JPH07116148B2 - 置換ピリジン誘導体 - Google Patents

置換ピリジン誘導体

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JPH07116148B2
JPH07116148B2 JP61061974A JP6197486A JPH07116148B2 JP H07116148 B2 JPH07116148 B2 JP H07116148B2 JP 61061974 A JP61061974 A JP 61061974A JP 6197486 A JP6197486 A JP 6197486A JP H07116148 B2 JPH07116148 B2 JP H07116148B2
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hydrogen
acid
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の背景 本発明の分野 本発明は化学および生物学の分野に属し、そしてそこで
使用するための蛍光アッセイ方法を提供する。さらに詳
しくは、本発明は一群のアリール置換ピリジン化合物
と、蛍光アッセイ技術のための蛍光キレート標識の成分
として、または該成分の中間体としてのそれらの使用に
関する。
背景 蛍光アッセイ技術は、化学的、生化学的および医学的分
析に増加しつつある用途を見出しつつある。蛍光測定方
法は生来的に極めて感受性である。しかしながら蛍光ア
ッセイの感度は実際にはバックグラウンド蛍光の存在に
よって制限される。
それぞれ1979年４月17日および1977年11月15日に発行さ
れた米国特許第4,150,295号および第4,058,732号、それ
にImmunofluorescence and Related Staining Techniqu
es,Knapp,et al編（1978,Elsevier/North Holland Biom
edical Press）68-80頁に見られる章は、バックグラウ
ンド蛍光は比較的短い寿命を有すること、および測定さ
れる蛍光スペシスとして長い寿命の蛍光を有利に採用す
ることができたとの一般的着想を開示する。この報告
は、間歇的励起源と蛍光の時間に連結した測定の使用に
より、所望の蛍光を測定しながらバックグラウンド蛍光
を実質上回避もしくは排斤できることを指摘する。
希土類キレートはこの先行技術により長い寿命の蛍光を
有する物質として同定されている。そのような物質は、
多数の代表的開示が指摘するように、アミンポリ酸（Wi
ederおよびWollenbergのUSP 4,352,751を見よ）、イミ
ノジアセテート置換フェノール類、クマリン類およびフ
ェナントロリン類を含むヘテロ原子含有基（イーストマ
ンコダックヨーロッパ特許出願0068875を見よ）、およ
び芳香族ジケトン類（***公開特許2,628,158を見よ）
のような一種またはそれ以上のリガンドによってキレー
トされたテルビウムまたはユーロピウムのような希土類
金属イオンを含んでいる。
先行技術はキレート化基において以下の性質が望ましい
ことを認めている。
1.それは希土類と安定なキレート錯塩、すなわち安定性
定数（iog K）17以上を形成しなければならない。
2.希土類との蛍光キレートは長い寿命の蛍光、すなわち
バックグラウンド妨害が既に崩壊した時認知できるほど
崩壊しない蛍光を持たなければならない。
3.蛍光励起は、生物学的サンプル中では約270nmの波長
において普通に発生する妨害を避けるため、できるだけ
長い波長，好ましくは300nmまたはそれ以上で発生しな
ければならない。
4.蛍光錯塩は強い放出を持たなければならないこと、す
なわちそれは高い量子収率を持たなければならない。
加えて、該物質は、該物質と共に使用されるサンプル
（通常水性サンプル）の性状と共存し得る溶解度、化学
的安定性および他の性質を持たなければならない。
先行技術においてこのような認識にもかかわらず、これ
まで記載された物質は一般にこれら性質の一またはそれ
以上を少なくともある程度欠いていた。例えば、ヨーロ
ッパ特許0066875は、芳香族ジケトン類（***公開特許
2,628,158）のような試薬の蛍光は水中安定性問題のた
め水中で消失するが、フェノール性芳香族ケトン類、ク
マリン類およびフェナントロリン類（これらはヨーロッ
パ特許0068875が特定的に開示する）は化学的安定性を
欠くことと、そして低量子収率を示したことを指摘して
いる。これらの欠点の結果、これまで何人も蛍光アッセ
イに広く使用し得る試薬を製造していない。
必要とされるのは、これら性質をより満足させる蛍光キ
レートシステムである。
本発明は、希土類金属との長寿命蛍光スペシス中へ組み
込むことができる置換ピリジン誘導体のファミリーとそ
の中間体とに関する。置換ピリジン誘導体の一般的クラ
スに対する参考は、米国特許4,008,239, 3,970,662およ
び3,907,808,CarbeteasおよびWilliams,J.Heterocycl.C
hem.,11（５）,819（1974）;WellerおよびLuellen,Tetr
ahedron Letters,Vol.22,No.44,pp 4381-84（1981）;We
ller,LuellenおよびWeller,j.Org.Chem.,47,4803-06（1
982）を含む。前出のヨーロッパ特許出願0068875も関係
がある。
本発明の説明 われわれは、置換アリール基でリング置換された2,6−
ビス〔N,N−ジ（カルボキシアルキル）アミノアルキ
ル〕ピリジンが蛍光キレート形成におけるリガンドとし
て使用するために特に魅力的な部分であることを発見し
た。
従って、一面において本発明は、置換アリール置換2,6
−ビス〔N,N−ジ（カルボキシアルキル）アミノアルキ
ル〕ピリジン部分を組み込んだために蛍光的に検出可能
な化合物を提供する。
もっと特定の面において、本発明は下記式を有する置換
アリール置換2,6−ビス〔N,N−ビスカルボキシアルキ
ル）アミノアルキル〕ピリジン部分を組み込んだために
蛍光的に検出可能な化合物を提供する。
式中、ｎおよびｎ′は独立に整数１または2,Arはアリー
ル,n″はAr上の提供可能な結合部位の数に等しい整数,M
は水素もしくは金属イオン、そして（Ｒ）ｎ″,R′およ
びＲ″はめいめい独立に水素か、低級アルコキシ、低級
アルキル、アミノ、ジアルキルアミノ、アリールおよび
アリールオキシを含む電子供与基か、または分子の残部
へ結合手を提供することができる非有結合およびブリッ
ジ基を含む連結基から選ばれ、ただし（Ｒ）ｎ″の少な
くとも１個は電子供与基であり、そしてＲ′,R″および
（Ｒ）ｎ″の少なくとも一つは分子の残部への連結基で
ある。
前記分子の残部は、生物学的活性物質、すなわちバイオ
