DE69434083T2

DE69434083T2 - Expression eines fusionspolypeptides, das ohne leadersequenz aus dem cytoplasma transportiert wird

Info

Publication number: DE69434083T2
Application number: DE69434083T
Authority: DE
Inventors: Desmond Mascarenhas; Yang Zhang; Pamela S. Olson; David R. Olsen; Pedro A. Carrillo
Original assignee: Celtrix Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Celtrix Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-08-02
Filing date: 1994-08-02
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2014-08-03
Also published as: ATE280234T1; US5830706A; EP0722461A1; AU7519494A; CA2168429C; CA2168429A1; EP0722461A4; JP3370094B2; EP0722461B1; US5563046A; DE69434083D1; WO1995004076A1; AU688363B2; US5629172A; JPH09504166A

Description

Fachgebiet
Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten Proteinsynthese. Insbesondere werden Polypeptide von Interesse als Fusionspolypeptide exprimiert, welche Fusionspartner umfassen, denen die Leadersequenzen fehlen, und wobei die Fusionspartner bewirken, dass die Fusionspolypeptide aus dem Cytoplasma der Wirtszellen sekretiert werden.
Hintergrund
Die Gentechnik hat die Erzeugung großer Mengen an Polypeptiden, die durch klonierte DNA codiert ist, mittels rekombinanter Expressionssysteme, insbesondere durch Expression in Prokaryonten wie Escherichia coli (E. coli), ermöglicht. Das exprimierte heterologe Polypeptid, das ansonsten durch die Wirtszelle entweder gar nicht oder lediglich in begrenzten Mengen produziert würde, kann einen beträchtlichen Anteil des gesamten zellulären Polypeptids der Wirtszelle ausmachen.
Verschiedene Probleme sind jedoch häufig anzutreffen. Im bakteriellen Cytoplasma überexprimierte Polypeptide akkumulieren häufig als unlösliche "Einschlusskörper" (Williams et al., Science 215: 687–688, 1982; Schoner et al., Biotechnology 3: 151–154, 1985). Die Bildung der Einschlusskörper ist nicht auf bakterielle Expressionssysteme beschränkt. Zum Beispiel kann das Krüppel-Genprodukt von Drosophila Einschlusskörper bilden, wenn in Insektenzellen unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems erzeugt. In Form von Einschlusskörpern akkumulierte Polypeptide sind für Screening-Zwecke in biologischen oder biochemischen Assays, oder als pharmazeutische Agenzien, relativ nutzlos. Die Umwandlung dieses unlöslichen Materials zu aktivem, löslichem Polypeptid erfordert zeitaufwändige und mühsame Aufschluss- und Rückfaltungs-Protokolle, welche oftmals die Nettoausbeute an biologisch aktivem Polypeptid stark reduzieren.
Selbst wenn heterologe Polypeptide im Cytoplasma von Bakterien in löslicher Form exprimiert werden, akkumulieren sie häufig nur wenig als Folge des Abbaus durch Wirtsproteasen. Außerdem weisen die akkumulierten Polypeptide oftmals einen vom erwünschten Amino-Terminus abweichenden auf.
Ein Ansatz für diese Probleme besteht im Fusionieren eines Polypeptids von Interesse an einen Polypeptid-Fusionspartner wie die lacZ- und trpE-Genprodukte (Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 106–110, 1979; Furman et al., Biotechnology 5: 1047–1051, 1987); Maltose-Bindungspolypeptid (Di Guan et al., Gene 67: 21–30, 1988); Glutathion-S-Transferase (Johnson, Nature 338: 585–587, 1989); Ubiquitin (Miller et al., Biotechnology 7: 698–704, 1989) oder Thioredoxin (LaVallie et al., Biotechnology 11: 187–193, 1993). Oftmals verleiht der Fusionspartner dem Polypeptid von Interesse solche erwünschten Eigenschaften wie größere Löslichkeit, insbesondere, wenn der rekombinante Wirt bei Temperaturen unterhalb der optimalen Wachstumstemperatur gezüchtet wird (LaVallie et al., 1993, op. cit.). Eine Niedertemperatur-Kultur bringt jedoch andere praktische Probleme mit sich, welche den Prozess in einem kommerziellen Maßstab weniger geeignet machen würden.
Die Anwendung von Polypeptidfusionen ermöglicht auch die Produktion von Polypeptiden, die ansonsten für eine effiziente Akkumulation im rekombinanten Wirt zu klein sein könnten (Schultz et al., J. Bacteriol. 169: 5385–5392, 1987). Weitere geeignete Fusionspartner können z. B. als Affinitätspeptide wirken, die die Gewinnung und Reinigung des Fusionspolypeptids aus Zellextrakten, die Hunderte weiterer Polypeptide enthalten, erleichtern (siehe z. B. WO 91/11454).
Die Verwendung der Fusionspolypeptide weist jedoch Nachteile auf. Es ist oftmals erforderlich, das gewünschte Polypeptid durch enzymatische oder chemische Methoden vom Fusionspartner abzuspalten. Dies kann durch Platzieren einer geeigneten Zielsequenz für die Spaltung zwischen die für den Fusionspartner und die für das gewünschte Polypeptid erreicht werden. Ungünstigerweise sind die am breitesten für die Peptidspaltung eingesetzten Enzyme kostspielig, ineffizient oder in ihrer Spaltung unpräzise, und sind für die Mehrzahl der Fusionskonstrukte nicht immer erfolgreich anwendbar.
Während zum Beispiel Enterokinase und Faktor Xa hochspezifische Endoproteasen sind, sind diese Säugerenzyme in der Produktion kostspielig und erfordern vor der Behandlung mit dem Säugerenzym das Isolieren eines in einer prokaryontischen Wirtszelle exprimierten Polypeptids von Interesse von der Wirtszelle, was einen großmaßstäblichen Prozess beträchtlich verteuert. Außerdem ist die Wirksamkeit und Spezifität, mit der einige Enzyme Substrate spalten, in hohem Maße variabel. Ein Enzym wie Subtilisin beispielsweise mag zwar relativ preiswert herstellbar sein, doch ist die Präzision, mit der es Substrate spaltet, für Prozesse im kommerziellen Maßstab unter den aktuellen "Good Manufacturing Practices" (GMP) weniger als akzeptabel.
Einige Hefe-Ubiquitinhydrolasen spalten Fusionen wirksam, in denen Ubiquitin der Fusionspartner ist und die Aminosäure unmittelbar stromabwärts der Spaltstelle nicht Prolin ist (Miller et al., op. cit., 1989; Tobias und Varshavsky, J. Biol. Chem. 266: 12021–12028, 1991; siehe auch WO 88/02406 und WO 89/09829). Ein Ubiquitinhydrolase-Gen, das aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) kloniert ist, YUH-1 (Miller et al., op, cit. 1989), wird Fusionen nicht wirksam spalten, in denen das stromabwärts gelegene Polypeptid größer als etwa 25 kD ist. Ein anderes S. cerevisiae-Ubiquitinhydrolase-Gen (Tobias und Varshavsky, J. Biol. Chem. 266: 12021–12028, 1991), ist zum Spalten von Ubiquitinfusionen fähig, in denen das Polypeptid stromabwärts der Spaltstelle sogar 130 kD groß ist. Beide Ubiquitinhydrolasen sind aktiv, wenn intrazellulär in E. coli exprimiert, was ihre Verwendung zur Spaltung von Fusionen in vivo möglich macht. Allerdings wird die Verwendung des Ubiquitins als einem Fusionspartner durch die Tatsache behindert, dass Multikopie-Plasmide, die Ubiquitin-Fusionskonstrukte tragen, zum Beispiel E. coli-Wirtszellen dazu bringen können, langsam zu wachsen und ihre Lebensfähigkeit zu verlieren.
