JPS60186290A - アルフア−１−アンチトリプシンを細菌に表現させる方法 - Google Patents
アルフア−１−アンチトリプシンを細菌に表現させる方法Info
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- JPS60186290A JPS60186290A JP59167269A JP16726984A JPS60186290A JP S60186290 A JPS60186290 A JP S60186290A JP 59167269 A JP59167269 A JP 59167269A JP 16726984 A JP16726984 A JP 16726984A JP S60186290 A JPS60186290 A JP S60186290A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
４ｊｉ’ｊ３ ｊ↓−（夕１／１リ−ｊ：Ｉ）ｋｇＵｆ
一本発明は哺乳動物のアルファー１−アンチトリプシン
を細菌に表現（形質発現）させる方法及びかようにして
表現されたタンパク質産生品に関する。 要約すると本発明＆；Ｉ： Ｉｌ＋ｌｉ ′７Ｌ ’Ｍ
のアルファー１−アンチ１〜リブシンのプロテアーゼ阻
害物質を有するポリペプチドを産生ずる方法を提供する
。本方法（Ｊ呻乳類のアルファー１−アンチトリプシン
に関する暗号解読のためのセグメントをイｊするＤＮＡ
転移へフタ−６ごまり形質転換された細菌を培養し生育
させる王朽１を含むものである。 上（米！と反３軌 アルファー １−アンチ１〜リプシンは哺乳動物血液中
に存在するプロテアーゼ阻害物質であって、その主な生
理学的作用は構造タンパク質を加水分解する自刃なプロ
テアーゼであるエラスターセを阻害するにあることが明
らかにされている。又アルファー１−アンチ１−リプシ
ンば他のセリンプロテアーゼ類をも聞書する。アルファ
ー１−アンチトリプシンの血漿中正常値は約２ｎｓｒ／
ｍＩ！である。 ■■■回アルファー１−アンチ１−リプシ／の血中低値
は慢性障害性肺気腫及び小児ＪＪＴ硬変に関連する。多
くの炎症性症状を伴う急性期の反応が起こり、アルファ
ー１−アンチトリプシンのＹ農度が実質的に増加する。 アルファー１−アンチ１〜リプシン欠乏症の研究と治療
並びに急性ｊす１反応機構の検査のために純粋なアルフ
ァー１−）′フチ１〜リプシンタンパク質の提供が要望
されている。特に遺伝子工学技術によって細菌に造らせ
たアンーｆ−トリプシンタンパク質給源のＩに供が望ま
れている。 尤功が解決しようとずＡ肌凱立 従って本発明の目的はアルファー１〜アンチトリプシン
を細菌に産生さゼる方法の提供にある。 更に本発明の目的は遺伝子工学技術により細菌に産生さ
せた純粋なアルファー１−アンチｌリプシンボリベブチ
ドの提供にある。 問題点を解決するだめの平成 アルファー１−アンチトリプシンに関する染色休１１Ｎ
△（ｃ、 Ｉ） Ｎ Ａ ）の暗号解読の筋道はクラ千
Ｑ’ｐ ｊＫｕｒ＋１（：ｂｉ ｅＬ ；＋１．、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、へｃａｄ、ｓｃｉ、ＩＪ、ｓ、へ、。 ７８ 、Ｇ ８２６− （ｉ ８３０ （＋ ９８１
） ）及びチャン１う等（Ｃ１＋ａｎｄｒ、］ｅＬ ａ
ｌ、、１１ｉｏｃｌＩＬ！ｍ、ｌｌ１ｏｐｈｙｓ。 １１ｃ！ｓ、ｃｏｍｍ、、１０３． ７５１−７５８
（１９８１）３Ｇこ、１、り記載されたがそれらの記Ｉ
ｌ＆事項は本明細書に引用され゛（いる。アルファー１
−）′ンチトリプソンに関する霊長１」の動物の遺伝子
はチャンドラ等の−１−記文＋ｉ＋Ｊ＋記載のｌ） Ｎ
Δクローン形成方法によって得られる。又ヒトの染色体
ｌＪＮΔライブラリ（ｃ、 ｌ） Ｎ Ａ ｌ １ｂｒ
ａｒｙ）から得られたヒトのアルファ １ アンチ１〜
リゾシンのｊニな形態に関する逍（Ｊ、イ暗壮文は添付
図面の第４図に丞ず通りである。 本発明は哺乳（ｆｌのアルファー１−アンチトリプシン
（以後ＡＴと略記する）のプロテアーゼ阻害活性をｆｌ
するポリペブチ１を細菌に表現させる表１見ヘクター（
ｅＸｉｌｌ”ｅｓｓＩｏＩｌ ｖｅｃｔｏｒ ）の中へ
ｃｌ）ＮＡ暗−号配列を挿入するごとにより細菌にΔ′
Ｆを産生させる力演に関する。ＤＮＡ転移転移ダクター
哺乳１ｒ（のΔ′１゛に関するｃＤＮΔＤＮＡグメント
のほかに、適当Ｇこ位置する翻訳開始暗号及び翻訳停止
Ｆ暗号を有すると共に表現型の選択のためのブ１１［−
ターセグメント及び遺伝子を有する。アルファー１−ア
ンチ１〜リゾシンに関する暗−Ｊ配列を含むｃ ｌ）
Ｎ Ａセグメントも才既述の１ＪＴ１り公知である。ヒ
１〜のアルファー１−アンチトリプシンの土形態に関す
る遺伝子暗号を使用することが好ましく、その配列順序
は第４図に示されている。りれどもＡＴの抗原性の少な
い突然変異型及び（又は）安定性の大きい突然変異型の
表現も又△′１゛の諸変５’Ｎ型を有する諸対象のため
に特に有用である。ヒトのＡＴの主要な照号配列はひひ
（動物）の△’Ｉ’ ；Ｈ伝子（クラ千等のｆｊｉ＋掲
文献）を交り（（のプに１−ゾ（ｐｒｏｂｅ ）として
使用することにより（二ｌ）Ｎ△ライブラリから華離さ
れる。 本発明に従う好適な・＼フタ−はメリック（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏＨｙ、
１（ｌｔ（１り８３） ：１により記載されたＭ１３ク
ローン形成・＼フタ−から誘導され得る。特に好適なヘ
クターはメシンク等（ｆｉｉｊ掲文献）により記載され
Ｐ −１，、ハイオゲミカルスＪｌ： （Ｐ−１−１１
ｉｏｃｂｅｍｉｃａｌｓ ）から販売されているソアー
ソＭ ｌ ３ ｍ ｐＩ Ｏである。このヘクターはす
るｃｏｌン１及び１３ ａ ｒｎ ＨＩの制限部位を原
配列の中に有すると共にｌａｃ Ｉ領域中に独自の△ｖ
ａ １１部位を有する。このヘクターによりＡ′Ｆの
表現を細菌において増強するためにＭ１３ｍｐ１０を、
プラスミドｐ Ｉ） Ｒ５４（ｌから得られるハイシリ
（・”１．ｒｐ−１ａｃプじ１モーターの挿入によって
（１に荊］する。該後者のプラスミドはラッセル等によ
。 り記載されており （Ｒｕｓｓｅｌ ｅＬ ＋ｉ１．．
Ｇｅｎ（！、２０，２旧２４３ （］ ９１１２） ）
