JPS62187454A - 置換ピリジン誘導体 - Google Patents

置換ピリジン誘導体

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JPS62187454A
JPS62187454A JP61061974A JP6197486A JPS62187454A JP S62187454 A JPS62187454 A JP S62187454A JP 61061974 A JP61061974 A JP 61061974A JP 6197486 A JP6197486 A JP 6197486A JP S62187454 A JPS62187454 A JP S62187454A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は化学および生物学の分野に屈し、そしてそこで
使用するための螢光アッセイ方法を提供する。さらに詳
しくは、本発明は一群のアリール置換ピリジン化合物と
、螢光アッセイ技術のための螢光キレート標識の成分と
して、または該成分の中間体としてのそれらの使用に関
する。
宜−塁 螢光アッセイ技術は、化学的、生化学的および医学的分
析に増加しつつある用途を見出しつつある。螢光測定方
法は生来的に極めて感受性である。
しかしながら螢光アッセイの感度は実際にはハックグラ
ウンド螢光の存在によって制限される。
それぞれ１９７９年４月１７日および１９７７年１１月
１５日に発行された米国特許第４，１５０．２９５号お
よび第４　、０５８　、７３２号、それにＩｎ＋ｍｕｎ
ｏｆ　１ｕｏｒｅｓ−ｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔ
ｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、にｎ
ａｌ’ｐ＋ｅｔ　ａｌ　ｌＪａ　（１９７Ｂ＋　Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏ−ｍ
ｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ　）　６８−８０頁に見られ
る章は、バンクグラウンド螢光は比較的短い寿命を有す
ること、および測定される螢光スペシスとして長い寿命
の螢光を有利に採用することができたとの一般的着想を
開示する。この報告は、間歇的励起源と螢光の時間に連
結した測定の使用により、所望の螢光を測定しながらバ
ックグラウンド螢光を実質上回避もしくは排斥できるこ
とを指摘する。
希土類キレートはこの先行技術により長い寿命の螢光を
有する物質として同定されている。そのような物質は、
多数の代表的開示が指摘するように、アミンポリ酸（Ｗ
ｉｅｄｅｒおよびＷｏｌｌｅｎｂｅｒｇのＵＳＰ　４，
３５２．７５１を見よ）、イミノジアセテート置換フェ
ノール類、クマリン類およびフェナントロリン類を含む
ヘテロ原子含有基（イーストマンコダックヨーロソバ特
許出願００６８８７５を見よ）、および芳香族ジケトン
類（***公開特許２．６２８．１５８を見よ）のような
一種またはそれ以上のりガントによってキレートされた
テルビウムまたはユーロピウムのような希土類金属イオ
ンを含んでいる。
先行技術をキレート化基において以下の性質が望ましい
ことを認めている。
１、　それは希土類と安定なキレート錯塩、すなわち安
定性定数（ｌｏｇＫ）１７以上を形成しなければならな
い。
２、　希土類との螢光キレートは長い寿命の螢光、すな
わちバンクグラウンド妨害が既に崩壊した時認知できる
ほど崩壊しない螢光を持たなければならない。
３、螢光励起は、生物学的サンプル中では約２７０ｎｓ
＋の波長において普通に発生する妨害を避けるため、で
きるだけ長い波長、好ましくは３００ｎａ＋またはそれ
以上で発生しなければならない。
４、螢光錯塩は強い放出を持たなければならないこと、
すなわちそれは高い量子収率を持たなければならない。
加えて、該物質は、該物質と共に使用されるサンプル（
通常水性サンプル）の性状と共存し得る溶解度、化学的
安定性および他の性質を持たなければならない。
先行技術においてこのような認識にもかかわらず、これ
まで記載された物質は一般に、これら性質の−またはそ
れ以上を少なくともある程度欠いていた。例えば、ヨー
ロッパ特許００６６Ｂ７５は、芳香族ジケトン類（***
公開特許２，６２８．１５８）のような試薬の螢光は水
中安定性問題のため水中で消失するが、フェノール性芳
香族ケトン類、クマリン類およびフェナントロリンＩＪ
′ｉ（これらはヨーロッパ特許００６８８７５が特定的
に開示する）は化学的安定性を欠くことと、そして低量
子収率を示したことを指摘している。これらの欠点の結
果、これまで何人も螢光アッセイに広く使用し得る試薬
を製造していない。
必要とされるのは、これら性質をより満足させる螢光キ
レートシステムである。
本発明は、希土類金属との長寿命螢光スペシス中へ組み
込むことができる置換ピリジン誘導体のファミリーとそ
の中間体とに関する。置換ピリジン誘導体の一般的クラ
スに対する参考は、米国特許４，００８，２３９．３，
９７０．６６２および３．９０７．８０８゜Ｃａｒｂｅ
ｔｅａｓおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、　Ｊ、　ＨｅＬｅｒ
ｏｃｙｃｌ、　Ｃｈｅｍ１１Ｎ５１．　８１９　（１９
７４）　　；　ＷｅｌｌｅｒおよびＬｕｅｌ　ｌｅｎ＋
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　　Ｖｏ
ｌ、　　２２＋　　ＰＪｎ　　４４＋　　ｐｐ　　４３
８１−８４　（１９８１）　　；　　Ｗｅｌｌｅｒ、　
ＬｕｅｌｌｅｎおよびＷｅｌｌｅｒ＋Ｊ、　Ｏｒｇ、　
Ｃｈｅｗ、、　４７．４８０３−０６　（１９８２）を
含む。前出のヨーロッパ特許出願００６８８７５も関係
がある。
木光凱皇役所 われわれは、置換子り−ル基でリング置換された２、６
−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（カルボキシアルキル）アミノアル
キルコピリジンが螢光キレート形成におけるリガンドと
して使用するために特に魅力的な部分であることを発見
した。
従って、−面において本発明は、置換アリール置換２，
６−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（カルボキシアルキル）アミノア
ルキル〕ピリジン部分を組み込んだために螢光的に検出
可能な化合物を提供する。
もっと特定の面において、本発明は下記式を有する置換
アリール置換２，６−ビス（Ｎ、Ｎ−ビス（カルボキシ
アルキル）アミノアルキル〕ピリジン部分を組み込んだ
ために螢光的に検出可能な化合物を提供する。
式中、ｎおよびｎ゛は独立に整数Ｉまたは２．Ａｒはア
リール、ｎ″は計上の提供可能な結合部位の数に等しい
整数９Ｍは水素もしくは金属イオン、そして（Ｒ）ｎ”
、Ｒ゛およびＲ”はめいめい独立に水素か、低級アルコ
キシ、低級アルキル、アミン、ジアルキルアミノ、アリ
ールおよびアリールオキシを含む電子供与基か、または
分子の残部へ結合手を提供することができる共有結合お
よびブリッジ基を含む連結基から選ばれ、ただしくＲ）
ｎ”の少なくとも１個は電子供与基であり、そしてＲ’
、Ｒ”および（Ｒ）ｎ”の少なくとも一つは分子の残部
への連結基である。
前記分子の残部は、生物学的活性物質、すなわちバイオ
特異性アッセイを実施することを許容するためバイオ特
異性（例えば免疫学的）ペアの半分を含むことができる
。
本発明はテトラ酸（すなわちＭ＝水素）の上記部分を組
