DE3785864T2

DE3785864T2 - Verfahren zur Herstellung von menschlichem Epidermalwachstumsfaktor und dessen Analogen.

Info

Publication number: DE3785864T2
Application number: DE87301490T
Authority: DE
Inventors: Charles Michael Dr Cohen; Roberto Dr Crea
Original assignee: Creative Biomolecules Inc
Current assignee: Creative Biomolecules Inc
Priority date: 1986-02-24
Filing date: 1987-02-20
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2007-02-21
Also published as: EP0234888B1; US4743679A; JPS62246600A; CA1269055A; US5004686A; EP0234888A3; DE3785864D1; EP0234888A2; AU595290B2; ATE89602T1; AU6901187A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zum Erzeugen und Verwenden von Epidermalwachstumsfaktor (EGF) und Analogen von ihm mit biologischer Aktivität.

Stand der Technik

Epidermalwachstumsfaktor (EGF) und seine Analogen bilden eine Familie von Polypeptiden mit einer Vielzahl von biologischen Aktivitäten. Menschlicher EGF selbst ist ein 53 Aminosäure-Polypeptid. Seine Analogen variieren in der Zahl der Aminosäuren in der Polypeptidkette. Eine Vielzahl von ihnen ist in der Literatur beschrieben worden. Vgl. z. B. US-Patent Nr. 3,917,824, ausgegeben am 4. November 1975. In der Literatur wurden auch verschiedenartige biologische Aktivitäten für diese Materialien beschrieben. Jedes Material kann die gleiche Aktivität oder eine breite biologische Aktivität wie die anderen haben oder auch nicht, aber im allgemeinen wurde gefunden, daß EGF und seine Analogen die Sekretion von Magensäure hemmt und Zellenwachstum fördert. Auf diese Weise waren sie brauchbar für Wundheilungsanwendungen.
Menschlicher EGF wird in dem Urin von jungen männlichen Individuen, in den maxillaren Drüsen und in verschiedenen anderen Stellen in dem Körper gefunden. Gegenwärtige Verfahren zum Erzeugen von menschlichem EGF und seinen Analogen umfassen weitgehend die Isolation der aktiven Komponenten von Urin und in einem geringeren Ausmaß die Erzeugung unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren.
Die Schwierigkeit, die den ersten dieser Verfahren innewohnt, ist ganz offensichtlich. Isolation aus Urinquellen ist zeitaufwendig, teuer und abhängig von der Versorgung mit Rohmaterial. Weiterhin ist die Isolation von intaktem menschlichem EGF kompliziert durch das Vorhandensein von nahe verwandten Analogen. Gegenwärtige Verfahren, die zu einer Rekombinanten-Methode zum Erzeugen von EGF fahren, waren noch nicht vollständig zufriedenstellend wegen offensichtlicher Instabilität von menschlichem EGF während der Herstellung und der Reinigung. Einige der Nachteile ergeben sich deutlicher, wenn nähere Einzelheiten in dieser Beschreibung beschrieben werden.
EGF, das auch als Urogastron bekannt ist, enthält 53 Aminosäuren, wie in der folgenden Sequenz gezeigt ist:
Die obenstehende Formel ist die Formel für EGF, wie er in menschlichen Wesen existiert und in der Literatur beschrieben wird. Die Erfindung bezieht sich, wie sie hier beschrieben wird, auf die mit Mikroben verbundene Erzeugung von menschlichem EGF und einige seiner biologisch aktiven Analogen. Sie ist jedoch in gleicher Weise anwendbar auf Mäuse-EGF und in der Tat jeglichen EGF, der eine gleiche oder kleinere Anzahl von Glutamylresten wie menschlicher EGF hat.
Es soll bemerkt werden, daß in der oben angegebenen Sequenz die Reste 5, 24, 40 und 51 Glutamyl sind. Das Molekül in seiner natürlichen Form ist so gefaltet, daß es Disulfid- Verbindungen zwischen den Resten 6-20, 14-31 und 33-42 gibt.
Während es in hohem Maße wünschenswert ist, dieses Material in rekombinanten DNA-Systemen unter Verwendung von E.Coli zu erzeugen, gibt es ein signifikantes Hindernis, das überwunden werden muß, weil das E. Coli die Tendenz hat, den EGF in seiner reduzierten Form zu erzeugen, der nicht stabil in Anwesenheit von endogenen bakteriellen Proteasen ist. Es ist in der Literatur berichtet worden, daß man zum Erhöhen der Stabilität eine Leader-Sequenz verwenden sollte, um ein unlösliches Fusionsprotein zu erzeugen, das leicht von dem Zellbrei rückgewonnen werden kann. Die Selektion der spezifischen Leader-Sequenz ist bekanntlich schwierig. Am Ende der Polypeptid-Isolationsphase muß die Leader-Sequenz abgetrennt und von der EGF-Hälfte an deren N-Endaminogruppe abgebaut werden. Selbst wenn eine geeignete Leader-Sequenz verwendet wird, treten große Schwierigkeiten beim Reinigen des entstehenden Polypeptids auf. Oft tritt der Fall ein, daß lästige chromatografische Trennungen erforderlich sind, die zu einem Verlust an Produkt führen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung liefert rekombinante DNA-Verfahren zum Erzeugen von Fusionsproteinen, die menschlichen EGF und neue Analoge einschließen. Sie bezieht sich auch auf Verfahren zum Einführen eines Glutamylrestes an dem Punkt der Befestigung der Leader-Sequenz und der ersten Aminosäure des EGF. Schließlich liefert sie biochemische Verfahren zum Erzeugen von EGF und Analogen von den Fusionsproteinen durch eine spezifische, vorzugsweise enzymatische Spaltung des Glu-Restes, der vor der Aminosäure-Sequenz von EGF und Analogen vorangeht.
Die Aminosäure-Sequenz einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform der EGF-Analogen der vorliegenden Erfindung, zusammen mit den Nukleinsäure-Sequenzen von Struktur-Genen, die diese Analoge kodieren, und in den Genen enthaltene Spaltstellen werden hier offenbart. Auch wird die Aminosäure-Sequenz der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen von Leader-Peptiden, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung aufgebaut sind, zusammen mit der DNA-Sequenz, die dieses Leader-Peptid kodiert, und Restriktionsendonuklease-Spaltstellen, die innerhalb der DNA- Sequenz enthalten sind, offenbart.

