DE68927886T2 - Terpyridin-derivate - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft organische Komplexierungsmittel (Liganden oder Chelatoren) mit einer 2,2':6',2"-Terpyridin- Struktur. In der vorliegenden Beschreibung werden Verbindungen mit dieser Struktur als Terpyridine, sofern nicht anders angegeben, bezeichnet. Die erfindungsgemäßen Liganden bilden fluoreszierende Lanthanidchelate mit den geeigneten Metallionen.
- Die neuen Chelate wie auch der Ligand finden Anwendungen auf solchen Gebieten, die für Chelate klassisch sind. Die erfindungsgemäßen fluoreszierenden Metallchelate sind nützlich als Sonden in zeitlich aufgespaltener bzw. zeitlich versetzter Fluoreszenz-Spektroskopie. Im Gegensatz zu vielen anderen bekannten Lanthandidchelatoren ergeben die erfindungsgemäßen Chelatoren sehr oft stark fluoreszierende Chelate, sowohl mit Tb³+ als auch mit Eu³+. Dies bewirkt, daß sie sehr wichtig sind in Multimarkierungsverfahren.
- Die Empfindlichkeit analytischer Verfahren, beruhend auf der molekularen Fluoreszenz, ist wegen der Hintergrundsignale, bedingt entweder durch Raman-Streuung oder fluoreszierende Verunreinigungen in der Probe, beschränkt. Beide von diesen Interferenzen sind allgemein kurzlebige Phänomene, d.h., der Strahlungsübergang, der nach Anregung des Moleküls erfolgt, tritt innerhalb einer Mikrosekunden-Zeitspanne auf. Somit kann irgendeine Verbindung mit langlebender Fluoreszenz wirksam in Anwesenheit eines kurzlebigen Hintergrunds bestimmt werden, wenn ein Fluorometer mit Zeitauflösung verfügbar ist. In diesem Fluorometer wird die Probe mit einer intermittierenden Lichtquelle so bestrahlt, daß die langlebige Fluores zenz während der Dunkelzeit, die auf den Zerfall des kurzlebigen Hintergrunds folgt, meßbar ist.
- Die Chelatbildungsfähigkeit von Terpyridinen, Bipyridinen und substituierten Pyridinen ist gut bekannt (EP-A-68 875, S. 29; Chemical Abstracts 98 (1983) 226913k, 102 (1985) 71589j, 103 (1985) 71419z und 106 (1987) 94885; FR-A-2 570 703; Chem. Berichte 118 (1985) 212-7; EP-A-195 413 und EP-A-203 047).
- Zeitlich versetzte Fluoreszenzspektroskopie unter Verwendung fluoreszierender Lanthanidchelate ist ebenfalls seit einiger Zeit bekannt. Bei den in der DE-A-2 628 158 und der US-A- 4 374 120 beschriebenen Verfahren werden β-Diketone in fluoreszierenden Lanthanidchelaten, die bei Fluoroimmunoassays verwendet werden, eingesetzt. Gemäß der DE-A-2 628 158 ist die lichtabsorbierende Gruppierung des fluoreszierenden Chelats kovalent an ein Antigen oder einen Antikörper konjugiert, der während des Testverfahrens einen Immunkomplex mit seinem immunologischen Gegenstück bilden kann. Bei dieser Art von Assay wird das Testprotokoll so angeordnet, daß die Menge an gebildetem Immunkomplex ein Anzeichen für die Substanz, die nachgewiesen werden soll (= Analyt), ist. Der Lanthanidchelat-markierte Immun-Reaktionsteilnehmer, der verwendet wird, besitzt ein Epitop gemeinsam mit dem Analyten (Analytanaloges), oder er ist eine aktive Antikörperkomponente, die gegen den Analyten oder gegen ein anderes antigenes oder haptenes Material, das für die Bildung des Immunkomplexes verwendet wird, gerichtet ist. Bei vielen Versionen dieser Art von Assays kann das Chelat direkt an ein Molekül, das als Antigen oder Hapten verwendet wird, konjugiert sein. Es gibt verschiedene Wege, um Fluoroimmunoassays und andere Assays, bei denen biospezifische Affinitätsreaktionen (Reaktionsteilnehmer) verwendet werden, zu kategorisieren. Wenn vor der Fluoreszenzmessung das Chelat, eingearbeitet in den Immunkomplex, von dem Teil des Chelats, der nicht eingearbeitet ist, getrennt wird, werden die Verfahren als heterogen bezeichnet. Wenn keine solche Trennstufe durchgeführt wird, werden sie als homogen bezeichnet. Diese beiden Varianten stellen an das verwendete Lanthanidchelat unterschiedliche Forderungen. Die homogenen Verfahren erfordern, daß das Chelat seine Fluoreszenzeigenschaften auf meßbare Weise als Konsequenz der Immunkomplexbildung ändert, wohingegen keine solche Forderungen für die heterogenen Versionen bestehen. Immunoassays sind gerade ein Beispiel von Verfahren, bei denen biospezifische Affinitätsreaktionen verwendet werden. Analog gibt es Assaysysteme, bei denen andere Arten von biospezifischer Affinität verwendet werden, wie zwischen DNA - komplementärer DNA, Protein A - dem Fc-Teil von IgG, Lectin - Kohlehydrat-Struktur usw. Die Prinzipien und die Klassifizierung, die oben erläutert wurden, gelten für diese ebenfalls.
- Der Hauptnachteil der fluoreszierenden Lanthanidchelate ist der, daß sie selten gute wäßrige Stabilität mit effizienter Fluoreszenz gemeinsam besitzen. In wäßrigen Lösungsmitteln wird ihre Fluoreszenz oft durch Wasser abgeschreckt.
- In der EP-A-64 484 wird eine Version eines heterogenen Lanthanidchelat-Fluoroimmunoassays beschrieben, bei dem keine Forderungen bestehen für Marker, die gute fluoreszierende Verbindungen sind. Stattdessen ist das Interesse auf die wäßrige Stabilität der verwendeten Lanthanidchelate fokussiert. Der Ligand dient nur dazu, das Lanthanid durch die Trennungsstufe zu transportieren, nach der das Lanthanidkation bei niedrigem pH-Wert dissoziiert und mit einem aromatischen β-Diketon als Ligand in mizellarer Phase ein stark fluoreszierendes Chelat gebildet wird. Dieses Verfahren ergibt eine sehr gute Empfindlichkeit, besitzt aber den Nachteil, daß es ein langdauerndes Verfahren ist.
- Es wäre von Vorteil, wenn stark fluoreszierende Lanthanidsonden mit guter wäßriger Stabilität verfügbar wären. Solche Sonden würden homogene Assays und kürzere Assayprozeduren in heterogenen Assays ermöglichen. Sie könnten ebenfalls in anderen Fluoreszenzverfahren, beispielsweise bei der Fluoreszenzmikroskopie, Verwendung finden.
- Es wurden Lanthanidchelate, die in wäßrigen Medien fluoreszieren, zuvor vorgeschlagen [EP-A-180 492 (makropolycyclisch); EP-A-68 875 (Phenole und Arylether und ein spezifischer Terpyridinchelator); EP-A-195 413 (Arylpyridine) und EP-A-203 047 (Ethinylpyridine)]. Obgleich diese in gewissem Umfang für die zuvor angegebenen Nachteile kompensieren, hat sich gezeigt, daß nur Lanthanidchelate der Ethinylpyridine (EP-A-203 047) eine wirksame Quantenausbeute und eine wäßrige Stabilität besitzen, so daß sie als direkte fluoreszierende Marker im Handel verwendet werden können.