Die cytoplasmatische Akkumulation von Fusionspolypeptiden leidet unter dem Nachteil, dass die heterologe Polypeptid-Komponente möglicherweise nicht zum korrekten Falten in der stark reduzierenden Umgebung des Cytoplasmas fähig ist, was zu schlechten Ausbeuten an biologisch aktivem Polypeptid führen kann. Um dieses Problem zu überwinden, kann das Polypeptid von Interesse an ein "Signalpeptid" fusioniert werden, eine kurze (15 bis 30 Aminosäuren) Sequenz, die am Amino-Terminus von Vorläufer-Polypeptiden vorhanden ist, die für die Sekretion bestimmt sind, d. h. den Export in nicht-cytoplasmatische Lokationen. In E. coli würden solche Lokationen die Innenmenbran, den periplasmatischen Raum, die Zellwand und die Außenmembran umfassen. Typischerweise wird an einem bestimmten Punkt direkt vor oder während des Transports der Polypeptide aus dem Cytoplasma heraus die Signalsequenz durch Wirtsenzyme zum Erhalt des "reifen" Polypeptids entfernt. In diesen Fällen, in denen die Signalsequenz durch Wirtsenzyme zum Erhalt des "reifen" Polypeptids entfernt wird, sind die Signalsequenzen auch als "Leader-Peptide" bekannt (für einen neueren Überblick über den allgemeinen Sekretionsweg in Gram-negativen Bakterien und eine Erörterung der Leader-Peptide, siehe Pugsley, Microbiol. Rev. 57: 590–108, 1993).
Die Lokalisation eines exprimierten Polypeptids im periplasmatischen Raum ist von Vorteil, da einfachere Methoden der Polypeptidgewinnung angewendet werden können, einschließlich des "osmotischen Schocks" und anderer Techniken. Obschon Leadersequenzen zum Transport der heterologen Polypeptide in den periplasmatischen Raum von E. coli verwendet werden können, werden mittels dieser Methode wenige Polypeptide in löslicher Form wirksam akkumuliert. Die Translokation der Polypeptide quer durch die Lipid-Doppelschicht der Innenmembran erscheint als ineffizient, insbesondere im Falle von Fusionen, die an heterologe Polypeptide geknüpfte Leadersequenzen umfassen.
Lediglich einige wenige Polypeptide, denen natürlicherweise eine Leadersequenz fehlt, werden in nicht-cytoplasmatische (oder periplasmatische) Lokationen sekretiert, wie durch ihre selektive Freisetzung aus Zellen auf die Behandlung durch osmotischen Schock oder Gefrier/Auftau-Protokolle gezeigt. Zu diesen zählen Thioredoxin (Lunn und Pigiet, op. cit. 1982) und Elongationsfaktor-Tu (EF-Tu) (Jacobson et al., Biochemistry 15: 2297–2302, 1976). In E. coli exprimiertes IL-1-β wurde durch ein modifiziertes osmotisches Schock-Verfahren extrahiert (Joseph-Liauzun et al., op. cit., 1990).
Die extrazelluläre Lokalisation kann ebenfalls vorteilhaft sein und kann mittels mindestens zweier unterschiedlicher Strategien erreicht werden: (1) Die Permeabilisierung der Außenmembran, was periplasmatischen Polypeptiden das "Austreten" ermöglicht (US-Patent Nr. 4,595,658; Kato et al., Gene 54: 197–202, 1987); und (2) die Fusion an Sequenzen, die den extrazellulären Export steuern (Nagahari et al., EMBO J. 4: 3589– 3592, 1985; US-Patent Nr. 5,143,830). Diese Methoden funktionieren jedoch in vielen Fällen nicht; und selbst, wenn sie funktionieren, sind die Methoden im allgemeinen unzureichend und erzeugen oftmals keine Polypeptide mit dem gewünschten Amino-Terminus (Holland et al., Biochimie 72: 131–141, 1990).
In der Konstruktion eines Fusionspolypeptids würde der ideale Fusionspartner ein solcher sein, der für die Produktion einer breiten Vielfalt heterologer Polypeptide in einer rekombinanten Wirtszelle, z. B. E. coli, bei optimalen Wachstumstemperaturen nützlich ist. Vorzugsweise würde solch ein Fusionspartner die Akkumulation des gewünschten Polypeptids in löslicher, aktiver Form in einer zellulären Lokation, in der es z. B. vor Proteolyse geschützt ist und wo das Fusionspolypeptid mittels vereinfachter Verfahrensweisen gewonnen werden kann, verbessern. Ebenfalls von Vorteil wäre, wenn solch ein Fusionspartner die Anwendung eines effizienten, preiswerten und präzisen Spaltsystems in vivo zuließe.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Fusionspolypeptide, die selektiv aus dem Cytoplasma der Wirtszelle heraustransportiert werden, umfassend einen Fusionspartner, der im wesentlichen aus einem reifen E. coli-DsbA-Polypeptid oder einem Fragment davon besteht, wobei dem Fusionspartner eine Leadersequenz fehlt. Spezifisch umfasst die Erfindung Fusionspolypeptide, bestehend aus: (a) einem Fusionspartner, der zum Steuern des extracytoplasmatischen Transports fähig ist, bestehend im wesentlichen aus mindestens einem Fragment eines reifen Polypeptids, wobei das reife Polypeptid E. coli-DsbA ist; und (b) einem Polypeptid von Interesse, wobei das Polypeptid von Interesse distal zum Carboxy-Terminus des Fusionspartners positioniert ist. Vorzugsweise umfassen die Fusionspolypeptide der Erfindung außerdem ein Linker-Peptid, das zwischen dem Fusionspartner und dem Polypeptid von Interesse positioniert ist. Am bevorzugtesten umfasst das Linker-Peptid eine Spaltstelle, z. B. eine durch Ubiquitinhydrolase gespaltene Stelle.
Die Fusionspolypeptide der Erfindung können in einer breiten Vielfalt von Wirtszellen, z. B. E. coli, in löslicher, aktiver und leicht gewinnbarer Form bei Temperaturen von oder nahe den physiologischen Optima für das Wachstum der Wirtszelle produziert werden.
Eine Vielzahl von Polypeptiden von Interesse kann in dieser Weise erzeugt werden, einschließlich Enzymen, Wachstumsfaktoren, einzelkettigen Antikörpern, DNA- oder RNA-Bindungsproteinen, Membranrezeptoren und Fragmenten davon.
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst sind Nukleinsäuren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die die Fusionspolypeptide der Erfindung codieren, und Wirtszellen, die diese Nukleinsäuren umfassen. Vorzugsweise umfassen solche Wirtszellen außerdem eine Nukleinsäure, die zum Exprimieren im Cytoplasma der Wirtszelle eines proteolytischen Enzyms fähig ist, welches eine Spaltstelle im Fusionspolypeptid, vorzugsweise im Linker, spezifisch erkennt. Solch ein System ist für die in vivo-Spaltung der Fusionspolypeptide nützlich, insbesondere, wenn Ubiquitinhydrolase coexprimiert wird und es das Fusionspolypeptid an einer kompatiblen Spaltstelle spaltet, die innerhalb eines zwischen dem Fusionspartner und dem Polypeptid von Interesse positionierten Linkers lokalisiert ist.