Beschreibung

Gemäß der Erfindung werden neue EGF-Analoge als Fusionsproteine, die EGF enthalten, geliefert. Solche Fusionsproteine können selektiv in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung an der Glu-Spaltstelle angrenzend an den EGF durch Behandlung mit einer Glu-spezifischen Protease gespalten werden.
Die Fachleute werden erkennen, daß selektive Spaltung an der spezifischen Glu-Stelle nicht offensichtlich ist, da es vier Glu-Reste in dem EGF-Molekül gibt. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist gefunden worden, daß eine Glu-spezifische Protease an dem Glu-Rest-N-Ende des EGF spalten kann, ohne die Glu-Reste in dem EGF-Molekül wesentlich zu ändern. Es wird angenommen, daß die spezifische Faltung des Moleküls und die Konformationsstabilität, die durch die drei Disulfid-Verbindungen geliefert wird, die inneren Glu-Reste gegen Angriff durch das Enzym schützen. Zusätzlich kann die Aminosäure-Sequenz, die die spezifische Glu-Spaltstelle flankiert, ausgelegt werden, um eine Vorzugsstelle für Hydrolyse durch eine Glu-spezifische Protease zu liefern. Auf diese Weise werden beispielsweise Glu-5, Glu-25 und Glu-40 überraschenderweise nicht leicht abgespalten. Jedoch kann Glu-51 leicht abgespalten werden wegen ihrer Lage an dem C-Anschlußende des menschlichen EGF. Bei der praktischen Durchführung der bevorzugten Mode der vorliegenden Erfindung werden sehr niedrige Niveaus der 25 und 40 Aminosäure-Analoge erzeugt, während etwa gleiche Mengen der 53 und 51 Aminosäure-Analoge erzeugt werden.
Es werden auch DNA-Sequenzen geliefert, die in der Lage sind, die Expression von solchen Analogen und Fusionsproteinen zu leiten, wodurch das Struktur-Gen für den EGF in einem geeigneten Expressionsvektor in Lesephase mit einer Sequenz von DNA ist, die für eine zusätzliche Sequenz von Aminosäuren und eine selektive Spaltstelle kodiert. Expression der DNA-Sequenz liefert ein Fusionsprotein, das das EGF-Analoge und eine selektive Glu-Spaltstelle angrenzend an das Analoge umfaßt.
Bei der vorliegenden Erfindung werden auch Mikroorganismen geschaffen, die solche Expressionsvektoren enthalten, die unter geeigneten Zeiten und Bedingungen der Inkubation veranlaßt werden können, die Fusionsproteile und Analoge der vorliegenden Erfindung zu expremieren.
Die Peptid-Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen im allgemeinen EGF-Analoge mit der folgenden Formel:
X-Glu-EGF,
wobei X ein Leader-Sequenz-Oligopeptid mit bis zu 200 Aminosäuren ist, Glu ein Glutamyl-Rest ist und EGF die Aminosäure-Sequenz für Epidermalwachstumsfaktor oder ein Analoges desselben mit zwischen 42 Aminosäuren und 53 Aminosäuren ist, der EGF an seinem N-Ende an den besagten Glu-Rest angeheftet ist und der besagte Glu-Rest an das C-Ende des Leader-Sequenz-Oligopeptids angeheftet ist; wobei die Peptid-Verbindung spaltbar ist durch eine Gluspezifische Protease, um X vom EGF abzutrennen, um aktiven EGF zu bilden; oder eine DNA, die das besagte Peptid kodiert.
Aktive Analoge, die die vorstehend beschriebenen allgemeinen Strukturmerkmale haben, können in Übereinstimmung mit der Offenbarung der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, wobei Variationsfähigkeit in den Aminosäure-Substitutionen in solchen Bereichen gestattet ist, wo Sequenzerhaltung niedrig ist. Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung können erhalten werden, indem die oben angegebene Formel auf zahlreiche Arten modifiziert wird, während die Aktivität der so erhaltenen Peptid-Verbindungen haltbar gemacht wird.
Zum Beispiel, während die Aminosäuren dieser Peptide normalerweise in der L-Form vorliegen, können eine oder mehrere, üblicherweise zwei oder weniger, mit der optischen Isomer-D-Form substituiert werden. Innerhalb der Peptid-Verbindungen enthaltene Aminosäure-Reste können auch durch Acylierung modifiziert werden oder mit anderen chemischen Gruppen substituiert werden, die zum Beispiel die Löslichkeit dieser Verbindungen ändern können, ohne ihre biologische Aktivität anzugreifen.
Weiterhin können einer oder mehrere Aminosäure-Reste durch funktionell äquivalente Reste ersetzt werden; zum Beispiel können basische polare Aminosäuren durch andere basische polare Aminosäuren ersetzt werden, und saure polare Aminosäuren können durch andere polare Aminosäuren ersetzt werden. Jedoch wird die Substitution von bestimmten Aminosäuren, insbesondere Cysteinen, als weniger wünschenswert angesehen wegen der Gefahr des ungünstigen Zusammenwirkens mit der Bildung der Cysteindisulfid- Brücken bei 6-20, 14-31 und 33-42.
Im allgemeinen sind X in der obigen Formel N-endständige Verlängerungen, die als Leader-Peptide bezeichnet werden, die ausgelegt sind, um die Expression des EGF und Analoger in dem gewählten Zell-Expressions-System zu maximalisieren. Diese Leader-Peptide sind ausgelegt worden, um Reinigung des EGF-Fusions-Analogen zu erleichtern, wie es in dem Beispiel dargestellt wird. Eine Glu-Spaltungsprotease, wie sie unten beschrieben ist, wird als Spaltungsmittel verwendet.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind die Leader-Peptide in dem offenbarten Fusionsprotein ausgelegt worden, um jegliches Cystein und jegliches, außer einem N-endständigen Methionin und einer C-endständigen Glutaminsäure auszuschließen. Die Aminosäure-Sequenz der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform eines Leader-Peptids in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung liefert eine Spaltstelle für Staphylococcus aureus V8 Protease. Auf diese Weise liefert die gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform eine Stelle für Spaltung durch ein Verfahren, das erstaunlicherweise nicht das Freisetzen des aktiven EGF und Analoger beeinträchtigt.
Weiterhin verhindert das Eliminieren von Cystein-Resten in dem Leader-Peptid mögliche Wechselwirkungen und Beeinträchtigungen der Obligatorenbildung von Disulfid-Brücken in den aktiven Analogen. Zusätzlich sollten die Leader- Peptide von minimaler Länge sein, um die Synthese von unnötigen Mengen an Leader-Peptid mit dem zugehörigen uneffizienten Einsatz der zellularen Maschinerie in transformierter Zellkultur zu vermeiden.
Eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform von Leader- Peptiden des oben beschriebenen Typs wird durch die folgende Formel geliefert: Tabelle I
Die gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform der DNA, die das obige Leader-X kodiert, ist in dem Beispiel beschrieben. Man versteht leicht, daß die DNA-Sequenzen und das Struktur-Gen, das verwendet wird, um für die Expression des Fusionsproteins zu sorgen, wirksam durch äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen in Übereinstimmung mit der Degeneration des genetischen Cods ersetzt werden können. Weiterhin können Modifikationen in der Aminosäure-Sequenz der verschiedenen Leader-Peptide und Analogen-Verbindungen durch Änderungen in der Nukleotid-Sequenz des geklonten Struktur-Gens und der DNA-Sequenz, die zum Leiten der Synthese des Analogen und des Fusionsproteins verwendet wird, bewirkt werden. In solche Modifikationen der DNA-Sequenz sind eingeschlossen die Substitution der verschiedenen Kodone durch andere Kodone, die die Synthese der gleichen Aminosäure leiten. Eingeschlossen sind auch Kodon-Substitutionen, bei denen einer oder mehrere Aminosäure-Reste durch funktionell äquivalente Reste ersetzt werden können, wie oben beschrieben wurde.