み込んだ化合物を提供する。本発明はまた４個のＭが螢
光希土類キレートを形成するような希土類金属イオンを
含む１　ｌｕＩまたはそれ以上の金属イオンを含む金属
塩、特に金属錯塩である化合物を提供する。
本発明はさらに、中間体として、上記テトラ酸に対応す
るエステル類、およびジ酸として、そしてその金属塩、
モノおよびジエステルとして前駆体アリール置換２．６
−ジカルボキシピリジン誘導体を提供する。
さらに他の面において、本発明は上記置換ピリジン部分
に対抗して、アリール置換ピリジンテトラ酸化合物を提
供する。これら化合物は式：を有し、そして希土類とし
寿命螢光キレートを形成するそれらの塩、および前記テ
トラ酸へのテトラエステル前駆体を含んでいる。前記式
において、ｎおよびｎ゛は１または２から選ばれた整数
であり、’Ｒ，Ｒ’およびＲ”は水素か、低級アルコキ
シ、低級アルキル、アミノ、アルキルアミノ、アリール
、了り−ルオキシ等のような電子供与基から選ばれた同
一もしくは異なる基であり、Ａｒはアリール基。
特にフェニルもしくはナフチル基であり、ｎ″はＡｒ基
上の提供可能な共有結合部位の数に相当する整数である
。これらテトラ酸化合物は希土類金属、好ましくはユー
ロピウムおよびテルビウムとキレートを形成する。
本発明の物質は、バックグラウンド妨害を避けるように
２８０ｎｍまたはそれ以上である励起波長を持ち、３１
０ｒｖ＋ないし３２５ｎｍまたはそれ以上の励起波長が
可能である利益を提供する。これら波長へのシフトを達
成した以前の物質は、芳香環がピリジン環へ縮合した構
造を採用していた。これら縮合環物質と比較する時、本
発明部分は実質的に改善された量子効率を有する。加え
て、本発明の物質は化学的に安定であり、水溶性で、そ
して高度に安定な金属錯塩を形成する。
さらに他の面において、本発明は、高いｆｆｌ　７−　
’ＡＪ率を持続する螢光希土類キレートの励起波長を増
すための改良方法と、そしてキレート化リガンドとして
この芳香環置換ピリジンの使用を含んでいる螢光アッセ
イの改良された方法を提供する。
本発明による置換ピリジン部分は、分子を螢光的に検出
可能なアリール置換２．６−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（カルボ
キシアルキル）アミノアルキルコピリジン類とするよう
に、分子中へ組み込まれる。該アリール置換置はそれ自
体少なくとも１個の電子供与基で置換される。これら物
質は下記一般式Ｉで表すことができる。
この式において、ｎおよびｎ”は整数ｌまたは２、そし
て好ましくは同じ整数であり、そしてさらに好ましくは
１である。ピリジン環は置換置Ｒ１゜Ｒ”および−Ａｒ
　　（Ｒ）ｎ”を有する。ＲｏおよびＲ”置換置は水素
か、または電子供与基、例えば炭素数１ないし４のアル
コキシ、特にメトキシもしくはエトキシである低級アル
コキシ；メチル、エチル、ｎおよびイソプロピル等のよ
うな炭素数１ないし４の低級アルキル基；アミノ；アル
キルすなわちモノおよびジ、そして特にジアルキルアミ
ノ、例えばジメチルアミノのようなアルキルが炭素数１
ないし４であるジアルキルアミノ；フェニルもしくはベ
ンジル等のような炭素数６のアリールおよび約９までの
炭素数のアラルキル（ただしそのようなアリールはピリ
ジン環から垂れ下がっており縮合していないことを条件
とする）　；フェニルオキシもしくはベンジルオキシ構
造のような了り−ルオキシもしくは約９までの炭素数の
アラルキルオキシであり、または後記のように分子の残
部への結合手を提供し得る共有結合およびブリッジ基を
含む連結基とすることができる。
ピリジン環上のＡｒ−（Ｒ）ｎ″置置装は、ｎ”個のＲ
置換置を含むアリールそのものである。該アリールはフ
ェニルもしくはナフチル環のどちらかである。数ｎ”は
Ａｒ置置換上上提供可焼な共有結合部位の数に相当する
整数、すなわちフェニルの場合は５またはナフチルの場
合は７である。＾ｒ基上のＲ置換置はＲｏおよびＲ１置
換分と同じ基から選ぶことができる。
このように、Ａｒ　　（Ｒ）ｎ″置置装は構造上一般式
１１ａおよびｎｂによって表すことができる。
式中、−、ｔ、−は＾・単位がツーニルかまたはナフチ
ルかに応じてピリジン環への共有結合である。
°好ましくは、アリール置換ピリジン類は、一般式■と
そして式Ｕａまたはｂを含む組合せ構造によってさらに
詳細に表すことができる。これは一般式■を与える。
式中、Ｒ’、Ｒ”、　Ｒ，Ｍ、　ｎおよびｎ”は前に定
義したとおりである。われわれは前出の物質のどれもが
本発明に従って実施可能であると信するが２．われわれ
の最大の経験はピリジン窒素に対して４位、すなわちパ
ラ位に結合したＡｒ−（Ｒ）ｎ”を有する物質について
であり、それを基礎にしてこの関係が好ましい。また、
連結基がＲｏまたはＲ”ではなくてＲの一つであり、Ｐ
゛およびＰ”の一方または両方が水素であり、そして特
にＲの１個ないし３（１Ｍが低級アルコキシであり、Ｒ
の残りが水素である物質が好ましい。
このアリール置換ピリジン部分は他の基へ連結すること
ができる。この連結はｌ？’、Ｒ”またはＲの一つ、特
にＲの１個を構成する共有結合により、または他の連結
基によって達成することができる。
この連結は螢光ピリジン部分が生物学的に活性なバイオ
特異性基を標識することを許容する。
この連結が連結基によって達成されるときは、このＲ基
はアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、エステル等の
ようなバイオ特異性基のカップリングを容易にする活性
または結合し得る部位を表さなければならない。そのよ
うな結合し得るＲ基の例は、アミノ基（−Ｎｌｌ２）、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＯ３もしそれらの異性体等のよう
な１級および２級アミン末端アリールおよびアリールオ
キシ、−Ｃｔｌｚ−Ｃ）１２−０１１゜−Ｃｌｌ　−Ｃ
１ｌ　−ＣＨａ等のようなヒドロキシル含有アルのよう
なヒドロキシル含有アリールおよびアリールオキシであ
る。
バイオ特異性基への結合手を形成するための他の通光な
官能基は、アミド、アミジン、チオアミド、尿素、チオ
尿素、グアニジン、ジアゾ、チオエーテル、カルボキシ
およびリン酸エステル、チオエステルおよび既に知られ
ているような他の共有結合鎖を含んでいる。好ましい連
結基は単なるアミノ基である。該連結基は生物学的に活
性な基へ直接連結することができ、または基−ＣＯ（Ｃ
ＨＩり４−　。
−Ｃ５−、−Ｃｏ（ＣＨｚ）ａＮＩＩｃＯｃＨｚＯＮ　
＝、　−ＣＯＣＩＩｚＯＮ　＝。
−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＩＩＣＯ（ＣＨ２）８ＣＯ＋、　
−Ｃｏ（ＣＨｚ）ｚｓｓ（ＣＨｚ）ｚｃｏ−。
−ＣＳＮＩＩ（ＣＨｚ）３Ｎ（ＣＨｚＣＨｚ）ｚＮ（Ｃ
Ｈｚ）ｓＮＨｃｏ（ＣＨｚ）ｅｃｏ　−。
−Ｃ５ＮＨ（ＣＨ２）３　Ｎ（ＣＨｚＣＨ２）２　Ｎ（
ＣＨ２）　３ＮＩＩｃｏ（ＣＩＩＯＩＩ　）２　ＣＯ−
。
−Ｃ３ＮＩＩ（ＣＨ２）３　Ｎ（ＣＩＩ２ＣＨ２）３　
ＮＨＣＯＣ１１２ＯＮ−等のような二官能性スペーサー
試薬を介して連結することができる。そのような連結基
は代表であり、螢光ピリジンとバイオ特異性基との間の
相互作用を変化させそして影響させることができる。
エベ乙ｊ」す１１基 上で認めたように、多数の有益な用途において、生物学
的に活性な、すなわちバイオ特異性基が前記置換ピリジ
ンへ連結される。“バイオ特異性基”および“生物学的
に活性な基”なる用語は、他の分子スペシスと“特異的
に認識する”または“特異的に反応する”または“特異
的に相互反応する”すべての分子構造を含む広裳に使用