Ｉ）−Ｌハイオゲミカシス社から販売されている。 添（＝Ｊ図向の第１図を参照すると本発明に従・つｉｆ
通な１つＮ△転転移ツクターＥｃ、 ｏ Ｒｌ及びＢ
ａ ｒｎ １１１を用いてファージＭｌ ３ｍｐ １０
を酵素−？的に分剤″することにより調製される。Ｐ−
１゜バイオケミカルス社から娼入される合成りＮＡ受容
体は１・記構造 ＡΔ’Ｉ’ Ｔ ＣＡ ＴＧ ＧへＧ Ｇ′ｒΔＣＣＴ ＣＣｉ’ Ａ Ｇ を有すると共に５個の主リン酸エステルを欠失する。得
られた付着末端に練合成り ＮＡ受容体を結合させて構
成体ｍｐｌＯＡ（第１図参照）を形成さ−ｌる。かよう
にして構成体ｓｎ ｐ Ｉ （ｌ ＡはΔ′１′市伝子
に関する開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏ
ｎ）及び最初のアミノ酸（Ｇｌｕ ）コト”ンを１ノ？
供するＡ Ｔ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ含有配列に沿うＫ ｃ
ｏ ＲＩ制限部イ１７及びｆ３ ａ ｍ Ｈ１部位を有
する。ｒｎ ｐ Ｉ ［１の原のＥ ｃ ｏ Ｒ１部位
と１３ ａ ｍ ＩＩ １部位との間の’４ｊＪ域に関
する受容体の置換はラフＩ・−ス（ｌ ａ ＜： ）オ
ペＩＩンの読み枠を破壊するので、得られたトフ／スソ
１゜クタント（形質変換−感染体）は白色のゾラークを
−りえる。 ヘクターｍｐｌＱΔはＡ Ｖ ａ ＩｆによりｌｊＶ素
学的に分解され、付着末端ばＩ） Ｎ Ａポリメラーゼ
のフレノウ１枡片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ
）を用い゛（充足される。次にＥＣ０ＲＩを用いて酵素
パ？的分解をｆ＋い、次いでＳ１ヌクレアーゼを用い−
ｒ ４＝Ｊ着末◇：１．；を除く。得られた平滑（ｂｌ
ｕｎｔ ）末端の断片を１ｒ目）ＪＯＢとして第１図に
示す。 第２図を参照するとＬｒｐ−１ａｃプロモーターをイ１
するｌ−） Ｎ Ａ １；７１片はｐ Ｉ） Ｒ５／Ｉ
Ｏから取出される。 プラスミドｐ Ｉ） Ｒ５４０をｔ（ｉ ｎ ｄ ＩＩ
Ｉで切断してイ；］着末端をクレノウボリメラーセを用
いて充足する。配列ＣＣＴ ＣＧΔＧＯをイ１゛づるリ
ンカ−（連鎖体）を、！ｌ′Ｗ’ｉ末端へ結合さ−Ｕ、
過剰なリンカ−を×１１ｏＩの酵素学約分ｈｉ″によっ
ζ除く、得られた（：Ｘ１造体はｐ Ｉ） Ｒ５４０Ｘ
として既知されＣいるがこれはｐ Ｉ） Ｒ５４（１０
月１ ｉ ｎ （Ｉ １１１部位の代わりにＸ ｈ ｏ
１部位をイ１する。Ｘ ｈ ｏ Ｉと１３ａ ｍＨＩ
とを用いてｐ［川？５／ＩＯＸを酵素学的に分解してか
一次にクレノウ１υｉ片を用いて末端を平滑化してｔｒ
ｐ −Ｉ 、Ｉｃ −）’ ｌコモ−ター（］゛ΔＣ）
及びシャイン−タルガルノ配列（Ｓｔ＋ｉｎｅ −Ｄａ
ｌｇａｒｎｏ ５ｅｑｕｅｎｃＣ）をイ１する断Ｊ４を
生成さ−ける。 第３図を参照するとＬｒｌ１−ｊａｃプロモーターをイ
１する］−記の断片をｍ ｌ） １０ Ｂ断片（最終構
造は第１図に示されている）の中へ挿入してバイブリド
（♀ｆ（種）ファージｍｐｌＯｃを生成させる。 ′１゛八〇へ有断片のＸ ｈ ｏ Ｉ平滑末端に対しｍ
ｐｌｏＩｌのＡｖａｎ平滑末端を結合さ一已ると結合ｒ
、ζ１所にＸｈｏ１部位を１１￥生成する。ｍ ｐ Ｉ
ＯＢ、ｃｌ’）Ｅｃｏｌｌ Ｉ平滑末端に対しＡ Ｔ
Ｃ断片のｔ３ ａ ｍ ＩＩ Ｉ平滑部位を結合させ
るとこの結合箇所にＮｃ ｏ ］部位（ＣＣ八へ］”
ＣＧ ）を生成する。この１ｈＪ［１，！ｌについ“（
正規の検削を行い青色のプラーク形成に阜づくスクリー
ニングが６１能である。ファージｍ ｐ ｌ ＯＣはΔ
ＴＧ開始コドンの−１−位に位置する第２の１３ ａ
ｍ Ｉ−１１部位を有づ−るがこれは原の１３ ａ ｍ
ＩＩ １部位の中へ・のＡ Ｔ ｉＪｌ伝子の挿入を
容易にさ・けるために除かれねばならない。この余計な
Ｈ；ｉ ｍ ＩＩ １部位を除くためにｒＴＩＩ’）、
１０Ｃをｒ３；ｉ ＩＴＩ ＋−１１使用］・に２回に
わたり酵素学的に分解する。最初に部分的分解を行い、
次にクレノウボリメラーゼを用いて付着末端を充足し、
Ｘ ｈ ｏ Ｉを用いて分解し、アガロースゲル」二で
純化する。この正規の断片はＮＣＯ■制限部位を有する
ものとして同定される。 ｍｐｌＯｃのＩ３ａｍＨＩによる第２回口の分解を完遂
し、クレノウボリメラーセを用いて付着末端を充足させ
、１３ ａ １３１エキソヌクレアーゼに、（、り平滑
末Ｑｉｉｉをマニキュア（ｍａｎｉｃｕｒｉｎｇ）する
ことを容易に−づるためにα−３２ｐ −（ｌ Ｎ Ｔ
Ｐ”Ｓ を使用する。標識、、ｉｉｉ部から５箇の塩
基対をＢａ、［３１ニー１−ソヌクレアーゼ使用によっ
て除きかようにしてＢ ａ ｍ ＩＩ １部位を除く。 プ１：１モーター含有配列をＸ ｔ＋ （ｌ Ｉの使用
土に除去し、ゲルを用いて純化した。ｒｎ ｐ Ｉ （
１３ｆＪ−５回片とｐ ＴＪ） Ｒ５４０−ＢＡｆｔ１
υ１片とを結合させ大腸１％’、ｉ １式、ごＩリ （
Ｅ、 ｃｏｌｉ）Ｋ Ｉ ２ （、Ｉ Ｍ Ｉ ［１３
） （ＭｅｓｓｉＢ Ｊ、’ｃＬ ａｌ、＋１，９８１
＋Ｎ １１ （： Ｉ ｅｉ （：八ｃ１ｄｓ １ｆｃ
ｓ、 ９ ： ３０９ 、Ｐ −Ｌバイオケミカルス社
の市販品人手ｉｉＪ能〕の中ヘクＩ：Ｉ−ン化（分枝系
形成、にｌｏｌ＋（３１ｎｔｏ）さ−１！、ＮＣ１０ｌ
感受性及びｉｊＩ色溶Ｉ１１斑形成に関してスクリーニ
ングを行−った。得られたヘクターはＭ Ｉ ３ Ｔ
Ａ Ｃである（第３１ソ１参照）。 第４図のΔ′１゛配列はｐ １１ Ｒ３２２のＰ ｓ
ｔ １部位の中・＼り１」−ン化された結果としてＰ
ｓ ｔ Ｉ ｔｂｌｌ限部位により攻撃（ｆｌａｎｋ
）される（クラ千等の」二掲文献参照）。従ってＡ Ｔ
遺伝子は約１４４６塩Ｊｌｉ対のｐ ｓｔ ＩＩＩＪｉ
片として取出され得てプラスミドｐＵｃ１３の中へ挿入
され得る。、（ｐｔＪｃされたようにして構成される〕
りれども１ａｃＺｉ貞伝子の開始において第５図に示さ
れるポリリンカー（多連鎖）配列を含め、シラスミ１．
ｐ ｔＪ Ｃ−α■を生成する。（第５１３図参照）
。ｐ（ＪＣ−ａｌはＰｓｔｌ及びＢ ａ ｒｎ ＩＩ
Ｉにより酵素学的に分解されてΔ１゛暗号配列を有する
断片を生成し、これはＢ ａ ｒｎ Ｈｌ −Ｐ ｓ
ｔ ｌ−分解Ｍ ｔ ３ ′ｒΔ０ヘクターの中へ挿入
される。得られた組換え体ソアージによって表現された
