, 4-Carboxyfluorescein oder deren Gemishen hergestellt. Sie
lassen sich durch die allgemeinen Formeln V und VI wiedergeben:
Die folgenden Beispiele erläutern Herstellungsverfahren für spezielle Tracer der
Erfindung. Das in den Strukturformeln, die die in den nachstehenden Beispielen hergestellten
Verbindungen erläutern, vorkommende Symbol / CF/ bedeutet einen Rest der allgemeinen
Formel VII
in der das Carbonylkohlenstoffattom in der 4- oder 5-Stellung
der vorgenannten Formel gebunden ist. Dies angesichts der Tatsache, dass ein Gemisch
aus IJ- und 5-Carboxyfluorescein als Ausgangsmaterial verwendet wird.
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Beispiel 1 5 mg m- oder p-Aminophenobarbital und 5 mg Carboxyfluorescein
werden in 0,5 ml Pyridin gelöst. Das Gemisch wird mit 15 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
versetzt. Nach 2-stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch
2 mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches
aus Chloroform und Methanol (2:1) als Laufmittel gereinigt. Man erhält ein Aminophenobarbi
tal-Carboxyfluorescein-Konjugat der Formel
Beispiel 2 Eine Lösung mit einem Gehalt an 1,0 g Natriumhydroxid,
2,5 g Phenytoin und 2,0 g 2-Brommethylamin-hydrobromid in 100 ml 100prozentigem
Athanol wird 2 Stunden unter Rückpluss erwärmt und sodann unter vermindertem Druck
zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Wasser suspendiert. Der pH-Wert
wird durch Zusatz von 6 n Natriumhydroxidlösung auf 11 eingestellt, um nicht umgesetztes
Phenytoin in Lösung zu bringen.
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Der verbleibende Niederschlag, nämlich 2-ß-Aminoäthylphenytoin, wird
filtriert, gründlich mit Wasser gespült und getrocknet.
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Ein aktiver Ester von Carboxyfluorescein wird hergestellt, indem man
5 mg N-Hydroxysuccinimid, 7,5 mg Carboxyfluorescein und 20 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
in 0,5 ml Pyridin löst. Nach 2-stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur werden 10
mg 2-ß-Aminoäthylphenytoin im Reaktionsgemisch gelöst. Das erhaltene Gemisch wird
über Nacht im Dunklen bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch
2 mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches
aus Chloroform und Methanol (3:1) als Laufmittel gereinigt. Man erhält ein 2-ß-Aminoäthylphenytoin-Carboxyfluorescein-Kon
jugat der Formel
Beispiel 3 Eine Lösung mit einem Gehalt an 620 mg 2-Carboxymethylphenytoin,
248 mg N-Hydroxysuccinimid und 453 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 6 ml wasserfre-iem
Dimethylsulfoxid wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen.
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Sodann wird das Gemisch filtriert. 4,5 ml Filtrat werden mit 0,7 ml
95-prozen gem Hydrazin versetzt. Nach 4-stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur wird
das Reaktionsgemisch mit 40 ml Wasser und 0,5 ml 10-prozentiger Natriumhydroxidlösung
versetzt. Das als Niederschlag gebildete 2-Carboxymethyl phenytoin-hydrazid wird
abfiltriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und ohne weitere Reinigung eingesetzt.
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15 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid werden zu einer Lösung von 5 mg
2-Carboxymethylphenytoin-hydrazid und 5 mg Carboxyfluorescein in 0,5 ml Pyridin
gegeben. Nach 2-stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das gebildete Reaktionsprodukt
2 mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches
aus Chloroform und Aceton (1:1) als Laufmittel gereinigt. Man erhält ein 2-Carboxymethylphenytoin-hydrazid-Carboxyfluorescein-Konjugat
der Formel
Beispiel 4 15 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid werden zu einer
Lösung von 5 mg 8-ß-Aminoäthyltheophyllin und 5 mg Carboxyfluorescein in 0,5 ml
Pyridin gegeben. Nach 2-stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das Reaktionsprodukt
2 mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches
aus Chloroform und Methanol (2:1) als Laufmittel gereinigt. Man erhält ein 8-ß-Aminoäthyltheophyllin-Carboxyfluorescein-Konjugat
der Formel
Beispiel 5 Das Verfahren von Beispiel 4 wird unter Verwendung von 8-Aminomethyltheophyllin
anstelle von 8-ß-Aminoäthyltheophyllin wiederholt. Man erhält ein 8-Aminomethyltheophyllin-Carboxyfluorescein-Konjugat
der Formel
Beispiel 6 7,5 g 6-Valerolactam werden unter trockenem Stick.etoff
in 60 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Der Reaktionskolben wird tropfenweise
mit 99 ml einer 1,6 m Lösung von n-Butyllithium in Hexan versetzt und in einem Trockeneis/Aceton-Bad
gekühlt. Nach beendeter Zugabe des n-Butyllithiums wird das Reaktionsgemisch 1 Stunde
bei Raumtemperatur gerührt, 30 Minuten unter Rückfluss erwärmt und sodann unter
trockenem Stickstoff auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschliessend werden unter Kühlung
des Kolbens in einem Eisbad 8,0 g 1-Bromäthan langsam zugegeben. Das erhaltene Gemisch
wird hierauf 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann langsam mit 100 ml
Wasser versetzt.