- Gegenstand der Erfindung sind Lanthanidchelate, worin Eu³&spplus;, Tb³+, Sm³&spplus; oder Dy³+ an eine Terpyridinverbindung der Struktur:
- chelatiert ist, worin
- (i) n = 1 oder 2;
- (ii) X&sub1;, X&sub2;, X&sub3;, X&sub4; und X&sub5; Wasserstoff bedeuten;
- (iii) Z&sub1; und Z&sub2; identisch und gleich zu -CH&sub2;-Z' sind, wobei Z' ausgewählt wird aus -N(-CH&sub2;COO&supmin;)&sub2;, -N(-CH&sub2;CH&sub2;COO&supmin;)&sub2;,
- -N(-CH&sub2;OP0&sub3;²&supmin;)&sub2;, -N(-CH&sub2;PO&sub3;²&supmin;)&sub2;, -N(-CH&sub2;CH&sub2;PO&sub3;²&supmin;)&sub2;, 2,6-Dicarboxypiperidin-1-yl und -N(-CH&sub2;COO&supmin;), überbrückend die Methylengruppen von -CH&sub2;-Z' in Z&sub1; und Z&sub2;;
- (iv) -X-Y ein Substituent ist, der Wasserstoff in Z' oder in einer oder beiden Gruppen X&sub1;-X&sub5; ersetzt, wobei in dem Substituent X-Y:
- X kein wirksames chelatbildendes Heteroatom enthält, das näher als in einer Entfernung von vier Atomen von den Heteroatomen entfernt ist, die bei der Chelatbildung eines gemeinsamen Metallions teilnehmen, und aus einer aromatischen Gruppe besteht, ausgewählt aus Chinolyl, Pyridyl, Bipyridyl, Phenyl, Naphthyl oder einer geradkettigen oder verzweigtkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffkette, die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthält, wobei die Gruppe X ein oder mehrere Strukturelement(e) enthalten kann, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -NR- (sekundäres und tertiäres Amin), -CONRund -NRCO- (substituiertes Amid), -S-S- (aliphatisches Disulfid), -S- (aliphatischer Thioether), -O- (Ether), -COO- und -OOC- (Ester) und -N=N- (Diaza), worin das Symbol R Wasserstoff oder Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen bedeutet; und
- Y
- (a) eine funktionelle Gruppe ist, ausgewählt aus Isothiocyanato, Bromacetamido, Iodacetamido, Succinamido, Pyridyldithio, Mercapto, Carboxyl und aktiven Estern, Hydroxyl, Aldehyd, Amino, Diazonium, Tosyl, Mesitylyl, Trexyl, Phosphodiestern und Phosphotriestern; oder
- (b) ein Rest einer Verbindung ist, die die Fähigkeit besitzt, in biospezifischen Affinitätsreaktionen zu partizipieren, wie zwischen Antigenen (Haptenen) und den homologen aktiven Antikörperkomponenten und komplementären Nucleinsäuren, wobei der Rest die biospezifische Affinität der Verbindung beibehält.
- Bevorzugte erfindungsgemäße Lanthanidchelate sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche 2 bis 11.
- Jeder der Substituenten Z&sub1; und Z&sub2; umfaßt zwei oder mehrere Heteroatome mit einem freien Elektronenpaar und angebracht in einer Entfernung von zwei oder drei Atomen voneinander. Beispiele für effiziente chelatbildende Heteroatome sind Amino- Stickstoffatome (primäre, sekundäre und tertiäre Amine), negativ geladene Sauerstoffatome, beispielsweise in Carboxylatanionen (COO&supmin;), Enolatanionen (C=C-O&supmin;), Phosphaten oder Phosphonaten. Eine andere gute Chelatbildungs-Struktur ist die Hydroxamatgruppe (CONOH). In den meisten Fällen enthält die Brücke zwischen zwei benachbarten chelatbildenden Heteroatomen 1, 2 oder 3 aliphatische Kohlenstoffatome. Unter besonders wichtigen Z'- und Z"-Strukturen können erwähnt werden N-Biscarboxymethylamino- und N-Biscarboxyethylaminogruppen, die analogen Phosphate (-N(-CH&sub2;-O-PO&sub3;²&supmin;)&sub2;) und Phosphonate (-N(-CH&sub2;-PO&sub3;²&supmin;)&sub2;) und 2,6-Dicarboxypiperidin-1-yl. Alternativ können Z&sub1; und Z&sub2; eine Brücke bilden, die die zwei äußeren Pyridinringe verbinden und eine makrocyclische chelatbildende Verbindung bilden. Bevorzugt ist eine solche Brücke -CH&sub2;N(CH&sub2;COO&supmin;)CH&sub2;- (Z' = Z" = NCH&sub2;COO&supmin;).
- In einigen erfindungsgemäßen Verbindungen können die Chelat- Heteroatome (N und 0) als entsprechende protonierte Formen und für 0 ebenfalls als Esterformen, wie Niedrigalkyl(C&sub1;-C&sub6;) oder Benzylester, vorliegen.
- Vom spektrofluorometrischen Standpunkt aus sind Z und Z' bevorzugt an Eu³&spplus;, Tb³&spplus;, Dy³&spplus; oder Sm³&spplus; chelatiert.
- X-Y bedeutet eine inerte organische Gruppe, worin X eine inerte und stabile Brücke ist und Y (a) eine funktionelle Gruppe oder (b) den Rest einer organischen Verbindung (Y') bedeutet, der die Eigenschaften aufweist, die in der Verbindung der Formel I (n = 1 oder 2) erhalten bleiben, nachdem sie kovalent an die Grundverbindung gekoppelt worden ist. Der obige Ausdruck "inert" bedeutet, daß die Gruppe oder Brücke, die mit diesem Adjektiv charakterisiert ist, kein effizientes Chelat-Heteroatom aufweist, das näher ist als es einer Entfernung von vier Atomen von den Heteroatomen entspricht, die bei der Chelatbildung eines gemeinsamen Metallions teilnehmen. In der tatsächlichen Praxis bedeutet dies, daß die vier Atome normalerweise durch eine Kette mit vier Kohlenstoffen dargestellt werden. "Stabil" bedeutet, daß die Brücke X nicht zerstört wird, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden. Beispielsweise erleidet die Brücke nicht leicht eine Hydrolyse. In der Formel I existiert X-Y als Substituent, der Wasserstoff in einer Z&sub1;- und/oder Z&sub2;-Gruppe, bevorzugt in einer Z'- und/oder Z"-Gruppe, oder Wasserstoff in einer oder beiden Gruppen X&sub1;-X&sub5; ersetzt.
- X kann mindestens ein Strukturelement, ausgewählt unter den folgenden, enthalten: -NR- (sekundäres und tertiäres Amin), -CONR- und -NRCO- (substituiertes Amid), -S-S- (aliphatisches Disulfid), -S- (aliphatischer Thioether), -O- (Ether), -COOund -OOC- (Ester) und -N=N- (Diaza) und eine reine Kohlenwasserstoffkette, die geradkettig, verzweigtkettig oder cyclisch sein kann und von 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthält. Die Kohlenwasserstoffkette kann rein aliphatisch oder rein aromatisch sein (einschließlich Phenyl, Naphthyl, Chinolyl, Pyridyl und Bipyridyl), und andere inerte funktionelle Gruppen, die nicht bei der oben erwähnten Chelatbildung teilnehmen, können vorhanden sein. Das Symbol R in dem obigen substituierten Amid stellt bevorzugt Wasserstoff dar, es kann jedoch Alkyl sein, beispielsweise Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen. Y kann aus zwei Hauptkategorien (den folgenden A und B) ausgewählt werden:
- A) Y kann der Rest einer organischen Verbindung (Y') sein, der bestimmte Eigenschaften aufweist, die im wesentlichen in der Verbindung der Formel I (n = 1 oder 2) erhalten bleiben. Die Verbindung Y' kann ein biologisch aktives Molekül sein, das die Fähigkeit aufweist, an biospezifischen Affinitätsreaktionen zu partizipieren, wie zwischen Antigenen (Haptenen) und den aktiven homologen Antikörperkomponenten, Nukleotiden, Oligonukleotiden, komplementären Nukleinsäuren (RNA, DNA), Lectinen und Kohlehydrat-Strukturen, Protein A und IgG usw. Diese Art von biologisch aktiven Molekülen wird oft als Zielsubstanzen (Zielmoleküle) bezeichnet. Üblicherweise wurden sie oder können leicht in Derivate überführt werden, die funktionelle Gruppen enthalten, die eine Konjugation an verschiedene Arten von Verbindungen erlauben. Die Verbindung (Y') kann ebenfalls eine multifunktionelle organische Verbindung sein, die durch eine ihrer funktionellen Gruppen an die Brücke X gebunden ist, so daß mindestens eine ihrer verbleibenden funktionellen Gruppen für eine weitere Derivatbildung frei ist.