Diese transformierten Wirtszellen sind für die rekombinante Produktion von Polypeptiden von Interesse als Fusionspolypeptide nützlich, auch hier wiederum vorzugsweise unter Anwendung einer in vivo-Spaltung, um vom Polypeptid von Interesse andere Sequenzen des Fusionspolypeptids, z. B. das DsbA-Polypeptid und den Linker, wegzuspalten.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Methoden zur Erzeugung im wesentlichen gereinigter Fusionspolypeptide der Erfindung, die durch eine Nukleinsäure der Erfindung codiert sind, welche die folgenden Schritte umfassen: (a) Einführen der Nukleinsäure, die dieses Fusionspolypeptid codiert, in eine Wirtszelle, wodurch eine transformierte Wirtszelle erzeugt wird; (b) Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zum Exprimieren des Fusionspolypeptids geeignet sind, wobei das Fusionspolypeptid exprimiert wird; und (c) Reinigen des Fusionspolypeptids, wobei ein im wesentlichen gereinigtes Fusionspolypeptid erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Methoden zur Erzeugung im Wesentlich gereinigter Polypeptide von Interesse, welche die folgenden Schritte umfassen: (a) Einführen in eine Wirtszelle einer Nukleinsäure der Erfindung, die eines der Fusionspolypepti de der Erfindung codiert, welche ein Linker-Peptid mit einer Spaltstelle umfasst, wobei eine transformierte Wirtszelle erzeugt wird; (b) Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression des Fusionspolypeptids geeignet sind, wobei das Fusionspolypeptid exprimiert wird; (c) Spalten des Fusionspolypeptids mit einem proteolytischen Enzym oder Spalt-Agens, welches die Spaltstelle erkennt, wobei das Polypeptid von Interesse erzeugt wird; und (d) Reinigen des Polypeptids von Interesse, wobei ein im wesentlichen gereinigtes Polypeptid von Interesse erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem Methoden zur Erzeugung im wesentlichen gereinigter Polypeptide von Interesse, welche die folgenden Schritte umfassen: (a) Einführen in eine Wirtszelle einer Nukleinsäure der Erfindung, die eines der Fusionspolypeptide der Erfindung codiert, welches ein Linker-Peptid mit einer Spaltstelle umfasst, wobei die Wirtszelle außerdem eine Nukleinsäure umfasst, die zum Exprimieren in der Wirtszelle eines proteolytischen Enzyms fähig ist, welches die Spaltstelle spezifisch erkennt; dabei Erzeugen einer transformierten Wirtszelle; (b) Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression des Fusionspolypeptids und des proteolytischen Enzyms geeignet sind, dabei Exprimieren des Fusionspolypeptids, Bewirken der in vivo-Spaltung des Fusionspolypeptids und Erzeugen des Polypeptids von Interesse; und (c) Reinigen des Polypeptids von Interesse, dabei Erhalten eines im wesentlichen gereinigten Polypeptids von Interesse.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem Methoden zur Erzeugung im wesentlichen gereinigter Polypeptide von Interesse, welche die folgenden Schritte umfassen: (a) Einführen in eine Wirtszelle einer Nukleinsäure der Erfindung, die eines der Fusionspolypeptide der Erfindung codiert, welches ein Linker-Peptid mit einer Spaltstelle umfasst, dabei Erzeugen einer transformierten Wirtszelle; (b) Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zum Exprimieren des Fusionspolypeptids geeignet sind, dabei Exprimieren des Fusionspolypeptids; (c) Reinigen des Fusionspolypeptids, dabei Erzeugen eines im wesentlichen gereinigten Fusionspolypeptids; (d) Spalten des im wesentlichen gereinigten Fusionspolypeptids mit einem proteolytischen Enzym oder Spalt-Agens, welches die Spaltstelle erkennt, dabei Erzeugen des Polypeptids von Interesse; und (e) Reinigen des Polypeptids von Interesse, dabei Erhalten eines im wesentlichen gereinigten Polypeptids von Interesse.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 (SEQ ID NR: 1 bis SEQ ID NR: 5) zeigt einen Vergleich der Sequenzen (Alignment) der fünf Mitglieder der IL-1-artigen Proteinfamilie: (1) E. coli-DsbA (SEQ ID NR: 1), (2) humanes IL-1-β (SEQ ID NR: 2), (3) humanes IL-1-α (SEQ ID NR: 3), (4) humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) (SEQ ID NR: 4), und (5) humaner saurer FGF (SEQ ID NR: 5).
In 2 sind die Homologien zwischen den reifen Polypeptiden von E. coli-DsbA, humanem IL-1-β, humanem IL-1-α, humanem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und dem Toxin-coregulierten Pilus-(TcpG)-Polypeptid von Vibrio cholerae zusammengestellt. Die Größe jedes der reifen Polypeptide ist in Klammern angegeben.
3 zeigt die SDS-PAGE von Fraktionen von E. coli-Zellen, die E. coli-DsbA exprimieren. (a) WCL bei 0', 60' und 120' von Zellen, die reifes DsbA exprimieren; (b) WCL bei 0', 60' und 120' von Zellen, die "mutiertes" DsbA exprimieren; (c) TEX-Extrakt ("T") und "cytoplasmatische" ("C") Fraktionen von Zellen, die reifes DsbA exprimieren; (d) "T"- und "C"-Fraktionen von Zellen, die "mutiertes" DsbA exprimieren. Die erwartete Größe des exprimierten Polypeptids beträgt etwa 22 kD (•).
4 zeigt die SDS-PAGE-Gele von Fraktionen von E. coli-Zellen, in denen eine Fusion des DsbA-Proteins mit humanem IGF-I oder der löslichen extrazellulären Domäne des Typ II-TGF-β-Rezeptors exprimiert wurden. Links: WCL bei 0' und 120' für (1) DsbA-Ubi-IGF (pYZ22070), erwartete Größe etwa 37 kD (•); und (2) DsbA-Ubi-TGFR (pDM15428), erwartete Größe etwa 46 kD (•). Rechts: TEX und "cytoplasmatische" ("CYT") Fraktionen für die beiden Fusionspolypeptide. Wo zwei Punkte stehen, stellt der untere Punkt ein Abbauprodukt mit geringerem Molekulargewicht des größeren Polypeptids dar.
5, links, zeigt die SDS-PAGE-Gele von WCL, 0' und 120', und lösliche ("S") und unlösliche ("I") Fraktionen von E. coli-Zellen, die mit pDJ16920 transformiert sind, welches das Ubiquitin-TGF-β2-Fusionspolypeptid codiert, erwartete Größe etwa 20 kD, oder mit Plasmid pYZ22096, welches eine DsbA-Ubiquitin-TGF-β2-Fusion codiert, erwartete Größe etwa 42 kD.
6, links: SDS-PAGE-Gele von WCL, 0' und 120', und lösliche ("S") und unlösliche ("I") Fraktionen von E. coli-Zellen, die mit pDJ16927 transformiert sind, welches eine Ubiquitin-IGF-Fusion exprimiert, erwartete Größe etwa 15 kD, oder mit pDM16965, welches IL-1-β-Ubiquitin-IGF exprimiert, erwartete Größe etwa 32 kD. 6, rechts, zeigt ähnliche Gele von Extrakten von E. coli-Zellen, die mit pyZ22070 transformiert sind, welches DsbA-Ubiquitin-IGF codiert, mit einer erwarteten Größe von 37 kD, oder mit pDM15426, welches DsbA-Ubiquitin-IGF codiert, worin DsbA seine native Signalsequenz aufweist, erwartete Größe etwa 37 kD.