特異性アッセイを実施することを許容するためバイオ特
異性（例えば免疫学的）ペアの半分を含むことができ
る。
本発明はテトラ酸（すなわちＭ＝水素）の上記部分を組
み込んだ化合物を提供する。本発明はまた４個のＭが蛍
光希土類キレートを形成するような希土類金属イオンを
含む１個またはそれ以上の金属イオンを含む金属塩、特
に金属錯塩である化合物を提供する。
本発明はさらに、中間体として、上記テトラ酸に対応す
るエステル類、およびジ酸として、そしてその金属塩、
モノおよびジエステルとして前駆体アリール置換2,6−
ジカルボキシピリジン誘導体を提供する。
さらに他の面において、本発明は上記置換ピリジン部分
に対抗して、アリール置換ピリジンテトラ酸化合物を提
供する。これら化合物は式： を有し、そして希土類と長寿命蛍光キレートを形成する
それらの塩、および前記テトラ酸へのテトラエステル前
駆体を含んでいる。前記式において、ｎおよびｎ′は１
または２から選ばれた整数であり、R,R′およびＲ″は
水素か、低級アルコキシ、低級アルキル、アミノ、アル
キルアミノ、アリール、アリールオキシ等のような電子
供与基から選ばれた同一もしくは異なる基であり、Arは
アリール基，特にフェニルもしくはナフチル基であり、
ｎ″はAr基上の提供可能な共有結合部位の数に相当する
整数である。これらテトラ酸化合物は希土類金属、好ま
しくはユーロピウムおよびテルビウムとキレートを形成
する。
本発明の物質は、バックグラウンド妨害を避けるように
280nmまたはそれ以上である励起波長を持ち、310nmない
し325nmまたはそれ以上の励起波長が可能である利益を
提供する。これら波長へのシフトを達成した以前の物質
は、芳香環がピリジン環へ縮合した構造を採用してい
た。これら縮合環物質と比較する時、本発明部分は実質
的に改善された量子効率を有する。加えて、本発明の物
質は化学的に安定であり、水溶性で、そして高度に安定
な金属錯塩を形成する。
さらに他の面において、本発明は、高い量子効率を持続
する蛍光希土類キレートの励起波長を増すための改良方
法と、そしてキレート化リガンドとしてこの芳香環置換
ピリジンの使用を含んでいる蛍光アッセイの改良された
方法を提供する。
本発明の詳細な説明 置換ピリジン部分 本発明による置換ピリジン部分は、分子を蛍光的に検出
可能なアリール置換2,6−ビス〔N,N−ジ（カルボキシア
ルキル）アミノアルキル〕ピリジン類とするように、分
子中へ組み込まれる。該アリール置換分はそれ自体少な
くとも１個の電子供与基で置換される。これら物質は下
記一般式Ｉで表すことができる。
この式において、ｎおよびｎ′は整数１または2,そして
好ましくは同じ整数であり、そしてさらに好ましくは１
である。ピリジン環は置換分Ｒ′,R″および−Ar−
（Ｒ）ｎ″を有する。Ｒ′およびＲ″置換分は水素か、
または電子供与基、例えば炭素数１ないし４のアルコキ
シ，特にメトキシもしくはエトキシである低級アルコキ
シ；メチル、エチル、ｎおよびイソプロピル等のような
炭素数１ないし４の低級アルキル基；アミノ；アルキル
すなわちモノおよびジ、そして特にジアルキルアミノ、
例えばジメチルアミノのようなアルキルが炭素数１ない
し４であるジアルキルアミノ；フェニルもしくはベンジ
ル等のような炭素数６のアリールおよび約９までの炭素
数のアラルキル（ただしそのようなアリールはピリジン
環から垂れ下がっており縮合していないことを条件とす
る）；フェニルオキシもしくはベンジルオキシ構造のよ
うなアリールオキシもしくは約９までの炭素数のアラル
キルオキシであり、または後記のように分子の残部への
結合手を提供し得る共有結合およびブリッジ基を含む連
結基とすることができる。
ピリジン環上のAr−（Ｒ）ｎ″置換分は、ｎ″個のＲ置
換分を含むアリールそのものである。該アリールはフェ
ニルもしくはナフチル環のどちらかである。数ｎ″はAr
置換分上に提供可能な共有結合部位の数に相当する整
数、すなわちフェニルの場合は５またはナフチルの場合
は７である。Ar基上のＲ置換分はＲ′およびＲ″置換分
と同じ基から選ぶことができる。
このように、Ar−（Ｒ）ｎ″置換分は構造上一般式IIa
およびIIbによって表すことができる。
式中、 はAr単位がフェニルかまたはナフチルかに応じてピリジ
ン環への共有結合である。
好ましくは、アリール置換ピリジン類は、一般式Ｉとそ
して式IIaまたはｂを含む組合せ構造によってさらに詳
細に表すことができる。これは一般式IIIを与える。
式中、Ｒ′,R″,R,M,nおよびｎ′は前に定義したとおり
である。われわれは前出の物質のどれもが本発明に従っ
て実施可能であると信ずるが、われわれの最大の経験は
ピリジン窒素に対して４位、すなわちパラ位に結合した
Ar−（Ｒ）ｎ″を有する物質についてであり、それを基
礎にしてこの関係が好ましい。また、連結基がＲ′また
はＲ″ではなくてＲの一つであり、Ｒ′およびＲ″の一
方または両方が水素であり、そして特にＲの１個ないし
３個が低級アルコキシであり、Ｒの残りが水素である物
質が好ましい。
このアリール置換ピリジン部分が他の基へ連結すること
ができる。この連結はＲ′,R″またはＲの一つ、特にＲ
の１個を構成する共有結合により、または他の連結基に
よって達成することができる。この連結は蛍光ピリジン
部分が生物学的に活性なバイオ特異性基を標識すること
を許容する。
この連結が連結基によって達成されるときは、このＲ基
はアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、エステル等の
ようなバイオ特異性基のカップリングを容易にする活性
または結合し得る部位を表さなければならない。そのよ
うな結合し得るＲ基の例は、アミノ基（−NH2）、−CH2
−CH2−NH2もしくは のような、１級および２級アミン末端アルキル、 それらの異性体等のような１級および２級アミン末端ア
リールおよびアリールオキシ、−CH2−CH2−OH, 等のようなヒドロキシル含有アルキル，および のようなヒドロキシル含有アリールおよびアリールオキ
シである。
バイオ特異性基への結合手を形成するための他の適当な
官能基は、アミド、アミジン、チオアミド、尿素、チオ
尿素、グアニジン、ジアゾ、チオエーテル、カルボキシ
およびリン酸エステル、チオエステルおよび既に知られ
ているような他の共有結合鎖を含んでいる。好ましい連
結基は異なるアミノ基である。該連結基は生物学的に活
性な基へ直接連結することができ、または基−CO(CH2)4
−，−CS−，−CO(CH2)8NHCOCH2ON＝，−COCH2ON＝，−
CO(CH2)5NHCO(CH2)6CO−，−CO(CH2)2SS(CH2)2CO−，−
CSNH(CH2)3N(CH2CH2)2N(CH2)3NHCO(CH2)6CO−，−CSNH