される。そのような基は、抗体およびそれらのそれぞれ
の抗原もしくはハプテンのような免疫学的に特異性基、
ホルモンおよびその受容体、ビオチンとアビジンのペア
のような結合ベアその他を含む。それらはまたそれらの
相補配列によって特異的にハイブリッド化される核酸配
列を含むことができる。
バイオ特異性基は標的分子を結合もしくはほかに複合す
るように選定されることができ、またはバイオ特異性反
応において標的と競合するように標的分子を模倣もしく
は含有するように選定されることができる。
前に記載したように、生物学的に活性な物質（”ｎ）は
式のＰ゛またはＰ゛に位置することができるが、しかし
好ましくは下記式の螢光標識したバイオ特異性試薬を与
えるように、Ｒの一つとして連結される。
式中、”Ｂ、　Ｍ、　ｎ、　ｎ”、　ｎ”は前記□のと
おりであり、Ｒ，Ｒ’　およびＲ”は各自独立に水素と
、そして電子供与基から選ばれる。
同様に、好ましい螢光標識したバイオ特異性試薬は以下
の式を持つことができる。
（以下余白） 式中、ｉは金属イオンまたは水素、ｎ＊は１ないし４の
整数、Ｍｋは炭素数１ないし４のアルキル、１’ｌ、は
生物学的に活性な物質である。
皿直立玉 バイオ特異性基が存在する時、その標的分子もしくは検
体はモノエピトープ性もしくはポリエピトープ性物質で
よい。それは薬物、代謝物、天然物、殺虫剤、空気およ
び水の汚染物質のような物質から限定なしに選ぶことが
できる。例示目的のため、ジゴキシン、ジギトキシン、
フェニトイン、テオフィリン、ゲンタマイシンおよびト
ブラマイシンを含む薬剤；モルフイン、ヘロイン、コカ
イン、麦角アルカロイド等のようなアルカロイド；エス
トローゲンおよびアンドローゲン例えばエストリオール
、および抗炎症ステロイド例えばコルチゾールを含むス
テロイじホルモン；フェノバルビタールを含むパルピッ
レートのようなラクタム；アンフェタミンのようなアミ
ノアルキルベンゼン；ビタミン、Ｆ２アルファおよびＥ
のようなプロスタグランジン、抗生物質その他、チロキ
シン、トリヨードチロキシンおよびオキシトシンのよう
な短鎖ペプチド配列またはアミノ酸を挙げることができ
る。代表的な汚染物質および殺虫剤は、ｐｃＢ、ダイオ
キシン、ハロゲン化ビフェニール、カーバメート、チオ
フォスファイト、リン酸エステルおよびそれらの代謝物
を含む。そのような物質は分子量が約５０ないし約１０
００の範囲であることができる。
標的分子はまた、クンバクもしくは他のポリ　（アミノ
酸）、ポリ核酸、またはポリサッカライドのような高分
子物質であることができる。そのようなタンパク物質は
、限定なしで、グロブリン、アルブミン、リポタンパク
、糖タンパク、ヒス；・−ン等を含むタンパク類、アル
ブミン、ＩｇＥのような免疫グロブリン、フィブリノー
ゲン、トランスフェリン、種々の補因子、ＣＥＡ　（が
ん胎児性抗原）およびＰＡＰのような腫瘍マーカーを含
む高感受性タンパク、ベーターｈＣＧ、ＦＳＨ。
ガストリン、ＬＨおよびプロラクチン、インシュリン、
チロトロピン、ゴナドトロピン等を含む種々の血液凝固
因子およびタンパクホルモンの任意のクラスから選ぶこ
とができる。バイオ特異性ポリサッカライドの例は、サ
ルモネラ属、ストレプトコツカス属およびクレブシェラ
屈の種々のスペシスに関連するような微生物から誘導さ
れたものである。他の標的は、限定なしに肝炎または風
疹による感染のような感染病症状に責任ある物質である
。
以」二のリストは概略アウトラインであることを意図す
る。先行技術にさらに詳しく挙げられたような他の均等
な物質（参照として取り入れたｕｓｐ４．１９３，９８
３第７〜１１欄参照）も本発明によって提供される蛍光
団と共に使用することができることを認識すべきである
。
盈連結生成■ Ｒ，Ｒ’　またはＲ”基の一つがバイオ特異性生物学的
活性基への連結基である、直前に記載した化合物に加え
、本発明はまた、式！および■と同じ一般的構造である
がミバイオ特異性物質への連結基を含まない、すなわち
Ｒ，Ｒ’およびＲ″のすべてが水素かまたは電子供与基
である他の物質を提供する。特にｈが水素である式Ｉお
よび■のそのような物質は金属のキレート剤として有用
であり、そして希土類金属ヘキレートした時溶液中の希
土類金属イオンの定量的もしくは定性的螢光測定のため
の指示薬として役立ち得る螢光スペシスを与える。
肴」」Ｌｔ厘 本発明のアリール置換ピリジン類は、テルビウム、ジス
プロシウム、ユーロピウム、サマリウムおよびネオジム
を含む希土類金属とそれらのイオンの形において長寿命
螢光錯塩を形成する。テルビウムおよびユーロピウム（
Ｔｂ″″゛およびＥ　ｕ　””　）が好ましい希土類金
属イオンである。
該金属イオンと、本発明のテトラ酸リガンドとの間に形
成される錯塩は、１：１等モル金属：リガンドキレート
錯塩であると一般に考えられる。
それらは一般式■とじて与えられた構造によって表され
る。
Ｍｌｉむ史 本発明の置換ピリジン類は三方法のいずれかによって製
造することができる。もし最終構造が反応性アミン官能
か、または使用する試薬と共存し得ない他の官能基を含
んでいなければ、第１の方法が好ましい。第２の方法は
そのような基を組み込むことを許容する。
第１の方法は、 Ａ、Ｊ当に置換されたベンズアルデヒドまたはナフトア
ルデヒドを少なくとも２モルの２−アシルフランと１．
５−ジ（２−フリル）　−１，５−ペンタンジオンが生
成するように反応させる。
Ｂ、液相中、４０℃ないし１７０℃、特に８０℃ないし
１５０℃のような上昇温度においてヒドロキシルアミン
と反応させることにより、Ａの生成物を対応するジ（フ
リル）ピリジンへ変換する。
Ｃ１有機液相中酸化剤と接触させることにより、Ｂの生
成物を対応するピリジン−２，６−ジカルボン酸へ酸化
する。この酸化の一例はアルカノール巾約５０℃ないし
約１００℃において３０ないし１２０分間過マンガン酸
カリウムの過剰の使用である。
Ｄ、前記ピリジン−２，６−ジカルボン酸をジアミドへ
変換する。これはオキザリルクロライドの過剰と、そし
て低温ないし環境温度において水酸化アンモニウムを使
用して実施することができる。
Ｅ、前記ジアミドを、約−１０°ないし＋３５℃の温度
において無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸等のような脱
水剤との反応によってジニトリルへ変換する。
Ｆ、該ジニトリルをジアミンへ還元する。これは微量の
酸の存在下貴金属触媒および分子状水素を使用して接触
的に実施することができる。
Ｇ、該アミン基へエステル基を連結する。これは１，８
−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレンまたは他の適当な
塩基の存在下ハロ酢酸アルキル、例えばブロモ酢酸アル
キルとの反応によって実施することができる。
Ｈ，４チル基を約５℃ないし約４５℃のような援用な温
度においてアルカリ金属炭酸塩もしくは水酸化物のよう
な無機塩基による鹸化によって酸へ変換する。
言及しないが、しかし実地においては実施しなければな
らないいくつかの分離および精製工程が存在するこが認
識されるであろう。
第２の製造方法においては、最初の三工程は、アリール
アルデヒド、すなわちベンズアルデヒドまたはナフトア
ルデヒドが、アミン置換基が最終的に望まれる場合はニ
トロ基を有し、または方法１の後の反応と共存し得ない
他の基を有する変更を除いて、第１の方法と実質上同様
に実施される。
これら三工程の生成物は、所望のそしてそのため出発物
質上に存在する種々のＲ，Ｒ’およびＲ″置置装を有す
るニトロフェニルもしくはニトロナフチルピリジン−２
，６−ジカルボン酸である。