7 zeigt die SDS-PAGE-Gele von Fraktionen von E. coli-Zellen, die Fusionen von IGFBP-3 exprimieren. Panel [i]: WCL bei 0' und 129', und "lösliche" ("S") und "unlösliche" ("I") Extrakte von E. coli-Zellen, die pDJ12875 exprimieren, welches eine Ubiquitin-IGFBP-3-Fusion codiert, mit einer erwarteten Größe von etwa 38 kD; Panel [ii], IL-1-Ubiquitin-IGFBP-3 mit einer erwarteten Größe von etwa 55 kD (pDM16967); und [iii] DsbA-Ubiquitin-IGFBP-3 mit einer erwarteten Größe von etwa 60 kD (pDM15427). 8, Panel [i], zeigt die SDS-PAGE-Gele von WCL bei 0' und 120', und "lösliche" ("S") und "unlösliche" ("I") Fraktionen von E. coli-Zellen, die eine Ubiquitin-TGF-βR-Fusion exprimieren, mit einer erwarteten Größe von etwa 24 kD (pDJ16921); Panel [ii], eine DsbA-Ubiquitin-TGF-βR-Fusion mit einer erwarteten Größe von etwa 46 kD (pDM15428).
9A und B: HPLC-Umkehrphasen-Elutionsprofile von Ubiquitinhydrolasegespaltenem IFG-I, abgeleitet aus Kulturen von DsbA-Ubiquitin-IGF- und Ubiquitin-IGF-Konstrukten, jeweils bei 30°C gezüchtet. C und D: Ubiquitinhydrolase-gespaltenes DsBa-Ubiquitin-IGF und Ubiquitin-IGF, jeweils gezüchtet bei 37°C. Die spezifische Aktivität der IGF-Peaks ist als eingerahmte Werte, willkürliche Einheiten, gezeigt.
10 zeigt die SDS-PAGE-Gele von teilweise gereinigtem TGF-βR (extrazelluläre Domäne von 136 Aminosäuren, pDM15428), vernetzt mit ¹²⁵I-radiomarkiertem TGF-β1. Die Größe des erwarteten Vernetzungsprodukts beträgt etwa 30 kD. Links (–): kein zugesetzter kalter TGF-β1. Rechts (+): überschüssiger kalter TGF-β1 (2500-fach molar). 11 zeigt die Ergebnisse der Dot-Blot-Assays unter Verwendung von ¹²⁵I-radiomarkiertem IGF-I zur Messung der Bindungsaktivität in Rohextrakten ("lösliche" Fraktion) von E. coli-Zellen, die exprimieren: (1) pDM15427, welches eine DsbA-Ubiquitin-IGFBP-3-Fusion codiert; (2) pDJ12875, welches eine Ubiquitin-IGFBP-3- Fusion codiert; oder (3) pDJ12887, eine "lediglich Vektor"-Kontrolle. Die Proben waren unbehandelt (–UH) oder mit Ubiquitinhydrolase gespalten (+UH).
12 zeigt die Proteine, die durch Plasmide pDM15486, pDM25492, pDM46805 und pDM46806 exprimiert werden, wenn sie wie für die Konstrukte in obigem Beispiel 10 beschrieben getestet werden. Panels "A" und "B" zeigen einen Vergleich von pYZ9206 (Leader-deletiertes DsbA) und pDM25452 (Leader-deletiertes Mini-DsbA). In jedem Fall wurden die induzierten Proben in TEX (T) fraktioniert, Rest lösliche (S) und unlösliche (1) Fraktionen. Panel "C" zeigt die mit pDM25499 erhaltenen Ergebnisse.
13 zeigt die erhaltenen Ergebnisse, wenn die durch Plasmide pYZ22055, pDM25450, pDM25453 und pDM15449 exprimierten Proteine analysiert werden. Bahnen "A", "B", "C" und "D" in jedem Panel wurden mit Extrakten beladen, entsprechend pYZ22055, pDM25450, pDM15449 und pDM15457. Die beiden Konstrukte, die das 13-mer-Biotinylierungs-Substratpeptid (pDM25450 und pDM15457) exprimieren, liefern klare positive Signale auf dem Western-Blot, wohingegen dies bei den Kontrollen nicht der Fall ist.
14 zeigt die Fraktionierung der von induzierten Zellen genommenen Proben, die pDM15449 (Panels "A") oder pDM25466 (Panels "B") tragen.
15A zeigt die Expression des Fusionsproteins und seine partielle Fraktionierung zu TEX (T) und Rest lösliche (S) Fraktionen.
15B zeigt, dass beide gereinigte Fraktionen eine DNA-Bindungsaktivität aufweisen.
16 (SEQ ID NR: 22) zeigt die Nukleinsäuresequenz für das native DsbA-(mit Leader)-Biotinylierungspeptid (Plasmid 25453).
17 (SEQ ID NR: 23) zeigt die Nukleinsäuresequenz für leaderless DsbA-(3'-modifiziertes)-Biotinylierungspeptid (Plasmid 25450).
18 (SEQ ID NR: 24) zeigt die Nukleinsäuresequenz für leaderless DsbA-(3'-modifiziertes)-hubi(del45).IGF.neu (Plasmid 25477).
19 (SEQ ID NR: 25) zeigt die Nukleinsäuresequenz für Leader-loses DsbA (3'-modifiziertes)-hubi.IGF.neu (Plasmid 41620).
20 (SEQ ID NR: 26) zeigt die Nukleinsäuresequenz für natives DsbA (Plasmid 9205).
21 (SEQ ID NR: 27) zeigt die Nukleinsäuresequenz für leaderless DsbC-(3'-modifizierte)-C>S-Variante (Plasmid 46805).
22 (SEQ ID NR: 28) zeigt die Nukleinsäuresequenz für leaderless DsbA (Plasmid 9206).
23 (SEQ ID NR: 29) zeigt die Nukleinsäuresequenz für leaderless DsbA (3'-modifiziert) (Plasmid 22055).
24 (SEQ ID NR: 30) zeigt die Nukleinsäuresequenz für leaderless Mini-DsbA (3'-modifiziert) (Plasmid 25452).
25 (SEQ ID NR: 31) zeigt die Nukleinsäuresequenz für leaderless DsbA-(3'-modifiziertes)-y.ubi.IGD.alt (Plasmid 22070).
26 (SEQ ID NR: 43) zeigt die Nukleinsäuresequenz für Mini-DsbA (3'-modifiziertes)-hubi(del45).IGF.neu (Plasmid 25499).
27 (SEQ ID NR: 44) zeigt die Nukleinsäuresequenz für leaderless Mini-DsbA-(3'-modifiziertes)-hub.IGF.neu (Plasmid 25485) (Vektor pUC18).
Ausführungsformen der Erfindung
Ein breiter Bereich von Polypeptiden akkumuliert, wenn an einen Fusionspartner fusioniert, der ein DsbA-Polypeptid oder Fragmente davon umfasst, in großen Mengen in löslicher, aktiver, leicht gewinnbarer Form in einer Vielfalt von Wirtszellen bei Temperaturen nahe oder bei den physiologischen Optima für das Wachstum der Wirtszellen. Sofern erwünscht, kann das Polypeptid von Interesse vom DsbA-Polypeptid in wirksamer und preiswerter Weise entweder in vivo oder in vitro abgespalten werden. DsbA-Polypeptide sind als generische Fusionspartner für die Expression einer breiten Vielfalt von heterologen Polypeptiden sowohl in prokaryontischen als auch eukaryontischen Zellen, einschließlich E. coli, Hefe, Insektenzellen und Säugerzellen, nützlich.
Die Verwendung der DsbA-Polypeptide als Fusionspartner kann die Produktion nicht-glykosylierter Polypeptide in Säugerzellen ermöglichen. Dieses Merkmal ist in solchen Fällen besonders wichtig, in denen die Glykosylierung eines Polypeptids von Interesse unerwünscht wäre. Werden zum Beispiel menschliche Proteine in anderen Säugerzellen synthetisiert, so kann eine unterschiedliche Glykosylierung erfolgen und können diese für menschliche Empfänger antigenisch sein. Dies stellt einen Hauptbereich für Bedenken für jene dar, die am Exprimieren von Polypeptiden, die als Humantherapeutika nützlich sind, in transgenen Tieren wie Ziegen oder Schafen interessiert sind.