Wenn einmal die Auslegung der DNA-Sequenz gewählt worden ist, kann sie mit anderen DNA-Sequenzen verbunden werden, um Replikation und Expression zu ermöglichen. Es sind zahlreiche Vektoren verfügbar für die Erzielung von Expression in Zellen wie z. B. Mikroorganismen, einschließlich Bakterien und Pilzen, oder verschiedene eukaryotische Zellen wie Hefe oder eingerichtete Zellinien. Wirte, die in der Lage sind, solche Vektoren aufzunehmen, umfassen E.Coli, S.Cerevisiae, B.Subtilis, Säugetierzellen und dergleichen.
Es ist allgemein wünschenswert, wenigstens einen Marker in das Replikationssystem einzubauen, um Selektion und Aufrechterhaltung des DNA-Vektors, der die synthetische DNA-Sequenz enthält, in dem Wirt zu gestatten. Es sind in der Technik zahlreiche Marker bekannt, und sie schließen antibiotische Widerstandskraft, Beständigkeit gegen Schwermetalle und anderes ein.
Das Auslegen des Fusionspeptids, das das interessante EGF-Analoge enthält, wird in wünschenswerterweise die Erzeugung des Analogen in bakteriellen Expressions-Systemen ermöglichen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Leader-Peptid eine synthetische Aminosäure-Sequenz sein, die so ausgelegt ist, daß die Stabilität und die Ausbeute des Expressionsproduktes verbessert werben und Spaltung eines aktiven EGF-Fragments erleichtert wird durch Vorsehen eines Glu-Restes an dem Punkt der Befestigung an dem EGF. Beispielsweise kann ein geeignetes Fusionsprotein Refraktionskörper innerhalb des bakteriellen Expressions-Systems bilden und kann bis zu näherungsweise 50% des gesamten Proteingehaltes der bakteriellen Zelle umfassen.
Unlöslichkeit der Fusionspeptide, die in solchen Refraktionskörpern enthalten sind, können jedoch die Ausbeute des gewünschten biologisch aktiven Analogen vermindern, wenn nicht darauf geachtet wird, daß sichergestellt ist, daß die Fusionspeptide für eine Löslichkeitsvorschrift geeignet sind.
Wenn einmal das Fusionsprotein von dem Expressions-System erhalten worden ist, wird das Leader-Peptid wünschenswerterweise von dem Fusionsprotein entfernt, um das biologisch aktive EGF-Analoge zu erzeugen. Während irgendeine Spaltung angewendet werden kann, ist es ein Merkmal dieser Erfindung, daß enzymatische Spaltung an dem Glu-Rest durchgeführt werden kann, der der ersten Aminosäure des biologisch aktiven EGF vorangeht, indem die Staphylococcus aureus V8 Protease oder irgendein anderes selektives Glu-Spaltungsenzym verwendet wird.
Verbindungen dieser Erfindung, von denen sich gezeigt hat, daß sie die oben genannten physiologischen Wirkungen haben, können bei therapeutischen Anwendungen, die aus verbesserten Zellwachstumseigenschaften Vorteil ziehen, Verwendung finden. Auf diese Weise können diese Verbindungen Verwendung finden als therapeutische Mittel zum Heilen von Wunden wie von Verbrennungen und Abschürfungen und für Behandlung von Magengeschwüren oder dergleichen.
Diese Verbindungen können Säugetierwirten fuhr Veterinärzwecke wie Haustieren und für klinische Zwecke bei Menschen auf eine Weise, die ähnlich wie für andere therapeutische Mittel ist, verabreicht werden, und zwar sowohl äußerlich als auch systemisch in einem physiologisch annehmbaren Träger. Im allgemeinen wird die Dosierung von etwa 0,001 bis 100 mg/kg des Wirtskörpergewichtes reichen. Dosierungen innerhalb dieser Bereiche können topisch in einer Menge pro Verabreichung reichen, die in Abhängigkeit von der Schwere des behandelten Zustands variieren kann, bis die günstigen Wirkungen erhalten worden sind.
Diese Verbindungen können unverdünnt, als Mischungen mit anderen pharmakologisch aktiven oder inaktiven Materialien oder mit physiologisch geeigneten Trägern wie z. B. Wasser oder normaler Salzlösung verabreicht werden. Die Verbindungen können parenteral, z. B. durch Injektion verabreicht werden. Die Injektion kann subkutan, intravenös oder intramuskulär sein.
Diese Verbindungen werden wünschenswerterweise in pharmazeutisch wirksamen Mengen und oft als pharmakologisch annehmbare Salze wie als saure Additionssalze verabreicht. Solche Salze können z. B. Hydrochlorid, Hydrobromid, Phosphat, Sulfat, Acetat, Benzoat und Malat unter anderem einschließen.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch zum Herstellen von Antiseren für die Verwendung in Immunoassays verwendet werden, wobei markierte Reagenzien, üblicherweise Antikörper, verwendet werden. Herkömmlicherweise können die Verbindungen an ein Antigen konjugiert werden mittels Dialdehyden, insbesondere eines aliphatischen Dialdehyds mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder eines Carbodiimids. Diese Verbindungen und iminunologischen Reagenzien können mit einer Vielzahl von Markierungsmitteln wie Chromophoren, Fluorphoren wie z. B. Fluorescein oder Rhodamin, Radioisotopen wie ¹²&sup5;I, ³&sup5;S, ¹&sup4;C, ³H oder magnetisierten Teilchen durch in der Technik gut bekannte Mittel markiert werden.
Diese markierten Verbindungen und Reagenzien oder markierte Reagenzien, die in der Lage sind, sie zu erkennen und sich spezifisch an sie zu binden, können Verwendung finden als z. B. diagnostische Reagenzien. Proben, die von biologischen Untersuchungsmaterialien abgeleitet sind, können auf das Vorhandensein oder die Menge von Substanzen mit einer allgemeinen antigenen Determinante mit Verbindungen der vorliegenden Erfindung getestet werden. Zusätzlich können monoklonale Antikörper durch an sich in der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden, wobei diese Antikörper therapeutische Anwendung finden können, z. B. um Überproduktion von immunologisch verwandten Verbindungen in vivo zu neutralisieren.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt spezifische Spaltverfahren, die Erzeugung von maximalen Mengen von dem 53 und 51 Aminosäure-EGF erleichtern und bei minimalen Mengen der anderen Analogen, wie sie durch Spaltung an den anderen Glu-Resten erhalten werden könnten.
Die Beispiele werden im einzelnen bevorzugte Ausführungsformen der Verfahrensbedingungen erläutern, aber im allgemeinen sind sie wie folgt:
Folgend auf die Bildung in dem Wirtsystem wird das EGF- Fusionsprotein in der Zelle ausgefällt und von ihr abgetrennt, wobei Standardtechniken angewendet werden. Bei dem bevorzugten Verfahren werden die Fusionsprotein-Flüssigkeitsüberstände von Harnstoff-Solubilisationen erhalten, bei denen vorzugsweise 8M Harnstoff verwendet wird, und werden dann auf eine chromatografische Säule aufgebracht und von dieser mit einer geeigneten Puffer/Lösungsmittel-Mischung eluiert. Das angereicherte EGF-Fusionsprotein wird dann mit der Glu-Spaltungsprotease behandelt, am meisten zu bevorzugen mit Staphylococcus aureus V8 Protease (eine geeignete Form ist von Miles Laboratories erhältlich). Das Enzymverhältnis ist kritisch zur Erzielung einer maximalen Menge von 53 und 51 Aminosäuren EGFs und minimaler Mengen anderer Analoge. Ein geeignetes Enzym: Substrat-Verhältnis reicht von 1 : 500 bis 1 : 10000, obgleich 1 : 1000 die besten Ergebnisse liefert.
Die Zeit für Hydrolyse läuft üblicherweise von 8 bis 15 Stunden, am meisten zu bevorzugen um 10 bis 12 bei erhöhten Temperaturen von 320 bis 40ºC, am meisten zu bevorzugen 37ºC.
Um die Einzelheiten der vorliegenden Erfindung in näheren Einzelheiten zu erklären, wird das Folgende zusammen mit erläuternden Beispielen angegeben.