(CH2)3N(CH2CH2)2N(CH2)3NHCO(CHOH)2CO−，−CSNH(C
H2)3N(CH2CH2)3NHCOCH2ON＝等のような二官能性スペー
サー試薬を介して連結することができる。そのような連
結基は代表であり、蛍光ピリジンとバイオ特異性基との
間の相互作用を変化させそして影響させることができ
る。
バイオ特異性基 上で認めたように、多数の有益な用途において、生物学
的に活性な、すなわちバイオ特異性基が前記置換ピリジ
ンへ連結される。“バイオ特異性基”および“生物学的
に活性な基”なる用語は、他の分子スペシスと“特異的
に認識する”または“特異的に反応する”または“特異
的に相互反応する”すべての分子構造を含む広義に使用
される。そのような基は、抗体およびそれらのそれぞれ
の抗原もしくはハプテンのような免疫学的に特異性基、
ホルモンおよびその受容体、ビオチンとアビジンのペア
のような結合ペアその他を含む。それらはまたそれらの
相補配列によって特異的にハイブリッド化される核酸配
列を含むことができる。
バイオ特異性基は標的分子を結合もしくはほかに複合す
るように選定されることができ、またはバイオ特異性反
応において標的と競合するように標的分子を模倣もしく
は含有するように選定されることができる。
前に記載したように、生物学的に活性な物質（MB）は式
のＲ′またはＲ″に位置することができるが、しかし好
ましくは下記式の蛍光標識したバイオ特異性試薬を与え
るように、Ｒの一つとして連結される。
式中、MB,M,n,n′,n″は前記のとおりであり、R,R′お
よびＲ″は各自独立に水素と、そして電子供与基から選
ばれる。
同様に、好ましい蛍光標識したバイオ特異性試薬は以下
の式を持つことができる。
式中、Ｍは金属イオンまたは水素、n*は１ないし４の整
数、AlKは炭素数１ないし４のアルキル、MBは生物学的
に活性な物質である。
標的分子 バイオ特異性基が存在する時、その標的分子もしくは検
体はモノエピトープ性もしくはポリエピトープ性物質で
よい。それは薬物、代謝物、天然物、殺虫剤、空気およ
び水の汚染物質のような物質から限定なしに選ぶことが
できる。例示目的のため、ジゴキシン、ジギトキシン、
フェニトイン、テオフィリン、ゲイタマイシンおよびト
ブラマイシンを含む薬剤；モルフィン、ヘロイン、コカ
イン、麦角アルカロイド等のようなアルカロイド；エス
トローゲンおよびアンドローゲン例えばエストリオー
ル、および抗炎症ステロイド例えばコルチゾールを含む
ステロイドホルモン；フェノバルビタールを含むバルビ
ツレートのようなラクタム；アンフェタミンのようなア
ミノアルキルベンゼン；ビタミン、F2アルファおよびＥ
のようなプロスタグランジン、抗生物質その他、チロキ
シン，トリヨードチロキシンおよびオキシトシンのよう
な短鎖ペプチド配列またはアミノ酸を挙げることができ
る。代表的な汚染物質および殺虫剤は、PCB、ダイオキ
シン、ハロゲン化ビフェニール、カーバメート、チオフ
ォスファイト、リン酸エステルおよびそれらの代謝物を
含む。そのような物質は分子量が約50ないし約1000の範
囲であることができる。
標的分子はまた、タンパクもしくは他のポリ（アミノ
酸）、ポリ核酸、またはポリサッカライドのような高分
子物質であることができる。そのようなタンパク物質
は、限定なしで、グロブリン、アルブミン、リポタンパ
ク、糖タンパク、ヒストーン等を含むタンパク類、アル
ブミン、IgEのような免疫グロブリン、フィブリノーゲ
ン、トランスフェリン、種々の補因子、CEA（がん胎児
性抗原）およびPAPのような腫瘍マーカーを含む高感受
性タンパク、ベーターhCG、FSH、ガストリン、LHおよび
プロラクチン、インシュリン、チロトロピン、ゴナドト
ロピン等を含む種々の血液凝固因子およびタンパクホル
モンの任意のクラスから選ぶことができる。バイオ特異
性ポリサッカライドの例は、サルモネラ属、ストレプト
コッカス属およびクレブシェラ属の種々のスペシスに関
連するような微生物から誘導されたものである。他の標
的は、限定なしに肝炎または風疹による感染のような感
染病症状に責任ある物質である。
以上のリストは概略アウトラインであることを意図す
る。先行技術にさらに詳しく挙げられたような他の均等
な物質（参照として取り入れたUSP4,193,983第７〜11欄
参照）も本発明によって提供される蛍光団と共に使用す
ることができることを認識すべきである。
非連結生成物 R,R′またはＲ″基の一つがバイオ特異性生物学的活性
基への連結基である、直前に記載した化合物に加え、本
発明はまた、式ＩおよびIIIと同じ一般的構造である
が、バイオ特異性物質への連結基を含まない、すなわち
R,R′およびＲ″のすべてが水素かまたは電子供与基で
ある他の物質を提供する。特にＭが水素である式Ｉおよ
びIIIのそのような物質は金属のキレート剤として有用
であり、そして希土類金属へキレートした時溶液中の希
土類金属イオンの定量的もしくは定性的蛍光測定のため
の指示薬として役立ち得る蛍光スペシスを与える。
希土類金属 本発明のアリール置換ピリジン類は、テルビウム、ジス
プロシウム、ユーロピウム、サマリウムおよびネオジム
を含む希土類金属とそれらのイオンの形において長寿命
蛍光錯塩を形成する。テルビウムおよびユーロピウム
（TbおよびEu）が好ましい希土類金属イオンであ
る。
該金属イオンと、本発明のテトラ酸リガンドとの間に形
成される錯塩は、1:1等モル金属：ガンドキレート錯塩
であると一般に考えられる。それらは一般式IVとして与
えられた構造によって表される。
製造方法 本発明の置換ピリジン類は二方法のいずれかによって製
造することができる。もし最終構造が反応性アミン官能
か、または使用する試薬と共存し得ない他の官能基を含
んでいなければ、第１の方法が好ましい。第２の方法は
そのような基を組み込むことを許容する。
第１の方法は、 A.適当に置換されたベンズアルデヒドまたはナフトアル
デヒドを少なくとも２モルの２−アシルフランと1,5−
ジ（２−フリル）−1,5−ペンタンジオンが生成するよ
うに反応させる。
B.液相中、40℃ないし170℃，特に80℃ないし150℃のよ
うな上昇温度においてヒドロキシルアミンと反応させる
ことにより、Ａの生成物を対応するジ（フリル）ピリジ
ンへ変換する。
C.有機液相中酸化剤と接触させることにより、Ｂの生成
物を対応するピリジン−2,6−ジカルボン酸へ酸化す
る。この酸化の一例はアルカノール中約50℃ないし約10
0℃において30ないし120分間過マンガン酸カリウムの過
剰の使用である。
D.前記ピリジン−2,6−ジカルボン酸をジアミドへ変換
する。これはオキザリルクロライドの過剰と、そして低
温ないし環境温度において水酸化アンモニウムを使用し
て実施することができる。
E.前記ジアミドを、約−10°ないし＋35℃の温度におい