Da darüber hinaus der durch die DsbA-Polypeptide der Erfindung genutzte alternative Transportweg aus dem Cytoplasma heraus das ER umgeht, kann es von Vorteil sein, Polypeptide mit freien Sulfhydrylgruppen, z. B. bFGF, PD-ECGF und ADF, zu exprimieren (Takahashi et al., Proc. Natol. Acad. Sci. USA 83: 8019–8023, 1986), als Fusionen an DsbA-Polypeptide, da solche Fusionen das oxidierende Milieu des ER-Lumens vermeiden.
Auch scheinen DsbA-Fusionen ohne Translokation durch eine Lipid-Doppelschicht sekretiert zu werden. Daher erlaubt die Verwendung von DsbA-Fusionen mit heterologen Polypeptiden, die normalerweise nicht über den allgemeinen Sekretionsweg sekretiert werden können, nun den erfolgreichen Transport jener Polypeptide aus dem Cytoplasma hinaus. Zu Beispielen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Polypeptide, die lange hydrophobe oder andere Sequenzen enthalten, die den Durchgang durch die Lipid-Doppelschicht beeinflussen können.
Wenn an ein Polypeptid von Interesse fusioniert, ist ein DsbA-Polypeptid der Erfindung auch zum Steuern des Transports jenes Fusionspolypeptids aus dem Cytoplasma hinaus in ein privilegiertes zelluläres Kompartiment fähig, in welchem das Fusionspolypeptid löslich und biologisch aktiv, doch vor Proteolyse geschützt ist.
DsbA-Polypeptide der Erfindung umfassen lediglich reife E. coli-DsbA-Polypeptide und funktionelle Fragmente davon, welchen: (a) eine Amino-terminale Leadersequenz fehlt, wie durch die Methode von Heijne (Nucl. Acids. Res. 14: 4683–4690, 1986) erkennbar; (b) eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zu mindestens 20% homolog zur Aminosäuresequenz des reifen humanen Interleukin-1-β (IL-1-β) ist, wenn in optimalem Alignment; und (c) zum Steuern der Translokation von mehr als 20% eines Fusionspolypeptids in ein privilegiertes zelluläres Kompartiment fähig sind. DsbA wird natürlich synthetisiert als ein Vorläufer mit einer Amino-terminalen Leadersequenz, wobei lediglich die DNA-Sequenz, die dem reifen Polypeptid entspricht, d. h. der eine Leadersequenz fehlt, als die Nukleinsäure, die das "DsbA-Polypeptid" codiert, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung erachtet wird. Daher sind die "DsbA-Polypeptide" der vorliegenden Erfindung das DsbA von E. coli.
Das reife E. coli-DsbA-Polypeptid (Bardwell et al., Cell 67: 581–589, 1991; Kamitani et al., EMBO J. 11: 57–62, 1992) stellt ein Beispiel eines DsbA-Polypeptids nach diesen Kriterien, die bei der Erfindung angelegt werden können, dar. DsbA wird normalerweise in den periplasmatischen Raum sekretiert, vermutlich mit Hilfe einer Amino-terminalen Leadersequenz von 19 Aminosäuren, die während der Translokation entfernt wird. Eine DsbA-Polypeptid-Variante, in welcher das Leader-Peptid durch ein einzelnes Methionin ersetzt ist, zeigt ein unerwartetes Verhalten: nicht nur durchquert das Polypeptid die Zellmembran, sondern ist der Transport durch die Membran tatsächlich erhöht. DsbA kann auch aus Zellen mittels eines modifizierten osmotischen Schock-Verfahrens und anderer vereinfachter Methoden freigesetzt werden, die die Zelle nicht lysieren, wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt.
1 zeigt die Sequenzähnlichkeit zwischen humaner IL-1-β-DNA und dem verkürzten DsbA-Gen. Zur Maximierung des Sequenzvergleichs (Alignment) wurden zwei Regionen der DsbA-Sequenz (entsprechend den Aminosäure-Resten 21–35 und 126–157) aus dem Vergleich ausgeschlossen. Das erste dieser Segmente (21–35) enthält ein Beispiel einer "doppelten Cystein-Aktivzentrum-Schleifen-Domäne", welche eine partielle Homologie zu den Aktivzentrumregionen anderer Oxidoreduktasen zeigt (Bardwell et al., op. cit., 1991). Diese doppelten Cystein-Aktivzentrum-Schleifen-Domänen, z. B. die innerhalb der Reste 21–35 von DsbA enthaltene Domäne, können von den Fusionspartnern entfernt (oder ersetzt) werden, die eine der Oxidoreduktasen umfassen, die in die DsbA-Poylpeptid-Klassen fallen, und beeinflusst möglicherweise den Transport eines Fusionspolypeptids der Erfindung nicht.
Die vorliegende Erfindung umfasst spezifisch die Verwendung von mutierten DsbA-Polypeptiden in den Fusionspartnern der Fusionspolypeptide der Erfindung. Zu solchen Mutationen können Deletionen, der Austausch von Aminosäuren oder die Addition von Aminosäuren zählen.
Die Fusionspolypeptide, welche die DNA-Sequenz des DsbA-Polypeptids in Fusion an die DNA eines ausgewählten heterologen Polypeptids, oder irgendeines Peptids von Interesse, umfassen, können mittels herkömmlicher gentechnischer Methoden ohne weiteres konstruiert werden. Das DsbA-Polypeptid wird vorzugsweise an den Amino- Terminus eines ausgewählten heterologen Polypeptids fusioniert, obschon auch die Insertion des ausgewählten Polypeptids in eine Stelle innerhalb eines DsbA-Polypeptids geeignet sein kann.
Die Nukleinsäure, die das Fusionspolypeptid codiert, kann wahlweise, zusätzlich zu den Fusionspartnern, die das DsbA-Polypeptid umfassen, und dem Polypeptid von Interesse, zusätzliche "Linker"-DNA, die zusätzliche Aminosäuren codiert, enthalten. Das Linker-Peptid wird zwischen dem Fusionspartner und dem Peptid von Interesse positioniert.
Ein Linker-Peptid kann einer Reihe von Funktionen dienlich sein. Zunächst kann ein Linker eine spezifische Spaltstelle zwischen dem DsbA-Polypeptid und dem Polypeptid von Interesse bereitstellen. Solch eine Spaltstelle kann ein Ziel für ein proteolytisches Enzym, z. B. Faktor Xa, Trypsin, Collagenase, Thrombin oder Subtilisinenterokinase, oder vorzugsweise Ubiquitinhydrolase, enthalten; oder für chemische "Spaltagenzien", wie z. B. Cyanogenbromid oder Hydroxylamin.
Die Spaltschritte können in vivo durch ein proteolytisches Enzym erfolgen, welches durch die Wirtszelle exprimiert wird und die proteolytische Spaltstelle des Linker-Peptids spezifisch erkennt. Alternativ können die Spaltschritte an Fusionspolypeptid-Proben mit oder ohne vorangegangenen Reinigungsschritt zur Entfernung des Wirtszell-Materials erfolgen, und können gefolgt sein von einem Reinigungsschritt zur Entfernung des Spaltagens oder proteolytischen Enzyms und der gespaltenen Proteinfragmente, z. B. Fusionspartner und Linker. Die Methoden zur Spaltung des Peptids von Interesse von den Fusionsproteinen der Erfindung und die verschiedenen darauf bezogenen Reinigungsschritte sind für das verwendete Spaltagens oder proteolytische Enzym spezifisch und sind im Fachgebiet bekannt. Beispiele geeigneter Methoden für die Spaltschritte und Reinigungsschritte sind nachstehend beschrieben und im nachstehenden Beispielabschnitt beispielhaft dargestellt.