Erläuterung durch Beispiele

Rekombinante DNA-Standardverfahren

Praktiker in der Technik werden vertraut sein mit den allgemeinen Verfahren der Vektorkonstruktion, Transformation, DNA-Sequenzierung, Sondentechniken, Stellen-spezifischer Mutagenese und dergleichen. Viele dieser Techniken sind in Standard-Laborhandbüchern beschrieben wie dem von Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor Press.
Jedoch sind der Einfachheit halber die Bedingungen, die bei der praktischen Durchführung der Erfindung nützlich sind, nachfolgend vorgeschlagen. Wie aus den folgenden Beispielen ersichtlich sein wird, wurden manchmal Modifikationen und Alternativen dieser Verfahren angewendet.

Vektorkonstruktion

DNA-Sequenzen, die von Plasmiden, Phagen, cDNA oder synthetischen Fragmenten, die in Vektoren geklont sind, abgeleitet sind, können manipuliert werden, indem nun Standardverfahren verwendet werden. Im allgemeinen werden DNA-Sequenzen gespalten, indem Restriktionsenzyme (R.E.) verwendet werden, die kommerziell erhältlich sind. Die Bedingungen der Spaltung bezüglich pH, Zeit, Temperatur und Konzentration des Enzyms sind typischerweise von dem Hersteller spezifiziert angegeben. Nach jeder Inkubation wird Protein durch Extraktion, z. B. mit Phenol/Chloroform, entfernt, und die Nukleinsäurefraktion wird durch Ausfällung mit Ethanol rückgewonnen. Größentrennung der Spaltfragmente kann durchgeführt werden, indem standardmäßige Agarose- oder Polyacrylamidgel-Elektrophoresetechniken angewendet werden, die in "Methods in Enzymology" (1980) 65 : 499-560 beschrieben sind. Fragmente können abgestumpft werden, wenn es gewünscht wird, indem sie mit E.Coli DNA Polymerase I (Klenow-Fragmente) in Anwesenheit der vier Desoxynukleotid-Triphosphate (dNTPs) bei Umgebungstemperatur über etwa 30 Minuten in 50 uM der dNTPs behandelt werden. Das Ausmaß des Auffüllens an den klebrigen Enden kann natürlich durch geeignete Wahl der dNTPs reguliert werden. Behandlung unter geeigneten Bedingungen mit SI- Nuklease entfernt einstrangige Abschnitte. Ligationen werden unter Verwendung von T8-DNA-Ligase bei pH 7,5 in Tris-Puffer unter Bedingungen durchgeführt, die von dem Hersteller empfohlen werden.
Die Konstruktion der beabsichtigten DNA-Sequenz wird bestätigt durch transformierende E.Coli oder andere geeignete Wirte, wobei erfolgreiche Transformanten ausgewählt werden, indem die geeigneten antibiotischen Widerstands- oder andere Marker verwendet werden, und Plasmide von Transformationen analysiert werden, z. B. durch das Verfahren von Clewell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1970), 74 : 5463 , wie weiterhin beschrieben von Messing et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9 : 309, oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology (1980) 65 : 499.
Transfektion von DNA-Vektoren in E.Coli oder andere Prokaryoten wird durchgeführt, wie es von Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1972) 69 : 110, beschrieben ist; Transformationen für Säugetierzellen erfolgen durch das Verfahren von Graham und Van der Eb, Virology (1978) 52 : 546.
Alternativen und Modifikationen der vorstehenden Verfahren sind auch anwendbar, aber die oben angegebenen Verfahren sind typisch für solche, die bei der Erfindung brauchbar sind.

Wirte und Steuersequenzen

Die DNA-Fragmente der Erfindung, die fuhr das EGF-Fusions- Analoge kodieren, können in einer Vielzahl von Expressions- Systemen verwendet werden, um die gewünschten Proteine zu erzeugen. Prokaryotische Systeme verwenden in der üblichsten Weise E.Coli als Wirt, obgleich andere bakterielle Stämme wie Bacillus, Pseudomonas, oder andere Gram-positive oder Gram-negative Prokaryoten auch verwendet werden können. Wenn prokaryotische Wirte verwendet werden, werden arbeitende Steuersysteme, die mit diesen Wirten kompatibel sind, an die DNA-Fragmente der Erfindung geknüpft (ligiert) und auf einem geeigneten Transfervektor angeordnet, der zur Replikation in der bakteriellen Wirtszelle fähig ist. Hauptketten-Vektoren, die zur Replikation fähig sind, umfassen Phagen-Vektoren und Plasmid-Vektoren, wie es in der Technik bekannt ist. Übliche Plasmid-Vektoren schließen solche ein, die von pBR322 und den pUC-Reihen abgeleitet sind. Charon-lambda-Phage ist ein häufig verwendeter Phagen-Vektor. Steuersequenzen schließen obligatorisch Promotor und Ribosomen- Bindungsstelle kodierende Sequenzen ein, und eine Vielzahl solcher Steuerungen sind in der Technik verfügbar, wie z. B. die Beta-Lactamase (Penicillinase) und Lactose (lac) Promotor-Systeme, Chang et al., Nature (1977) 198 : 106, und das Tryptophan (trp) Promotor-System, Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8 : 4057. Zusammengesetzte Promotoren, die Elemente sowohl von dem trp als auch dem lac Promotor-System enthalten, sind auch in der Technik- verfügbar.
Eukaryotische Mikroben können auch fuhr die Expression verwendet werden, und zwar am üblichsten Laboratoriums-Stämme von Saccharomyces cerevisiae oder Bäckerhefe. Eine Anzahl von Hefe-Steuersystemen und Vektoren steht zur Verfügung, einschließlich solchen, die Promotoren für die Synthese von glycolytischen Enzymen sind, Hess et al., J.Adv. Enzyme Res. (1968) 7 : 149; Holland et al., Biochemistry (1978) 17 : 4900. Hefe-Vektoren, bei denen der 2 Mikron-Ursprung der Replikation angewendet wird, sind als Transfervektoren geeignet (vgl. z. B. Broach, Meth Enzym. (1982) 101 : 307)
Gewebekulturzellen, bei denen immortalisierte Zellinien von Säugetieren oder anderen höheren Organismen verwendet werden, sind auch als rekombinante Wirte verwendet worden. Solche Zellinien schließen Ovarium von chinesischem Hamster (CHO), Vero, HeLa und Cos Zellen ein. Im allgemeinen wird das Cos-Zellensystem für vorübergehende Expression verwendet, während CHO-Zellen typischerweise transformierte DNA in das Chromosom integrieren. Geeignete Säugetier-Vektoren sind im allgemeinen basierend auf viralen Ursprüngen von Replikation und Steuersequenzen. Am üblichsten verwendet werden die Simian Virus 40 (SV40) Promotoren und Replikonen (Fiers et al., Nature (1978) 273 : 113) und ähnliche Systeme, die von Adenovirus 2, bovinem Papilloma Virus oder Avian Sarcoma Virus abgeleitet sind.
Die Schritte beim Konstruieren eines mikrobiellen Systems und die biochemischen Verfahren, die zum Erzeugen von EGF verwendet werden, werden nun beschrieben. Die charakteristischen Merkmale der beschriebenen Verfahren sind anwendbar auf die Synthese von anderen EGF-Analogen und EGF von anderen Arten und insbesondere auf die Synthese von menschlichem EGF.