第２の方法の工程りにおいては、２個のカルボキシル基
が選択的に還元される。すなわち、それらはニトロ基を
還元しない条件下で還元される。
ボランがこれを達成する還元剤の一種である。この還元
は過剰のボランと、緩和な温度と、そして乾燥条件を使
用することによって実施することができる。これにより
ジカルボン酸に対応するシカルビノールが得られる。
Ｅ、このシカルビノールは該カルビノール官能をアルキ
ルハライドへ変換する試薬と反応させられる。モル過剰
のチオニールブロマイドが５０℃ないし１２５℃のよう
な上昇温度においてこの変換を達成し、ピリジン窒素に
関し２位および６位においてアルキルブロマイドで置換
された所望のニトロアリ−ルビリジンである生成物を与
える。
Ｆ、この工程においては、前記アルキルブロマイド置換
ピリジンがイミノジ酢酸ジエステルと、２個の臭素をイ
ミノジ酢酸官能で置換するために反応させられる。これ
は１．８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレンのような
塩基と、約２５℃ないし約５５℃のような緩和な温度と
、そして不活性雰囲気を使用して実施することができる
。これはテトラエステルを与える。
０１次に４個のエステル基は方法１の工程度Ｈに示した
鹸化条件を使用して除去することができる。
Ｈｌこの方法の最終工程においては、了り−ル置換分上
のニトロ基がアミンへ還元される。この反応は貴金属触
媒と分子状水素とを使用して接触的に実施することがで
きる。代表的な触媒はアルミナまたは炭素上の白金また
はパラジウムを含む。
水素圧力は大気圧ないし数気圧、すなわち１〜１０気圧
の範囲とすることができ、そして環境ないし約７５℃の
温度が所望の選択的還元を達成するために採用される。
これは所望のアミン置換ピリジン物質を与える。もし望
むならば他の均等製造方法を使用することができる。例
えば、アミン官悌は、方法ｌの工程Ｇの生成物を発煙硝
酸でニトロ化し、そのように導入された二１・０基を方
法２におけるように後で還元する、方法ｌの修飾によっ
て導入することができる。
刈り」木 これら方法において、新規化合物と信じられる重要中間
体が製造される。これらは下記式を持つ酸、塩として、
またはモノもしくはジエステルとして存在し得る２、６
−ジカルボン酸置換ピリジンを含んでいる。
式中、Ａｒはアリールであり、ｎ”はＡｒ上の提供し得
る結合部位の数に等しい整数であり、Ｒ，Ｒ’およびＲ
”は独立に水素か、または低級アルコキシ、低級アルキ
ル、アミノ、ジアルキルアミノ、アリールおよびアリー
ルオキシを含む電子供与基か、または連結基から選ばれ
、Ｒ＊およびＲ＊＊は独立して金属イオン、水素および
低級アルキルの中から選ばれる。
盟益坐使■ 本発明の製品は希土類全屈をキレートするためのリガン
ドとして広い用途を有する。そのようにして生成したキ
レートは螢光を発し、そのため材料中の希土類イオン含
量の測定方法を提供する。
ここに記載した置換ピリジン類はそれらの希土類金属キ
レートとして、それらの螢光性質がそれらをバイオ特異
性分子のための標識として役立つことを許容する場合、
各種のアッセイ操作において特に有用である。典型的に
は、本発明のキレートまたはリガンドは、抗体、抗原、
ハプテンまたは他の標的分子のようなバイオ特異性分子
の適当な反応性基と反応するイソシアネート、アミン、
イミデート、ジアゾまたは他の適当な基のような反応性
官能基を持つように製造される。バイオ特異性分子の結
合ペアのこのように標識されたメンバーは、競合的結合
アッセイおよびイムノメトリックサンドイッチ型アッセ
イを含む、当業者に既知の種々のアッセイ方法のどれに
も使用することができる。
１施± 本発明は以下の実施例によりさらに説明される。
それらは本発明を例証することを意図し、その範囲を限
定するものと解してはならない。
実施例１ の製造 Ａ、　５−ジ（２−フリル）−３−フェニル−１，５−
ペンタンジオンの製造 ベンズアルデヒド　　６２．６ｇ　　（６０献）　　（
０，５９モル）２−アセチルフラン、８５％　　　　１
６５ｇ　（１５０１ｎｉ）（１，２７モル） 水酸化カリウム、８５％　　　　　３５ｇ　（０，５３
モル）ＫＯＨを加熱かきまぜながらメタノール（約６０
０ｄ）に溶解する。この溶液を少し冷し、アルデヒドと
フランとの混合物を一度に添加する。混合物を６０℃へ
加熱し、４５〜６０分間かきまぜる。最初緑色が発色し
、速やかに褐色に暗色化する。反応混合物はオレンジ−
褐色結晶の塊に固化する。エタノール（約１５０ｍｆｆ
１）を加え、固体を砕く。混合物を一夜冷却し、生成物
結晶を口取し、水冷エタノール（約４００ｍｔ’）で洗
い、次にヘプタン（約２００．ｄ）で洗う。結晶を８０
℃で減圧乾燥する。ペンタンジオンの収３１１０３．５
■または５７．３％ Ｂ、４−フェニル−２，６−ジ（２−フリル）ピリジン
の製造 ｎ−ブタノール（シダ７１３Ｆ−５０７０）　　１６０
０　ａｅ工程Ａで製造したジオン、ヒドロキシルアミン
塩酸塩およびブタノールを、機械的スターシーとコンデ
ンサーを備えた５１の３頚フラスコへ加え、５時間還流
かきまぜ、冷却し、約６０時間かきまぜる。生成した黒
色溶液を１５％Ｎａ０１１１１中へ注ぎ、トルエン（Ｉ
ｌ）で抽出する。有機層を税イオン水（ＩＸ２００ｍＮ
）で洗い、ＮａｚＳＯ４で乾燥し、ロータリーエバポレ
ーターで濃縮する。粘ちょうな残渣をＣＨｚＣｅｚ　　
（約２５０１ｎｉ）で熔かす。
ヘキサン（約２５０ｄ）を生成溶液へ加え、シリカゲル
で口遇し、１　：　Ｉ　ＣＨｚα２／ヘキサン（約５０
０ｄ）で溶出する０口液を濃縮し、エタノール（約２０
０ｍ＆’）を加え、混合物を水中で冷却する。生成した
結晶を口取し、水冷エタノールで洗い、室温で減圧乾燥
すると、１番結晶約６５ｇが得られる。口演を濃縮し、
精製し、冷却すると２番結晶１３．６　ｇが得られる。
Ｃ，４−フェニル−２，６−ピリジンジカルボン酸工程
Ｂのジフリルビリジン化合物を過マンガン酸で酸化する
。
工程Ｂの生成物　　　　　　　　２３ミリモルＫＭｎＯ
４４５，４ｇ ｔ−ブタノール　　　　　　　１５００１ｎｉ水　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３００威ｔ−ブタノー
ル（約１１）をメカニカルスタ−ラー、マントルおよび
コンデンサーを備えた二頭フラスコへ入れる。工程Ｂの
生成物を加え、フラスコ中へ残りのｔ−ブタノールを加
える。混合物を加熱し、溶液になるまでかきまぜる。次
に水を加え、温度が約７５℃へ達した時ＫＭｎＯ４を少
しづつ３０分を要して加える。混合物を９０分間還流す
る。アルコールをアスピレータ−真空で留去し、熱い残
渣をセライトで口過し、熱１　：　１　　ｔ−Ｂｕ０１
１／Ｈ２０で洗う。残存ＫＭｎＯａをＮａＨ３Ｏ３で消
費し、溶液をロータリーエバポレーター（約６５℃）で
約１５０献へ濃縮する。２Ｎ　１ｌｃｊ！　（２５威）
で酸性化した後、生成した所望の４−フェニル−２，６
−ピリジンジカルボン酸の結晶を口取し、洗浄し、乾燥
する。
０．４−フェニル−２，６−ピリジンジカルボン酸アミ
ド オキザリルクロライド　　　　　　４．８献塩化メチレ
ン　　　　　　　　　８０　献ジメチルホルムアミド　
　　　　　５　滴ピリジンジカルボン酸をＣＨ２α２　
、　ＤＭＦおよびかくはん棒つきの１０（ｌｔｅ二頚フ
ラスコへ加える。
フラスコをＣａＳＯ４乾燥チューブで封鎖し、水中で冷
却する。次いでオキザリルクロライドを注射器から約５
分にわたって加え、室温で約２時間かきまぜる。得られ
る溶液をロータリーエバポレーターで濃縮して固体の酸
クロライドを得、ベンゼン（１５０ｍｉ）を加え、ロー
タリーエバポレーターで除去し、次に残渣を真空乾燥す