て無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸等のような脱水剤と
の反応によってジニトリルへ変換する。
F.該ジニトリルをジアミンへ還元する。これは微量の酸
の存在下貴金属触媒および分子状水素を使用して接触的
に実施することができる。
G.該アミン基へエステル基を連結する。これは1,8−ビ
ス（ジメチルアミノ）ナフタレンまたは他の適当な塩基
の存在下ハロ酢酸アルキル、例えばブロモ酢酸アルキル
との反応によって実施することができる。
H.エステル基を約５℃ないし約45℃のような緩和な温度
においてアルカリ金属炭酸塩もしくは水酸化物のような
無機塩基による鹸化によって酸へ変換する。
言及しないが、しかし実施においては実施しなければな
らないいくつかの分離および精製工程が存在するこが認
識されるであろう。
第２の製造方法においては、最初の三工程は、アリール
アルデヒド、すなわちベンズアルデヒドまたはナフトア
ルデヒドが、アミン置換基が最終的に望まれる場合はニ
トロ基を有し、または方法１の後の反応と共存し得ない
他の基を有する変更を除いて、第１の方法と実質上同様
に実施される。これら三工程の生成物は、所望のそして
そのため出発物質上に存在する種々のR,R′およびＲ″
置換分を有するニトロフェニルもしくはニトロナフチル
ピリジン−2,6−ジカルボン酸である。
第２の方法の工程Ｄにおいては、２個のカルボキシル基
が選択的に還元される。すなわち、それらはニトロ基を
還元しない条件下で還元される。ボランがこれを達成す
る還元剤の一種である。この還元は過剰のボランと、緩
和な温度と、そして乾燥条件を使用することによって実
施することができる。これによりジカルボン酸に対応す
るジカルビノールが得られる。
E.このジカルビノールは該カルビノール官能をアルキル
ハライドへ変換する試薬と反応させられる。モル過剰の
チオニールブロマイドが50℃ないし125℃のような上昇
温度においてこの変換を達成し、ピリジン窒素に関し２
位および６位においてアルキルブロマイドで置換された
所望のニトロアリールピリジンである生成物を与える。
F.この工程においては、前記アルキルブロマイド置換ピ
リジンがイミノジ酢酸ジエステルと、２個の臭素をイミ
ノジ酢酸官能で置換するために反応させられる。これは
1,8−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレンのような塩基
と、約25℃ないし約55℃のような緩和な温度と、そして
不活性雰囲気を使用して実施することができる。これは
テトラエステルを与える。
G.次に４個のエステル基は方法１の工程度Ｈに示した鹸
化条件を使用して除去することができる。
H.この方法の最終工程においては、アリール置換分上の
ニトロ基がアミンへ還元される。この反応は貴金属触媒
と分子状水素とを使用して触媒的に実施することができ
る。代表的な触媒はアルミナまたは炭素上の白金または
パラジウムを含む。水素圧力は大気圧ないし数気圧、す
なわち１〜10気圧の範囲とすることができ、そして環境
ないし約75℃の温度が所望の選択的還元を達成するため
に採用される。これは所望のアミン置換ピリジン物質を
与える。もし望むならば他の均等製造方法を使用するこ
とができる。例えば、アミン官能は、方法１の工程Ｇの
生成物を発煙硝酸でニトロ化し、そのように導入された
ニトロ基を方法２におけるように後で還元する、方法１
の修飾によって導入することができる。
中間体 これら方法において、新規化合物と信じられる重要中間
体が製造される。これらは下記式を持つ酸、塩として、
またはモノもしくはジエステルとして存在し得る2,6−
ジカルボン酸置換ピリジンを含んでいる。
式中、Arはアリールであり、ｎ″はAr上の提供し得る結
合部位の数に等しい整数であり、R,R′およびＲ″は独
立に水素か、または低級アルコキシ、低級アルキル、ア
ミノ、ジアルキルアミノ、アリールおよびアリールオキ
シを含む電子供与基か、または連結基から選ばれ、Ｒ＊
およびＲ＊＊は独立して金属イオン、水素および低級ア
ルキルの中から選ばれる。
製品の使用 本発明の製品は希土類金属をキレートするためのリガン
ドとして広い用途を有する。そのようにして生成したキ
レートは蛍光を発し、そのため材料中の希土類イオン含
量の測定方法を提供する。ここに記載した置換ピリジン
類はそれらの希土類金属キレートとして、それらの蛍光
性質がそれらをバイオ特異性分子のための標識として役
立つことを許容する場合、各種のアッセイ操作において
特に有用である。典型的には、本発明のキレートまたは
リガンドは、抗体、抗原、ハプテンまたは他の標的分子
のようなバイオ特異性分子の適当な反応性基と反応する
イソシアネート、アミン、イミデート、ジアゾまたは他
の適当な基のような反応性官能基を持つように製造され
る。バイオ特異性分子の結合ペアのこのような標識され
たメンバーは、競合的結合アッセイおよびイムノメトリ
ックサンドイッチ型アッセイを含む、当業者に既知の種
々のアッセイ方法のどれにも使用することができる。
実施例 本発明は以下の実施例によりさらに説明される。それら
は本発明を例証することを意図し、その範囲を限定する
ものと解してはならない。
実施例１ の製造 A.5−ジ（２−フリル）−３−フェニル−1,5−ペンタン
ジオンの製造 ベンズアルデヒド 62.6g（60ml）（0.59モル） ２−アセチルフラン,85％ 165g（150ml）（1.27モル） 水酸化カリウム,85％ 35g（0.53モル） KOHを加熱かきまぜながらメタノール（約600ml）に溶解
する。この溶液を少し冷し、アルデヒドとフランとの混
合物を一度に添加する。混合物を60℃へ加熱し、45〜60
分間かきまぜる。最初緑色が発色し、速やかに褐色に暗
色化する。反応混合物はオレンジ−褐色結晶の塊に固化
する。エタノール（約150ml）を加え、固体を砕く。混
合物を一夜冷却し、生成物結晶をロ取し、氷冷エタノー
ル（約400ml）で洗い、次にヘプタン（約200ml）で洗
う。結晶を80℃で減圧乾燥する。ペンタンジオンの収量
103.5mgまたは57.3％ B.4−フェニル−2,6−ジ（２−フリル）ピリジンの製造 ５−ジ（２−フリル）−３−フェニル−1,5−ペンタン
ジオン 143g ヒドロシキルアミン塩酸塩 （アルドリッチ 102337） 129g ｎ−ブタノール（シグマ 13F-5070） 1600ml 工程Ａで製造したジオン、ヒドロキシルアミン塩酸塩お
よびブタノールを、機械的スターラーとコンデンサーを
備えた5lの３頸フラスコへ加え、５時間還流かきまぜ、
冷却し、約60時間かきまぜる。生成した黒色溶液を15％
NaOH 1中へ注ぎ、トルエン（１）で抽出する。有機
層を脱イオン水（１×200ml）で洗い、Na2SO4で乾燥
し、ロータリーエバポレーターで濃縮する。粘ちょうな
残渣をCH2Cl2（約250ml）で溶かす。ヘキサン（約250m