タンパク質はＭｅｔから開始し、それに次いで成！７１
Ａ ｉ’の配列が続く。組換え体ファージをトランス
フェクｌ−（形質変換体）大腸菌Ｅ、コリＫ １２ （
ＪＭＩ （１３）に対して使用し得る。スロコムヘ等（
Ｓｌｏｃｏｍｂｅ Ｏｔ ａｌ、、ＰＮＡＳＵ、Ｓ、八
、、７９．５４５５ （１９８２））の方法は本明細書
に引用されるが該方法に従って細胞群を生育させ、感染
させ、誘ｍする。銹？ｒ後の各１１．１１！ｌＪ１に試
料（複数）を集め定速遠心分離により細胞群を収穫しｌ
／２０容積の５０ ｍ Ｍ ）リスｐＨ８，０，３０ｍ
Ｍ ＮａＣ＋２，１０ｍＭ ｌ”：ＤＴＡの中に再懸濁
さ・ける、、１−澄液を採って細胞外ファージについ゛
（検査し、／ｉ４終濃度１■／ｍ７！に達するまでごの
細菌）脈濁液に対してリソチームを加える。４℃におい
゛（３０分間後に数・す“イクルの凍結−融解により菌
について細胞溶解を行い１時間当たり１００，０００×
１＜で遠心分離し〜（細胞砕片を除去する。−１−澄液
をｌ） Ｎ Ａ Ｓ ｅで処理し、ＩＦ、 ｌ−Ｉ Ｓ
Ａ及びエラ□スター ノミ結合試験により八ｌ’につい
′Ｃ検査する。 例−１− へ゛口１′閉′１イ＋ １’、 １． ｌ Ｓへ検ｈ２
＋７．相性利用に５１．す）うめ鈍化されノこ２０ （
１／７１！のヤギのＪｊ“Ｌ−アルファー１−アンチト
リプシン（ｐ１１！１．１１ （７，） ｆｌ、 Ｉ
Ｍ Ｎ；＋２ＧＯ＋＋中１ ｆｌ 、＋７ ｌ：、／ｍ
７りを、へ゛１゛検Ｎ ノ’／コメａ、’：、：ｒ ｂ
ｔ＋ｃ＋ ｏ、＞ 凹ｒすｔ 全一も一’ ＋；ｊｋ
小力価検定用ｉｆ？養板の各凹所の中で３７℃に２〜
４時間敢置装た。ごの溶液を取除いζ１％ＢＳΔとμｐ
を各凹所へ加えて３７℃に２時間放置した。 次に被検品を、標準品をも含めて、各凹所・・、加えた
。ＡＴがもし存在ずれば該Δ′１゛は特定の抗体と結合
する。恒温保持１５〜３０分間後にこの凹所群をＰＢＳ
ですすく。各凹所に対しｌ） Ｉｊ Ｓ中１％ＢＳＡの
存在ドに２００ ／７１２のウリ°ギ抗 アルファー１
− Ａ ｌ’を加えた。恒温保持１５分間後にこの溶液
を取除き、各凹所をＩ） １３ Ｓで４ずく。 １％１３ Ｓ Ａ及びＩ） １３ Ｓ中のアルカリホス
ファターゼにカプリングさせたヤギ抗つ勺ギ１ｇＧの２
００μＣの試料を各凹所へ添ＪＪＩＩ して１５分間恒
温保持した。凹所群をずずぎ、次に２００ ｌｉ （Ｊ
の基質溶液を加えたが、こればＩ’ｌｌ ！］、 Ｅｉ
の５０ ｍ ７！＋７）０．１ｍジェタノールアミン中
に？容解している３０−■のジニトロフェニルボスフェ
イトを含イｊしていた。黄色が発現（１５〜［ｉ ０分
間）するからその強さを検出器（ＴｉＬｅｒｔｅｋ Ｍ
ｕｌＬｉｓｃａｎ ｄｔ＋Ｌｅｃｔｏｒ） Ｉで４０５
ｎ ｍにおいて記録した。該ｔ／ｊ ｉ！！、は被検
硲液中のＡＴ量に比例する。 例−η の０．０５％１−ウィン”２０．０．０５％アシ化ナト
リウム； ３、 １％ウシ血ンー？アルフ゛ミン（１３ＳΔ）を含
有する）８液２； ４．９（ｉｍβジ〕ニタノ−ルアミン、５６１［のＭ８
＋：Ｊ２に水を加えてＩＩとしたン容液、ｐｌ＋ り、
８ ＋５、７容／１謎４の５０ｍｌ１当り３０■のア
ルカリホスファターゼ基１（（ｐ− 二１−口フェノールポスフェイ１へ、 ユナ１リウＪ、塩） 〔シダマゲミカ ルンｌ： （Ｓｉｇｍａ Ｃ１１ｃｍ１ｃ、ａｌ Ｃｏ
、）販売品〕含有液。 凹所（１６筒を有する微小力価検定板の各凹所に１ｍ７
！当りＩ （ｌμｇのエラスクニゼ（シグマゲミカル社
販売品）を含有する２００μｌの溶？Ｆｉ Ｉを加えた
。この検定板を３７゛Ｃに２時間１１ｊ、 ？Ａ！＋保
Ｔｉ１シた。次にこの溶液を取除き凹所Ｂ’（を２０
（１／１１．の？容液２で２回洗った。次に３００μｐ
の）澄液３を各凹所に加えて該検定板を３７℃に２時間
恒６１に保持し、又は冷凍庫内に終夜保持した。溶ンｆ
Ｕを取除き凹所群を上記の通りに洗浄した。被検試料を
溶液３で希釈し、希釈試料２００ ＩＩ Ｉ！を凹すｉ
へ加えた。２００μｌの溶液３をずべての不使用凹所ノ
１ｒ−１ＪＪ１１えた。この検定板を３７°Ｃに３０分
間恒温保持してから凹所を空（から）にし、て既述のよ
うもこ洗浄した。各凹所へＡ′Ｆに対抗するウザー１−
抗体の２００μβ （これは２８１反３中にＩ ： Ｉ
Ｏ（１０に４゜釈されている）を加えた。この検定板
を３７℃に３０分間恒温保持し、空にしてから？８液２
で３回洗浄した。各凹所に対しヤギ抗つリギＩ ｌｉ
Ｇにカプリングしたアルカリポスファターセの２ （１
０μｌ （？８液３でｌ：１０００に希釈されている）
を加えた。この検定板を３７℃に３０分間↑
一本発明は哺乳動物のアルファー１−アンチトリプシン
を細菌に表現（形質発現）させる方法及びかようにして
表現されたタンパク質産生品に関する。 要約すると本発明＆；Ｉ： Ｉｌ＋ｌｉ ′７Ｌ ’Ｍ
のアルファー１−アンチ１〜リブシンのプロテアーゼ阻
害物質を有するポリペプチドを産生ずる方法を提供する
。本方法（Ｊ呻乳類のアルファー１−アンチトリプシン
に関する暗号解読のためのセグメントをイｊするＤＮＡ
転移へフタ−６ごまり形質転換された細菌を培養し生育
させる王朽１を含むものである。 上（米！と反３軌 アルファー １−アンチ１〜リプシンは哺乳動物血液中
に存在するプロテアーゼ阻害物質であって、その主な生
理学的作用は構造タンパク質を加水分解する自刃なプロ
テアーゼであるエラスターセを阻害するにあることが明
らかにされている。又アルファー１−アンチ１−リプシ
ンば他のセリンプロテアーゼ類をも聞書する。アルファ
ー１−アンチトリプシンの血漿中正常値は約２ｎｓｒ／
ｍＩ！である。 ■■■回アルファー１−アンチ１−リプシ／の血中低値
は慢性障害性肺気腫及び小児ＪＪＴ硬変に関連する。多
くの炎症性症状を伴う急性期の反応が起こり、アルファ
ー１−アンチトリプシンのＹ農度が実質的に増加する。 アルファー１−アンチ１〜リプシン欠乏症の研究と治療
並びに急性ｊす１反応機構の検査のために純粋なアルフ
ァー１−）′フチ１〜リプシンタンパク質の提供が要望
されている。特に遺伝子工学技術によって細菌に造らせ
たアンーｆ−トリプシンタンパク質給源のＩに供が望ま
れている。 尤功が解決しようとずＡ肌凱立 従って本発明の目的はアルファー１〜アンチトリプシン
を細菌に産生さゼる方法の提供にある。 更に本発明の目的は遺伝子工学技術により細菌に産生さ