る。酸クロライドを２８％ＮＨ４０１１（５０＋ｎｉ）
へ５〜１０分にわたってかきまぜながら添加し、１時間
かきまぜ、口遇し、水洗し、乾燥して所望のアミドを得
る。
Ｅ、４−フェニル−２，６−ピリジンジカルボニトリル
ｐ−ジオキサン　　　　　　　１７０ｄピリジン　　　
　　　　　　　　１１．３献トリフルオロ酢酸無水物　
　　　１１．０ｄ最初の三成分をかくはん棒を備えた２
５０献フラスコ中へ入れる。フラスコをアルゴンガス下
封鎖し、凍結したジオキサンが存在するまで水中で冷却
する（１０℃）。酸無水物を約１０分を要して加え（温
度約１５℃）、混合物を室温で２時間かきまぜる。生成
した暗色溶液を水中へ注ぎ、各回メチレンクロライド１
５０１Ｒ１で３回抽出する。
抽出液をＮａＨ３Ｏ３上で乾燥し、ロータリーエバポレ
ーターで暗色固体へ濃縮し、塩化メチレンへ溶解し、シ
リカを通して追加の塩化メチレンで溶出する。溶出液を
固体へ濃縮し、乾燥し、所望のジカルボニトリルを得る
。
Ｆ、４−フェニル−２，６−ジ（アミノメチル）−ピリ
ジン ２％ｌ１ｃＩ！０４土夕）−ル　　　　３７０ｉ１０％
パラジウム炭　　　　　　　３．７ｇニトリルを７０％
Ｈα０４１０．５ｙｉを添加したエタノール中に懸濁し
、混合物をパールポ１−ルヘ移す。ボトルを窒素で掃気
し、触媒を加える。ボトルを次に水素で４０ｐｓｉへ与
圧する。３０分後面トルを開き、液体を取り出して暗色
液体へ濃縮する。該液ヘジメチルエーテルを加え、口過
することによって黄色固体を回収する。過酸塩素酸塩固
体を真空ポンプで乾燥する。このアミン過塩素酸塩を水
約３０−へ熔解し、４０％Ｎ　ａ　ＯＩＩへ加える。
生成した遊離アミンをＣＨ２Ｃｌ！２で抽出し、Ｎａｚ
Ｓ＋上で乾燥し、真空ポンプで暗色オイルへ濃縮する。
Ｇ、４−フェニル−２，６−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（メトキ
シカルボニルメチル）−アミノメチルツーピリジン 工程Ｆのアミン　　　　　　　１２．０ミリモルブロム
酢酸メチル　　　　　　　　７．３５ｇアセトニトリル
　　　　　　　１３０献塩基をフラスコへ入れる。アミ
ンをアセトニトリルへ溶解し、フラスコへ入れる。かく
はん棒を加え、混合物を均一になるまで４５℃でかきま
ぜる。次にアルゴンガス下アセトニトリル４０叔中のブ
ロム酢酸メチルを滴下する。約４５℃で約１６時間後、
生成物を水１５０減と０．１Ｍクエン酸中へ注ぐ。この
混合物を塩化メチレンで抽出する。
抽出液を洗浄し、乾燥し、濃縮し、再熔解し、シリカで
口過する。生成物は溶媒として酢酸エチル／塩化メチレ
ンを使用してシリカゲルクロマトグラフィーで精製する
。
Ｈ，テトラエステルの鹸化 工程Ｇのテトラエステルをメタノール／水１：１中へ入
れ、Ｋ２ＣＯ３のモル過剰を加え、室温で２゜５時間か
きまぜることによって鹸化する。次に溶液をｐＨ７へ酸
性化し、乾燥すると所望のテトラ酸を与える。ＮＭＲに
よってその同一性が確認される。
実施例２ 実施例１の製造法を、工程へにおいてベンズアルデヒド
を２．４−ジメトキシベンズアルデヒドの同モル量に代
え、生成する中間体が４−　（２，４−ジメトキシフェ
ニル）　−２，６−ピリジンジカルボン酸であり、そし
て最終生成物が実施例１の工程Ｈの生成物の２，４−ジ
メトキシ類縁体となるように変更してくり返す。各子程
において得た収率は、所望の４−　（２，４−ジメトキ
シフェニル）−２，６−ビス〔Ｎ、Ｎ−ジ（カルボキシ
メチル）アミノメチル〕〜ピリジンの、 Ａ工程　　　９５％ Ｂ工程　　　７２％ ゛Ｅ工程　　　８４％ である。
実施例３ないし１７ 実施例１の製造法を、ベンズアルデヒドを以下の置換ベ
ンズアルデヒドの同モル量に代えることにより変更し、
１５回くり返す。
爽施週監　　　　ベンズアル−゛ヒＥ］ｎＪＬ□３４−
メトキシベンズアルデヒド ４３．４−ジメトキシ　　　　〃 ５　　３．４．５−　）ジメトキシ　　〃６２．５−ジ
メトキシ　　　　〃 ？　　　２，４．５−　トリメトキシ　　〃８４−エト
キシ　　　　　　〃 ９２．４−ジプロポキシ　　　〃 １０　２−エトキシ−４−メトキシ〃 １１　　４−ベンジルオキシ　　　〃 １２　３−メトキシ−４−ベンジルオキシ　〃１３　　
３．４−メチレンジオキシ　〃１４　２−メトキシ−４
−ベンジルオキシ　〃１５　　２．４−ジメトキシ　　
　　〃１６　　２．４．６−）ジメトキシ　　〃これら
異なるベンズアルデヒドをもって対応する２、６−ビリ
シンジガルボン酸中間体およびテトラ酸最終製品が得ら
れる。
実施例１８ この実施例はアミン置換置をフェニル環へ導入すること
を示す。実施例１の工程Ａ、ＢおよびＣを、ベンズアル
デヒドを３−ニトロベンズアルデヒドの同モル量に代え
る変更をもってくり返す。
ごれせは４−（３−ニトロフェニル）　−２，６−ピリ
ジンジカルボン酸を与える。
Ｄ、　４−　（３−ニトロフェニル）　−２，６−ピリ
シンシメタノール 上記ジ酸　　　　　　　２８．８ｇ（０，１モル）ボラ
ン／ＴＨＦ錯体　　２８８ｄ、１モルジ酸をＴＩＩＦｌ
ｏｏｏｄおよびかくはん棒を入れた乾燥した２Ｎフラス
コへ入れる。乾燥チューブを取り付け、フラスコをアル
ゴンで掃気する。
次にボラン／ＴＨＦ錯体をはげしくかきまぜながら室温
において徐々に２０〜３０分を要して添加する。かくは
んを４時間続け、次に過剰のポランを希１１ｃｅ　（６
Ｎ　ｌｌＣｅ　２０　ｄおよびＨ２Ｏ８５ｍ）で加水分
解する。次に１０％ＮａｚＣＯ３６０ｍｅを加え、溶液
をロータリーエバポレーターで濃縮する。残渣を重炭酸
塩水溶液へ加え、酢酸ブチルで３回抽出し、抽出液を乾
燥し、溶媒を留去して所望のジオールをオレンジ色固体
として得る。
Ｅ、　４−　（３−ニトロフェニル）−２，６−ビス（
ブロムメチル）ピリジン 工程りのジオール　　　９．１ｇ（３５ミリモル）チオ
ニルブロマイド　　７．０ｄ（９０ミリモル）工程りの
ジオールをフラスコに入れ、約２０１ｎｉの塩化メチレ
ンを加え、次にチオニルブロマイドを加える。フラスコ
を入口アダブタ−で封鎖し、８０℃の油浴へ入れる。塩
化メチレンおよびｆｌＢｒを追い出し、粘ちょうな残渣
が残る。これを水性ＮａｚＣＯａ中へ入れ、塩化メチレ
ンで３回抽出する。
抽出液を乾燥し、濃縮し、塩化メチレンで希釈し、シリ
カで口遇する。０液を集め、蒸発し所望の臭化物を得る
。
Ｆ、２．６−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（カルボキシメチル）ア
ミノメチル）　−４−（３−ニトロフェニル）−ピリジ
ンテトラメチルエステル 工程Ｅのジプロマイド　３．４４ｇ　　（８，９ミリモ
ル）イミドジ酢酸ジメチルエーテル　　２．８８ｇ１．
８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン　３．７６ｇア
セトニトリル　　　　　　　　　　１４０減塩基をフラ
スコに入れる。イミドジエステルをアセトニトリルと混
合し、そして添加する。フラスコをアルゴンで掃気し、
４５℃へ加熱する。ＴＨＦ中のジブロマイドを磁力でか
きまぜながら６０〜９０分にわたって加える。１８時間
後混合物を冷却し、室温で約２日間かきまぜる。混合物
をベンゼンへ加え、口過し、０．１　Ｍクエン酸および
水で洗い、ＮａｚＳＯ４上で乾燥する。溶液を次に浦へ
濃縮し、塩化メチレンへ取り、酢酸エチル／塩化メチレ
ン、次いで酢酸エチルを溶出液としてシリカゲルを２回
通す。分画を集め、所望の物質を単離し、こはく色の油
へ濃縮する。
Ｇ、ニトロ基のアミンへの還元 ５％パラジウム炭　　　　２．７ｇ エチルアルコール　　　３０〇− ニトロ化合物をエタノール３００献を入れた１１フラス