l）を生成溶液へ加え、シリカゲルでロ過し、1:1CH2Cl2
／ヘキサン（約500ml）で溶出する。ロ液を濃縮し、エ
タノール（約200ml）を加え、混合物を氷中で冷却す
る。生成した結晶をロ取し、氷冷エタノールで洗い、室
温で減圧乾燥すると、１番結晶約65gが得られる。ロ液
を濃縮し、精製し、冷却すると２番結晶13.6gが得られ
る。
C.4−フェニル−2,6−ピリジンカルボン酸 工程Ｂのジフリルピリジン化合物を過マンガン酸で酸化
する。
工程Ｂの生成物 23ミリモル KMnO4 45.4g ｔ−ブタノール 1500ml 水 300ml ｔ−ブタノール（約１）をメカニカルスターラー、マ
ントルおよびコンデンサーを備えた三頸フラスコへ入れ
る。工程Ｂの生成物を加え、フラスコ中へ残りのｔ−ブ
タノールを加える。混合物を加熱し、溶液になるまでか
きまぜる。次に水を加え、温度が約75℃へ達した時KMnO
4を少しづつ30分を要して加える。混合物を90分間還流
する。アルコールをアスピレーター真空で留去し、熱い
残渣をセライトでロ過し、熱1:1 t−BuOH/H2Oで洗う。
残存KMnO4をNaHSO3で消費し、溶液をロータリーエバポ
レーター（約65℃）で約150mlへ濃縮する。2N HCl（25m
l）で酸性化した後、生成した所望の４−フェニル−2,6
−ピリジンカルボン酸の結晶をロ取し、洗浄し、乾燥す
る。
D.4−フェニル−2,6−ピリジンジカルボン酸アミド ４−フェニル−2,6−ピリジンジカルボン酸 21.5ミリモ
ル オキザリルクロライド 4.8ml 塩化メチレン 80ml ジメチルホルムアミド ５滴 ピリジンジカルボン酸をCH2Cl2,DMFおよびかくはん棒つ
きの100ml二頸フラスコへ加える。フラスコをCaSO4乾燥
チューブで封鎖し、氷中で冷却する。次いでオキザリル
クロライドを注射器から約５分にわたって加え、室温で
約２時間かきまぜる。得られる溶液をロータリーエバポ
レーターで濃縮して固体の酸クロライドを得、ベンゼン
（150ml）を加え、ロータリーエバポレーターで除去
し、次に残渣を真空乾燥する。酸クロライドを28％NH4O
H（50ml）へ５〜10分にわたってかきまぜながら添加
し、１時間かきまぜ、ロ過し、水洗し、乾燥して所望の
アミドを得る。
E.4−フェニル−2,6−ピリジンジカルボニトリル ４−フェニル−2,6−ピリジン−ジカルボン酸アミド17.
5ミリモル ｐ−ジオキサン 170ml ピリジン 11.3ml トリフルオロ酢酸無水物 11.0ml 最初の三成分をかくはん棒を備えた250mlフラスコ中へ
入れる。フラスコをアルゴンガス下封鎖し、凍結したジ
オキサンが存在するまで氷中で冷却する（10℃）。酸無
水物を約10分を要して加え（温度約15℃）、混合物を室
温で２時間かきまぜる。生成した暗色溶液を水中へ注
ぎ、各回メチレンクロライド150mlで３回抽出する。抽
出液をNa2SO4上で乾燥し、ロータリーエバポレーターで
暗色固体へ濃縮し、塩化メチレンへ溶解し、シリカを通
して追加の塩化メチレンで溶出する。溶出液を固体へ濃
縮し、乾燥し、所望のジカルボニトリルを得る。
F.4−フェニル−2,6−ジ（アミノメチル）−ピリジン ４−フェニル−2,6−ピリジン−ジカルボニトリル 13.5
ミリモル ２％HClO4エタノール 370ml 10％パラジウム炭 3.7g ニトリルを70％HClO410.5mlを添加したエタノール中に
懸濁し、混合物をパールボトルへ移す。ボトルを窒素で
掃気し、触媒を加える。ボトルを次に水素で40psiへ与
圧する。30分後ボトルを開き、液体を取り出して暗色液
体へ濃縮する。該液へジメチルエーテルを加え、ロ過す
ることによって黄色固体を回収する。過酸塩素酸塩固体
を真空ポンプで乾燥する。このアミン過塩素酸塩を水約
30mlへ溶解し、40％NaOHへ加える。生成した遊離アミン
をCH2Cl2で抽出し、Na2S4上で乾燥し、真空ポンプで暗
色オイルへ濃縮する。
G.4−フェニル−2,6−ビス〔N,N−ジ（メトキシカルボ
ニルメチル）−アミノメチル〕−ピリジン 工程Ｆのアミン 12.0ミリモル 1,8−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン 10.3g ブロム酢酸メチル 7.35g アセトニトリル 130ml 塩基をフラスコへ入れる。アミンをアセトニトリルへ溶
解し、フラスコへ入れる。かくはん棒を加え、混合物を
均一になるまで45℃でかきまぜる。次にアルゴンガス下
アセトニトリル40ml中のブロム酢酸メチルを滴下する。
約45℃で約16時間後、生成物を水150mlと0.1Mクエン酸
中へ注ぐ。この混合物を塩化メチレンで抽出する。抽出
液を洗浄し、乾燥し、濃縮し、再溶解し、シリカでロ過
する。生成物は溶媒として酢酸エチル／塩化メチレンを
使用してシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。
H.テトラエステルの鹸化 工程Ｇのテトラエステルをメタノール／水1:1中へ入
れ、K2CO3のモル過剰を加え、室温で2.5時間かきまぜる
ことによって鹸化する。次に溶液をpH7へ酸性化し、乾
燥すると所望のテトラ酸を与える。NMRによってその同
一性が確認される。
実施例２ 実施例１の製造法を、工程Ａにおいてベンズアルデヒド
を2,4−ジメトキシベンズアルデヒドの同モル量に代
え、生成する中間体が４−（2,4−ジメトキシフェニ
ル）−2,6−ピリジンカルボン酸であり、そして最終生
成物が実施例１の工程Ｈの生成物の2,4−ジメトキシ類
縁体となるように変更してくり返す。各工程において得
た収率は、所望の４−（2,4−ジメトキシフェニル）−
2,6−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノメチ
ル〕−ピリジンの、 Ａ工程 95％ Ｂ工程 72％ Ｅ工程 84％ である。
実施例３ないし17 実施例１の製造法を、ベンズアルデヒドを以下の置換ベ
ンズアルデヒドの同モル量に代えることにより変更し、
15回くり返す。
これら異なるベンズアルデヒドをもって対応する2,6−
ピリジンジカルボン酸中間体およびテトラ酸最終製品が
得られる。
実施例18 この実施例はアミン置換分をフェニル環へ導入すること
を示す。実施例１の工程A,BおよびＣを、ベンズアルデ
ヒドを３−ニトロベンズアルデヒドの同モル量に代える
変更をもってくり返す。これせは４−（３−ニトロフェ
ニル）−2,6−ピリジンジカルボン酸を与える。
D.4−（３−ニトロフェニル）−2,6−ピリジンジメタノ
ール 上記ジ酸 28.8g（0.1モル） ボラン/THF錯体 288ml,1モル ジ酸をTHF1000mlおよびかくはん棒を入れた乾燥した2l
フラスコへ入れる。乾燥チューブを取り付け、フラスコ