せた純粋なアルファー１−アンチｌリプシンボリベブチ
ドの提供にある。 問題点を解決するだめの平成 アルファー１−アンチトリプシンに関する染色休１１Ｎ
△（ｃ、 Ｉ） Ｎ Ａ ）の暗号解読の筋道はクラ千
Ｑ’ｐ ｊＫｕｒ＋１（：ｂｉ ｅＬ ；＋１．、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、へｃａｄ、ｓｃｉ、ＩＪ、ｓ、へ、。 ７８ 、Ｇ ８２６− （ｉ ８３０ （＋ ９８１
） ）及びチャン１う等（Ｃ１＋ａｎｄｒ、］ｅＬ ａ
ｌ、、１１ｉｏｃｌＩＬ！ｍ、ｌｌ１ｏｐｈｙｓ。 １１ｃ！ｓ、ｃｏｍｍ、、１０３． ７５１−７５８
（１９８１）３Ｇこ、１、り記載されたがそれらの記Ｉ
ｌ＆事項は本明細書に引用され゛（いる。アルファー１
−）′ンチトリプソンに関する霊長１」の動物の遺伝子
はチャンドラ等の−１−記文＋ｉ＋Ｊ＋記載のｌ） Ｎ
Δクローン形成方法によって得られる。又ヒトの染色体
ｌＪＮΔライブラリ（ｃ、 ｌ） Ｎ Ａ ｌ １ｂｒ
ａｒｙ）から得られたヒトのアルファ １ アンチ１〜
リゾシンのｊニな形態に関する逍（Ｊ、イ暗壮文は添付
図面の第４図に丞ず通りである。 本発明は哺乳（ｆｌのアルファー１−アンチトリプシン
（以後ＡＴと略記する）のプロテアーゼ阻害活性をｆｌ
するポリペブチ１を細菌に表現させる表１見ヘクター（
ｅＸｉｌｌ”ｅｓｓＩｏＩｌ ｖｅｃｔｏｒ ）の中へ
ｃｌ）ＮＡ暗−号配列を挿入するごとにより細菌にΔ′
Ｆを産生させる力演に関する。ＤＮＡ転移転移ダクター
哺乳１ｒ（のΔ′１゛に関するｃＤＮΔＤＮＡグメント
のほかに、適当Ｇこ位置する翻訳開始暗号及び翻訳停止
Ｆ暗号を有すると共に表現型の選択のためのブ１１［−
ターセグメント及び遺伝子を有する。アルファー１−ア
ンチ１〜リゾシンに関する暗−Ｊ配列を含むｃ ｌ）
Ｎ Ａセグメントも才既述の１ＪＴ１り公知である。ヒ
１〜のアルファー１−アンチトリプシンの土形態に関す
る遺伝子暗号を使用することが好ましく、その配列順序
は第４図に示されている。りれどもＡＴの抗原性の少な
い突然変異型及び（又は）安定性の大きい突然変異型の
表現も又△′１゛の諸変５’Ｎ型を有する諸対象のため
に特に有用である。ヒトのＡＴの主要な照号配列はひひ
（動物）の△’Ｉ’ ；Ｈ伝子（クラ千等のｆｊｉ＋掲
文献）を交り（（のプに１−ゾ（ｐｒｏｂｅ ）として
使用することにより（二ｌ）Ｎ△ライブラリから華離さ
れる。 本発明に従う好適な・＼フタ−はメリック（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏＨｙ、
１（ｌｔ（１り８３） ：１により記載されたＭ１３ク
ローン形成・＼フタ−から誘導され得る。特に好適なヘ
クターはメシンク等（ｆｉｉｊ掲文献）により記載され
Ｐ −１，、ハイオゲミカルスＪｌ： （Ｐ−１−１１
ｉｏｃｂｅｍｉｃａｌｓ ）から販売されているソアー
ソＭ ｌ ３ ｍ ｐＩ Ｏである。このヘクターはす
るｃｏｌン１及び１３ ａ ｒｎ ＨＩの制限部位を原
配列の中に有すると共にｌａｃ Ｉ領域中に独自の△ｖ
ａ １１部位を有する。このヘクターによりＡ′Ｆの
表現を細菌において増強するためにＭ１３ｍｐ１０を、
プラスミドｐ Ｉ） Ｒ５４（ｌから得られるハイシリ
（・”１．ｒｐ−１ａｃプじ１モーターの挿入によって
（１に荊］する。該後者のプラスミドはラッセル等によ
。 り記載されており （Ｒｕｓｓｅｌ ｅＬ ＋ｉ１．．
Ｇｅｎ（！、２０，２旧２４３ （］ ９１１２） ）
Ｉ）−Ｌハイオゲミカシス社から販売されている。 添（＝Ｊ図向の第１図を参照すると本発明に従・つｉｆ
通な１つＮ△転転移ツクターＥｃ、 ｏ Ｒｌ及びＢ
ａ ｒｎ １１１を用いてファージＭｌ ３ｍｐ １０
を酵素−？的に分剤″することにより調製される。Ｐ−
１゜バイオケミカルス社から娼入される合成りＮＡ受容
体は１・記構造 ＡΔ’Ｉ’ Ｔ ＣＡ ＴＧ ＧへＧ Ｇ′ｒΔＣＣＴ ＣＣｉ’ Ａ Ｇ を有すると共に５個の主リン酸エステルを欠失する。得
られた付着末端に練合成り ＮＡ受容体を結合させて構
成体ｍｐｌＯＡ（第１図参照）を形成さ−ｌる。かよう
にして構成体ｓｎ ｐ Ｉ （ｌ ＡはΔ′１′市伝子
に関する開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏ
ｎ）及び最初のアミノ酸（Ｇｌｕ ）コト”ンを１ノ？
供するＡ Ｔ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ含有配列に沿うＫ ｃ
ｏ ＲＩ制限部イ１７及びｆ３ ａ ｍ Ｈ１部位を有
する。ｒｎ ｐ Ｉ ［１の原のＥ ｃ ｏ Ｒ１部位
と１３ ａ ｍ ＩＩ １部位との間の’４ｊＪ域に関
する受容体の置換はラフＩ・−ス（ｌ ａ ＜： ）オ
ペＩＩンの読み枠を破壊するので、得られたトフ／スソ
１゜クタント（形質変換−感染体）は白色のゾラークを
−りえる。 ヘクターｍｐｌＱΔはＡ Ｖ ａ ＩｆによりｌｊＶ素
学的に分解され、付着末端ばＩ） Ｎ Ａポリメラーゼ
のフレノウ１枡片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ
）を用い゛（充足される。次にＥＣ０ＲＩを用いて酵素
パ？的分解をｆ＋い、次いでＳ１ヌクレアーゼを用い−
ｒ ４＝Ｊ着末◇：１．；を除く。得られた平滑（ｂｌ
ｕｎｔ ）末端の断片を１ｒ目）ＪＯＢとして第１図に
示す。 第２図を参照するとＬｒｐ−１ａｃプロモーターをイ１
するｌ−） Ｎ Ａ １；７１片はｐ Ｉ） Ｒ５／Ｉ
Ｏから取出される。 プラスミドｐ Ｉ） Ｒ５４０をｔ（ｉ ｎ ｄ ＩＩ
Ｉで切断してイ；］着末端をクレノウボリメラーセを用
いて充足する。配列ＣＣＴ ＣＧΔＧＯをイ１゛づるリ
ンカ−（連鎖体）を、！ｌ′Ｗ’ｉ末端へ結合さ−Ｕ、
過剰なリンカ−を×１１ｏＩの酵素学約分ｈｉ″によっ
ζ除く、得られた（：Ｘ１造体はｐ Ｉ） Ｒ５４０Ｘ
として既知されＣいるがこれはｐ Ｉ） Ｒ５４（１０
月１ ｉ ｎ （Ｉ １１１部位の代わりにＸ ｈ ｏ
１部位をイ１する。Ｘ ｈ ｏ Ｉと１３ａ ｍＨＩ
とを用いてｐ［川？５／ＩＯＸを酵素学的に分解してか
一次にクレノウ１υｉ片を用いて末端を平滑化してｔｒ
ｐ −Ｉ 、Ｉｃ −）’ ｌコモ−ター（］゛ΔＣ）
及びシャイン−タルガルノ配列（Ｓｔ＋ｉｎｅ −Ｄａ