Ein Linker kann auch einen "Affinitäts-Tag", der in der Reinigung des Fusionspolypeptids von den anderen zellulären Polypeptiden hilfreich sein soll, codieren. Zum Beispiel können vielfache, durch den Linker codierte Histidin-Reste die Anwendung der Metall chelat-affinitätschromatographischen Methoden zur Reinigung des Fusionspolypeptids möglich machen.
Der Linker kann auch als ein Spacer dienen, z. B. zur Vermeidung der sterischen Hinderung in einem Fusionspolypeptid zwischen dem DsbA-Polypeptid und dem Polypeptid von Interesse. Ob ein Linker erforderlich ist, wird von den strukturellen und funktionellen Eigenschaften des Polypeptids von Interesse, das an das DsbA-Polypeptid fusioniert werden soll, abhängen, wie für Fachleute des Gebiets erkennbar sein wird. Wird das Polypeptid von Interesse natürlich gespalten, so ist möglichweise kein Linker erforderlich. Das Fusionspolypeptid selbst kann ohne Spaltung nützlich sein.
Der Linker kann einem oder all diesen Zwecken oder zusätzlichen Funktionen, oder anderen Funktionen, je nach Erfordernissen dienen.
Die Fähigkeit des DsbA-Polypeptids zum Zielen eines Fusionspolypeptids in einen extracytoplasmatischen Raum in Gegenwart anderer Sequenzen innerhalb derselben Wirtszelle (z. B. nach Permeabilisierung der Außenmembran, was periplasmatischen Polypeptiden das "Austreten" erlaubt, wie in US-Patent Nr. 4,595,658 gelehrt), vereinfacht die Reinigung des Fusionspolypeptids, da zum Beispiel E. coli wenige Polypeptide in das Kulturmedium sekretiert. Alternativ kann die einfache Behandlung von Ganzzellen, die das Fusionspolypeptid exprimieren, mit geeigneten Extraktionspuffern, wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt, das Fusionspolypeptid ohne Freisetzung des Großteils der cytoplasmatischen Polypeptide oder Nukleinsäuren selektiv freisetzen. Diese selektive Freisetzung vereinfacht die Reinigung des Fusionspolypeptids in starkem Maße.
Eine breite Vielfalt von Polypeptiden, einschließlich jener, die ansonsten instabil oder weitgehend unlöslich sind, kann als Fusionen mit den DsbA-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen durch Verwendung geeigneter Expressionssysteme exprimiert werden.
Kurz gesagt werden mit der vorliegenden Erfindung Methoden und Zusammensetzungen bereitgestellt, bei denen eine Nukleinsäure, die Sequenzen umfasst, die ein E. coli- DsbA-Polypeptid codieren, an ein Polypeptid von Interesse, vorzugsweise in einem Expressionsvektor, fusioniert wird. In den Beispielen wurde ein T7-RNA-Polymerasegesteuertes Expressionssystem (Studier und Moffat, J. Mol. Biol. 189: 113–130, 1986), modifiziert durch Translationskopplung (Squires et al., J. Biol. Chem. 263: 16297–16302, 1988) zum Exprimieren großer Mengen der Fusionspolypeptide verwendet, in denen eine DsbA-Polypeptidsequenz an den Amino-Terminus eines heterologen Polypeptids über eine Linker-Polypeptidsequenz geknüpft ist. Mehrere Beispiele der heterologen Polypeptide wurden verwendet, um die generischen Eigenschaften dieses Expressionssystems zu zeigen, einschließlich zweier Wachstumsfaktoren, zweier Enzyme, eines einzelkettigen Antikörpers, eines Bindungspolypeptids und der extrazellulären Domäne eines Membran-durchspannenden Rezeptors. Die Beispiele zeigen, dass die Methoden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine in hohem Maße lösliche Expression bestimmter erwünschter therapeutischer Polypeptide, z. B. IGF-I, ermöglichen, die ansonsten in geringen Mengen in bakteriellen Wirtszellen erzeugt werden.
Die Produktion der Fusionspolypeptide gemäß dieser Erfindung verbessert die Löslichkeit der gewünschten heterologen Polypeptide zuverlässig und erhöht, indem sie die Faltung der gewünschten Polypeptide zu aktiven Konformationen und die Sequestrierung der Fusionspolypeptide in ein privilegiertes Kompartiment im Inneren der Wirtszelle fördern oder den Transport aus dem Cytoplasma der Wirtszelle heraus bewirken, die Stabilität und Akkumulation der heterologen Polypeptidprodukte.
Weiterhin erlaubt die vorliegende Erfindung das Screening mittels Assays von Banken willkürlicher Polypeptide auf ihre biologische Funktion. In Fusion an ein DsbA-Polypeptid akkumulieren die willkürlichen Polypeptide in einem geschützten zellulären Kompartiment in einer löslichen, aktiven Form. Das funktionelle Screening von Expressionsbanken, die Säuger-DNA enthalten, wurde durch die Tatsache behindert, dass es keine Gewissheit gibt, dass die gewünschte Funktion des Proteins erhalten bleibt. Dieses Problem kann durch Klonieren der Gensequenzen der Bank in einen Expressionsvektor, der eine Sequenz für ein DsbA-Polypeptid enthält, ohne weiteres umgangen werden, so dass die Banksequenzen als DsbA-Fusionen exprimiert werden können. Zum Beispiel werden Kolonien von E. coli-Zellen, die mit der Bank transformiert sind, auf einen festen Träger, wie etwa eine Nylonmembran, übertragen. Dort werden die Zellen vorsichtig lysiert (z. B. unter Verwendung eines milden Detergens wie Triton-X 100), um die exprimierten Fusionspolypeptide freizusetzen, und die Fusionspolypeptide werden auf ihre biologische Aktivität gescreent, wodurch der Klon mit dem Gen von Interesse identifiziert wird.
Außerdem können die Fusionspolypeptide der vorliegenden Erfindung zur Entwicklung von Antikörpern, einschließlich monoklonaler Antikörper, mittels wohlbekannter Methoden, wie sie den Fachleuten des Gebiets vertraut sind, verwendet werden.
Polypeptide
Die Polypeptidhomologie wird typischerweise unter Verwendung einer Software zur Sequenzanalyse wie dem Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center (1710 University Avenue, Madison, WI 53705) analysiert. Die Polypeptidanalyse-Software passt ähnliche Sequenzen unter Anlegen von Messwerten der Homologie zusammen, die verschiedenen Substitutionen, Deletionen, Substitutionen oder anderen Modifikationen zugeordnet sind. Zu konservativen Substitutionen zählen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin.
Ein "Fragment" des DsbA-Polypeptids stellt einen Abschnitt der vollen Länge des DsbA-Polypeptids dar, welcher seine funktionellen Eigenschaften im wesentlichen beibehält. Das heißt, das DsbA-Polypeptid-Fragment ist ein solches, das zum Steuern der Translokation von mindestens etwa 20% eines Fusionspolypeptids in ein geeignetes privilegiertes zelluläres Kompartiment der Wirtszelle, in der es exprimiert wird, fähig ist. Auch wird der Ausdruck "zum Steuern des extracytoplasmatischen Transports fähig" mit der Bedeutung verwendet, dass das derart beschriebene Polypeptid oder Fragment ein solches ist, das durch ein geeignetes geschütztes zelluläres Kompartiment der Wirtszelle, in der es exprimiert wird, anzielbar ist.