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Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Nach dem Abtrennen der organischen Phase wird die wässrige Phase mit 50 ml Diäthyläther
extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet.
Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene dunkle öl kristallisiert beim
Stehenlassen. Der kristalline Rückstand wird aus Petroläther umkristallisiert.
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Man erhält 3,8 g Rückstand. 2,8 g des Rückstands werden in 25 ml 6
n Salzsäure 6 Stunden unter Rückfluss erwärmt.
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Nach dem Abdampfen des Wassers aus dem Reaktionsgemisch erhält man
2-Athyl-5-aminopentansäure in Form eines dunklen, dicken Öls, das ohne weitere Reinigung
weiterverazencet wird.
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Ein aktiver Ester von Carboxyfluorescein wird hergestellt, indem man
5 mg N-Hydroxysuccinimid, 7,5 mg Carboxyfluorescein und 20 mg ,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
in 0,5 ml Pyridin löst. Nach 2-stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch
mit 20 mg 2-Äthyl-5-aminopentansäure versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht
im Dunklen bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Reaktionsprodukt
wird
2 mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches
aus Chloroform und Methanol (3:1) als Laufmittel gereinigt. Man erhält ein 2-Ä'thyl-5-aminopentansäure-Carboxyfluorescein-Konjugat
der Formel
Beispiel 7 Ein aktiver Ester von Carboxyfluorescein wird hergestellt, indem man
5 mg N-Hydroxysuccinimid, 7,5 mg Carboxyfluorescein und 20 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
in 0,5 ml Pyridin löst. Nach 2-stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch
mit 20 mg 5-(r-Aminopropyliden)-5H-dibenzo/ a,d/-10,11-dihydrocyclohepten versetzt.
Das erhaltene Gemisch wird über Nacht im Dunklen bei Raumtemperatur umgesetzt. Das
Reaktionsgemisch wird 2 mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung
eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (3:1) als Laufmittel gereinigt. Man
erhält ein 5-(t-Aminopropyliden)-5H-dibenzo/ 1 1-dihydrocyclohepten-Carboxyfluorescein-Konjugat
der Formel
Beispiel 8 Eine Lösung- von 1,33 g Desipramin-hydrochlorid und 0,8 g Chloracetylchlorid
in 25 ml Chloroform wird 2 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Der nach dem Abdampfen
des Chloroforms erhaltene Rückstand wird in 25 ml Aceton gelöst. Die Acetonlösung
wird mit 0,75 g Natriumjodid versetzt. Die Lösung wird 30 Minuten unter Rückfluss
erwärmt. Sodann wird die Lösung filtriert und das ausgefallene Salz mit Aceton gewaschen.
Das Acetonfiltrat wird eingedampft und der P.ückstand in 20 ml Methanol aufgenommen.
Nach Zusatz von 20 ml konzentriertem Ammoniak zur Methanollösung wird die erhaltene
Lösung 1 Stunde unter Rückfluss erwärmt. Sodann wird das Reaktionsgemisch 3 mal
mit je 25 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden über Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und eingedampft. Man erhält N-Aminoacetyldesipramin, das ohne
weitere Reinigung eingesetzt wird. 5 mg N-Aminoacetyldesipramin und 5 mg Carboxyfluorescein
werden in 0,5 ml Pyridin gelöst. Das Gemisch wird mit 15 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
versetzt.