- B) Y kann eine funktionelle Gruppe sein, die so ausgewählt wird, daß sie chemisch mit der funktionellen Gruppe A der organischen Verbindung (Y') reagieren kann, so daß eine kovalente Bindung zwischen Y' und einer Verbindung der Formel I (n = 1 oder 2) gebildet wird. Die Auswahl von Y hängt von A und umgekehrt ab, es wird aber angenommen, daß jeder Fachmann die gegenseitig reaktiven Gruppen auf geeignete Weise auswählen kann. Y und A können unter elektrophilen und nukleophilen Gruppen ausgewählt werden. Wenn sie ein Paar elektrophiler Gruppen oder ein Paar nukleophiler Gruppen sind, ist es beispielsweise möglich, (a) eine oxidative Kupplung für die Bildung der Bindung zu verwenden (beispielsweise -SH + HS- --- -S-S-) oder (b) eine der Gruppen des Paars chemisch in eine Gruppe des entgegengesetzten Typs umzuwandeln. Ein Beispiel für den letzteren Fall ist die Aktivierung mit bifunktionellen Kupplungsreagentien (ebenfalls als Aktivierungsreagentien bezeichnet). Wenn Y nukleophil und A elektrophil oder umgekehrt sind, können diese zwei Gruppen üblicherweise miteinander ohne vorhergehende Aktivierung umgesetzt werden. Die meisten nukleophilen Gruppen enthalten ein Heteroatom mit einem Elektronenpaar, das für die Reaktion mit einem elektronendefizienten Atom (elektrophile Gruppe) verfügbar ist.
- Beispiele geeigneter funktioneller Gruppen umfassen Isothiocyanato, Bromacetamido, Iodacetamido, Succinamido, Pyridyldithio, Mercapto, Carboxyl und ihre aktiven Ester (beispielsweise N-Hydroxysuccinimido oder p-Nitrophenyl), Hydroxyl, Aldehyd, Amino, Diazonium, Tosyl, Mesitylyl, Trexyl, Phosphodiester oder Phosphotriester. Andere funktionelle Gruppen sind dem Fachmann geläufig.
- Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen ist es zwingend, daß alle erwähnten Gruppen coexistieren können. Jedoch muß die reaktive Gruppe Y nicht notwendigerweise mit einer erfindungsgemäßen Chelat- bzw. chelatbildenden Gruppe coexistieren. Für einige Zwecke kann der Chelatbildungsteil des Moleküls vorübergehend geschützt sein, beispielsweise in Form eines Esters, so daß der geschützte Ligand mit dem Zielmolekül gekuppelt werden kann, und nach der Schutzgruppenabspaltung wird schließlich das gewünschte markierte Produkt gebildet. Die Schutzgruppe wird entsprechend gut bekannten Prinzipien ausgewählt [vgl. beispielsweise Protective Groups in Organic Synthesis; T.N. Greene; John Wiley & Sons Inc., USA (1981)]. Faktoren, die beachtet werden müssen, wenn die Gruppe ausgewählt wird, sind inter alia die Stabilität der Verbindung, mit der Y umgesetzt wird, die Reaktivität von Y und die Art der Struktur, die bei der Reaktion von Y gebildet wird, und die der gewünschten Verbindung.
- Die Beispiele in dieser Beschreibung erläutern gut bekannte Verfahren zur Einführung funktionalisierter Methylengruppen nächsten einem Pyridinkern. Diese Gruppen können anschließend mit Iminobisessigsäureestern unter Bildung von Chelatgruppen Z&sub1; und Z&sub2; umgesetzt werden. Phosphonatgruppen können entsprechend J. Org. Chem. 31 (1966) 1603 und Phosphatgruppen entsprechend Helv. Chim. Acta 70 (1987) 175 eingeführt werden. Für die Bildung von Chelaten mit unterschiedlichen Metallionen vergleiche Nucl. Med. Biol. 13 (1986) 311 und die dort genannten Literaturstellen. Vor der ersten Einreichung dieser Patentanmeldung gab es keine Publikation, in der irgendein gutes Verfahren zur Synthese von Iminobisessigsäureesterderivaten mit einem funktionalisierten Substituenten an der Methylengruppe der Acetylgruppierung beschrieben wurde. Ein synthetisches Verfahren wurde bei Wallac Oy, Finnland, entwickelt, und es wird in der vorliegenden Beschreibung in den Beispielen 37 bis 45 näher erläutert. Die so synthetisierten Derivate knnen mit 6,6"-Bishalogenmethylterpyridinen analog den Verfahren, wie sie in den folgenden Beispielen 34 bis 35 beschrieben werden, umgesetzt werden.
- Gemäß einer allgemeinen erfindungsgemäßen Ausführungsform können die neuen fluoreszierenden Chelate als Sonden in zeitlich versetzter Fluoreszenz-Spektrophotometrie verwendet werden. Gemäß einer Ausführungsform wird der Licht-absorbierende chelatbildende Molekülteil des Chelats als Fluoreszenzverstärker für Verfahren verwendet, bei denen im wesentlichen nichtfluoreszierende Eu³&spplus;-, Dy³&spplus;-, Sm³&spplus;- oder Tb³&spplus;-Chelate verwendet werden [vgl. beispielsweise die EP-A-64 484 (Wallac Oy) und die US-A-4 352 751 (Wieder)]. Eine andere Ausführungsform ist das zeitlich versetzte fluorometrische Verfahren, bei dem ein fluoreszierendes Lanthanidchelat als Sonde für die Bestimmung einer Zielsubstanz (Struktur) verwendet wird. Im allgemeinen umfassen diese Assayverfahren zwei Stufen: (i) die spezifische Markierung der Zielstruktur mit einem erfindungsgemäßen Lanthanidchelat (Sonde) (oder nur des chelatierenden Liganden, wenn das Ziel ein Lanthanidion ist, das mit dem Liganden ein fluoreszierendes Chelat bildet) und (ii) die Messung nach per se bekannten Verfahren der Fluoreszenz, die mit der Sonde im Zusammenhang steht. Assaysysteme, bei denen biospezifische Affinitätsreaktionen verwendet werden, wie sie im Einführungsteil beschrieben wurden, sind eines der wichtigsten Systeme, die unter diese Definition fallen. Entsprechend können andere Stufen vorgesehen sein und vor oder nach den Stufen (i) und (ii) durchgeführt werden [vgl. ebenfalls die US-A-4 058 732 (Wieder)].
- Die Erfindung wird jetzt anhand der Synthese verschiedener erfindungsgemäßer Verbindungen erläutert.
- Die Strukturen und die im Versuchsteil verwendeten synthetischen Wege sind in den Reaktionsschemata 1 bis 3 dargestellt. In den Schemata 1 und 2 werden Terpyridinverbindungen mit ein oder mehreren 4'- bzw. 4- und 4"-Substituenten erläutert. Durch geeignete Auswahl von R¹ in den Ausgangsverbindungen werden Substituenten eingeführt, die entweder die direkte Kupplung oder die Kupplung unter Verwendung von üblichen bifunktionellen Kupplungsreagentien an biologisch aktive Moleküle, die in biospezifischen Affinitätsreaktionen partizipieren, erlauben. Beispiele solcher Gruppen sind nukleophile Gruppen (primäres Amino, Isothiocyanato usw.). In dem Schema 3 wird die Synthese von Iminobisessigsäurederivaten erläutert, die zur Bildung der Chelatgruppen Z&sub1; und Z&sub2; (der Formel I) verwendet werden können. Die Derivate enthalten eine reaktive Gruppe, die an der Chelatbildung nicht teilnehmen kann, die aber verwendet werden kann, um ein biologisch aktives Molekül des Typs, wie er oben beschrieben wurde, kovalent an die Terpyridinstruktur zu binden. Schema 1 Schema 2 Schema 3
- 2-Acetylpyridin (1,82 g; 15,0 mmol) und 3-Nitrobenzaldehyd (2,27 g; 15,0 mmol) wurden zu einer Lösung aus KOH (0,67 g; 12,0 mmol) in Wasser (6 ml) und Methanol (54 ml) gegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt, wonach die Prazipitation des Produkts beendet war. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Methanol gewaschen.