コへ入れる。フラスコを窒素で掃気し、触媒を加える。
フラスコを次に水素で１気圧に与圧する。１時間後反応
混合物を口遇し、０液をロータリー蒸発によって黄色油
へ濃縮する。この油は工程Ｆの製品に対応するアミノテ
トラメチルエステルであることが決定される。
Ｈ，ｌ１ｉａ化 工程Ｇのアミノテトラメチルエステルは実施例１の方法
を使用して鹸化される。これにより所望の３−アミノテ
トラ酸が得られる。
実施例１９ Ａ、　２．６−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（カルボキシメチル）
アミノメチル）　−４−（４−ニトロフェニル）−ピリ
ジンテトラメチルエステルの製造 発煙硝酸（０，０３ｍ＆’、　０．４３２８ミリモル）
を室温において塩化メチレン（４献）中のトリフルオロ
メタンスルホン酸溶液へ加える。５分間かきまぜた後、
少量の塩化メチレン中の実施例１の工程Ｇからのような
２，６−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノ
メチルゴー４−フェニル−ピリジン溶液を０℃において
ゆっくり加える。溶液が室温へ暖まることを許容し、１
時間かきまぜを許容する。次に反応混合物を氷の上へ注
ぎ、混合物を炭酸ナトリウムで中和する。塩化メチレン
で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発すると粗製
品９０曙を与える。
Ｂ、２．６−ビス（Ｎ、　Ｎ−ジ（カルボキシメチル）
アミノメチル）　−４−（４−アミノフェニル）−ピリ
ジンテトラメチルエステルの製造 上記反応からの粗生成物（９０■、０．１７ミリモル）
をエタノール（１３ｍ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ５０
ｍｇを加え、混合物を水素１気圧のもとて１時間室温で
かきまぜる。触媒を０去し、溶媒を蒸発すると４−アミ
ノ化合物６０献を与える。
このアミノ化合物（５１■）は製法２によって製造され
た対応する３−ニトロ化合物７０＊（０，１２９ミリモ
ル）から同様に製造される。この製造法は実施例１８に
示したものと実質上同じである。
もし望むならば、それらのアリール環上にアミン置装分
を有するこれらおよび同様なアリールピリジンは、アミ
ン含有標的分子その他へ結合することができるイソチオ
シアネートへアミンを変換するチオホスゲンとアリール
アミンとの反応について既知の条件でチオホスゲンと反
応させることができる。
Ｃ，２，６−ビス（Ｎ、　Ｎ−ジ（カルボキシメチル）
アミツメチル）　−４−（４−および３−アミノフェニ
ル）−ピリジンテトラメチルエステルのテオフィリン−
８−酪酸への結合 クロルギ酸イソブチル（０，０２ｍｊ’、　　０．１１
７ミリモル）をトリエチルアミン（０，２０ｍｉ、　　
０．１１７ミリモル）を含有するジメチルホルムアミド
（１，５成）中のテオフィリン−８−酪酸（３１，３■
。
０．１１７ミリモル）の溶液へアルゴン雰囲気下０℃に
おいて加える。０℃で０．５時間後、クロロホルム中の
４−アミン（６０■、０．１１７ミリモル）の溶液をゆ
っくり加える。溶液を０〜５℃で１７時間かきまぜ、次
に溶媒を蒸発により除去し、粗製品１０３■を残す。こ
の物質をシリカゲル上でクロロホルム：メタノール（９
：　１）でクロマトグラフィーし、所望の生成物６０■
（６７％）を与える。対応する３−アミノ化合物（５１
■、０゜０１ミリモル）を同様に処理し、３位にテオフ
ィリンが結合した物質５０■を得る。
Ｄ、　２．６−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（カルボキシメチル）
アミノメチル）　−４−（４−（テオフィリン−８−ブ
チルアミド）−フェニル〕−ピリジンテトラ酸の製造 前工程からのテトラメチルエステル（３４■。
０、０４５ミリモル）をＩＮ水酸化ナトリウム０．２減
を含有するメタノール（２威）中に溶解し、３時間加熱
還流する。次に溶液を水浴中で冷却し、ＩＮ　１ｌｃｉ
！で酸性化し、蒸発して粗製品を得る。メタノール：水
（６：　４）中の逆相カラムクロマトグラフィーによる
粗製品はテトラ酸１４■を与える。
Ｗ４伯の３−置換化合物４０ｍｇ（０，０５ミリモル）
の鹸化は逆相クロマトグラフィー後そのテトラ酸１４．
６■を与える。
Ｅ、キレートの製造 り部のテトラ酸を別々に１０−５Ｍの濃度に０．０１Ｍ
ホウ酸ナトリウム溶液に溶解する。次に水性塩化テルビ
ウムの同モル量をそれぞれへ加え、混合物を数分間放置
する。螢光測定を実施し、テトラ酸とテルビウムとのｌ
：１モルキレート錯塩が生成したこと、およびそのよう
な錯塩は螢光性であり、かつ安定であることを示す。
Ｆ、標識したテオフィリンの抗体への結合による螢光の
増強によるテオフィリンの均質螢光イムノアッセイ テオフィリンのアッセイは、上の螢光標識したテオフィ
リントレーサーのテルビウムキレート（すなわち、２．
６−ビス（Ｎ、　Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミキメ
チル）　−４−（４−（テオフィリン−８，−ブチルア
ミド）−フェニル〕−ピリジンテリビウムキレート）が
抗テオフィリン抗体への結合についてテオフィリンスタ
ンダードと競合することを許容することによって実施さ
れる。抗体への結合に際し標識したテオフィリンはその
螢光の増強を受け、そしてこの増強は結合した標識テオ
フィリンの量に正比例し、そしてサンプル中に存在する
テオフィリンの量に反比例する。アッセイはポリスチレ
ン試験管（１２Ｘ１５ｍ）中で実施され、該試験管へ０
．０１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐ　Ｈ８，５の１〃贋
が加えられる。その後ｌμＨトレーサー１０μ／（８，
７ｎｇ）およびテオフィリンスタンダード（０，５，４
，１６，２，５４および５４０　ｎｇ）の１０ｐＡが添
加される。　０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび１％正常ヒ
ト血清を含有する０、０１Ｍホウ酸塩中の約０．３μＨ
抗テオフィリン抗体２５μｌ（アッセイ管中の最終濃度
約７．５ｎＭ）の添加は、種々のスタンダードに対し、
観察された螢光の増加それぞれ４００％〜５０％へ導く
。これは５．４．１６．２．５４および５４０ｎｇスタ
ンダードについてそれぞれ８０．６４゜５３および１４
％のＢ／Ｂｏ値に相当する。
実施例２０ Ａ、Ｏ−ベンジルバニリンの製造 バニリン　　　１００．４ｇ　（０，６６モル）アルド
リッチベンジルクロライド　８４．０ｇ　　（７７献、
　０．６６モル）炭酸カリウム　　　　１１５　　ｇ アセトン　　　　　　２ｒ １８−クラウン−６３ｇ 上記成分をマントル、コンデンサーおよびメカニカルス
ターラーを備えた３１三頚丸底フラスコへ入れる。混合
物を還流下７０時間かきまぜる。
最初の２４時間の間に明るい黄色になり、還流３日目に
明るい黄褐色に変わる。次にアセトン約１ｅを留去し、
残渣を砕いた氷（約２１）と水（約５００ｄ）中にかき
まぜながら注ぐ。溶液を接種し、固体沈澱を析出させ、
約２０分間静置し、次に口過し、エタノール（０’ｃ、
４００１ｎｉ）で洗い、真空乾燥すると、所望の生成物
１２０ｇを与える。
これは約７５％の収率である。
Ｂ、　２．６−ジ（２−フリル）　−４−（３−メトキ
シ−４−ヘンシルオキシフェニル）−ピリジン ０−ベンジルバニリン（Ａ部から）　３１．５ｇ　　（
０，１３モル）アセチルフラン（アルドリッチ）　　４
３ｇ　（０，３９モル）メタノール　　　　　　　　　
　３００献上記成分を５００ｍｆｆ１フラスコ中で混合