をアルゴンで掃気する。次にボラン/THF錯体をはげしく
かきまぜながら室温において徐々に20〜30分を要して添
加する。かくはんを４時間続け、次に過剰のボランを希
HCl（6N HCl20mlおよびH2O85ml）で加水分解する。次に
10％Na2CO360mlを加え、溶液をロータリーエバポレータ
ーで濃縮する。残渣を重炭酸塩水溶液へ加え、酢酸ブチ
ルで３回抽出し、抽出液を乾燥し、溶媒を留去して所望
のジオールをオレンジ色固体として得る。
E.4−（３−ニトロフェニル）−2,6−ビス（ブロムメチ
ル）ピリジン 工程Ｄのジオール 9.1g（35ミリモル） チオニルブロマイド 7.0ml（90ミリモル） 工程Ｄのジオールをフラスコに入れ、約20mlの塩化メチ
レンを加え、次にチオニルブロマイドを加える。フラス
コを入口アダプターで封鎖し、80℃の油浴へ入れる。塩
化メチレンおよびKBrを追い出し、粘ちょうな残渣が残
る。これを水性Na2CO3中へ入れ、塩化メチレンで３回抽
出する。抽出液を乾燥し、濃縮し、塩化メチレンで希釈
し、シリカでロ過する。ロ液を集め、蒸発し所望の臭化
物を得る。
F.2,6−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノメチ
ル〕−４−（３−ニトロフェニル）−ピリジンテトラメ
チルエステル 工程Ｅのジブロマイド 3.44g（8.9ミリモル） イミドジ酢酸ジメチルエーテル 2.88g 1,8−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン 3.76g アセトニトリル 140ml 塩基をフラスコに入れる。イミドジエステルをアセトニ
トリルと混合し、そして添加する。フラスコをアルゴン
で掃気し、45℃へ加熱する。THF中のジブロマイドを磁
力でかきまぜながら60〜90分にわたって加える。18時間
後混合物を冷却し、室温で約２日間かきまぜる。混合物
をベンゼンへ加え、ロ過し、0.1Mクエン酸および水で洗
い、Na2SO4上で乾燥する。溶液を次に油へ濃縮し、塩化
メチレンへ取り、酢酸エチル／塩化メチレン、次いで酢
酸エチルを溶出液としてシリカゲルを２回通す。分画を
集め、所望の物質を単離し、こはく色の油へ濃縮する。
G.ニトロ基のアミンへの還元 工程Ｆのニトロテトラメチルエステル 2.7g（4.9ミリモ
ル） ５％パラジウム炭 2.7g エチルアルコール 300ml ニトロ化合物をエタノール300mlを入れた１フラスコ
へ入れる。フラスコを窒素で掃気し、触媒を加える。フ
ラスコを次に水素で１気圧に与圧する。１時間後反応混
合物をロ過し、ロ液をロータリー蒸発によって黄色油へ
濃縮する。この油は工程Ｆの製品に対応するアミノテト
ラメチルエステルであることが決定される。
H.鹸化 工程Ｇのアミノテトラメチルエステルは実施例１の方法
を使用して鹸化される。これにより所望の３−アミノテ
トラ酸が得られる。
実施例19 A.2,6−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノメチ
ル〕−４−（４−ニトロフェニル）−ピリジンテトラメ
チルエステルの製造 発煙硝酸（0.03ml,0.4328ミリモル）を室温において塩
化メチレン（4ml）中のトリフルオロメタンスルホン酸
溶液へ加える。５分間かきまぜた後、少量の塩化メチレ
ン中の実施例１の工程Ｇからのような2,6−ビス〔N,N−
ジ（カルボキシメチル）アミノメチル〕−４−フェニル
−ピリジン溶液を０℃においてゆっくり加える。溶液が
室温へ暖まることを許容し、１時間かきまぜを許容す
る。次に反応混合物を氷の上へ注ぎ、混合物を炭酸ナト
リウムで中和する。塩化メチレンで抽出し、硫酸ナトリ
ウム上で乾燥し、蒸発すると粗製品90mgを与える。
B.2,6−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノメチ
ル〕−４−（４−アミノフェニル）−ピリジンテトラメ
チルエステルの製造 上記反応からの粗生成物（90mg,0.17ミリモル）をエタ
ノール（13ml）に溶解し、10％Pd/C 50mgを加え、混合
物を水素１気圧のもとで１時間室温でかきまぜる。触媒
をロ去し、溶媒を蒸発すると４−アミノ化合物60mlを与
える。このアミノ化合物（51mg）は製法２によって製造
された対応する３−ニトロ化合物70mg（0.129ミリモ
ル）から同様に製造される。この製造法は実施例18に示
したものと実質上同じである。もし望むならば、それら
のアリール環上にアミン置換分を有するこれらおよび同
様なアリールピリジンは、アミン含有標的分子その他へ
結合することができるイソチオシアネートへアミンを変
換するチオホスゲンとアリールアミンとの反応について
既知の条件でチオホスゲンと反応させることができる。
C.2,6−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノメチ
ル〕−４−（４および３−アミノフェニル）−ピリジン
テトラメチルエステルのテオフィリン−８−酪酸への結
合 クロルギ酸イソブチル（0.02ml,0.117ミリモル）をトリ
エチルアミン（0.20ml,0.117ミリモル）を含有するジメ
チルホルムアミド（1.5ml）中のテオフィリン−８−酢
酸（31.3mg,0.117ミリモル）の溶液へアルゴン雰囲気下
０℃において加える。０℃で0.5時間後、クロロホルム
中の４−アミン（60mg,0.117ミリモル）の溶液をゆっく
り加える。溶液を０〜５℃で17時間かきまぜ、次に溶媒
を蒸発により除去し、粗製品103mgを残す。この物質を
シリカゲル上でクロロホルム：メタノール（9:1）でク
ロマトグラフィーし、所望の生成物60mg（67％）を与え
る。対応する３−アミノ化合物（51mg,0.01ミリモル）
を同様に処理し、３位にテオフィリンが結合した物質50
mgを得る。
D.2,6−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノメチ
ル〕−４−〔４−（テオフィリン−８−ブチルアミド）
−フェニル〕−ピリジンテトラ酸の製造 前工程からのテトラメチルエステル（34mg,0.045ミリモ
ル）を1N水酸化ナトリウム0.2mlを含有するメタノール
（2ml）中に溶解し、３時間加熱還流する。次に溶液を
氷浴中で冷却し、IN HClで酸性化し、蒸発して粗製品を
得る。メタノール：水（6:4）中の逆相カラムクロマト
グラフィーによる粗製品はテトラ酸14mgを与える。類似
の３−置換化合物40mg（0.05ミリモル）の鹸化は逆相ク
ロマトグラフィー後そのテトラ酸14.6mgを与える。
E.キレートの製造 Ｄ部のテトラ酸を別々に10-5Mの濃度に0.01Mホウ酸ナト
リウム溶液に溶解する。次に水性塩化テルビウムの同モ
ル量をそれぞれへ加え、混合物を数分間放置する。蛍光