- Ausbeute: 93%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 7,52-7,55 (1H, m); 7,62 (1H, t, J=8 Hz); 7,91 (1H, dt, J=8 Hz und 2 Hz); 7,94 (1H, d, J=16 Hz); 8,01 (1H, d, J=8 Hz); 8,21 (1H, d, J=8 Hz); 8,26 (1H, dd, J=8 Hz und 2 Hz); 8,44 (1H, d, J=16 Hz); 8,59 (1H, s); 8,78 (1H, d, J=5 Hz).
- Diese Verbindung wurde unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der in Beispiel 1, 3b, beschriebenen Synthese war. Das Rohprodukt wurde aus Ethanol kristallisiert.
- Ausbeute: 68%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 7,52-7,56 (1H, m); 7,87 (2H, d, J=9 Hz); 7,91 (1H, dt, J=8 Hz und 2 Hz); 7,92 (1H, d, J=16 Hz); 8,21 (1H, d, J=8 Hz); 8,27 (2H, d, J=9 Hz); 8,43 (1H, d, J=16 Hz); 8,76 (1H, d, J=5 Hz).
- 2-Acetylpyridin (1,21 g; 10,0 mmol) und Iod (2,54 g; 10, mmol) wurden am Rückfluß in Pyridin (12 ml) 1 Stunde lang erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt, und der dunkle Niederschlag wurde abfiltriert und mit Pyridin gewaschen.
- Ausbeute: 72%
- ¹H-NMR (DMSO): 6,51 (2H, s); 7,82-7,85 (1H, m); 8,08 (1H, d, J=7 Hz); 8,14 (1H, dt, J=8 und 2 Hz); 8,28 (2H, t, J=8 Hz); 8,73 (1H, t, J=8 Hz); 8,87 (1H, d, J=5 Hz); 9,00 (2H, d, J=6 Hz).
- 1-(2-Pyridyl)-3-(3-nitrophenyl)-2-propenon (2,54 g; 10,0 mmol) und 1-(2-Pyridylcarbonylmethyl)pyridiniumiodid (3,26 g; 10,0 mmol) und Ammoniumacetat (4,82 g; 60,0 mmol) wurden am Rückfluß in Essigsäure (37 ml) 1,5 Stunden lang erhitzt, wonach die Lösung gekühlt wurde und der Niederschlag filtriert und mit Essigsäure gewaschen wurde. Das Rohprodukt wurde aus Acetonitril kristallisiert.
- Ausbeute: 56%
- ¹H-NMR (DMSO): 7,54-7,58 (2H, m); 7,89 (1H, t, J=8 Hz); 8,06 (2H, dt, J=8 Hz und 2 Hz); 8,38-8,41 (1H, m); 8,41-8,44 (1H, m); 8,66 (1H, t, J=2 Hz); 8,70 (2H, d, J=8 Hz); 8,78-7,80 (4H, m).
- Diese Verbindung wurde unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der Synthese war, wie sie in Beispiel 4, 6c beschrieben wurde. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Kieselsäure, Chloroform mit Methanol- Gradient) gereinigt.
- Ausbeute: 56%
- ¹H-NMR (DMSO): 7,53-7,56 (2H, m); 8,05 (2H, dt, J=8 Hz und 2 Hz); 8,22 (2H, d, J=9 Hz); 8,40 (2H, d, J=9 Hz); 8,68 (2H, d, J=8 Hz); 8,76 (2H, s); 8,77 (2H, d, J=5 Hz).
- 2,2';6',2"-Terypridin (0,94 g; 4,0 mmol) wurde in Dichlormethan (80 ml) gelöst, und m-Chlorperbenzoesäure (2,60 g; 15,1 mmol) wurde zugegeben. Nach dem Rühren über Nacht wurde etwas Dichlormethan zugegeben, und die Lösung wurde mit 10%igem Natriumcarbonat gewaschen. Die Dichlormethan-Phase wurde verdampft und durch Flashchromatographie (Kieselsäure, Chloroform mit Methanol-Gradient) gereinigt.
- Ausbeute: 93%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 7,31 (2H, dd, J=2 und 7 Hz); 7,40 (2H, dd, J=1 und 8 Hz); 7,98 (1H, t, J=8 Hz); 8,20 (2H, dd, J=2 und 8 Hz); 8,37 (2H, dd, J=1 und 7 Hz); 8,94 (2H, d, J=8 Hz). UV (λmax in Ethanol): 241, 279.
- Diese Verbindung wurde unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der Synthese war, wie sie in Beispiel 6, 7a, beschrieben wurde. Das Rohprodukt wurde durch Kristallisation aus einem Gemisch aus Acetonitril und Methanol gereinigt.
- Ausbeute: 51%
- ¹H-NMR (DMSO): 7,52-7,58 (4H, m); 8,11 (2H, dd, J=7 Hz und 2 Hz); 8,26-8,28 (2H, m); 8,41-8,46 (4H, m); 9,16 (2H, s).
- Diese Verbindung wurde unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der Synthese war, wie sie in Beispiel 6, 7a, beschrieben wurde. Das Rohprodukt wurde durch Kristallisation aus einem Gemisch aus Ethanol und Chloroform gereinigt.
- Ausbeute: 78%
- ¹H-NMR (DMSO): 7,52-7,58 (4H, m); 7,89 (1H, t, J=8 Hz); 8,25- 8,28 (2H, m); 8,31 (1H, d, J=8 Hz); 8,38 (1H, dd, J=8 Hz und 1 Hz); 8,43-8,45 (2H, m); 8,61 (1H, t, J=2 Hz); 9,17 (2H, s).
- 2,2';6',2"-Terpyridin-N,N"-dioxid (7a) (0,96 g; 3,6 mmol) wurde in Dichlormethan (10 ml) suspendiert. N,N-Dimethylcarbamylchlorid (0,95 g; 8,8 mmol) und Trimethylsilylcyanid (1,26 g; 12,7 mmol) wurden zugegeben. Nach dem Rühren während zwei Wochen bei Raumtemperatur wurde 10%iges Kaliumcarbonat zugegeben, bis die Lösung neutral war. Die Phasen wurden getrennt, und die Wasserphase wurde mit Chloroform extrahiert. Das Chloroform wurde verdampft, und der Rückstand wurde aus einem Gemisch aus Acetonitril und Tetrahydrofuran kristallisiert.
- Ausbeute: 65%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 7,75 (2H, d, J=8 Hz); 8,01 (2H, t, J=8 Hz); 8,05 (1H, t, J=8 Hz); 8,58 (2H, d, J=8 Hz); 8,82 (2H, d, J=8 Hz).
- UV (λmax in Ethanol): 215, 250, 291.
- Diese Verbindung wurde unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der Synthese war, wie sie in Beispiel 9, 8a, beschrieben wurde. Das Rohprodukt wurde durch Kristallisation aus einem Gemisch aus Acetonitril und Tetrahydrofuran gereinigt.
- Ausbeute: 56%
- ¹H-NMR (DMSO): 8,22 (2H, dd, J=8 Hz und 1 Hz); 8,30 (2H, d, J=9 Hz); 8,33 (2H, t, J=8 Hz); 8,43 (2H, d, J=9 Hz); 8,77 (2H, s,); 8,01 (2H, dd, J=8 Hz und 1 Hz).