DNA-Synthese und Gen-Ligation

Um eine DNA Sequenz, die in der Lage ist, die Expression des menschlichen EGF und der interessanten Analogen zu kodieren, oder ein Fusionsprotein, das diese Polypeptide enthält, zu konstruieren, werden Oligonukleotide chemisch synthetisiert, z . B. durch Festphasen-Phosphortriester- Methodenlehre, wie diejenige, die von Crea und Horn, Nucleic Acids Res., 8 : 2331-2348 (1980) beschrieben ist, oder durch ein automatisiertes System, bei dem das Phosphittriester-Verfahren angewendet wird, wie es von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters, 22 : 1859-1862, (1981) beschrieben ist.
Oligonukleotide, die für Gen-Synthese verwendet werden, variieren in der Länge, reichen jedoch im allgemeinen von 11 bis 15 Nukleotiden. Um doppelsträngige DNA-Sequenzen zu konstruieren, umfassen gewisse der Oligonukleotide den oberen Strang und andere umfassen den unteren Strang der doppelsträngigen DNA. Gewisse Abschnitte von jedem Oligonukleotid überlappen vorzugsweise Komplementär-Regionen von anderen Oligonukleotiden derart, daß die Komplementarität mit gegenüberliegenden Fragmenten Selbstaufbau durch. Wasserstoffbindung fördert. Wenn sie einmal auf diese Weise zusammengestellt ist, kann die doppelsträngige Sequenz durch Ligation vervollständigt werden, wobei z. B. DNA-Ligase verwendet wird.
Wo das strukturelle Gen und die DNA-Sequenz, die für die Expression des gewünschten menschlichen EGF oder Fusionsproteins kodieren, in einen Expressionsvektor eingeschoben werden sollen, steht vor dem Gen oder der DNA-Sequenz ein "Start" Kodon, z. B. ATG, und sofort danach folgt ein oder mehrere Beendigungs- oder Stop-Kodone. Wie hier in näheren Einzelheiten beschrieben wird, kann die Aminosäure Sequenz des Fusionsproteins expremiert werden, was proteolytische Spaltstellen anstoßend an den menschlichen EGF, vorzugsweise bei oder nahe des N-endständigen Endes des menschlichen EGF, liefert. Solche Spaltstellen werden kodiert durch das geeignete Kodon bzw. die geeigneten Kodone, die eine selektive Spaltstelle für ein Leader-Peptid-EGF- Analoges definieren.
Um das Struktur-Gen für die gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform von menschlichem EGF zu konstruieren, wurden die folgenden 26 Oligonukleotide konstruiert, die, wenn sie zusammengebaut sind, das menschliche EGF-Gen umfassen:
Diese Sequenzen wurden allgemein von Dinukleotid-Reagenzien auf einem Zellulose-Träger unter Verwendung des Phosphortriester-Verfahrens konstruiert, wie es von Crea und Horn (1980) beschrieben worden ist.
Zusätzlich wurden das Fusionspeptid-Gen, das das Leader- Peptid X&sub1; und X&sub2;, den Trp-Promotor umfaßt und das menschliche EGF-Gen der vorliegenden Erfindung enthält, durch die Synthese und Ligation von Oligonukleotid-Fragmenten konstruiert. Die Sequenzen von diesen DNAs sind in den Tabellen 2, 3 und 4 unten angegeben. Tabelle 2 Tabelle 3 * CG ist das klebrige Ende der taqI-Stelle. Diese Stelle wurde verwendet, um die Helix mit dem taqI (claI-Stelle) des synthetischen trp Promotors zu verbinden Tabelle 4 SYNTHESTISCHER TRP PROMOTOR
Mit Ausnahme der obigen Oligonukleotide wurden die anderen DNA-Fragmente, die für die Gen-Synthese verwendet wurden, von Diisopropylphosphoramidit-Nukleotiden synthetisiert (Beaucage und Caruthers, 1981), wobei die automatisierte stufenweise Additions-Vorgehensweise von Alvarado-Urbina et al., Science 214 : 270-274 (1981) verwendet wurde.
Es wurden z. B. 5'-(Dimethoxytrityl)-2'-Desoxynukleoside (1 mMol) in die entsprechenden Diisopropylphosphoramidit- Derivate in Reaktionsmischungen umgewandelt, die 15 ml wasserfreies Acetonitril, 0,6 ml trockenes 2',6'-Leutidin und 0,2 ml Chlor (N,N-diisopropylamino)methoxyphosphin enthielten. Nach 15 Minuten schütteln wurden 30 ml 7 mg/ml 1H-Tetrazol in Acetonitril zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben. Die entstandenen aktivierten Phosphoramidit- Derivate wurden für Oligonukleotid-Synthese auf einem derivatisierten Siliziumdioxid-Träger verwendet (Alvarado- Urbina et al., 1981). Ein typischer Additionszyklus bestand aus (a) Zugabe von Phosphoramidit-Derivat (1 min), (b) Stopp-Fluß (i min), (c) Zugabe von 1% Jod in Tetrahydrofuran-Pyridin-Wasser (3 : 1 : 1 v/v) (30 s), (d) Pyridinwaschung (1,5 min), (e) Methylenchloridwaschung (1 min), (f) Waschen mit 3% Trichloressigsäure in Methylenchlorid (v/v) (1,5 min), (g) Methylenchloridwaschung (1,5 min) und (h) Acetonitrilwaschung (2 min). Die Durchflußrate wurde bei 5 ml/min über den gesamten Zyklus gehalten.
Bei der Fertigstellung der Synthese wurden Oligonukleotide mit Dioxan-triethylamin-thiophenol (2 : 1 : 1 v/v) bei Raumtemperatur über 45 Minuten und dann mit konzentriertem Ammoniak über Nacht bei 55ºC behandelt. Die Oligonukleotide wurden von der entstandenen Mischung durch Dünnschicht- Chromatografie auf Kieselgel 60 Platten behandelt (Alvarado-Urbina et al., 1981). Die Reinheit und die Größe der Endprodukte wurden bestimmt durch elektrophoretische Analyse auf Polyacrylamidgelen, wie es früher beschrieben wurde (Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 5765-5769, 1978).

Gen-Ligation

Oligonukleotide 2 bis 13 und 15 bis 26 wurden mit Polynukleotid-Kinase bei 37ºC über 1 Stunde in einer Reaktionsmischung phosphoryliert, die Oligonukleotide (1,2 ug von jedem) 1 mM ATP T4-Polynukleotid-Kinase (1,2 Einheiten/ug DNA), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol und 70 mM Tris-HCl, pH 7,6, enthielt.
Ligation der Oligonukleotide 1 bis 26 wurde bei 15ºC 2 Stunden in einer Reaktionsmischung durchgeführt, die 0,75 mM ATP, T4 DNA-Ligase (1 ,5 Einheiten/ug DNA), 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM Dithiothreitol, 50 ug/ml BSA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, enthielt. Die DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese auf 8% (Gewicht/Volumen) Polyacrylamidgelen in dem Tris-Borat-EDTA-Puffersystem aufgelöst, das von Maniatis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 : 1184-1188, (1975) beschrieben ist. Banden, die bei dem erwarteten Molekulargewicht wanderten, wurden von dem Gel abgeschnitten und wurden elektro-eluiert (Maniatis et al., 1982). Die eluierte DNA wurde unter Vakuum bis zur Trockenheit gehalten und wurde in 200 ul 0,2 M Natriumacetat, pH 5, wieder suspendiert. Die Probe wurde zweimal mit einem gleichen Volumen von Phenol und Chloroform extrahiert, und die DNA wurde mit 2,5 Volumen absolutem Ethanol ausgefällt. Die gereinigten Gen-Fragmente wurden bei 4ºC in 1 mM Tris-HCl und 0,1 mM EDTA, pH 7,5, gelagert.