ｌｇａｒｎｏ ５ｅｑｕｅｎｃＣ）をイ１する断Ｊ４を
生成さ−ける。 第３図を参照するとＬｒｌ１−ｊａｃプロモーターをイ
１する］−記の断片をｍ ｌ） １０ Ｂ断片（最終構
造は第１図に示されている）の中へ挿入してバイブリド
（♀ｆ（種）ファージｍｐｌＯｃを生成させる。 ′１゛八〇へ有断片のＸ ｈ ｏ Ｉ平滑末端に対しｍ
ｐｌｏＩｌのＡｖａｎ平滑末端を結合さ一已ると結合ｒ
、ζ１所にＸｈｏ１部位を１１￥生成する。ｍ ｐ Ｉ
ＯＢ、ｃｌ’）Ｅｃｏｌｌ Ｉ平滑末端に対しＡ Ｔ
Ｃ断片のｔ３ ａ ｍ ＩＩ Ｉ平滑部位を結合させ
るとこの結合箇所にＮｃ ｏ ］部位（ＣＣ八へ］”
ＣＧ ）を生成する。この１ｈＪ［１，！ｌについ“（
正規の検削を行い青色のプラーク形成に阜づくスクリー
ニングが６１能である。ファージｍ ｐ ｌ ＯＣはΔ
ＴＧ開始コドンの−１−位に位置する第２の１３ ａ
ｍ Ｉ−１１部位を有づ−るがこれは原の１３ ａ ｍ
ＩＩ １部位の中へ・のＡ Ｔ ｉＪｌ伝子の挿入を
容易にさ・けるために除かれねばならない。この余計な
Ｈ；ｉ ｍ ＩＩ １部位を除くためにｒＴＩＩ’）、
１０Ｃをｒ３；ｉ ＩＴＩ ＋−１１使用］・に２回に
わたり酵素学的に分解する。最初に部分的分解を行い、
次にクレノウボリメラーゼを用いて付着末端を充足し、
Ｘ ｈ ｏ Ｉを用いて分解し、アガロースゲル」二で
純化する。この正規の断片はＮＣＯ■制限部位を有する
ものとして同定される。 ｍｐｌＯｃのＩ３ａｍＨＩによる第２回口の分解を完遂
し、クレノウボリメラーセを用いて付着末端を充足させ
、１３ ａ １３１エキソヌクレアーゼに、（、り平滑
末Ｑｉｉｉをマニキュア（ｍａｎｉｃｕｒｉｎｇ）する
ことを容易に−づるためにα−３２ｐ −（ｌ Ｎ Ｔ
Ｐ”Ｓ を使用する。標識、、ｉｉｉ部から５箇の塩
基対をＢａ、［３１ニー１−ソヌクレアーゼ使用によっ
て除きかようにしてＢ ａ ｍ ＩＩ １部位を除く。 プ１：１モーター含有配列をＸ ｔ＋ （ｌ Ｉの使用
土に除去し、ゲルを用いて純化した。ｒｎ ｐ Ｉ （
１３ｆＪ−５回片とｐ ＴＪ） Ｒ５４０−ＢＡｆｔ１
υ１片とを結合させ大腸１％’、ｉ １式、ごＩリ （
Ｅ、 ｃｏｌｉ）Ｋ Ｉ ２ （、Ｉ Ｍ Ｉ ［１３
） （ＭｅｓｓｉＢ Ｊ、’ｃＬ ａｌ、＋１，９８１
＋Ｎ １１ （： Ｉ ｅｉ （：八ｃ１ｄｓ １ｆｃ
ｓ、 ９ ： ３０９ 、Ｐ −Ｌバイオケミカルス社
の市販品人手ｉｉＪ能〕の中ヘクＩ：Ｉ−ン化（分枝系
形成、にｌｏｌ＋（３１ｎｔｏ）さ−１！、ＮＣ１０ｌ
感受性及びｉｊＩ色溶Ｉ１１斑形成に関してスクリーニ
ングを行−った。得られたヘクターはＭ Ｉ ３ Ｔ
Ａ Ｃである（第３１ソ１参照）。 第４図のΔ′１゛配列はｐ １１ Ｒ３２２のＰ ｓ
ｔ １部位の中・＼り１」−ン化された結果としてＰ
ｓ ｔ Ｉ ｔｂｌｌ限部位により攻撃（ｆｌａｎｋ
）される（クラ千等の」二掲文献参照）。従ってＡ Ｔ
遺伝子は約１４４６塩Ｊｌｉ対のｐ ｓｔ ＩＩＩＪｉ
片として取出され得てプラスミドｐＵｃ１３の中へ挿入
され得る。、（ｐｔＪｃされたようにして構成される〕
りれども１ａｃＺｉ貞伝子の開始において第５図に示さ
れるポリリンカー（多連鎖）配列を含め、シラスミ１．
ｐ ｔＪ Ｃ−α■を生成する。（第５１３図参照）
。ｐ（ＪＣ−ａｌはＰｓｔｌ及びＢ ａ ｒｎ ＩＩ
Ｉにより酵素学的に分解されてΔ１゛暗号配列を有する
断片を生成し、これはＢ ａ ｒｎ Ｈｌ −Ｐ ｓ
ｔ ｌ−分解Ｍ ｔ ３ ′ｒΔ０ヘクターの中へ挿入
される。得られた組換え体ソアージによって表現された
タンパク質はＭｅｔから開始し、それに次いで成！７１
Ａ ｉ’の配列が続く。組換え体ファージをトランス
フェクｌ−（形質変換体）大腸菌Ｅ、コリＫ １２ （
ＪＭＩ （１３）に対して使用し得る。スロコムヘ等（
Ｓｌｏｃｏｍｂｅ Ｏｔ ａｌ、、ＰＮＡＳＵ、Ｓ、八
、、７９．５４５５ （１９８２））の方法は本明細書
に引用されるが該方法に従って細胞群を生育させ、感染
させ、誘ｍする。銹？ｒ後の各１１．１１！ｌＪ１に試
料（複数）を集め定速遠心分離により細胞群を収穫しｌ
／２０容積の５０ ｍ Ｍ ）リスｐＨ８，０，３０ｍ
Ｍ ＮａＣ＋２，１０ｍＭ ｌ”：ＤＴＡの中に再懸濁
さ・ける、、１−澄液を採って細胞外ファージについ゛
（検査し、／ｉ４終濃度１■／ｍ７！に達するまでごの
細菌）脈濁液に対してリソチームを加える。４℃におい
゛（３０分間後に数・す“イクルの凍結−融解により菌
について細胞溶解を行い１時間当たり１００，０００×
１＜で遠心分離し〜（細胞砕片を除去する。−１−澄液
をｌ） Ｎ Ａ Ｓ ｅで処理し、ＩＦ、 ｌ−Ｉ Ｓ
Ａ及びエラ□スター ノミ結合試験により八ｌ’につい
′Ｃ検査する。 例−１− へ゛口１′閉′１イ＋ １’、 １． ｌ Ｓへ検ｈ２
＋７．相性利用に５１．す）うめ鈍化されノこ２０ （
１／７１！のヤギのＪｊ“Ｌ−アルファー１−アンチト
リプシン（ｐ１１！１．１１ （７，） ｆｌ、 Ｉ
Ｍ Ｎ；＋２ＧＯ＋＋中１ ｆｌ 、＋７ ｌ：、／ｍ
７りを、へ゛１゛検Ｎ ノ’／コメａ、’：、：ｒ ｂ
ｔ＋ｃ＋ ｏ、＞ 凹ｒすｔ 全一も一’ ＋；ｊｋ
小力価検定用ｉｆ？養板の各凹所の中で３７℃に２〜
４時間敢置装た。ごの溶液を取除いζ１％ＢＳΔとμｐ
を各凹所へ加えて３７℃に２時間放置した。 次に被検品を、標準品をも含めて、各凹所・・、加えた
。ＡＴがもし存在ずれば該Δ′１゛は特定の抗体と結合
する。恒温保持１５〜３０分間後にこの凹所群をＰＢＳ
ですすく。各凹所に対しｌ） Ｉｊ Ｓ中１％ＢＳＡの
存在ドに２００ ／７１２のウリ°ギ抗 アルファー１
− Ａ ｌ’を加えた。恒温保持１５分間後にこの溶液
を取除き、各凹所をＩ） １３ Ｓで４ずく。 １％１３ Ｓ Ａ及びＩ） １３ Ｓ中のアルカリホス
ファターゼにカプリングさせたヤギ抗つ勺ギ１ｇＧの２
００μＣの試料を各凹所へ添ＪＪＩＩ して１５分間恒
温保持した。凹所群をずずぎ、次に２００ ｌｉ （Ｊ
の基質溶液を加えたが、こればＩ’ｌｌ ！］、 Ｅｉ
の５０ ｍ ７！＋７）０．１ｍジェタノールアミン中
に？容解している３０−■のジニトロフェニルボスフェ
イトを含イｊしていた。黄色が発現（１５〜［ｉ ０分
間）するからその強さを検出器（ＴｉＬｅｒｔｅｋ Ｍ
ｕｌＬｉｓｃａｎ ｄｔ＋Ｌｅｃｔｏｒ） Ｉで４０５
ｎ ｍにおいて記録した。該ｔ／ｊ ｉ！！、は被検