- Diese Verbindung wurde unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der Synthese war, wie sie in Beispiel 9, 8a, beschrieben wurde. Das Rohprodukt wurde durch Kristallisation aus einem Gemisch aus Acetonitril und Tetrahydrofuran gereinigt.
- Ausbeute: 71%
- ¹H-NMR (DMSO): 7,90 (1H, t, J=8 Hz); 8,22 (2H, dd, J=8 Hz und 1 Hz); 8,33 (2H, t, J=8 Hz); 8,41-8,45 (1H, m); 8,47-8,72 (1H, m); 8,72 (1H, s); 8,77 (2H, s); 9,00 (2H, d, J=8 Hz).
- Die Verbindung 8a (0,55 g; 1,9 mmol) wurde in trockenem Tetrahydrofuran (15 ml) suspendiert. Durch die Suspension wurde Stickstoff durchperlen gelassen. Ein Borantetrahydrofuran- Komplex (1 M; 25 ml; 25,0 mmol) wurde langsam zugegeben. Nach dem Rühren über Nacht wurde das extra Boran durch Zugabe von Methanol zerstört. Das Gemisch wurde zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde in Ethanol (30 ml), welches mit Chlorwasserstoffsäure gesättigt war, gelöst. Nach dem Rühren während 1 Stunde wurde die Lösung abgekühlt und das Produkt filtriert.
- Ausbeute: 54%
- ¹H-NMR (D&sub2;O): 4,68 (4H, s); 7,89 (2H, d, J=8 Hz); 8,31 (2H, t, J=8 Hz); 8,51 (2H, d, J=8 Hz); 8,82 (2H, d, J=8 Hz); 8,90 (1H, t, J=8 Hz).
- UV (λmax in H&sub2;O): 232, 293.
- Diese Verbindung wurde unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der Synthese war, wie sie in Beispiel 12, 9a beschrieben wurde. Das Rohprodukt wurde nicht gereinigt, und daher konnten keine genauen NMR-Werte erhalten werden. Das Rohprodukt wurde als solches bei der nächsten Stufe verwendet.
- Ausbeute: 56% Rohprodukt
- Diese Verbindung wurde unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der Synthese war, wie sie in Beispiel 12, 9a, beschrieben wurde. Das Rohprodukt wurde bei der nächsten Stufe ohne weitere Reinigungen verwendet.
- Ausbeute: 61% Rohprodukt
- Die Verbindung 9a (0,43 g; 0,9 mmol), Acetonitril (15 ml), trockenes Natriumcarbonat (2,00 g) und der t-Butylester von Bromessigsäure (1,44 g; 7,4 mmol) wurden 2 Stunden lang am Rückfluß erhitzt, und dann wurden die Salze abfiltriert. Die organische Phase wurde verdampft und durch Flashchromatographie (Kieselsäure, Chloroform) gereinigt.
- Ausbeute: 38%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,48 (36H, s); 3,56 (8H, 5); 4,15 (4H, s); 7,66 (2H, d, J=8 Hz); 7,84 (2H, t, J=8 Hz); 7,90 (1H, t, J=8 Hz); 8,47 (2H, d, J=8 Hz); 8,50 (2H, d, J=8 Hz)
- UV (λmax in Ethanol): 235, 288.
- Die entsprechende Nitroverbindung wurde aus 9b und dem Ethylester von Bromessigsäure unter Verwendung eines Verfahrens, das analog war zu der Synthese, die für 10a beschrieben wurde, synthetisiert. Das Produkt wurde durch Flashchromatographie (Kieselsäure, Chloroform mit Methanolgradient) gereinigt.
- Ausbeute: 20%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,25 (12H, t, J=7 Hz); 4,18 (8H, q, J=7 Hz); 3,71 (8H, 5); 4,23 (4H, s); 7,66 (2H, dd, J=8 Hz und 2 Hz); 7,90 (2H, t, J=8 Hz); 8,06 (2H, d, J=9 Hz); 8,42 (2H, d, J=9 Hz); 8,57 (2H, dd, J=8 Hz und 2 Hz); 8,76 (2H, s).
- Die Aminoverbindung 10b wurde aus der entsprechenden Nitroverbindung unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der für 10c beschriebenen Synthese war.
- Ausbeute: 16%
- Die entsprechende Nitroverbindung wurde aus 9c und dem Ethylester von Bromessigsäure unter Verwendung eines Verfahrens, das analog war zu der Synthese, die für 10a beschrieben wurde, synthetisiert. Das Produkt wurde durch Flashchromatographie (Kieselsäure, Chloroform mit Methanolgradient) gereinigt.
- Ausbeute: 53%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 1,24 (12H, t, J=8 Hz); 4,17 (8H, q, J=8 Hz); 3,69 (8H, s); 4,23 (4H, s); 7,67 (2H, dd, J=8 Hz und 2 Hz); 7,89 (2H, t, J=8 Hz); 7,85- 8,30 (4H, m); 8,57 (2H, dd, J=8 Hz und 2 Hz); 8,75 (2H, s).
- Die Aminoverbindung 10c wurde aus der entsprechenden Nitroverbindung (50 mg; 0,07 mmol) synthetisiert, welche in Methanol (2 ml) gelöst wurde. 10%iges Palladium auf Kohle (10 mg) wurde zugegeben, gefolgt von der langsamen Zugabe von Natriumborhydrid (4 mg; 0,1 mmol). Nach 1 Stunde wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und die Lösung wurde verdampft. Der Rückstand wurde in einer 0,1 M Natriumhydroxid-Lösung gelöst, und das Produkt wurde mit Chloroform aus der Wasserphase extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde durch Flashchromatographie gereinigt (CHCl&sub3;/MeOH; 10:0,5).
- Ausbeute: 79%
- Der Tetraester (10a) (260 mg; 0,4 mmol) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst. Nach 2 Stunden wurde die Trifluoressigsäure verdampft, etwas Diethylether wurde zugegeben, und das Produkt wurde filtriert.
- Ausbeute: 87%
- ¹H-NMR (DMSO): 3,99 (8H, s); 4,47 (4H, s); 7,65 (2H, d, J=8 Hz); 8,10 (2H, t, J=8 Hz); 8,11 (1H, t, J=8 Hz); 8,48 (2H, d, J=8 Hz); 8,61 (2H, d, J=8 Hz).
- UV (λmax in Wasser): 237, 288, 305.
- Diese Verbindung wurde unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der Synthese war, wie sie in Beispiel 20, 11c, beschrieben wurde.
- Ausbeute: 100%
- ¹H-NMR (DMSO): 3,82 (8H, s); 4,31 (4H, s); 6,90 (2H, d, J=7 Hz); 7,67 (2H, d, J=8 Hz); 7,80 (2H, d, J=9 Hz); 8,08 (2H, t, J=8 Hz); 8,60 (2H, d, J=8 Hz); 8,67 (2H, s).
- Der entsprechende Tetraester 10c (0,10 g; 0,17 mmol) wurde in 5 ml einer 0,5 M KOH/EtOH-Lösung gelöst. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Ethanol zur Trockene eingedampft, und Wasser wurde zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt, wonach das Produkt mit 2 M Chlorwasserstoffsäure präzipitierte.
- Ausbeute: 100%
- ¹H-NMR (DMSO): 3,74 (8H, s); 4,27 (4H, s); 7,71 (2H, d, J=7 Hz); 7,87 (1H, t, J=8 Hz); 8,09 (2H, t, J=7 Hz); 8,33 (1H, d, J=8 Hz); 8,62 (1H, d, J=8 Hz); 8,63 (2H, d, J=7 Hz); 8,79 (2H, s); 8,83 (1H, s).
- 2,6-Diacetylpyridin (8,16 g; 50,0 mmol) und Iodid (25,38 g; 100,0 mmol) wurden am Rückfluß in Pyridin (125 ml) während 2 Stunden erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt, und das braune kristalline Pyridiniumsalz (13) wurde durch Filtration abgetrennt.