Verstärkung und Klonung des menschlichen EGF-Gens.

Das synthetische menschliche EGF-Gen wurde in die EcoRI und BamHI-Stellen von pUC8 eingebaut (Viera und Messing, Gene 19 : 259-268, 1982). Die synthetische menschliche EGF DNA (30 ng) und das große EcoRI/BamHI Fragment von pUC8 (100 ng) wurden kombiniert und mit T4 DNA Ligase behandelt. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um fähige Escherichia Coli K12 UT481 Zellen zu transformieren. Fähige Zellen wurden hergestellt, indem die niedrig-pH Verfahren angewendet wurden, die von Enea et al., J.Mol. Biol., 96 : 495-509, 1975 beschrieben sind. Transformanten wurden selektiert durch Ausstreichen auf NZCYM Agar (Maniatis et al., 1982), das 25 ug/ml Ampicillin enthielt. Plasmide wurden isoliert von kleinen Kulturen von transformierten Bakterien durch Anwendung einer Modifikation des Verfahrens von Birnboim und Doly, Nucleic Acid Res., 7 : 1513-1523 (1979), wie es von Maniatis et al.(1982)beschrieben ist. Gereinigte Plasmide wurden klassiert auf die Anwesenheit des 170 Basis-Paar EGF-Gen-Einschubs durch EcoRI und BamHI - Digerierung, woraufhin Polyacrylamid- Gel-Elektrophorese folgte. Zubereitungen von Plasmiden im großen Maßstab, die den menschlichen EGF-Einschub enthielten, wurden durchgeführt durch Anwendung des Alkali- Lyse-Verfahrens von Birnboim und Doly (1979).

DNA Sequenz-Analyse

Die DNA Sequenz des geklonten menschlichen EGF-Gens wurde durch das Didesoxynukleotid-Kettenbestimmungsverfahren bestimmt (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 : 5463-5467, 1977). Das das menschliche EGF-Gen enthaltende pUC8-Plasmid wurde mit EcoRI und BamHI gespalten, und der Gen-Einschub wurde durch Gel-Elektrophorese gereinigt. Das menschliche EGF-Gen wurde in die EcoRI und BamHI-Stellen von M13 mp10w und mp11w eingeschoben (New England Biolabs Messing, Methods Enzymol., 101 : 20-78, 1983). Einzelsträngige M13 Matrizen wurden hergestellt, indem das Verfahren von Schreier und Cortese, J.Mol. Biol., 129 : 169-172, (1979) angewendet wurde.

Konstruktion von DNA für das Leader-Peptid und Promotor

Die Gene für die Leader-Peptide X&sub1;, X&sub2; und den synthetischen Trp Promotor (Tabellen 2-4) wurden von der enzymatischen Ligation von chemisch synthetisierten Fragmenten konstruiert, in dem Plasmid pUC8 geklont, verstärkt und sequenziert, indem ein ähnliches Verfahren wie das, das für das obige menschliche EGF-Gen beschrieben wurde, angewendet wurde.
All die synthetischen Gene wurden von Oligonukleotiden durch DNA-Ligase unter den gleichen Bedingungen zusammengestellt, die für die Synthese des EGF-Gens berichtet wurden.
Das Gen, das dem Leader X-1 entsprach, wurde ausgelegt, damit es ein klebriges Ende trägt, das den TaqI und BamHI Restriktionsendonuklease-Stellen jeweils an den 5' und 3' Enden entspricht (vgl. Tabelle 2). Das Gen, das dem Leader X-2 entspricht, wurde mit TaqI und Bg1II klebrigen Enden ausgelegt (vgl. Tabelle 3). Weiterhin wurde ein synthetisches Gen, das dem Tryptophan (TRP) Promotor entspricht, ausgelegt und von Oligonukleotiden zusammengestellt. Dieses Gen wurde mit SacI und ClaI klebrigen Enden ausgelegt (vgl. Tabelle 4).

Klonen zur Expression von Fusions-EGF Analogen

a. Konstruktion von Glu-EGF Gen

Das EGF synthetische Gen wurde an seinem N-endständigen Ende modifiziert, um ein Kodon für den Glutamyl-Rest einzuführen, was für die spezifische enzymatische Spaltung durch Staphylococcus aureus V8 Protease notwendig ist.
Um dieses Ziel zu erreichen, wurde das in pUC8 geklonte EGF Gen als ein HinfI bis HindIII Fragment geborgen, wobei HinfII eine Stelle ist, die benachbart zu dem N-endständigen Ende des Gens ist, und HindIII eine Stelle ist, die stromabwärts von der BamHI Stelle an dem 3' Ende des synthetischen Gens liegt.
Es wurde ein Plasmid, pUC130XT, ausgelegt, um eine sehr hohe Zahl von Restriktionsenzymstellen zu liefern. Die Beschreibung des Plasmids und seines Zusammenbaus ist unten beschrieben. Dies Plasmid wurde mit BgiII und HindIII R.E. abgebaut, um die Gegenstück-klebrigen Stellen zu liefern. Das EGF Fragment und das Plasmid waren miteinander verbunden in einer Drei-Stücke-Ligation mit Hilfe eines synthetischen Fragments, dessen Sequenz wie folgt war:
Dieses Fragment wird das N-Ende des EGF Gens wieder aufbauen und ein Kodon fuhr einen Glutamyl-Rest direkt vor der ersten Aminosäure des EGF anordnen. Dieses neue Glu-EGF-Gen wurde verwendet zum Einschieben in einen Expressionsvektor, der aufgebaut wurde, um Fusions-EGF- Analoge zu erzeugen, und unten beschrieben ist.

b. Konstruktion eines "universellen" Klonierungsvektors pUC130XT

Das Plasmid pUC8 wurde als das Ausgangsplasmid verwendet, um einen neuen Klonierungsvektor zu konstruieren, der den Vorteil hatte, daß er eine hohe Anzahl von R.E.-Stellen aufwies. Dies machte ihn zu einem sehr flexiblen Klonierungshilfsmittel. Das pUC8 wurde mit PvuII abgebaut, um das DNA-Fragment zu eliminieren, das die Polylinker-DNA umfaßte. Dieses Fragment wurde durch ein entsprechendes PvuII-Fragment ersetzt, das von einem kommerziell erhältlichen doppelsträngigen M13 Vektor erhalten wurde (M13- TG130, Amersham) und eine-ausgedehnte Anzahl von R.E.- Stellen enthielt. Es wurden blaue Kolonien ausgewählt, und das Vorhandensein der neuen Multilinker-DNA wurde durch R.E. Analyse bestätigt. Dieses Plasmid wurde weiterhin modifiziert durch Abbauen des Plasmids mit EcoRI und KpnI und Ersetzen dieses Fragments durch ein synthetisches Fragment, das die R.E. Stellen für ClaI, SphI und NciI enthielt. Diese Modifikation änderte nicht den Leserahmen des Lac-Bereichs, und deshalb konnte das neue Plasmid auf der Basis des so erzeugten blauen Phänotyps ausgewählt werden. Dieses Plasmid wurde pUc130XT genannt.

c. Klonierung des TRP Promotors und der Leader-Peptide X-1 und X-2 in pUC130XT.