硲液中のＡＴ量に比例する。 例−η の０．０５％１−ウィン”２０．０．０５％アシ化ナト
リウム； ３、 １％ウシ血ンー？アルフ゛ミン（１３ＳΔ）を含
有する）８液２； ４．９（ｉｍβジ〕ニタノ−ルアミン、５６１［のＭ８
＋：Ｊ２に水を加えてＩＩとしたン容液、ｐｌ＋ り、
８ ＋５、７容／１謎４の５０ｍｌ１当り３０■のア
ルカリホスファターゼ基１（（ｐ− 二１−口フェノールポスフェイ１へ、 ユナ１リウＪ、塩） 〔シダマゲミカ ルンｌ： （Ｓｉｇｍａ Ｃ１１ｃｍ１ｃ、ａｌ Ｃｏ
、）販売品〕含有液。 凹所（１６筒を有する微小力価検定板の各凹所に１ｍ７
！当りＩ （ｌμｇのエラスクニゼ（シグマゲミカル社
販売品）を含有する２００μｌの溶？Ｆｉ Ｉを加えた
。この検定板を３７゛Ｃに２時間１１ｊ、 ？Ａ！＋保
Ｔｉ１シた。次にこの溶液を取除き凹所Ｂ’（を２０
（１／１１．の？容液２で２回洗った。次に３００μｐ
の）澄液３を各凹所に加えて該検定板を３７℃に２時間
恒６１に保持し、又は冷凍庫内に終夜保持した。溶ンｆ
Ｕを取除き凹所群を上記の通りに洗浄した。被検試料を
溶液３で希釈し、希釈試料２００ ＩＩ Ｉ！を凹すｉ
へ加えた。２００μｌの溶液３をずべての不使用凹所ノ
１ｒ−１ＪＪ１１えた。この検定板を３７°Ｃに３０分
間恒温保持してから凹所を空（から）にし、て既述のよ
うもこ洗浄した。各凹所へＡ′Ｆに対抗するウザー１−
抗体の２００μβ （これは２８１反３中にＩ ： Ｉ
Ｏ（１０に４゜釈されている）を加えた。この検定板
を３７℃に３０分間恒温保持し、空にしてから？８液２
で３回洗浄した。各凹所に対しヤギ抗つリギＩ ｌｉ
Ｇにカプリングしたアルカリポスファターセの２ （１
０μｌ （？８液３でｌ：１０００に希釈されている）
を加えた。この検定板を３７℃に３０分間↑
【１〆１１
、ｋ保持し溶液２を用いて３回洗浄した。次に２ （］
０μｌの溶液５を加え一ζ黄色が発現ずｚ、 ｒｌ：
’Ｃ（３ｆ）〜６０分間）この検定板を３７℃に恒温
保持し４ （１５ｎ ｍで溶液の光学密度を記録した。 秒Ｉ＋ ３− Ｉ−・些−４ニミモ、Ａ工融イじ乙／で望ｊ℃の）ξ県
１３ΔＭＨＩ及びｌ） Ｓ ｉ−１を用いてプラスミド
ｐ［ＪＣαＩ （第５１３図）を酵素学的に分解して１
３２０ｂｐ断片をアガロースゲル使用により純化した〔
八ｎａ１．Ｉｔｉｏｃｌ＋ｅｍ、Ｉ Ｃ１３、２６４（
１９８０）参照〕。この断片をＭｉ３ｍｐｌＯ（このも
のｂ又１−３ΔＭ１］］及びＩ） Ｓ Ｔ Ｉにより分
解されている）の中へ結合さ−ｌた。得られた構造体部
ぢＭ ｌ ３α１八゛１゛を第６図に示す。 スロニｌＪ、・＼等（前掲文献）の定式に従い大腸菌ｌ
Ｌ、：’：Ｉすに１２ （ＪＭ１０３）を生育させ、Ｍ
１３α１ 八′】゛で感染さ−Ｕで該文献記載のようＧ
こして誘導した。誘導後に複数回にわたって試料を集め
、低速遠心分離器により細胞Ｊｆｆを収穫し５０ｍＭの
Ｉ−リスｐＨ８，０，３０ｍ Ｍ （２）ＮａＣ１１及
び１０ｍ ＭのＤΔ′Ｆへのｌ／２０容の中に再懸濁さ
せた。」−澄液について細胞外ファージの検査を行った
。この細菌懸濁物へリソチームを加えて最終濃度を１１
■／ ｍ Ｉｌとした。４°Ｃで３０分間後に数サイク
ルの凍結−融解によって溶菌さゼ、１時間Ｈ）０．＋１
（１０ｘｇの遠心処理によって細胞砕片を除いた。例１
及び２の夫々の操作に従い上澄液に刻しＩｉ Ｌ Ｉ
Ｓ Ａ及びエラスターゼ結合試験によりα、Ａ′Ｆの検
査を行った。 第１表のＥＬ■ＳＡ検査の結果は、表現ヘクターを用イ
ルけれどもα、Ａ′ｒ（ＪＭ Ｉ Ｏ３） に関する遺
伝子を用いない培養物かα、八へ１゛を／、Ｉユ成しな
いことを示している。Ｍ１３α１ △Ｔ表表現ツクター
有する大腸菌、Ｊ Ｍ １０３の２柿の培養物は０．１
６％及び０．１８％のＡ′Ｆを表現した。 ７ｐ１表− 第７図は培養物３の中のＡ Ｔの誘導を例証する。 第７図中１） Ｆ Ｕはプラーク形成単位を意味する。 エラスターゼ結合試験を用いて同様の結果を得たが該結
果は’ｆＳ’Ｂ’物によっ一ζ表現されたα、八へＩ゛
は作用油１１をイｊするごと、及び表現は誘導可能なラ
クト−スラブに１モーターの＄ｌＪ ｊ卸下にあること
を示した。 培養物の磨砕均質物（ボモジネ−１・）を免疫吸着コラ
ムへ通過させた。このコラムはセファロース４Ｂにカプ
リングしたヤギ抗−ヒトαＩＡ”Ｙ’（親和性利用によ
り純化されたもの）から成るものである。このコラムを
０．５ Ｍ ＮａＣ７！含イｊ’ｐｌ＋７．２のリン酸
塩緩衝食塩溶液（ＰＩ３３）で充分に洗−７た。次いで
特異的に免疫吸着されたいかなる物質をも３Ｍ Ｎａ５
ＣＮを用いてコラムから溶出さ−ｌた。 該物質をＰＢＳに対し透析して塩を除い“ζから１デシ
ル硫酸すトリウム及びメルカプトエタノールの存在下に
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に（＝Ｊした。その結
果Ｅ、コリに表現されたα、ＡＴを均質磨砕しポリペプ
チド単鎖として純化しても表現された生成物は安定であ
ることが示された。１１￥母に表現されたαｌＡ”Ｆ（
１９８３年４月２８１」米国出願４８９４０６号参照）
と比１咬すると１−、。 コリに生成されたα、Ａ’Ｆはその分子用が１・“６か
に大きく （４２，０００に対し約４３．００（１）ご
れはＥ、コリに造らせた融合タンパク質のアミノ−末端
への１１アミノ酸残暴のイ」加を反映している。（＝ｊ
加されたアミノ酸残Ｗが該阻害物質を不粘性化しないこ
とは明らかである。 更にＥ Ｌ Ｉ Ｓ、Ａ試験及びエラスターゼ試験によ
って陽１１の成績を与えたホモジネート中のすべての物
質は免疫吸着操作法によって除去され得る。 Ｘ１１１１７ＩにＡ′Ｆを産生さ−Ｕるだめの上記の方
法及び該方法に有用な諸種のベクターをその特定の態様
に関連させて記述したけれどもそれらは更に変改されｊ
（ｊるごと及び本発明のいかなる変改、使用又は適用り
本発明並びに本発明の一般的に包含されることを適業技
術４イは理解すべきである。
、ｋ保持し溶液２を用いて３回洗浄した。次に２ （］
０μｌの溶液５を加え一ζ黄色が発現ずｚ、 ｒｌ：
’Ｃ（３ｆ）〜６０分間）この検定板を３７℃に恒温
保持し４ （１５ｎ ｍで溶液の光学密度を記録した。 秒Ｉ＋ ３− Ｉ−・些−４ニミモ、Ａ工融イじ乙／で望ｊ℃の）ξ県
１３ΔＭＨＩ及びｌ） Ｓ ｉ−１を用いてプラスミド
ｐ［ＪＣαＩ （第５１３図）を酵素学的に分解して１