測定を実施し、テトラ酸とテルビウムとの1:1モルキレ
ート錯塩が生成したこと、およびそのような錯塩は蛍光
性であり、かつ安定であることを示す。
F.標識したテオフィリンの抗体への結合による蛍光の増
強によるテオフィリンの均質蛍光イムノアッセイ テオフィリンのアッセイは、上の蛍光標識したテオフィ
リントレーサーのテルビウムキレート（すなわち、2,6
−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノメチル〕
−４−〔４−（テオフィリン−８−ブチルアミド）−フ
ェニル〕−ピリジンテリビウムキレート）が杭テオフィ
リン抗体への結合についてテオフィリンスタンダードと
競合することを許容することによって実施される。抗体
への結合に際し標識したテオフィリンはその蛍光の増強
を受け、そしてこの増強は結合した標識テオフィリンの
量に正比例し、そしてサンプル中に存在するテオフィリ
ンの量に反比例する。アッセイはポリスチレン試験管
（12×15mm）中で実施され、該試験管へ0.01Mホウ酸ナ
トリウム緩衝液pH8.5の1mlが加えられる。その後１μＭ
トレーサー10μｌ（8.7ng）およびテオフィリンスタン
ダード（0,5.4,16.2,54および540ng）の10μｌが添加さ
れる。0.1M塩化ナトリウムおよび１％正常ヒト血清を含
有する0.0Mホウ酸塩中の約0.3μＭ杭テオフィリン抗体2
5μｌ（アッセイ管中の最終濃度約7.5nM）の添加は、種
々のスタンダードに対し、観察された蛍光の増加それぞ
れ40％〜50％へ導く。これは5.4,16.2,54および540ngス
タンダードについてそれぞれ80,64,53および14％のB/Bo
値に相当する。
実施例20 A.0−ベンジルバニリンの製造 バニリン 100.4g（0.66モル）アルドリッチ ベンジルクロライド 84.0g（77ml,0.66モル） 炭酸カリウム 115g アセトン 2l 18−クラウン−６ 3g 上記成分をマントル、コンデンサーおよびメカニカルス
ターラーを備えた3l三頸丸底フラスコへ入れる。混合物
を還流下70時間かきまぜる。最初の24時間の間に明るい
黄色になり、還流３日目に明るい黄褐色に変わる。次に
アセトン約１を留去し、残渣を砕いた氷（約2l）と水
（約500ml）中にかきまぜながら注ぐ。溶液を接種し、
固体沈澱を析出させ、約20分間静置し、次にロ過し、エ
タノール（０℃,400ml）で洗い、真空乾燥すると、所望
の生成物120gを与える。これは約75％の収率である。
B.2,6−ジ（２−フリル）−４−（３−メトキシ−４−
ベンジルオキシフェニル）−ピリジン ０−ベンジルバニリン（Ａ部から） 31.5g（0.13モル） アセチルフラン（アルドリッチ） 43g（0.39モル） メタノール 300ml 上記成分を500mlフラスコ中で混合し、均質になるまで
（約20分）加熱し、かきまぜる。次に20％KOH/メタノー
ル約5mlを加え、45分間加熱かくはんを続ける。次に20
％KHO/メタノールの他の15mlを加え、フラスコの口を軽
くカバーし、中味を16時間加熱し、かきまぜる。生成物
を6N HCl（約10ml）で酸性化し、約55℃でロータリーエ
バポレーター中で濃縮する。
次にヒドロキシルアミン塩酸塩22gとｎ−ブチルアルコ
ール250mlを加え、混合物をマントルを使って３時間還
流する。ブタノールを約65℃でロータリーエバポレータ
ー中で除去し、残渣を水（200ml）中へ注ぎ、6N NaOH
（60ml）で塩基性化し、トルエン（２×200ml）で抽出
する。抽出液を水（約100ml）で洗い、Na2SO4上で乾燥
し、ロータリーエバポレーターで約65℃において黒い油
へ濃縮する。これをシリカゲル（約200g）でロ過し、1:
1CH2Cl2／ヘキサンで溶出する。溶出液を油へ濃縮す
る。この油を再度シリカロ過にかけ、再度油へ濃縮し、
再度シリカゲル（約200g）でロ過し、今度はトルエン／
CH2Cl29:1（約１）で溶出する。この溶出液はこはく
色油へ濃縮され、エタノール（約50ml）に溶解され、再
度油へ濃縮される。製品収率は約25gである。
C.4−（３−メトキシ−４−ベンジルオキシフェニル）
−2,6−ピリジンジカルボン酸 ジフリルピリジン（Ｂ部から） 19g（0.45モル） ｔ−ブチルアルコール 3l 脱イオン水 0.6l 過マンガン酸カリウム 93g 実施例１のＣ部の操作を以下の変更を加えて実施する。
KMnO4添加後、混合物を1 1/2時間加熱、かきまぜる。次
にｔ−ブタノールを留去する。約200mlへ濃縮後、生成
物を2N HCl（約50ml）で酸性化する。カナリヤ黄色沈澱
が生成し、これを水数mlで薄め、ロ過し、冷水（約50m
l）で洗い、真空乾燥し、製品15.2gを与える。これは約
90％の収率である。
D.4−（３−メトキシ−４−ベンジルオキシフェニル−
2,6−ピリジンカルボン酸クロライド ジ酸（Ｃ部から） 6.07g（0.016モル） 塩化メチレン 60ml オキザリルクロライド 3.5ml ジメチルホルムアミド ４滴 ジ酸を乾燥チューブおよび隔壁ストッパーを取り付けた
100ml二頸丸底フラスコ中へ秤量する。かくはん棒をCH2
Cl2（約60ml）およびDMFとともに加える。オキザリルク
ロライド（3.5ml）を注射器からゆっくり加える間（添
加時間約５分）混合物を氷中でかきまぜる。次に反応混
合物を室温で２時間かきまぜる。酸は約１時間でHClを
発生して溶液中へ移行する。暗色溶液を250mlフラスコ
へ移し、そして溶媒をロータリーエバポレーターで除去
する。ベンゼン（約100ml）を黄色残渣へ加え、ロータ
リーエバポレーターで除去すると、所望のクロライドで
ある暗緑色固体6.65gが得られる。
E.4−（３−メトキシ−４−ベンジルオキシフェニル）
−2,6−ピリジンメタノール ジ酸クロライド（Ｄ部から） 6.65g（0.16モル） ジグリム 300ml 水素化ホウ素ナトリウム 1.5g テトラヒドロフラン 20ml NaBH4をアルゴン導入口、温度計および添加ロートを備
えた乾燥500ml三頸フラスコ中へ秤取する。かくはん棒
およびジグリム（約300ml）を加え、フラスコをアルゴ
ンで掃気し、０℃へ冷却する。ジ酸クロライドをジグリ
ム（約40ml）およびTHE（約20ml）中に溶解し、添加ロ
ートへ移し、そしてかきまぜおよび冷却下（温度０℃）
15分を要してフラスコへ滴下する。混合物を室温で２時
間かきまぜる。溶液の色はこはく色から１時間の間にさ
んご色へ変化し、次に以後濁った褐色へ変化する。生成
物を水（約500ml）と約100mlの0.1Mクエン間中へ注ぎ、
ロータリーエバポレーターで濃縮する（60℃）。残渣
（約500ml）を水（約ｌ）中へ注ぎ、そしてエチルエー
テル（４×100ml）で抽出する。抽出液をNa2SO4上で乾