Der synthetische TRP Promotor wurde in pUC130XT geklont nach Plasmid-Abbau mit SacI und ClaI. Danach wurde das Leader-Peptid-Gen mit TaqI und Bg1II (oder BamHI, vgl.
Tabellen 2 und 3) an den TRP Promotor bei ClaI und BamHI geschmolzen, wobei die gleichen Verfahren angewendet wurden. (Die bg1III/bam Hybridstelle kann mit XhoII oder Sau3A gespalten werden.) Um die Konstruktionen in ein anderes Expressionsplasmid zu übertragen, wurden die Fragmente, die den synthetischen TRP Promotor angrenzend an die Leader-Sequenzen enthielten, durch Abbauen mit SmaI und PstI Endonukleasen isoliert. Die SmaI Stelle ist stromaufwärts von dem Promotor vorhanden, und PstI ist stromabwärts von dem Carboxy-Ende der zwei Leader-Peptide vorhanden.

d. Konstruktion eines Expressionsvektors für die Fusions EGF-Analogen.

Um einen wirksamen Expressionsvektor aufzubauen, wurde das Plasmid pKK223-3, das von Brosius et al. entwickelt worden war, ausgewählt. Dieses Plasmid trägt ein Gen für Amp-Beständigkeit, wo die ursprüngliche PstI-Stelle zerstört wurde. Dieses Plasmid ist empfindlich für Tetracyclin. Wir ersetzten das unvollständige Tet-Gen durch ein vollständiges und funktionelles Gen, das von pBR322 erhalten worden war. Das AvaI-Fragment, das von einem pBR322-Derivat erhalten worden war, das einen Polylinker in der EcoRI-Stelle enthielt, der eine SmaI (AvI)-Stelle benachbart zur EcoRI-Stelle einbaut, wurde verwendet, um das entsprechende AvaI-Fragment von pKK-223-3 zu ersetzen. Wir wählten ein Plasmid aus, das das Tet-Gen in einer Gegenuhrzeiger-Orientierung trägt. Dieses Tet-beständige Plasmid wurde mit SmaI und PstI abgebaut und an die SmaI- PstI-Fragmente gebunden, die von puC130XT erhalten worden waren, die den TRP-Promotor jeweils neben dem Leader X-1 und X-1 enthielten. Schließlich- wurde das Plasmid mit Bg1II (oder teilweise Bam) und PstI abgebaut und an das Glu-EGF- Gen ligiert, um ein vollständiges Plasmid zu erzeugen, das den TRP Promotor enthielt, und jedes der Leader-Peptide an den menschlichen EGF durch den Glutamyi-Rest geschmolzen. Die zwei Expressionsplasmide, pEGFX1 und pEGFX2, die so erhalten worden waren, tragen das Tet-Gen und können deshalb verwendet werden, um kompetente E.Coli- Zellen zu transformieren und eine Auswahl für Tet-resistente Transformanten zu treffen.

e. Expression von Fusions-Polypeptid, das EGF enthält.

Die Expressionsplasmide, pEGFX1 und pEGFX2 wurden verwendet, um den E.Coli-Stamm JM83 unter Standardbedingungen zu transformieren. Der transformierte Stamm, der die rekombinanten Plasmide enthielt, wurde ausgewählt und in M9 Medium, das 20 mg/l L-Tryptophan enthielt, gezüchtet (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour, 1972). Diese Zellen wurden verwendet, um 10 Liter des M9 Mediums in einen 10 Liter Fermentor einzuimpfen, wurden mit zusätzlicher Glucose, 15 g/l, und Casaminosäuren, 15 g/l, angereichert, bei ca. 400 Umdrehungen pro Minute gerührt. Alle Fermentationen fanden bei 37ºC, pH 7,0 statt bei einer Durchlüftungsrate von 10 Liter pro Minute.

Isolation und Reinigung des Fusion-Proteins.

Das EGF-Fusions-Protein wird ausgefällt in der Wirtszelle, folgend auf seine Synthese. Diese leichten refraktilen Körper werden unterscheidend solubilisiert von anderem Zellmaterial, um die Basis für eine 80% Produktanreicherung zu liefern. Alle Verfahren werden bei 4ºC durchgefährt. Der Zellbrei wird suspendiert in 25 mM Tris, 10 mM EDTA, pU 8,0 (,10 mlAg Zellbrei), mit Lysozym (1 mg/g Zellbrei) (Sigma Chemical Co.) behandelt und 30 Minuten rühren gelassen. Die Suspension wird dreimal (3 Minuten) mit 5-minutigen Kühlungsperioden zwischen den Beschallungen beschallt (Fisher Sonic Dismembrator, Model 300, Einstellung 60%). Die entstehende Suspension wird zentrifugiert bei 17000 Umdrehungen pro Minute über 20 Minuten (Bechman Instruments, Model J2-21M, JA-17 Rotor). Das Pellet wird wieder suspendiert in dem gleichen Puffer und 30 Sekunden bei der No.4 Einstellung homogenisiert (Dupont Omnimixer Model 17105). Das entstehende Homogenat wird wie oben zentrifugiert, ausgenommen dieses Mal und alle nachfolgenden Zentrifugierungen dauern 15 Minuten. Das Pellet wird wieder suspendiert in einem 95% Volumen des gleichen Puffers und wie oben homogenisiert. Nach dem Mischen wird ausreichend konzentriertes Triton X-100 zugegeben, damit eine Suspension mit einer endgültigen Detergenz-Konzentration von 1% entsteht. Die Suspension wird 30 Minuten rühren gelassen und wie oben zentrifugiert. Das entstehende Pellet wird wieder in verdünntem Puffer (2,5mM Tris, 1,0 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert, homogenisiert und wie oben zentrifugiert. Das Pellet wird wieder suspendiert in dem verdünnten Puffer, der 8M Harnstoff enthält (5 ml Puffer/g Zellenbrei), homogenisiert und wie oben zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten werden auf Anwesenheit des Fusions-Proteins abgeschätzt, wobei 15% SDS Polyacrylamidgel-Elektrophorese angewendet wird. Folgend auf die Zentrifugierung wird die mit Produkt angereicherte überstehende Flüssigkeit auf eine DEAE-52 chromatographische Säule (Whatman Chemicals) aufgebracht. Die Größe der Säule wird bestimmt durch die Menge der Probe, die verarbeitet werden soll. Die Säule wird mit Aufschlämmung bepackt und mit 2,5 mM Tris, 1,0 mM EDTA, 6 M Harnstoff, pH 8,0, equilibriert. Das Protein wird mit einem kontinuierlichen Salzgradienten eluiert (0-250 mM NaCl). Säulenfraktionen werden spektrophotometrisch bei 280 nm überwacht, und aliquote Fraktionsteile werden auf 15% SDS PAGE laufen gelassen. EGF-Fusion enthaltende Fraktionen werden dann im Pool gesammelt und gegen verschiedene Änderungen des für den Proteolyseschritt verwendeten Puffers dialysiert (100 mM Ammoniumacetat, 1 mM EDTA, pH 7,8). Die Protein-Konzentration des Dialysats wird durch UV-Abtastung bestimmt. Das EGF-Fusions-Protein ist etwa 95% rein, bestimmt durch HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasen-C18-Säule (4,6 mm · 250 mm, Vydac). Das Protein wird mit einem kontinuierlichen Gradienten eluiert (Puffer A ist 0,05% TFA/H&sub2;O; Puffer B ist 0,035% TFA/Acetonitril, pH2). Das angereicherte EGF-Fusions- Protein wird dann mit Staphylococcus aureus V8 Protease (Miles Laboratories) bei einem Enzym: Substratverhältnis von 1 : 1000 über 12 Stunden bei 37ºC, behandelt. Die Produkte, die auf einen Abbau folgen, werden gereinigt, indem Umkehrphasen-C18-Chromatografie mit einem kontinuierlichen Gradienten verwendet wird (Puffer A ist 10 mM Natriumphosphat, pH 6,2; Puffer B ist Acetonitril). Es werden näherungsweise gleiche Mengen der 1-53 und 1-51 Analogen erhalten.