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Die Reaktion läuft 2 Stunden bei Raumtemperatur ab. Anschliessend
wird das Reaktionsprodukt 2 mal dünnschichtchromatographisch an Kieselgel unter
Verwendung eines Gemisches
aus Chloroform und Aceton (1:1) als
Laufmittel gereinigt. Man erhält ein N-Aminoacetyldesipramin-Carboxyfluorescein-Konjugat
der Formel
Beispiel 9 Eine Lösung von 5 mg N-Hydroxysuccinimid,. 7,5 mg Carboxyfluorescein
und 20 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Pyridin wird 4 Stunden bei Raumtemperatur
umgesetzt. Ein aktiver Ester von Carboxyfluorescein wird ausgefällt, indem man das
Reaktionsgemisch mit 10 ml Diäthyläther versetzt. Der Niederschlag wird filtriert,
gründlich mit Diäthyläther gewaschen und in 0,5 ml Dimethylsulfoxid in Lösung gebracht.
Sodann wird die Lösung mit 10 mg L-Thyroxin versetzt. Nach 2-stündiger Umsetzung
bei Raumtemperatur wird das Reaktionsprodukt 2 mal'dünnschichtchromatographisch
an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (3:1)
als Laufmittel gereinigt.
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Man erhält ein L-Thyroxin-Carboxyfluorescein-Konjugat der Formel
Beispiel 10 Eine Lösung von 0,89 g Ammoniumacetat, 389 mg 3-Oxodigoxigenin und 63
mg Natriumcyanoborhydrid in 5 ml Methanol wird 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Sodann wird die Lösung durch Zusatz von konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert
von 1 eingestellt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand
wird in 10 ml Wasser aufgenommen und 3 mal mit je 10 ml Chloroform extrahiert.
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Die wässrige Phase wird mit festem Kaliumhydroxid auf den pH-Wert
11 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird 5 mal mit je 10 ml Methylenchlorid extrahiert.
Die organischen Phasen werden vereinigt, getrocknet und unter vermindertem Druck
zur Trockne eingedampft. Man erhält 3-Amino-3-desoxydigoxigenin, das ohne weitere
Reinigung eingesetzt wird.
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Ein aktiver Ester von Carboxyfluorescein wird hergestellt, indem man
5 mg N-Hydroxysuccinimid, 7,5 mg Carboxyfluorescein und 20 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
in 0,5 ml Pyridin löst. Nach 2-stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur wird das 3-Amino-3-desoxydigoxigenin-Carboxyfluorescein-Konjugat
der folgenden Formel isoliert
Gemäss dem vorstehenden Verfahren werden folgende Tracer hergestellt: Beispiel 11
O-Aminoacetyl-propranolol-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 12 2-Propyl-5-aminopentansäure-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 13 2-Butyl-5-aminopentansäure-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 14 Aminoprimidon-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 15 i-(4'-Nitrophenyl)-1-hydroxy-2-amino-3-hydroxypropan-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 16 p-Aminophenol-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 17 N-(2-Aminoäthyl) ethosuximid Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 18 N' -Desäthyl-N-acetyl-procainamid-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 19 t esäthyl-N'-aminoacetyl-N-aeetyl-procainamid-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 20 1-Amino-2 phenyl-2-(2'-pyridyl)-4-(diisopropylamino)-butan-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 21 3,3' 5 -Trijod-L-thyronin-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 22 3,3 5X5 t -Tetrajod-D-thyronin-Carboxyfluoreseein-Konjugat
Beispiel 23 N-Aminoacetyl-iminodibenzyl-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 24 Carbhydrazinimino-dibenzyl-Carboxyfluorescein-Konjugat
Beispiel 25 Dibenzosuberonhydrazon-Fluorescein-Konjugat
Beispiel 26 5-Amino-10,11-dihydro-5H-dibenzol-[a,d]-cyclohepten
Wie bereits erwähnt, handelt es sich bei den Tracern der Erfindung um wirksame Reagentien
zur Verwendung bei Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays. Die folgenden Bei--spiele
erläutern die Eignung der Tracer der Erfindung bei Immunoassays unter Anwendung
von Fluoreszenzpolarisationstechniken.
Derartige Bestimmungen werden
nach folgendem allgemeinen Verfahren durchgeführt: 1) Ein gemessenes Volumen eines
Standards oder Testserums wird in ein Reagensglas gegeben und mit Puffer verdünnt.
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2) Eine bekannte Konzentration eines Tracers der Erfindung, der gegebenenfalls
ein oberflächenaktives Mittel enthält, wird sodann in die einzelnen Reagensgläser
gegeben.
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3) Eine bekannte Konzentration an Antiseren wird in die Reagensgläser
gegeben.