- Ausbeute: 87%
- Eine Lösung von 13 (2,86 g; 5,0 mmol), 2-Oxo-4-phenyl-3- butensäure (1,76 g; 10,0 mmol) und Ammoniumacetat (8,86 g; 115,0 mmol) in Essigsäure (50 ml) wurde 5 Stunden lang am Rückfluß erhitzt, wonach die braune Lösung abgekühlt wurde. Das feste Material wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet. Das Ammoniumsalz von 2 wurde in Wasser gelöst und mit 6 M HCl (pH etwa 1) angesäuert. Das Produkt wurde filtriert und mit Wasser gewaschen.
- Ausbeute: 34%
- Fp.: 279ºC (Zers.)
- ¹H-NMR (DMSO): 7,56-8,06 (10H, m); 8,27 (1H, t); 8,40 (2H, d); 8,70 (2H, d); 9,18 (2H, d).
- IR (KBr): 1760, 1715, 1695, 1420, 1365, 1272 cm&supmin;¹ (C=O und C-O).
- Die Verbindung 16b wurde aus 13 und 15b unter Verwendung eines Verfahrens synthetisiert, das analog zu der für 16a beschriebenen Synthese war.
- Ausbeute: 57%
- ¹H-NMR (DMSO): 8,24 (1H, t); 8,28 (4H, d); 8,37 (4H, d); 8,43 (2H, d); 8,65 (2H, d); 9,13 (2H, d).
- Die Verbindung 16c wurde aus 13 und 15c unter Verwendung eines Verfahrens, das analog zu der für 16a beschriebenen Synthese war, synthetisiert.
- Ein Tropfen konz. Schwefelsäure wurde zu der Suspension von 16a (0,77 g; 1,6 mmol) in Methanol (5 ml) gegeben. Das Gemisch wurde am Rückfluß während 24 Stunden erhitzt. Das kalte Gemisch wurde filtriert, und das Produkt wurde aus Dichlormethan kristallisiert.
- Ausbeute: 61%
- Fp.: 285,5 - 286,5ºC
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 4,13 (6H, s); 7,49-7,88 (10H, m); 8,07 (1H, t); 8,44 (2H, d); 8,67 (2H, d); 9,07 (2H, d).
- IR (KBr): 1741, 1725, 1255, 1144 cm&supmin;¹ (C=O und C-O).
- Die Verbindung 17b wurde aus 16b unter Verwendung eines Verfahrens, das analog zu der für 17a beschriebenen Synthese war, synthetisiert.
- Ausbeute: 45%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 4,05 (6H, s); 7,80-9,03 (15H, m).
- IR (KBr): 1740, 1250, 1125 cm&supmin;¹ (C=O und C-O), 1525, 1345 cm&supmin;¹ (NO&sub2;).
- Die Verbindung 17c wurde aus 16c unter Verwendung eines Verfahrens, das zu der für 17a beschriebenen Synthese analog war, synthetisiert.
- Ausbeute: 38%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 4,05 (3H, s); 4,09 (3H, s); 7,75-8,97 (15H, m).
- IR (KBr): 1725, 1260, 1130 cm&supmin;¹ (C=O und C-O), 1530, 1340 cm&supmin;¹ (NO&sub2;).
- Natriumborhydrid (0,13 g; 3,5 mmol) wurde zu einer Suspension von 17a (0,40 g; 0,8 mmol) in absolutem Ethanol (10 ml) gegeben. Nach dem Rühren während 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Gemisch am Rückfluß 15 Stunden lang erhitzt. Die Lösung wurde im Vakuum eingedampft. Eine gesättigte Lösung von Natriumhydrogencarbonat (5 ml) wurde zu dem Rückstand gegeben. Nachdem die Lösung zum Sieden gebracht worden war, wurde Wasser (15 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht in der Kälte stehengelassen. Der Niederschlag wurde filtriert, an der Luft getrocknet und schließlich aus Methanol kristallisiert.
- Ausbeute: 47%
- Fp.: 218 - 219 ºC
- ¹H-NMR (DMSO): 4,75 (4H, s); 7,52-7,95 (10H, M); 7,86 (2H, d); 8,14 (1H, t); 8,49 (2H, d); 8,81 (2H, d).
- Die Verbindung 18b wurde aus 17b unter Verwendung eines Verfahrens, das analog zu der für 18a beschriebenen Synthese war, synthetisiert.
- Ausbeute: 40%
- Die Verbindung 18c wurde aus 17c unter Verwendung eines Verfahrens, das analog zu der für 18a beschriebenen Synthese war, synthetisiert.
- Ausbeute: 56%
- ¹H-NMR (DMSO): 4,98 (4H, s); 7,86-9,13 (15H, m). IR (KBr): 1530, 1350 cm&supmin;¹ (NO&sub2;).
- Eine Lösung aus Phosphortribromid (0,12 g; 0,4 mmol) in Chloroform (1 ml) wurde zu einer Lösung aus 18a (0,13 g; 0,3 mmol) in Chloroform (17 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 11 Stunden lang am Rückfluß erhitzt, wonach das Gemisch mit 5%igem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert wurde. Die wäßrige Schicht wurde mit Chloroform (3 x 20 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde aus Dichlormethan kristallisiert.
- Ausbeute: 29%
- Fp.: 253,5 - 255,5ºC
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 4,73 (4H, s); 7,47-7,81 (10H, m); 7,73 (2H, dm); 8,01 (1H, t); 8,57 (2H, d); 8,79 (2H, d).
- Die Verbindung 19b wurde aus 18b unter Verwendung eines Verfahrens, das analog zu der für 19a beschriebenen Synthese war, synthetisiert.
- Ausbeute: 37%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 4,75 (4H, s); 7,40-8,70 (15H, m).
- Die Verbindung 19c wurde aus 18c unter Verwendung eines Verfahrens, das analog zu der für 19a beschriebenen Synthese war, synthetisiert.
- Ausbeute: 50%
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 4,78 (2H, s); 4,83 (2H, s); 7,48-8,65 (15H, m).
- Kaliumcarbonat (120 mg; 0,9 mmol) wurde zu einem Gemisch von 19a (47 mg; 0,08 mmol) und Di-t-butyliminodiacetat (41 mg; 0,20 mmol) in trockenem Acetonitril (5 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand wurde mit Chloroform (10 ml) gerührt, mit Wasser (2 x 10 ml) gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Das Verdampfen ergab ein Öl, welches durch das NMR-Spektrum charakterisiert wurde. Das Öl wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst und bei Raumtemperatur 16 Stunden lang gehalten. Die Trifluoressigsäure wurde im Vakuum verdampft, und der feste Rückstand wurde mit Ethylether verrieben.
- Ausbeute: 59%
- ¹H-NMR (DMSO): 3,71 (8H, s); 4,27 (4H, s); 7,54-7,96 (10H, m); 8,04 (2H, d); 8,18 (1H, t); 8,51 (2H, d); 8,85 (2H, d).
- IR (KBr): 1734, 1630, 1395, 1200 cm&supmin;¹ (C=O und C-O).
- Die Umsetzung zwischen 19b (0,11 g; 0,2 mmol) und Diethyliminodiacetat (76 mg; 0,40 mmol) in trockenem Acetonitril (10 ml) und Kaliumcarbonat (0,27 g; 20 mmol) erfolgte analog, wie für 20a beschrieben. Die Reaktion ergab ein Öl, welches durch Flashchromatographie (Kieselsäure, MeOH/CHCl&sub3;; 1:19) gereinigt wurde. Das Öl wurde in Methanol (5ml) gelöst, 10%iges Palladium auf Kohle (20 mg) wurde zugegeben, und dann wurde Natriumborhydrid (23 mg; 0,60 mmol) zugegeben. Nach 1 Stunde wurde das Gemisch filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in 0,5 M Kaliumhydroxid/Ethanol (20 ml) gelöst. Nach dem Rühren während 3 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Gemisch verdampft, und Wasser (20 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde mit 6 M HCl (pH etwa 2,0) angesäuert. Das Produkt wurde filtriert und mit Wasser gewaschen.
- Ausbeute: 60%
- ¹H-NMR (DMSO): 3,71 (8H, s); 4,30 (4H, s); 7,75-8,80 (15H, m).