Aminosäurenanalyse

Alle Chemikalien und Lösungsmittel sind von HPLC-Reinheit (J.T. Baker Chemical Co./VWR Scientific). Proben für Aminosäurenzusammensetzungs-Analyse wurden im Vakuum in 0,2 ml 6N konstant-siedender HCl (Pierce Chemical Co.) über 24 Stunden bei 110ºC hydrolysiert. Nach der Hydrolyse wurden die Proben in einem Vakuum-Exsikkator über Natriumhydroxid-Pellets; getrocknet und in Wasser vom HPLC-Grad bis zu einer näherungsweisen Konzentration von 100 pm/20 ul gelöst. Das völlig automatisierte Verfahren ist eine Anpassung eines Verfahrens für Vor-Säulen-Derivatisierung mit OPA (o-Phthalaldehyd), das von H.Jones et al., (J. Liquid Chromatog. 4(4):565-596, 1981) beschrieben wurde. QPA (Fluoropa, Pierce Chemical Co.) wird hergestellt wie folgt: 100 mg OPA werden in 2,0 ml Methanol gelöst, dann werden 29,0 ml 0,4M Natriumborat pH 9,5 (hergestellt von Natriumtetraborat) und 100 ul 2-Mercaptoethanol (Bio-Rad Laboratories) hinzugegeben. Die Arbeitslösung, die täglich frisch hergestellt wird, wird durch Verdünnen von 750 ul über OPA-Vorrat mit 3,25 ml Boratpuffer hergestellt. Aminosäure-Standards, die auch täglich frisch hergestellt werden, werden bis zu einer Konzentration von 100 pm/20 ul durch Einspritzen von Wasser mit HPLC-Reinheit verdünnt.

Sequenzierung und PTH-Analyse

Aminosäuresequenz-Bestimmungen wurden durch automatisierte Edman-Degradation mit einem Gas-Phasen-Sequenzanalysator (Applied Biosystems Model 470A) unter Verwendung von Standard-Techniken durchgeführt. EGF wurde mit Trypsin bei einem Enzym zu Substrat-Verhältnis von 1 : 10 (Gewichte Gewicht) abgebaut, und die entstandenen Peptide wurden durch HPLC abgetrennt und identifiziert, um Erzeugung von EGF 53 und 51 zu bestätigen, wobei eine automatisierte Sequenz-Analyse verwendet wurde.
Alle unterstrichenen Reste sind durch direkte Sequenz- Analyse identifiziert worden. Cys wird bestimmt durch chemische Standardverfahren, die auf Sequenz-Analyse folgt.

Rezeptor-Bindungs-Probe für Epidermalwachstumsfaktor (EGF)

Die biologische Aktivität der 53 und 51 Aminosäure-EGFs wurde quantitativ bestimmt, indem eine konkurrenzfähige radiometrische Versuchsanordnung verwendet wurde, die das Binden an Rezeptoren auf Epidermalzellen mißt.

Claims

1. Eine Peptidverbindung der Formel:

X-Glu-EGF

wobei X ein Leader-Sequenz-Oligopeptid mit bis zu 200 Aminosäuren ist, Glu ein Glutamyl-Rest ist und EGF die Aminosäure-Sequenz für Epidermalwachstumsfaktor oder ein Analoges desselben mit zwischen 42 Aminosäuren und 53 Aminosäuren ist, der EGF an seinem N-Ende an den besagten Glu-Rest angeheftet ist und der besagte Glu-Rest an das C-Ende des Leader-Sequenz-Oligopeptids angeheftet ist; wobei die Peptidverbindung spaltbar ist durch eine Gluspezifische Protease, um X vom EGF abzutrennen, um aktiven EGF zu bilden; oder eine DNA, die das besagte Peptid kodiert.

2. Das Peptid nach Anspruch 1, bei dem

(a) EGF die 53 Aminosäure-Sequenz vom Epidermalwachstumsfaktor ist; oder

(b) EGF die Aminosäure-Sequenz vom Epidermalwachstumsfaktor minus dem 52 Leu-Rest und dem 53 ARG-Rest ist.

3. Das Peptid nach Anspruch 1, bei dem

(a) X die Aminosäure-Sequenz hat, die in Tabelle 3 der Beschreibung angegeben ist; oder

(b) X ein Leader-Sequenz-Oligopeptid mit bis zu 75 Aminosäuren ist.

4. Ein Verfahren zum Herstellen von Epidermalwachstumsfaktor, das folgendes umfaßt:

Fermentieren eines Fermentationsgemisches, das Zellen umfaßt, die ein rekombinantes mikrobielles Klonierungshilfsmittel (z. B. einen E. Coli-Stamm) beherbergen, das ein strukturelles Gen umfaßt, das ein Fusionspeptid kodiert mit der Formel:

X-Glu-EGF,

wobei X ein Leader-Sequenz-Oligopeptid mit bis zu 200 Aminosäuren ist, Glu ein Glutamyl-Rest ist und EGF die Aminosäure-Sequenz für Epidermalwachstumsfaktor oder ein Analoges desselben mit zwischen 42 Aminosäuren und 53 Aminosäuren ist, der EGF an seinem N-Ende an den Glu-Rest angeheftet ist und der Glu-Rest an dem C-Ende des Leader-Sequenz-Oligopeptids angeheftet ist,

Erhalten mikrobieller Zellen aus dem Fermentationsgemisch und Freisetzen des Fusionspeptids davon und Behandeln des entstehenden Fusionspeptids mit einer Staphylococcus aureus Protease, die für Spaltung von Peptiden an einem Glutamyl-Rest spezifisch ist.

5. Das Verfahren nach Anspruch 4, das das Lösen des Fusionspeptids in Harnstoff und das Konzentrieren der entstehenden Lösung vor der Behandlung mit der Protease umfaßt.

6. Das Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das molare Verhältnis von Protease zu Fusionspeptid bei der Behandlungsstufe von 1 : 500 bis 1 : 10.000 beträgt.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Proteasebehandlungsschritt 8 bis 15 Stunden lang durchgeführt wird.

8. Das Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der Protease- Behandlungsschritt bei 32ºC bis 40ºC durchgeführt wird.

9. Das Verfahren nach Anspruch 4, bei dem X die in Tabelle 3 angegebene Aminosäure-Sequenz aufweist.