Außerdem werden die Begriffe "Leader-Peptid", "Signalpeptid" und "Leader" hierin in austauschbarer Weise verwendet und stehen für kurze (15–30 Aminosäuren) Sequen zen, die am Amino-Terminus der Vorläufer-Polypeptide, die zur Sekretion bestimmt sind, d. h. zum Export in nicht-cytoplasmatische Lokationen, die in den reifen Proteinen nicht vorhanden sind, vorliegen.
"Isoliert". Die Begriffe "isoliert", "im wesentlichen rein", "im wesentlichen gereinigt" und "im wesentlichen homogen" werden in austauschbarer Weise zum Beschreiben eines Polypeptids verwendet, welches von seinen natürlichen Komponenten abgetrennt wurde, einschließlich beispielsweise einer Linkersequenz etc., die chemisch oder enzymatisch abgespalten wurde, um das Polypeptid von Interesse ohne solche Komponenten zu erhalten. Ein monomeres Polypeptid ist im wesentlichen rein, wenn mindestens etwa 60 bis 75% einer Probe eine einzige Polypeptidsequenz zeigen. Ein im wesentlichen reines Polypeptid umfasst typischerweise etwa 60 bis 90% (w/w) einer Polypeptidprobe, gewöhnlicher etwa 95%, und ist vorzugsweise zu über etwa 99% rein. Die Reinheit oder Homogenität des Polypeptids kann durch eine Reihe von im Fachgebiet wohlbekannten Methoden angezeigt werden, wie etwa der Polyacrylamid-Gelelektrophorese einer Polypeptidprobe, gefolgt von Sichtbarmachung einer einzelnen Polypeptidbande auf das Anfärben des Gels hin. Für bestimmte Zwecke kann eine höhere Auflösung unter Anwendung der HPLC oder anderer im Fachgebiet wohlbekannter Methoden erreicht werden.
Polypeptid-Reinigung. Bei Expression in Bakterienzellen können Fusionspolypeptide, die eine DsbA-Polypeptid-Komponente umfassen, aus den Zellen durch modifizierten osmotischen Schock, Gefrier/Auftau-Verfahren oder durch Resuspendierung in bestimmten Extraktionspuffern, wie nachstehend als Beispiele angegeben, freigesetzt werden. Eine weitere Polypeptid-Reinigung kann mittels verschiedener, im Fachgebiet wohlbekannter Methoden, z. B. der Affinitätschromatographie, erreicht werden.
Es kann von Vorteil sein, das Fusionspolypeptid zu spalten, um ein Polypeptid von Interesse von einem Fusionspartner und/oder einer Linkersequenz oder anderen Sequenzen zu isolieren, die das Fusionspolypeptid, von dem sie ein Teil ist, umfasst. Ein Linker, der eine Sequenz umfasst, die beispielsweise eine Polyhistidin-Strecke codiert, kann durch Binden an ein Harz, zum Beispiel Ni-NTA-Harz (QIAGEN, Chatsworth, CA) und ProBond-Harz (Invitrogen, San Diego, CA) gereinigt werden. Weitere nützliche Me thoden der Polypeptid-Reinigung sind beschrieben z. B. in Guide to Polypeptide Purification, Hrg. M. Deutscher, 182 Meth. Enzymol. (Academic Press, Inc.; San Diego, 1990) und R. Scopes, Polypeptide Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: New York, 1982.
Vorzugsweise erfolgt die Spaltung des Fusionspolypeptids in vivo über die Coexpression eines kompatiblen proteolytischen Enzyms im Cytoplasma der Wirtszelle. In bakteriellen Wirten wie E. coli ist Ubiquitinhydrolase bevorzugt. Bei Expression in Verbindung mit einem Polypeptid mit einer Ubiquitinhydrolase-Spaltstelle, z. B. als Teil eines Linkers in den Fusionsgenen der vorliegenden Erfindung, spaltet die Ubiquitinhydrolase spezifisch und effizient, wie in Beispiel 6 gezeigt.
Das intakte Fusionspolypeptid kann ebenfalls nützlich sein.
Polypeptid-Modifikationen; Fragmente; Fusionspolypeptide
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polypeptide mit chemischen und biochemischen in vivo- oder in vitro-Modifikationen oder solche, die ungewöhnliche Aminosäuren enthalten. Diese Modifikationen sind wohlbekannt und umfassen zum Beispiel die Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung, Glykosylierung, Ubiquitinierung, Markierung, z. B. mit Radionukliden, verschiedene enzymatische Modifikationen. Siehe z. B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Bd. 1–3, Hrg. Sambrookk, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) oder Current Protocols in Molecular Biology, Hrg.. F. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York (1987 und periodische Überarbeitungen).
Die vorliegende Erfindung stellt Fusionspolypeptide bereit, die ein DsbA-Polypeptid und ein Polypeptid von Interesse umfassen. Beispiele der an ein DsbA-Polypeptid fusionierten Polypeptide umfassen jegliches Peptid oder Polypeptid, das für die Human- oder Veterinärtherapie, für Diagnostik- oder Forschungsanwendungen nützlich ist. Zu solchen Polypeptiden von Interesse zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Hormone, Cytokine, Wachstums- oder Inhibitionsfaktoren, und Enzyme.
Die DsbA-Polypeptide, die Polypeptide von Interesse und die Fusionspolypeptide werden typischerweise mittels rekombinanter Methoden hergestellt, können aber auch chemisch synthetisiert werden. Die Techniken für die Synthese der Polypeptide sind zum Beispiel beschrieben bei Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149–2156, 1963.
Nukleinsäuren
Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuren bereit, die ein Fusionspolypeptid codieren, umfassend ein E. coli-DsbA-Polypeptid und ein anderes Polypeptid von Interesse. Zu solchen Nukleinsäuren zählen RNA, cDNA, genomische DNA, synthetische Formen und Mischpolymere, dabei sowohl Sense- als auch Antisense-Stränge. Diese Nukleinsäuren können chemisch oder biochemisch modifiziert sein und können nicht-natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen enthalten. Die das Fusionspolypeptid codierende Sequenz kann durch Intronen unterbrochen sein.
Die Nukleinsäuresequenzen dieser Erfindung sind von einer ausreichenden Länge, um ein Fusionspolypeptid und, sofern erforderlich, jegliche Vektorsequenzen zu codieren. Die Sequenzen sind gewöhnlich mehrere Hundert Nukleotide oder Nukleotid-Basenpaare lang und können mehrere Kilobasen lang sein.
Die Techniken für die Nukleinsäure-Manipulation, einschließlich der Konstruktion von Nukleinsäuren, die zum Codieren und Exprimieren der Fusionspolypeptide der vorliegenden Erfindung fähig sind, sind wohlbekannt und allgemein beschrieben zum Beispiel bei Sambrook et al., op. cit., oder Ausubel et al., op. cit. Die für die Anwendung dieser Techniken nützlichen Reagenzien, z. B. Restriktionsenzyme und ähnliches, sind im Fachgebiet breit bekannt und kommerziell verfügbar.
Die zur Erzeugung der Fusionspolypeptide der vorliegenden Erfindung verwendeten rekombinanten Nukleinsäuresequenzen können von natürlichen oder synthetischen Sequenzen abgeleitet sein. Die Nukleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen und/oder Fragmente davon können erhalten werden von GENBANK und/oder der Swiss Protein Database, wobei die Zugriffsnummern der Datenbanken die folgenden sind:
Im Falle von IGF und IGFBP-3 werden Codon-optimierte Gene verwendet. In allen Fällen werden lediglich die Abschnitte jeder Sequenz, die für das reife Genprodukt codieren, verwendet.
Jeglicher Expressionsvektor, der mit einer ausgewählten Wirtszelle kompatibel ist, kann in der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Konstruktion der Fusionspolypeptide der vorliegenden Erfindung wird unter Anwendung wohlbekannter Methoden in der rekombinanten DNA-Technologie, z. B. PCR, automatische DNA-Synthese etc., ohne weiteres erreicht.