３２０ｂｐ断片をアガロースゲル使用により純化した〔
八ｎａ１．Ｉｔｉｏｃｌ＋ｅｍ、Ｉ Ｃ１３、２６４（
１９８０）参照〕。この断片をＭｉ３ｍｐｌＯ（このも
のｂ又１−３ΔＭ１］］及びＩ） Ｓ Ｔ Ｉにより分
解されている）の中へ結合さ−ｌた。得られた構造体部
ぢＭ ｌ ３α１八゛１゛を第６図に示す。 スロニｌＪ、・＼等（前掲文献）の定式に従い大腸菌ｌ
Ｌ、：’：Ｉすに１２ （ＪＭ１０３）を生育させ、Ｍ
１３α１ 八′】゛で感染さ−Ｕで該文献記載のようＧ
こして誘導した。誘導後に複数回にわたって試料を集め
、低速遠心分離器により細胞Ｊｆｆを収穫し５０ｍＭの
Ｉ−リスｐＨ８，０，３０ｍ Ｍ （２）ＮａＣ１１及
び１０ｍ ＭのＤΔ′Ｆへのｌ／２０容の中に再懸濁さ
せた。」−澄液について細胞外ファージの検査を行った
。この細菌懸濁物へリソチームを加えて最終濃度を１１
■／ ｍ Ｉｌとした。４°Ｃで３０分間後に数サイク
ルの凍結−融解によって溶菌さゼ、１時間Ｈ）０．＋１
（１０ｘｇの遠心処理によって細胞砕片を除いた。例１
及び２の夫々の操作に従い上澄液に刻しＩｉ Ｌ Ｉ
Ｓ Ａ及びエラスターゼ結合試験によりα、Ａ′Ｆの検
査を行った。 第１表のＥＬ■ＳＡ検査の結果は、表現ヘクターを用イ
ルけれどもα、Ａ′ｒ（ＪＭ Ｉ Ｏ３） に関する遺
伝子を用いない培養物かα、八へ１゛を／、Ｉユ成しな
いことを示している。Ｍ１３α１ △Ｔ表表現ツクター
有する大腸菌、Ｊ Ｍ １０３の２柿の培養物は０．１
６％及び０．１８％のＡ′Ｆを表現した。 ７ｐ１表− 第７図は培養物３の中のＡ Ｔの誘導を例証する。 第７図中１） Ｆ Ｕはプラーク形成単位を意味する。 エラスターゼ結合試験を用いて同様の結果を得たが該結
果は’ｆＳ’Ｂ’物によっ一ζ表現されたα、八へＩ゛
は作用油１１をイｊするごと、及び表現は誘導可能なラ
クト−スラブに１モーターの＄ｌＪ ｊ卸下にあること
を示した。 培養物の磨砕均質物（ボモジネ−１・）を免疫吸着コラ
ムへ通過させた。このコラムはセファロース４Ｂにカプ
リングしたヤギ抗−ヒトαＩＡ”Ｙ’（親和性利用によ
り純化されたもの）から成るものである。このコラムを
０．５ Ｍ ＮａＣ７！含イｊ’ｐｌ＋７．２のリン酸
塩緩衝食塩溶液（ＰＩ３３）で充分に洗−７た。次いで
特異的に免疫吸着されたいかなる物質をも３Ｍ Ｎａ５
ＣＮを用いてコラムから溶出さ−ｌた。 該物質をＰＢＳに対し透析して塩を除い“ζから１デシ
ル硫酸すトリウム及びメルカプトエタノールの存在下に
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に（＝Ｊした。その結
果Ｅ、コリに表現されたα、ＡＴを均質磨砕しポリペプ
チド単鎖として純化しても表現された生成物は安定であ
ることが示された。１１￥母に表現されたαｌＡ”Ｆ（
１９８３年４月２８１」米国出願４８９４０６号参照）
と比１咬すると１−、。 コリに生成されたα、Ａ’Ｆはその分子用が１・“６か
に大きく （４２，０００に対し約４３．００（１）ご
れはＥ、コリに造らせた融合タンパク質のアミノ−末端
への１１アミノ酸残暴のイ」加を反映している。（＝ｊ
加されたアミノ酸残Ｗが該阻害物質を不粘性化しないこ
とは明らかである。 更にＥ Ｌ Ｉ Ｓ、Ａ試験及びエラスターゼ試験によ
って陽１１の成績を与えたホモジネート中のすべての物
質は免疫吸着操作法によって除去され得る。 Ｘ１１１１７ＩにＡ′Ｆを産生さ−Ｕるだめの上記の方
法及び該方法に有用な諸種のベクターをその特定の態様
に関連させて記述したけれどもそれらは更に変改されｊ
（ｊるごと及び本発明のいかなる変改、使用又は適用り
本発明並びに本発明の一般的に包含されることを適業技
術４イは理解すべきである。
添付図面の第１図はベクターＭ ｌ ３ ｍ ｐ ｌ
ＯをＬｒ（＋−１ａｃプ１：１モーター受容のために使
用される線状断片へ転化さ・ける諸工程を示す。 第２図はプラスミドｐＤｌン５４０からｔｒｐ −Ｉ
ａ ｃプロモーター断ハをｉｉ１離するルト丁程を示す
。 第３図は第１及び第２図の工程からの最終断片（１復数
）を融合させて融合物をベクターＩＴＩ ｌ ３′［Δ
Ｃへ転化さ−１る諸工程を示す。 第４図はヒトのα＝−１−アンチトリプシンのｊＦ形的
のための遺伝子暗号配列を示す。 第５Δ図はｐ Ｕ ＣＩ ａ内のＩａｃＺ遺伝子の開始
時の多連類１） Ｎ Ａ配列及び対応アミノ酸配列を示
す。 第５１３図はプラスミＩ ｐ Ｕ Ｃ−アルファー １
の制限地図である。 第６図はプラスミドＭ１３α、八′Ｆの制限地図である
。 第７図は例３の操作に従って調製されたｌａｃ Ｚ−α
１ へ′Ｆ融合りンバク質のエラスターセ結合試験の結
果を示す。 図面の浄ノー（内容に変更なし）゛ ＦＩＧ、４−（−の１ １ ２３４５６７８４ １ ２ ３ ４’ ＰＲＯＳＥＲＬＥＵ ＧＬＹ ＣＹ
Ｓ ＡＲＧ ’３ＥＲＴＨＲＬＩＭＩ３ｍｐＨ／ｐＬＪ
ｃ１３ ＴＨＲＭＥ丁 ＩＬＥ ＴＨＲＡ丁Ｇ ＡＣＣ
ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＣＧ ＣＣＡ ＡＧＣＴＴＧ ＧＧ
Ｃ丁ＧＣＡＧＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＣＴＨｉｎｄｌｒｌ
Ｐｓｔｌ ５ａｌｌ ＸｂａｆＡｃｃｌ 、Ｈｉｎｃ
ＩＩ ＦＩＧ、−５Ａ ｌ ｔｏ １１ １２ １３ １４ １５ １６：ＵＧ
ＬＵＡＳＰＰＲＯＡＲＧＡＬＡＳＥＲＳＥＲ５６７８Ａ
ＳＮ ＳＥＲＬεＬＩ ＡＬＡ Ａ ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣＣＧＧ ＧＣＧ ＡＧＣＴ
ＣＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＧＣＧＢａｍＨＩ Ｘ
ｍａＩ ５ａｔｌ ＥｃｏＲＩ Ｈｏｅｌｌｌｍａｌ ＦＩＧ、 ６ 第１頁の続き ［相］Ｉｎｔ、Ｃ１，４識別記号 庁内整理番２１−４ ３５−４ ３５−４ ６０−４ 号 三「 続 捕 ｔｈ 書く方式） ；七、補正をする：打 ’１１性との関係 出 願 人 ４、代理人
ＯをＬｒ（＋−１ａｃプ１：１モーター受容のために使
用される線状断片へ転化さ・ける諸工程を示す。 第２図はプラスミドｐＤｌン５４０からｔｒｐ −Ｉ
ａ ｃプロモーター断ハをｉｉ１離するルト丁程を示す