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11) Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur inkubiert.
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5) Die an Antikörper gebundene Menge. an Tracer wird durch Fluoreszenzpolarisationstechniken
als ein Mass für die Ligandenmenge in der Probe gemessen.
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Beispiel 27 Bestimmung von Phenytion A) Erforderliche Materialien:
1) BGG-Puffer, bestehend aus 0,1 m Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 7,5 mit einem
Gehalt an 0,01 Prozent Rinder-g-Globulin und 0,01 Prozent Natriumazid.
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2) Tracer, bestehend aus 2-ß-Aminoäthylphenytoin-Carboxyfluorescein
in einer Konzentration von etwa 105 nanomolar in BGG-Puffer mit einem Zusatz an
5 Prozent Natriumcholat.
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3) Antiserum, bestehend aus Antiserum gegen Phenytoin, entsprechend
in BGG-Puffer mit einem Gehalt an 0,005 Prozent Benzalkoniumchlorid verdünnt.
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4) Proben von Humanserum oder anderen biologischen Flüssigkeiten mit
einem Gehalt an Phenytoin.
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5) Als Küvetten verwendete gläserne Kulturröhrchen der Abmessungen
10 x 75 mm.
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6) Fluorimeter zur Messung der Fluoreszenzpolarisation mit einer Präzision
von + 0,001 Einheiten.
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B) Bestimmungsverfahren: 1) Jede Küvette wird mit einem geringen Probenvolumen
(0,366 ,,ul) versetzt,- indem man 15 ,ul Probe in ein Verdünnungsgefäss pipettiert
und mit 600 pl BGG-Puffer verdünnt. Anschliessend werden 15,ul der verdünnten Probe
in die Küvette pipettiert und sodann mit 600 »1 BGG-Puffer versetzt.
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2) Tracer wird zugegeben, indem man 40 »1 Tracer und 1000 pl BGG-Puffer
in die Küvette pipettiert.
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3) Zum Start der Reaktion wird Antiserum zugesetzt, indem man 40 ,ul
Antiserum und anschliessend 1000 µl BGG-Puffer in die Küvette pipettiert.
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11) Der Küvetteninhalt wird jeweils gründlich vermischt und 15 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert.
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5) Die Fluoreszenzpolarisation wird am Fluorimeter abgelesen. Zur
Bestimmung unbekannter Proben wird eine Eichkurve aufgestellt.
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C) Die Ergebnisse einer Reihe von Eichseren mit einem Phenytoingehalt
zwischen 0 und 110 Xg/ml sind nachstehend zusammengestellt. Die einzelnen Konzentrationen
werden jeweils 2-fach bestimmt und sodann die Mittelwerte berechnet.
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Phenytoinkonzentration (pg/ml) Polarisation 0 0,222 2,5 0,196 5,0
0,178 10,0 0,154 20,0 0,132 40,0 0,110
Es ist ersichtlich, dass
die Polarisation der Fluoreszenz in regelmässiger Weise mit zunehmender Phenyto-inkonzentration
abnimmt, was die Aufstellung einer Eichkurve ermöglicht. Unbekannte, auf identische
Weise behandelte Proben können mit Hilfe der Eichkurve quantitativ bestimmt werden.
Die vorstehenden Ausführungen belegen also die Eignung von 2-ß-Aminoäthylphenyto
in-Carboxyfluorescein zur Messung von Phenytoin.
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Beispiel 28 Bestimmung von Phenobarbital A) Erforderliche Materialien:
1) BGG-Puffer (vgl. Phenytoin) 2) Tracer, bestehend aus Aminophenobarbital-Carboxyfluorescein
in einer Konzentration von etwa 110 nanomolar in Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5
mit einem Gehalt an 0,01 Prozent Natriumazid, 0,01 Prozent Rinder-/-Globulin und
0,125 Prozent Natriumdodècylsulfat.
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3) Antiserum, bestehend aus Antiserum gegen Phenobarbital, entsprechend
verdünnt in BGG-Puffer mit einem Gehalt an 0,005 Prozent Benzalkoniumchlorid.
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11) Proben von Humanserum oder anderen biologischen Flüssigkeiten
mit einem Gehalt an Phenobarbital.
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5) Küvetten (vgl. Phenytoin) 6) Fluorimeter (vgl. Phenytoin) B) Bestimmungsverfahren:
1) In die Küvette wird ein geringes Probenvolumen (0,196 Xl) gegeben, indem man
10 vul Probe in ein Verdünnungsgefäss pipettiert und mit 500 Xul BGG-Puffer verdünnt.