し、均質になるまで（約２０分）加熱し、かきまぜる。
次に２０％ＫＯＨ／メタノール約５減を加え、４５分間
加熱かくはんを続ける。次に２０％ＫＩＩＯ／メターノ
ルの他の１５蔵を加え、フラスコの口を軽くカバーし、
中味を１６時間加熱し、かきまぜる。
生成物を６Ｎ　１ｉｃｅ　（約１０ｍｆｆ１）テ酸性化
し、約５５℃でロータリーエバポレーター中で濃縮する
。
次にヒドロキシルアミン塩酸塩２２ｇとｎ−ブチルアル
コール２５０献を加え、混合物をマントルを使って３時
間還流する。ブタノールを約６５℃でロータリーエバポ
レーター中で除去し、残渣を水（２００１ｎｉ）中へ注
ぎ、６Ｎ　ＮａＯＨ（６０ｍ）で塩基性化し、トルエン
（２ｘ２００ｍ）で抽出する。抽出液を水（約１００ｄ
）で洗い、ＮａｚＳＯ４上で乾燥し、ロータリーエバポ
レーターで約６５℃において黒い油へ濃縮する。これを
シリカゲル（約２００　ｇ）で口過し、１　：　Ｉ　Ｃ
ＨｚＣ１！ｚ　／ヘキサンで溶出する。溶出液を油へ濃
縮する。この油を再度シリカロ遇にかけ、再度油へ濃縮
し、再度シリカゲル（約２００　ｇ）で口遇し、今度は
トルエン／　ＣＨ２α２９：１（約１１）で溶出する。
この溶出液はこはく色油へ濃縮され、エタノール（約５
０ｍ１）に熔解され、再度油へ濃縮される。製品収率は
約２５ｇである。
Ｃ，４−（３−メトキシ−４−ベンジルオキシフェニル
）−２，６−ピリジンジカルボン酸 ジフリルピリジン（Ｂ部から）　１９ｇ　　（０，４５
モル）ｔ−ブチルアルコール　　　　　３１ 脱イオン水　　　　　　　　　０．６１過マンガン酸カ
リウム　　　　９３ｇ 実施例１の０部の操作を以下の変更を加えて実施する。
ＫＭｎＯ４添加後、混合物を１部時間加熱、かきまぜる
。次に【−ブタノールを留去する。約２００減へ濃縮後
、生成物を２Ｎ　ＨＣｉ（約５０献）で酸性化する。カ
ナリヤ黄色沈澱が生成し、これを水数献で薄め、口過し
、冷水（約５０ｍｆｆ１）で洗い、真空乾燥し、製品１
５．２　ｇを与える。これは約９０％の収率である。
Ｄ、　４−　（３−メトキシ−４−ベンジルオキシフェ
ニル−２，６−ピリジンカルボン酸クロライドジ酸（０
部から）　　　　　　６．０７ｇ　　（０，０１６モル
）塩化メチレン　　　　　　６０淑 オキザリルクロライド　　　３．５　ｍｉジメチルホル
ムアミド ジ酸を乾燥チューブおよび隔壁ストッパーを取り付けた
１００ｄ二頚丸底フラスコ中へ秤量する。
かくはん棒をＣＨｚＣｉ２（約６０献）および口ＭＦと
ともに加える。オキザリルクロライド（３．５１ｎｉ）
を注射器からゆっくり加える間（添加時間約５分）混合
物を水中でかきまぜる。次に反応混合物を室温で２時間
かきまぜる。酸は約１時間でＨｃＩｚを発生して溶液中
へ移行する。暗色溶液を２５０滅フラスコへ移し、そし
て溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。ベンゼ
ン（約１００〃ｆ）を黄色残渣へ加え、ロータリーエバ
ポレーターで除去すると、所望のクロライドである暗緑
色固体６．６５ｇが得られる。
Ｅ．　４−　（３〜メトキシ−４−ベンジルオキシフェ
ニル）−２．６−ビリシンメタツール ジ酸クロライド（Ｄ部から）　６．６５ｇ　　（０．１
６モル）ジグリム　　　　　　　　３００献 水素化ホウ素ナトリウム　　１．５ｇ テトラヒドロフラン　　　２０ボ ＮａＢＩＩａをアルゴン導入口、温度計および添加ロー
トを備えた乾燥５　０　０ｄ三頚フラスコ中へ秤取する
。かくはん棒およびジグリム（約３００１ｎｉ）を加え
、フラスコをアルゴンで掃気し、０℃へ冷却する。ジ酸
クロライドをジグリム（約４０ｍｉ）およびＴＨＦ　（
約２０ｄ）中に熔解し、添加ロートへ移し、そしてかき
まぜおよび冷却下（温度Ｏ”Ｃ）１５分を要してフラス
コへ滴下する。混合物を室温で２時間かきまぜる。溶液
の色はこはく色から１時間の間にさんご色へ変化し、次
に以後濁った褐色へ変化する。生成物を水（約５００ｄ
）と約１００献の０．１Ｍクエン間中へ注ぎ、ロータリ
ーエバポレーターで濃縮する（６０℃）。残渣（約５０
０ｄ）を水（約１）中へ注ぎ、そしてエチルエーテル（
４ｘｌＯＯｍ）で抽出する。抽出液をＮａ２５Ｏ＋上で
乾燥し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、ＤＭＳＯ
に可溶な褐色固体として所望のジオール４．０ｇを得る
。
Ｆ、　４−　（３−メトキシ−４−ベンジルオキシフェ
ニル）−２，６−ジ（ブロムメチル）−ピリジントリフ
ェニルフォスフイン　　１５．２ｇ臭素　　　　　　　
　　　　　　３．〇−乾燥した２５０ｍｆｆ１三頚丸底
フラスコ中にフォスフインを秤取する。ＣＨ３ＣＮ　（
約５０ｄ）とかくはん棒とを加え、フラスコを隔壁とア
ルゴン導入口で封鎖する。溶液を氷／メタノール中０℃
へ冷却し、Ｂｒｚを約２０分を要して滴下する。混合物
を室温で１５分間かきまぜる。ジオールをＣ）１３ＣＮ
　（約７５淑）中に懸濁し、フォスフイン臭素複合体中
へ移し、２時間室温でかきまぜ、そして水（約６００ａ
ｅ）中へ注ぎ、ＮａｔｌＣＯｚを飽和させる。この水性
懸濁液をＣＨｚＣｅｚ　　（２ｘ　２００献）で抽出す
る。抽出液をＮａｚＳＯａ上で乾燥し、シリカゲルで口
過し、ＣＨ２α２で溶出する。溶出液をロータリーエバ
ポレーターで２．２ｇの白色固体へ濃縮する。
これが所望のジブロマイドであり、微量のトリフェニル
フォスフインオキサイドを含有する。
Ｇ、　２．６−ビス（Ｎ、　Ｎ−ジ（カルボキシメチル
）アミノメチル）−４−（３−メトキシ−４−ベンジル
オキシフェニル）−ピリジンテトラエステルジブロマイ
ド（Ｆ部より）　２．１５ｇ　　（４，５ミリモル）乾
燥した１００−二頭フラスコ中ヘイミノエステルを秤取
し、塩基およびＣＨ３ＣＮ　（約５０献）を加える。ジ
ブロマイドはＴＨＦ　（約３５ｄ）に溶かし、フラスコ
へかきまぜまがらアルゴン下４５℃で一夜添加する。反
応混合物を水（約１５０ｍｇ）およびＯ，１Ｍクエン酸
（約１５０ｄ）および酢酸エチル（約１５０ｄ）中へ注
ぐ。酢酸エチル層を分離し、０．１！’Ｉクエン酸（約
１００１１Ｉｉ）、水（約１００献）および食塩水（約
１００ｍ）で洗い、ＮａｚＳＯ４上で乾燥し、粘ちょう
な紫色部へ濃縮する。
コノ油をＣＨｚＣｅｚ　ニ熔かし、シリカ（３５ｇ）で
口過する。紫色バントをＣＨ２α２　（約２００ｍ）中
１０％酢酸エチルで溶出する。その後所望のテトラエス
テルを５０９４酢酸エチル／　ＣＨ２α２（２（）０献
）および８０％酢酸エチル／　ＣＨ２Ｃｌ？、ｚ　　（
約２００ｄ）で溶出する。テトラエステルを含有する溶
液分画を約２．５ｇの油へ濃縮する。
１［、テトラエステルの鹸化 工程Ｇのテトラエステルは実施例１の操作を使用して鹸
化され、所望のテトラ酸を与える。
実施例２１ 実施例１９の一般的操作を追従して、４−（４（または
３）−アミノフェニル）−２，６−ビス（Ｎ。
Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノメチル〕−ピリジン
テトラエステルは、ジゴキシゲニンオンー３−０−カル
ボキシメチルオキシム、フェニトイン−３−（８−オク
タン酸）、およびコルチゾール−３−０−カルボキシメ
チルオキシムへ結合され、結晶物質を与える。これらテ
トラエステルの鹸化はテトラ酸を与え、それは希土類金
属と標的検体の螢光標識した免疫学的に活性な類縁体を
形成した。

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）置換アリール置換２，６−ビス〔Ｎ，Ｎ−ジ（カ
    ルボキシアルキル）アミノアルキル〕ピリジン部分を含
    むことを特徴とする螢光的に検出可能な分子。