- IR (KBr): 1735, 1630, 1400, 1200 cm&supmin;¹ (C=O und C-O).
- Die Verbindung 20c wurde aus 19c unter Verwendung eines Verfahrens, das analog zu der für 20b beschriebenen Synthese war, synthetisiert.
- Ausbeute: 79%
- ¹H-NMR (DMSO): 3,68 (8H, s); 4,21 (4H, s); 7,63-8,64 (15H, m).
- IR (KBr): 1725, 1630, 1400, 1190 cm&supmin;¹ (C=O und C-O).
- Thionylchlorid (5,0 ml; 8,06 g; 68 mmol) wurde tropfenweise zu 500 ml eisgekühltem trockenem Ethanol gegeben. Das gerührte Gemisch wurde 20 Minuten lang bei dieser Temperatur gehalten, und L-Lysinhydrochlorid (20 g; 109 mmol) wurde zugegeben.
- Das Gemisch wurde dann 3 Stunden lang am Rückfluß erhitzt und auf ein Volumen von etwa 200 ml konzentriert. 200 ml Diethylether wurden zugegeben, und das kristallisierte Produkt wurde abfiltriert.
- Ausbeute: 29 g (97%) Dihydrochlorid; Rf=0,20 (System F)
- L-Lysin-HCl (5 g; 27,4 mmol) wurde in 50 ml Wasser aufgelöst und mit 5 M NaOH auf pH 10,5 titriert. 4-Nitrobenzoylchlorid (6,6 g; 36 mmol) in Dioxan (50 ml) und 5 M NaOH wurden langsam zugegeben, um das heftig gerührte Reaktionsgemisch bei pH 10,5 zu halten.
- Nach Beendigung der Zugabe und dem Verschwinden der rosa Farbe wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl auf pH 2 angesäuert und viermal mit Diethylether extrahiert. Die wäßrige Phase wurde zur Trockene konzentriert, zweimal mit 200 ml trockenem Ethanol coverdampft und in 250 ml trockenem Ethanol, welches zuvor mit 10 ml Thionylchlorid behandelt worden war, suspendiert. Das Gemisch wurde 3 Stunden lang am Rückfluß erhitzt, filtriert und eingedampft. Das verbleibende Material wurde zwischen gesättigtem Natriumbicarbonat und Chloroform/Ethanol (1:1) verteilt, und die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, wobei ein Rohprodukt erhalten wurde, welches durch Flashchromatographie unter Verwendung von 5% EtOH/Chloroform als Eluierungsmittel gereinigt wurde.
- Ausbeute: 1,08 g (12%) Öl, welches beim Stehen kristallisiert; Rf=0,23 (System A)
- ¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 8,25 (d, 2H, J=9 Hz); 7,93 (d, 2H, J=9 Hz); 6,87 (s, breit, 1H); 3,99- 4,34 (q, 2H); 3,30-3,60 (m, 3H); 1,40-1,75 (m, 8H); 1,11-1,37 (t, 3H).
- Die Verbindung (37) (0,54 g; 1,7 mmol) wurde mit Toluol coverdampft, in trockenem Acetonitril (10 ml) gelöst, und Bromessigsäuremethylester (0,265 g; 1,7 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von pulverisiertem trockenem Natriumcarbonat (2,0 g). Das Gemisch wurde 3 Stunden lang am Rückfluß erhitzt.
- Die Filtration der anorganischen Salze und das Verdampfen des Acetonitrils ergab ein öliges Produkt, welches durch Flashchromatographie gereinigt wurde.
- Ausbeute: 0,45 g (68%) Öl; Rf=0,26 (System A)
- ¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 8,25 (d, 2H, J=9 Hz); 7,93 (d, 2H, J=9 Hz); 6,63 (s, breit, 1H); 3,95- 4,30 (q, 2H); 3,68 (s, 3H); 3,30-3,60 (m, 3H); 1,40-1,75 (m, 7H); 1,11-1,37 (t, 3H).
- Trockenes Triethylamin (1,8 ml; 18 mmol) wurde zu einer Suspension der Ausgangsverbindung (Schema 3) (1,5 g; 6 mmol) in 20 ml trockenem Pyridin gegeben. Zu diesem Gemisch, welches bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde festes Monomethoxytritylchlorid (1,96 g; 6 mmol) (MMTrCl) in kleinen Teilchen während einer Zeit von 1 Stunde zugegeben, wonach das Gemisch weitere 2 Stunden lang gerührt wurde. Eine Standard-Natriumbicarbonat-Aufarbeitung, gefolgt von der Extraktion mit Chloroform, ergab ein mit α-MMTr-Isomeren verunreinigtes Rohprodukt.
- Die reine Titelverbindung konnte leicht durch Flash-Säulenchromatographie, bedingt durch den großen Rf-Unterschied zwischen den Isomeren, isoliert werden.
- Ausbeute: 1,35 g (48%) Öl; Rf=0,43 (System A) ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,5-6,75 (m, 14H); 4,18-4,13 (q, 2H); 3,78 (s, 3H); 3,45-3,37 (m, 1H); 2,14-2,10 (t, 2H, J=7 Hz); 1,75-1,35 (m, 9H); 1,26 (t, 3H).
- Ein teilweise geschütztes L-Lysinderivat (39) (1,0 g; 2,13 mmol) wurde zu dem Produkt (40) unter Verwendung des in Beispiel 36 beschriebenen Verfahrens umgewandelt.
- Ausbeute: 0,81 g (70%) Öl; Rf=0,73 (System A)
- ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,46-6,77 (m, 14H); 4,19-4,14 (q, 2H); 3,77 (s, 3H); 3,70 (s, 3H); 3,31-3,45 (q, 2H); 3,22-3,25 (t, 1H); 2,09-2,12 (t, 2H); 1,35- 1,70 (m, 6H); 1,23-1,27 (t, 3H).
- Die Ausgangsverbindung (Schema 3) (2,0 g; 8,1 mmol) wurde in 10 ml trockenem Ethanol gelöst und mit trockenem Triethylamin (4,09 g; 40,4 mmol) behandelt. Ethyltrifluoracetat (1,5 g; 10,5 mmol) wurde zu der gebildeten gerührten Suspension zugegeben, und das Gemisch wurde 6 Stunden lang am Rückfluß erhitzt.
- Alle flüchtigen Stoffe wurden dann verdampft, und der Rückstand wurde zwischen gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und Chloroform/Ethanol (1:1) verteilt.
- Die vereinigte organische Phase (5 x 60 ml) wurde verdampft, mit Toluol coverdampft und flashchromatographiert, wobei das Titelprodukt in Form eines farblosen Öls erhalten wurde.
- Ausbeute: 1,9 g (87%); Rf=0,72 (System D)
- ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,10 (t, 1H, austauschbar); 4,21- 4,16 (q, 2H); 3,45-3,40 (m, 1H); 3,38-3,31 (m, 2H); 1,84 (s, 2H, austauschbar); 1,82-1,40 (m, 6H); 1,28 (t, 3H).
- Das L-Lysinderivat (41) (1,0 g; 3,7 mmol) wurde in das Produkt (42) mittels eines Verfahrens überführt, das analog zu dem von Beispiel 36 war.
- Ausbeute: 1,05 g (83%) Öl; Rf=0,48 (System A)
- ¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;+CD&sub3;OD): 4,4-4,0 (q, 2H); 3,68 (s, 3H); 3,5-3,1 (m, 5H); 1,8-1,4 (m, 6H); 1,23 (t, 3H).
- Der L-Lysinethylester x 2 HCl (36) (2 g; 8,1 mmol) in 30 ml trockenem Ethanol wurde mit trockenem Triethylamin (5,63 ml; 40,5 mmol) und λ-Butyrolacton (0,7 g; 8,1 mmol) behandelt, und die entstehende Suspension wurde 3 Stunden lang am Rückfluß erhitzt.