Sodann werden 10 vul verdünnte Probe und hierauf 500 Xul BGG-Puffer in die Küvette
pipettiert.
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2) Tracer wird zugesetzt, indem man jeweils 40 Sl Tracer und 1000
All BGG-Puffer in die Küvetten pipettiert.
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3) Antiserum wird zum Start der Reaktion zugesetzt, indem man 40 kl
Antiserum und anschliessend 1000 kl BGG-Puffer pipettiert.
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4) Der Inhalt sämtlicher Küvetten wird gründlich vermischt und 15
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
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5) Die Fluoreszenzpolarisation wird mittels eines Fluorimeters abgelesen.
Zur Bestimmung von unbekannten Proben wird eine Eichkurve aufgestellt.
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C) Die Ergebnisse einer Reihe von Serumstandards mit einem Gehalt
an Phenobarbital zwischen 0 und 80 >ig/ml sind nachstehend angegeben. Für jede
Konzentration wird eine Doppelbestimmung vorgenommen und gemittelt.
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Phenobarbitalkonzentration (,ul) Polarisation 0 0,250 5,0 0,231 10,0
0,196 20,0 0,150 40,0 0,104 80,0 0,077 Es ist ersichtlich, dass die Polarisation
der Fluoreszenz in regelmässiger Weise mit zunehmender Phenobarbitalkonzentration
abnimmt, was die Aufstellung einer Eichkurve ermöglicht. Unbekannte, auf identische
Weise behandelte Proben können mittels der Eichkurve quantitativ bestimmt werden.
Somit eignet sich Aminophenobarbital-Carboxyfluorescein zur Messung von Phenobarbital.
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Beispiel 29 Bestimmung von Theophyllin A) Erforderliche Materialien:
1) Tracer, bestehend aus 2 nanomolar 8-Aminoäthyltheophyllin-Carboxyfluorescein
in BGG-Puffer (vgl. .Phenytoinbestimmung) mit einem Gehalt an 0,01 Prozent Natriumdodecylsulfat.
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2) Antiserum, bestehend aus Antiserum gegen Theophyllin, in BGG-Puffer
entsprechend verdünnt.
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3) Proben von Humanserum oder anderen biologischen Flüssigkeiten mit
einem Gehalt an Theophyllin.
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4) Küvetten (vgl. Phenytoinbestimmung) 5) Fluorimeter, (vgl. Phenytoinbestimmung)
B) Bestimmungsverfahren: 1) Jeweils 1,0 ml Tracer in die Küvette geben.
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2) Jeweils 2,0 p1 Probe in die Küvette geben.
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3) Jede Küvette mit jeweils 1,0 ml Antiserum versetzen 4) Gründlich
mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
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5) Die Fluoreszenzpolarisation am Fluorimeter ablesen und eine Eichkurve
aufstellen.
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C) Die Ergebnisse einer -Reihe von Serumstandards mit einem Gehalt
an Theophyllin in Konzentrationen zwischen 0 und 40 Xug/ml sind nachstehend wiedergegeben.
Für jede Konzentration wird eine Doppelbestimmung durchgeführt und gemittelt.
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Theophyllinkonzentration (pg/ml) Polarisation 0 0,158 2,5 0,118 5
0,105 10 0,091 20 0,076 110 0,063 Es ist ersichtlich, dass die Polarisation der
Fluoreszenz in regelmässiger Weise mit zunehmender Theophyllinkonzentration abnimmt,
was die Aufstellung einer Eichkurve ermöglicht. Unbekannte, auf identische Weise
behandelte Proben können mit Hilfe der Eichkurve quantitativ bestimmt werden. Somit
eignet sich 8-Aminoäthyltheophyllin-Carboxyfluorescein zur Messung von Theophyllin.
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Beispiel 30 Bestimmung von Digoxin A) Erforderliche Materialien: 1)
BGG-Puffer, bestehend aus 0,-1 m Natriumphpsphatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem
Gehalt an 0,01 Prozent Rinder-»-Globulin und 0,01 Prozent Natriumazid.
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2) Tracer, bestehend aus Digoxin-Carboxyfluorescein in einer Konzentration
von etwa 2 nanomolar in BGG-Puffer.
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3) Antiserum, bestehend aus Kaninchenantiserum gegen Digoxin, entsprechend
verdünnt in BGG-Puffer.