  2. （２）前記置換アリール基は１個またはそれ以上の電子
    供与基で置換されたアリール基である第１項記載の螢光
    的に検出可能な分子。
  3. （３）生物学的に活性な物質をさらに含む第２項記載の
    螢光的に検出可能な分子。
  4. （４）前記電子供与基は低級アルコキシ、低級アルキル
    、アミノ、ジアルキルアミノ、アリールおよびアリール
    オキシから選ばれる第２項記載の螢光的に検出可能な分
    子。
  5. （５）前記置換アリール置換２，６−ビス〔Ｎ，Ｎ−ジ
    （カルボキシアルキル）アミノアルキル〕ピリジン部分
    は、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎおよびｎ’は独立に１または２の整数であり
    、Ａｒはアリールであり、ｎ”はＡｒ上の提供可能な結
    合部位の数に等しい整数であり、Ｍは水素か金属イオン
    であり、そして（Ｒ）ｎ”，Ｒ’およびＲ”はめいめい
    独立に水素か；低級アルコキシ、低級アルキル、アミノ
    、ジアルキルアミノ、アリールおよびアリールオキシを
    含む電子供与基か；または分子の残部への結合手を提供
    することができる共有結合もしくはブリッジ基を含む連
    結基から選ばれ、ただし（Ｒ）ｎ”の少なくとも１個は
    電子供与基であり、そしてＲ’，Ｒ”および（Ｒ）ｎ”
    の少なくとも１個は連結基である。）を有する第１項記
    載の螢光的に検出可能な分子。
  6. （６）　ｎおよびｎ’がめいめい１である第５項記載の
    螢光的に検出可能な分子。
  7. （７）　Ａｒがフェニルであり、そして（Ｒ）ｎ”の少
    なくとも一つが低級アルコキシである第５項記載の螢光
    的に検出可能な分子。
  8. （８）　Ｍは４個のカルボキシル基と錯塩結合した希土
    類金属イオンを含む１個またはそれ以上の金属イオンよ
    りなる第５項記載の螢光的に検出可能な分子。
  9. （９）　前記ピリジン部分が連結される前記分子の残部
    は生物学的に活性な物質である第５項記載の螢光的に検
    出可能な分子。
  10. （１０）　式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍは水素または金属イオンであり、ｎおよびｎ
    ’は独立に１または２の整数であり、（Ｒ）＿５，Ｒ’
    およびＲ”はめいめい独立に共有結合か、水素か、また
    は低級アルコキシ、低級アルキル、アミノ、ジアルキル
    アミノ、アリールまたはアリールオキシを含む電子供与
    基から選ばれ、ただし（Ｒ）＿５の少なくとも１個は電
    子供与基であり、そしてＲ’，Ｒ”および（Ｒ）＿５の
    少なくとも１個は分子の残部への結合手を提供するもの
    とする。）を有する置換アリール置換２，６−ビス〔Ｎ
    ，Ｎ−ジ（カルボキシアルキル）アミノアルキル〕ピリ
    ジン部分を含むことを特徴とする螢光的に検出可能な分
    子。
  11. （１１）　（Ｒ）＿５の一つまたはそれ以上が電子供与
    基である第１０項記載の螢光的に検出可能な分子。
  12. （１２）　Ｒ’およびＲ”がめいめい水素である第１１
    項記載の螢光的に検出可能な分子。
  13. （１３）　ｎおよびｎ’がめいめい１である第１１項記
    載の螢光的に検出可能な分子。
  14. （１４）　Ｍがめいめい水素である第１１項記載の螢光
    的に検出可能な分子。
  15. （１５）　Ｍは４個のカルボキシル基と錯塩結合した希
    土類金属イオンを含む１個またはそれ以上の金属イオン
    よりなる第１１項記載の螢光的に検出可能な分子。
  16. （１６）　前記分子の残部は生物学的に活性な物質であ
    る第１１項記載の螢光的に検出可能な分子。
  17. （１７）　構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍは金属イオンまたは水素であり、ｎ＾＊は１
    ないし４の整数であり、Ａｌｋは炭素数１ないし４のア
    ルキルであり、Ｍ＿Ｂ生物学的に活性な物質である。）
    を有する螢光的に検出可能な特異性結合試薬。
  18. （１８）　めいめいのＭが水素である第１７項記載の試
    薬。
  19. （１９）　めいめいのＭが金属イオンである第１７項記
    載の試薬。
  20. （２０）　Ｍは４個のカルボキシル基と錯塩結合した希
    土類金属イオンを含む１個またはそれ以上の金属イオン
    よりなる第１７項記載の試薬。
  21. （２１）　式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎおよびｎ’は独立に１または２の整数であり
    、Ｒ，Ｒ’およびＲ”は独立に水素か、低級アルコキシ
    、低級アルキル、アミノ、ジアルキルアミノ、アリール
    またはアリールオキシを含む電子供与基から選ばれ、Ａ
    ｒはアリールであり、ｎ”はＡｒ上の提供可能な結合部
    位の数に等しい整数である。）を有する置換アリール置
    換２，６−ビス〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシアルキル）ア
    ミノアルキル〕ピリジン化合物。
  22. （２２）　ｎおよびｎ’が１である第２１項記載の化合
    物。
  23. （２３）　Ｒ’，Ｒ”および（Ｒ）ｎ”の少なくとも１
    個がアミンである第２２項記載の化合物。
  24. （２４）　Ｒ’，Ｒ”および（Ｒ）ｎ”の１個がアミン
    である第２３項記載の化合物。
  25. （２５）　前記アミンはイソチオシアネートへ変換され
    る第２４項記載の化合物。
  26. （２６）　ＲおよびＲ”は水素であり、Ａｒはフェニル
    であり、そのため該化合物は、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する第２２項記載の化合物。
  27. （２７）　式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａｒはアリールであり、ｎ”はＡｒ上の提供可
    能な結合部位の数に等しい整数であり、Ｒ，Ｒ”および
    Ｒ”は独立に水素か、または低級アルコキシ、低級アル
    キル、アミノ、ジアルキルアミノ、アリールまたはアリ
    ールオキシを含む電子供与基から選ばれ、Ｒ＾＊および
    Ｒ＾＊＾＊は独立に水素または低級アルキルから選ばれ
    る。）を有する置換アリール置換２，６−ジカルボキシ
    ルピリジン化合物。
  28. （２８）　Ｒ＾＊およびＲ＾＊＾＊が水素である第２７
    項記載の化合物。
  29. （２９）　Ｒ＾＊およびＲ＾＊＾＊の一方が水素である
    第２７項記載の化合物。
  30. （３０）　Ｒ＾＊およびＲ＾＊＾＊の両方が低級アルキ
    ルである第２７項記載の化合物。
  31. （３１）　第１項の分子を測光的に励起し、そして第１
    項の分子からの螢光放出を検出することよりなる第１項
    の分子の存在を検出する方法。
  32. （３２）　前記励起は放射線のパルスによって実施され
    、該パルスは前記分子の螢光崩壊寿命に比較して短いパ
    ルス持続時間を持ち、そして前記分子の螢光を環境物質
    の螢光が実質上崩壊した後に検出する第３１項記載の方
    法。
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