- Das Verdampfen der flüchtigen Stoffe und das Coverdampfen mit Toluol ergab das Rohprodukt, welches durch Flashchromtographie unter Verwendung von 20% Methanol/Chloroform als Lösungsmittel gereinigt wurde.
- Ausbeute: 1,54 g (73%) Öl; Rf=0,28 (System D)
- ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;+CD&sub3;OD): 4,30-4,22 (q, 2H); 3,72-3,77 (m, 1H); 3,58-3,65 (t, 2H), 3,18-3,28 (m, 2H); 2,30-2,36 (t, 2H); 1,40-2,00 (m, 8H); 1,28-1,34 (t, 3H).
- Die relative Fluoreszenzausbeute rel der Europium- und Terbiumchelate der Verbindung 20a wurde in äquimolaren 10&supmin;&sup5; M- Lösungen der Verbindung 20a und des entsprechenden Lanthanidions gemessen. Die Fluoreszenzmessungen erfolgten auf einem Perkin-Elmer-LS-5 -Spektrofluorometer unter Verwendung der Phosphoreszenzeinstellung, welche erlaubte, daß die Zerfallskurven der Lanthanidfluoreszenz gemessen werden konnten Die Fluoreszenzausbeute wird relativ, bezogen auf die Fluoreszenz des nichtkomplexierten Lanthanidkations (Ln), unter Verwendung der Gleichung:
- rel = IcheCLnkLn/ILnCchekche
- angegeben, worin Iche und ILn die präexponentiellen Bedingungen der Emissions-Zerfallskurven für das chelatierte bzw. nichtkomplexierte Lanthanidkation bedeuten (614 nm für Europium und 544 nm für Terbium). Die Anregungs-Wellenlänge für das nichtkomplexierte Europium betrug 395 nm und für Terbium 370 nm. CLN und Cche sind die Konzentrationen des freien bzw. komplexierten Lanthanidkations und kLn und kche die ensprechenden Zerfallskonstanten. Für die Verbindung 20a betrug die relative Fluoreszenzausbeute für den Europiumkomplex 2,1x10&sup6; und für den Terbiumkomplex 8,1x10&sup4;. Die Anregungs-Wellenlänge für die Chelate war in beiden Fällen 340 nm.
Claims (11)
1. Lanthanidchelate, worin Eu³&spplus;, Tb³&spplus;, Sm³&spplus; oder Dy³&spplus; mit
einer Terpyridinverbindung der Struktur:
chelatiert ist, worin
(i) n = 1 oder 2;
(ii) X&sub1;, X&sub2;, X&sub3;, X&sub4; und X&sub5; Wasserstoff bedeuten;
(iii) Z&sub1; und Z&sub2; identisch sind und zu -CH&sub2;-Z' gleich
sind, wobei Z' ausgewählt wird aus -N(-CH&sub2;COO&supmin;)&sub2;,
-N(-CH&sub2;CH&sub2;COO&supmin;)&sub2;, -N(-CH&sub2;OPO&sub3;²&supmin;)&sub2;, -N(-CH&sub2;PO&sub3;²&supmin;)&sub2;,
-N(-CH&sub2;CH&sub2;PO&sub3;²&supmin;)&sub2;, 2,6-Dicarboxypiperidin-1-yl und
-N(-CH&sub2;COO&supmin;), überbrückend die Methylengruppen von -CH&sub2;-Z' in
Z&sub1; und Z&sub2;;
(iv) -X-Y ein Substituent ist, der Wasserstoff in Z'
oder in einer oder beiden Gruppen X&sub1;-X&sub5; ersetzt, wobei in dem
Substituent X-Y:
X kein wirksames chelatbildendes Heteroatom enthält,
das näher als in einer Entfernung von vier Atomen von den
Heteroatomen entfernt ist, die bei der Chelatbildung eines
gemeinsamen Metallions teilnehmen, und aus einer aromatischen
Gruppe besteht, ausgewählt aus Chinolyl, Pyridyl, Bipyridyl,
Phenyl, Naphthyl oder einer geradkettigen oder
verzweigtkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffkette, die 1 bis 12
Kohlenstoffatome enthält, wobei die Gruppe X ein oder mehrere
Strukturelement(e) enthalten kann, ausgewählt aus der Gruppe
bestehend aus -NR- (sekundäres und tertiäres Amin),
-CONR- und -NRCO- (substituiertes Amid), -S-S- (aliphatisches
Disulfid), -S- (aliphatischer Thioether), -O- (Ether), -COO- und
-OOC- (Ester) und -N=N- (Diaza), worin das Symbol R
Wasserstoff oder Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen
bedeutet; und
Y
(a) eine funktionelle Gruppe bedeutet, ausgewählt aus
Isothiocyanato, Bromacetamido, Iodacetamido,
Succinamido, Pyridyldithio, Mercapto, Carboxyl
und aktiven Estern, Hydroxyl, Aldehyd, Amino,
Diazonium, Tosyl, Mesitylyl, Trexyl,
Phosphodiestern und Phosphotriestern; oder
(b) einen Rest einer Verbindung bedeutet, die die
Fähigkeit besitzt, in biospezifischen
Affinitätsreaktionen zu partizipieren, wie zwischen
Antigenen (Haptenen) und den homologen aktiven
Antikörperkomponenten und komplementären Nucleinsäuren,
wobei der Rest die biospezifische Affinität der
Verbindung beibehält.
2. Chelat nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die reine Kohlenwasserstoffkette Phenyl oder
Naphthyl ist.
3. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch
gekennzeichnet, daß Y den Rest einer organischen
Verbindung bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Antigenen, Haptenen, Antikörpern und Nucleinsäuren.
4. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch
gekennzeichnet, daß Y eine funktionelle Gruppe,
wie in Anspruch 1 unter Punkt (a) definiert, bedeutet.
5. Chelat nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß n = 1; X&sub2;, X&sub3; und X&sub4; Wasserstoff bedeuten; Z'
-N(CH&sub2;COO&supmin;)&sub2; bedeutet; und -X-Y 4-Aminophenyl bedeutet,
welches X&sub3; ersetzt.
6. Chelat nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß n = 1; X&sub2;, X&sub3; und X&sub4; Wasserstoff bedeuten; Z'
-N(CH&sub2;COO&supmin;)&sub2; bedeutet; und -X-Y 3-Aminophenyl bedeutet,
welches X&sub3; ersetzt.
7. Chelat nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß n = 2; X&sub2;, X&sub3; und X&sub4; Wasserstoff bedeuten; Z'
-N(CH&sub2;COO&supmin;)&sub2; bedeutet; und -X-Y 4-Aminophenyl bedeutet,
welches X&sub2; bzw. X&sub4; ersetzt.
8. Chelat nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß n = 2; X&sub2;, X&sub3; und X&sub4; Wasserstoff bedeuten; Z'
-N(CH&sub2;COO&supmin;)&sub2; bedeutet; und -X-Y 3-Aminophenyl bedeutet,
welches X&sub2; bzw. X&sub4; ersetzt.
9. Chelat nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß n = 1; X&sub2;, X&sub3; und X&sub4; Wasserstoff bedeuten; Z'
-N(CH&sub2;COO&supmin;)2 bedeutet; X 4-Aminophenyl bedeutet, an das der
Rest Y in der 4-Aminogruppe gebunden ist; und X-Y X&sub3; ersetzt.
10. Chelat nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß n = 1; X&sub2;, X&sub3; und X&sub4; Wasserstoff
bedeuten; Z' -N(CH&sub2;COO&supmin;)&sub2; bedeutet; X 3-Aminophenyl bedeutet,
an das der Rest Y in der 3-Aminogruppe gebunden ist; und X-Y
X&sub3; ersetzt.
11. Chelat nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß n = 2; X&sub2;, X&sub3; und X&sub4; Wasserstoff bedeuten; Z'
-N(CH&sub2;COO&supmin;)&sub2; bedeutet; X 4-Aminophenyl bedeutet, an das der
Rest Y in der 4-Aminogruppe gebunden ist; und X-Y X&sub2; bzw. X&sub4;
ersetzt.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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