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4) Proben von Humanserum oder anderen biologischen Flüssigkeiten mit
einem Gehalt an Digoxin.
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5) Fällungsreagens: 5-prozentige Trichloressigsäure in Wasser.
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6) Küvetten: Gläserne Kulturröhrchen der Abmessungen 10 x 75 mm.
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7) Fluorimeter zur Messung der Fluoreszenzpolarisation mit einer Genauigkeit
von + 0,001 Einheiten.
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B) Bestimmungsverfahren: 1) 100/ul 5-prozentige Trichloressigsäure
wird in einem Reagensglas mit 100 oul Standard oder unbekannter Probe versetzt.
Die die Probe enthaltenden Röhrchen werden verschlossen und gründlich geschüttelt
( vortexed).
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2) Die den Standard oder die Probe in Trichloressigsäure enthaltenden
Röhrchen werden zentrifugiert.
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3) Ein Reagensglas mit 1,8 ml BGG-Puffer und 25 kl Antiserum wird
bei 35 0C mit 150 pl des Trichloressigsäureüberstands versetzt.
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4) Die Antiserum und überstand enthaltenden Reagensgläser werden 6
Minuten bei 35 inkubiert. Anschliessend wird die Fluoreszenzpolarisation der Reagensgläser
gemessen.
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Bei dieser Messung handelt es sich um die Hintergrundfluoreszenz-Polarisation
des Standards oder der unbekannten Probe.
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5) 10 Minuten nach der Zugabe des Überstands zum Antiserum werden
25 vul Tracer in das Reagensglas gegeben.
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6) 6 Minuten nach der Zugabe des Tracers wird die Fluor es zenzpolarisation
der Standard- und Probenrohrchen gemessen.
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Die auf die vorstehende Weise ermittelte Hintergrundfluoreszenzpolarisation
wird subtrahiert, wodurch man die Fluoreszenzpolarisation des gebildeten Antikörper-Tracer-Komplexes
erhält.
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7) Die Ergebnisse einer Reihe von Serumstandards mit einem Gehalt
an- Digoxin in Konzentrationen zwischen 0 und 5 ng/ml sind nachstehend wiedergegeben.
Für jede Konzentration wird eine Vierfachbestimmung durchgeführt und gemittelt.
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Digoxinkonzentration (ng/ml) Polarisation O 0,142 0,5 0,134 1,0 0,123
2,0 0,106 3,0 0,092 5,0 0,070 Es ist ersichtlich, dass die Polarisation der Fluoreszenz
in regelmässiger Weise mit zunehmender Digoxinkonzentration abnimmt, was die Aufstellung
einer Eichkurve erlaubt. Unbekannte, in identischer Weise behandelte Proben können
mittels der Eichkurve quantitativ bestimmt werden, was die Eignung von Digoxin-Carboxyfluorescein
zur Messung von Digoxin belegt.
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In der nachstehenden Tabelle sind verschiedene Fluoreszenzpolarisationsbestimmungen
zusammengestellt, die gemäss den vorstehenden Ausführungen unter Verwendung der
gemäss den Beispielen hergestellten Tracer durchgeführt werden können. Für die einzelnen
Tracer ist jeweils die entsprechende Nummer des Herstellungsbeispiels und der bzw.
die spezifischen Liganden angegeben.
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Beispiel Nr Ligand(en) 1 Phenobarbital 2 Phenytoin 3 Phenytoin 4 Theophyllin
5 Theophyllin 6 Valproasäure 7 Nortriptylin; Amitriptylin 8 Imipramin; Desipramin
9 Thyroxin 10 Digoxin 11 Propranolol 12 Valproasäure 13 Valproasäure 14 Primidon
15 Chloramphenicol 16 Acetaminophen 17 Ethosuximid 18 N-Acetylprocainamid 19 N-Acetylprocainamid
20 Disopyramid 21 Trijodthyronin 22 Thyroxin 23 Imipramin;Desipramin-24 Imipramin;
Desipramin 25 Nortriptylin; Amitriptylin 26 Nortriptylin; Amitriptylin
Aus
den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, dass die Tracer der Erfindung wirksame
Reagentien für Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays sind. Zusätzlich zu den vorerwähnten
Eigenschaften sind die erfindungsgemässen Tracer thermisch sehr stabil, besitzen
ein hohes Mass an gebundener Polarisation, gewährleisten hohe Quantenausbeuten und
sind relativ leicht herzustellen und zu reinigen.
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Ende der Beschreibung