。 第３図は第１及び第２図の工程からの最終断片（１復数
）を融合させて融合物をベクターＩＴＩ ｌ ３′［Δ
Ｃへ転化さ−１る諸工程を示す。 第４図はヒトのα＝−１−アンチトリプシンのｊＦ形的
のための遺伝子暗号配列を示す。 第５Δ図はｐ Ｕ ＣＩ ａ内のＩａｃＺ遺伝子の開始
時の多連類１） Ｎ Ａ配列及び対応アミノ酸配列を示
す。 第５１３図はプラスミＩ ｐ Ｕ Ｃ−アルファー １
の制限地図である。 第６図はプラスミドＭ１３α、八′Ｆの制限地図である
。 第７図は例３の操作に従って調製されたｌａｃ Ｚ−α
１ へ′Ｆ融合りンバク質のエラスターセ結合試験の結
果を示す。 図面の浄ノー（内容に変更なし）゛ ＦＩＧ、４−（−の１ １ ２３４５６７８４ １ ２ ３ ４’ ＰＲＯＳＥＲＬＥＵ ＧＬＹ ＣＹ
Ｓ ＡＲＧ ’３ＥＲＴＨＲＬＩＭＩ３ｍｐＨ／ｐＬＪ
ｃ１３ ＴＨＲＭＥ丁 ＩＬＥ ＴＨＲＡ丁Ｇ ＡＣＣ
ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＣＧ ＣＣＡ ＡＧＣＴＴＧ ＧＧ
Ｃ丁ＧＣＡＧＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＣＴＨｉｎｄｌｒｌ
Ｐｓｔｌ ５ａｌｌ ＸｂａｆＡｃｃｌ 、Ｈｉｎｃ
ＩＩ ＦＩＧ、−５Ａ ｌ ｔｏ １１ １２ １３ １４ １５ １６：ＵＧ
ＬＵＡＳＰＰＲＯＡＲＧＡＬＡＳＥＲＳＥＲ５６７８Ａ
ＳＮ ＳＥＲＬεＬＩ ＡＬＡ Ａ ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣＣＧＧ ＧＣＧ ＡＧＣＴ
ＣＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＧＣＧＢａｍＨＩ Ｘ
ｍａＩ ５ａｔｌ ＥｃｏＲＩ Ｈｏｅｌｌｌｍａｌ ＦＩＧ、 ６ 第１頁の続き ［相］Ｉｎｔ、Ｃ１，４識別記号 庁内整理番２１−４ ３５−４ ３５−４ ６０−４ 号 三「 続 捕 ｔｈ 書く方式） ；七、補正をする：打 ’１１性との関係 出 願 人 ４、代理人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） 哺乳動物のアルファー１−アンチ１リプシンの
ゾｌ」テアーセ阻害活性を有するポリペプチドの産生方
法において、哺乳動物のアルファ〜Ｉ−アンナトリゾシ
ンに関する＋＋（＋号解読のためのセグメン１−をイ１
するｌ） Ｎ Ａ転移ヘクターによって形質転換された
細菌の培養物を生育させる上程を包含することを特徴と
−づる方法。 （２）イ１）１菌の中・＼Ｉ） Ｎ Ａ転移ヘクターを
導入する−に程をＩＩ擾こ含む特許請求の範囲第１項記
載の方法。 （２（） 咄゛ｙ１４動物のアルファー １−アンチト
リプシンＣ，二閏づ゛る暗−′；３解Ｓｉコのための該
セグメントを有するＪｌ！ｉ宜の−、フタ−を変換させ
てＩ）ＮΔ転転移ツクター形成さ・υるに稈を更に含む
特許請求の範囲第２項記載のツノ法。 （４）細菌が大腸菌Ｅ、＝＋りを包含する特許請求の範
囲第１．２又は３項記載の方法。 （５１ＤＮΔ転移ヘクターがＭ１３りｌ−１−ン形成−
・フタ−から誘導されたものである特許請求の範囲第４
項記載の方法。 ＋６１ ＤＮＡ転移−・フタ−内での−ｌｌラフ−−］
−アアンチ１リプシン表現がｔｒｐ−１ａｃ −）″
Ｌｚモーターによって制御される特シ′１請求の範囲第
５項記載の方法。 （７１ｔｒｐ−１ａｃプロモーターがプラスミｔ” １
） ｌ） Ｒ５４０から誘導される′１．′ｌ許請求の
範囲第６項記載の方法。 （８）相許請求の範囲第１．２又は３ ｉｆ↓記載の方
法により産生されたポリペプチド。 （≦））特許請求の範囲第４項記載の方法に１ＪＬっ゛
（Ｊ’）、を生されたポリペプチド。 （１０）特許請求の範囲第５項記載の方法Ｇ、二従っ゛
（産生されたポリペプチド。 （ＩＩ）特許請求の範囲第６項記載の方法に征って産生
されたポリペプチド。 （１２、特許請求の範囲第７項記載の方法Ｑ、二従って
産生きれたポリペプチド。 （１３） 哺乳動物におりるアルファー１−アンチトリ
プシンの軍的不足に関連する病的症候の治療ブｊ法にお
いて、特許請求の範囲第８項記載のポリペプチドの製薬
学的有効量を該哺乳動物に投与する処；す”を特徴とす
る方法。 （１４） 投Ｉｊ、が吸入によって達成される特許請求
の範囲第１３項記載の方法。 （１５） 投与が静脈内で達成される特許請求の範ｖｌ
ｌ第１３ Ｊｌ記載の方法。 （１６） 細菌にアルファー１−アンチトリプシンを表
現さ・ｔ！１：ｆるＩ） Ｎ Ａベクターを構成する方
法において、アルファー１−アンチトリプシンに関する
暗号を含む構造遺伝子を有するＤＮ、Ａセグメントを、
適宜に位置する翻訳開始暗月及び翻訳停止暗−υ並びに
プロ千−ターセグメンｉ・と共に、転移ヘクター内へ挿
入すること、但し該転移ベクターは細菌起源の複製物を
包含することを特徴とする方法。 （１７）転移ベクターがＭＩ３クーロン形成へフタ−か
ら誘導されたものである特許請求の範囲第１６項記載の
方法。 （１８） プロモーターセグメントが［ｒＴｌ−１ａｃ
プロモーターを包含する特許請求の範囲第１ ’１項ｎ
己ｈｋの方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52219083A | 1983-08-10 | 1983-08-10 | |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60186290A true JPS60186290A (ja) | 1985-09-21 |
Family
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| Country | Link |
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-
1984
- 1984-08-09 JP JP59167269A patent/JPS60186290A/ja active Pending
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Patent Citations (2)
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