燥し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、DMSOに可溶
な褐色固体として所望のジオール4.0gを得る。
F.4−（３−メトキシ−４−ベンジルオキシフェニル）
−2,6−ジ（ブロムメチル）−ピリジン ジオール（Ｅ部からとプラス反復） 5.1g（21.2ミリモ
ル） トリフェニルフォスフィン 15.2g 臭素 3.0ml 乾燥した250ml三頸丸底フラスコ中にフォスフィンを秤
取する。CH3CN（約50ml）とかくはん棒とを加え、フラ
スコを隔壁とアルゴン導入口で封鎖する。溶液を氷／メ
タノール中０℃へ冷却し、Br2を約20分を要して滴下す
る。混合物を室温で15分間かきまぜる。ジオールをCH3C
N（約75ml）中に懸濁し、フォスフィン臭素複合体中へ
移し、２時間室温でかきまぜ、そして水（約600ml）中
へ注ぎ、NaHCO3を飽和させる。この水性懸濁液をCH2Cl2
（２×200ml）で抽出する。抽出液をNa2SO4上で乾燥
し、シリカゲルでロ過し、CH2Cl2で溶出する。溶出液を
ロータリーエバポレーターで2.2gの白色固体へ濃縮す
る。これが所望のジブロマイドであり、微量のトリフェ
ニルフォスフィンオキサイドを含有する。
G.2,6−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノメチ
ル〕−４−（３−メトキシ−４−ベンジルオキシフェニ
ル）−ピリジンテトラエステル ジブロマイド（Ｆ部より） 2.15g（4.5ミリモル） イミドジ酢酸ジメチルエーテル 1.45g（9.0ミリモル） 1,8−ビス（ジメチルアミノ）−ナフタレン1.94g
乾燥した100ml三頸フラスコ中へイミノエステルを秤取
し、塩基およびCH3CN（約50ml）を加える。ジブロマイ
ドはTHF（約35ml）に溶かし、フラスコへかきまぜまが
らアルゴン下45℃で一夜添加する。反応混合物を水（約
150ml）および0.1Mクエン酸（約150ml）および酢酸エチ
ル（約150ml）中へ注ぐ。酢酸エチル層を分離し、0.1M
クエン酸（約100ml）、水（約100ml）および食塩水（約
100ml）で洗い、Na2SO4上で乾燥し、粘ちょうな紫色油
へ濃縮する。この油をCH2Cl2に溶かし、シリカ（35g）
でロ過する。紫色バンドをCH2Cl2（約200ml）中10％酢
酸エチルで溶出する。その後所望のテトラエステルを50
％酢酸エチル／CH2Cl2（200ml）および80％酢酸エチル
／CH2Cl2（約200ml）で溶出する。テトラエステルを含
有する溶液分画を約2.5gの油へ濃縮する。
H.テトラエステルの鹸化 工程Ｇのテトラエステルは実施例１の操作を使用して鹸
化され、所望のテトラ酸を与える。
実施例21 実施例19の一般的操作を追従して、４−〔４（または
３）−アミノフェニル〕−2,6−ビス〔N,N−ジ（カルボ
キシメチル）アミノメチル〕−ピリジンテトラエステル
は、ジゴキシゲニンオン−３−０−カルボキシメチルオ
キシム、フェニトイン−３−（８−オクタン酸）、およ
びコルチゾール−３−０−カルボキシメチルオキシムへ
結合され、結晶物質を与える。これらテトラエステルの
鹸化はテトラ酸を与え、それは希土類金属と標的検体の
蛍光標識した免疫学的に活性な類縁体を形成した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．47 （1982），ｐｐ．4803−4806 Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ. 22，Ｎｏ．44（1981），ｐｐ．4381−4384

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式I: （式中、ｎおよびｎ′は独立に１または２の整数であ
    り、Arはアリールであり、ｎ″はAr上の提供可能な結合
    部位の数に等しい整数であり、Ｍは水素か金属イオンで
    あり、そして（Ｒ）ｎ″,R′およびＲ″はめいめい独立
    に水素か、電子供与基か、または生物学的に活性な物質
    への結合手を提供することができる連結基から選ばれ、
    ただし（Ｒ）ｎ″の少なくとも１個は電子供与基であ
    り、そしてＲ′,R″，（Ｒ）ｎ″の少なくとも１個は連
    結基である。）を有することを特徴とする生物学的に活
    性な物質を蛍光的に検出可能に標識するための試薬。
  2. 【請求項２】前記電子供与基は低級アルコキシ、低級ア
    ルキル、アミノ、ジアルキルアミノ、アリールおよびア
    リールオキシから選ばれる第１項記載の試薬。
  3. 【請求項３】ｎおよびｎ′がめいめい１である第１項記
    載の試薬。
  4. 【請求項４】Arがフェニルであり、そして（Ｒ）ｎ″の
    少なくとも一つが低級アルコキシである第１項記載の試
    薬。
  5. 【請求項５】Ｍは４個のカルボキシル基と錯塩結合した
    希土類金属イオンを含む１個または２個以上の金属イオ
    ンよりなる第１項記載の試薬。
  6. 【請求項６】生物学的に活性な物質を蛍光的に検出可能
    に標識する方法であって、式I: （式中、ｎおよびｎ′は独立に１または２の整数であ
    り、Arはアリールであり、ｎ″はAr上の提供可能な結合
    部位の数に等しい整数であり、Ｍは水素か金属イオンで
    あり、そして（Ｒ）ｎ″,R′およびＲ″はめいめい独立
    に水素か、電子供与基か、または生物学的に活性な物質
    への結合手を提供することができる連結基から選ばれ、
    ただし（Ｒ）ｎ″の少なくとも１個は電子供与基であ
    り、そしてＲ′,R″，（Ｒ）ｎ″の少なくとも１個は連
    結基である。）を有するマーカー試薬を前記連結基を使
    用して生物学的に活性な物質へ直接、または二官能スペ
    ーサー基を介して結合することを特徴とする生物学的に
    活性な物質の標識方法。
  7. 【請求項７】前記電子供与基は低級アルコキシ、低級ア
    ルキル、アミノ、ジアルキルアミノ、アリールおよびア
    リールオキシから選ばれる第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】ｎおよびｎ′がめいめい１である第６項記
    載の方法。
  9. 【請求項９】Arがフェニルであり、そして（Ｒ）ｎ″の
    少なくとも一つが低級アルコキシである第６項記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】Ｍが４個のカルボキシル基と錯塩結合し
    た希土類金属イオンを含む１個または２個以上の金属イ
    オンよりなる第６項記載の方法。
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