"Codieren". Von einer Nukleinsäure wird gesagt, dass sie ein Polypeptid "codiert", wenn sie in ihrem nativen Zustand oder im durch den Fachleuten des Gebiets wohlbekannte Methoden manipulierten Zustand transkribiert und/oder translatiert werden kann, um das Polypeptid zu erzeugen. Der Antisense-Strang solch einer Nukleinsäure wird ebenfalls als das Polypeptid codierend bezeichnet.
"Operativ verknüpft". Eine Nukleinsäuresequenz ist operativ verknüpft, wenn sie in einer funktionellen Beziehung zu einer anderen Nukleinsäuresequenz steht. Zum Beispiel ist ein Promotor operativ an eine Codierungssequenz geknüpft, wenn der Promotor ihre Transkription oder Expression beeinflusst. Allgemein bedeutet operativ verknüpft, dass die verknüpften DNA-Sequenzen aneinander angrenzend sind und dort, wo zur Verbindung zweier Polypeptid-Codierungsregionen erforderlich, angrenzend sind und im Leseraster vorliegen.
"Rekombinant". Der Begriff "rekombinante" Nukleinsäure (und analog dazu ein "rekombinantes" Polypeptid, das durch die Expression einer rekombinanten Nukleinsäure erzeugt wird) ist eine solche, die nicht natürlich vorkommt oder durch die künstliche Kombination zweier ansonsten getrennter Segmente einer Sequenz durch chemische Synthesemethoden oder die künstliche Manipulation isolierter Segmente der Nukleinsäuren, z. B. durch genmanipulatorische Techniken, erhalten wird.
Herstellung der rekombinanten oder chemisch synthetisierten Nukleinsäuren; Vektoren, Transformation, Wirtszellen. Große Mengen der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können durch Replikation in einer geeigneten Wirtszelle, ob nun einer Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Amphibien-, Vogel-, Säuger- oder anderen eukaryontischen Zellen und Expressionssystemen, erzeugt werden. Die natürlichen oder synthetischen DNA-Fragmente, die für ein gewünschtes Fragment codieren, werden in rekombinante Nukleinsäure-Konstrukte, typischerweise DNA-Konstrukte, eingebaut. Diese DNA-Konstrukte werden in prokaryontische oder eukaryontische Zellen eingeführt, in denen sie replizieren. Üblicherweise eignen sich die DNA-Konstrukte für die autonome Replikation in einem einzelligen Wirt, z. B. einer Hefe oder Bakterie. Die Konstrukte können auch in das Genom einer gezüchteten Insekten-, Säuger-, Pflanzen- oder anderen eukaryontischen Zelllinie eingeführt und integriert werden. Geeignete Methoden für diese Zwecke sind im Fachgebiet wohlbekannt und wurden beschrieben z. B. bei Sambrook et al. (1989) oder Ausubel et al. (1987 und periodische überarbeitete Auflagen), Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung werden wahlweise mittels chemischer Synthese erzeugt, z. B. durch die Phosphoramidit-Methode, wie beschrieben von Beaucage und Carruthers (Tetra. Letts. 22: 1859–1862, 1981) oder die Triester-Methode nach Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, 1981) und können auf handelsüblichen Oligonukleotid-Syntheseautomaten durchgeführt werden.
Die zur Einführung in einen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt präparierten DNA-Konstrukte umfassen typischerweise ein Replikationssystem, das durch den Wirt erkannt wird, einschließlich des angestrebten DNA-Fragments, das das gewünschte Polypeptid codiert, und enthalten vorzugsweise außerdem Transkriptions- und Translationsinitiations-regulatorische Sequenzen, die operativ an das Polypeptid-codierende Segment geknüpft sind. Expressionsvektoren enthalten zum Beispiel einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS) und Expressionskontrollsequenzen, einen Promotor, einen Enhancer und die nötigen Prozessierungs-Informationsstellen, wie etwa Ribosomen-Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen, Transkriptionsterminatorsequenzen und mRNA-stabilisierende Sequenzen. Solche Vektoren werden mittels standardmäßiger rekombinanter Techniken hergestellt, wie im Fachgebiet wohlbekannt und erörtert zum Beispiel bei Sambrook et al. (1989) oder Ausubel et al. (1987).
Geeignete Promotor- und andere erforderliche Vektorsequenzen werden auf ihre Funktion im Wirt hin ausgewählt. Beispiele funktioneller Kombinationen von Zelllinien und Expressionsvektoren sind beschrieben bei Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1987; siehe auch, z. B. Metzger et al., Nature 334: 31–36, 1988. Viele nützliche Vektoren sind im Fachgebiet bekannt und kommerziell verfügbar. Zur Verwendung in prokaryontischen Wirten enthalten Promotoren, ohne darauf beschränkt zu sein, die trp-, lac- und Phagen-Promotoren, tRNA-Promotoren und glykolytische Enzym-Promotoren. Zu nützlichen Hefepromotoren zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Promotorregionen für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, wie z. B. Enolase oder Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, und Enzyme, die für die Maltose- und Galaktose-Ausnutzung verantwortlich sind. Weitere geeignete Vektoren und Promotoren zur Anwendung in der Hefeexpression sind außerdem beschrieben bei Hitzeman et al., EP 73.657A. Zu geeigneten nicht-nativen Säuger-Promotoren zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die frühen und späten Promotoren von SV40 (Fiers et al. Nature 273: 113, 1978) oder von murinem Moloney-Leukämievirus, Mäuse-Mamma-Tumorvirus, Vogelsarkom-Virus, Adenovirus II, Rinderpapillomavirus und Polyomavirus abgeleitete Promotoren. Außerdem kann das Konstrukt an ein amplifizierbares Gen (z. B. DHFR) gebunden werden, so dass vielfache Kopien des Gens vorgenommen werden können.
Diese Expressionsvektoren können autonom replizieren. Bei einer weniger bevorzugten Ausführungsform kann der Expressionsvektor durch seine Einführung in das Genom der Wirtszelle mittels im Fachgebiet wohlbekannter Methoden replizieren.
Die Expressions- und Kloniervektoren enthalten allgemein einen wählbaren Marker, welcher ein für das Überleben oder Wachsen seiner Wirtszelle erforderliches Polypeptid codiert. Das Vorhandensein dieses Gens gewährleistet das Wachstum lediglich jener Wirtszellen, die den Marker exprimieren. Typische Selektionsgene codieren Polypeptide, die (a) Antibiotika und anderen toxischen Substanzen Resistenz verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat, etc.; (b) auxotrophe Defizienzien komplementieren; oder (c) entscheidende Nährstoffe zuführen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind. Die Wahl des geeigneten selektierbaren Markers hängt von der Wirtszelle ab. Geeignete Marker für verschiedene Wirte sind im Fachgebiet wohlbekannt.
Vektoren mit den Nukleinsäuren von Interesse können in vitro transkribiert werden, und die resultierende DNA wird in die Wirtszellen mittels wohlbekannter Methoden eingeführt (z. B. durch Injektion). Siehe T. Kubo et al., FEBS Lett. 241: 119, 1988. Alternativ können die Vektoren direkt in die Wirtszellen mittels im Fachgebiet wohlbekannter Methoden eingeführt werden, welche in Abhängigkeit von der Art des zelluären Wirts variieren. Zu diesen Methoden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Elektroporation; die Transfektion unter Verwendung von Calciumchlorid, Rubidiumchloridcalciumphosphat, DEAE-Dextran oder anderen Substanzen; der Mikroprojektilbeschuss; die Lipofektion; und die Infektion (dort, wo der Vektor ein infektiöses Agens ist, z. B. ein Retrovi rus-Genom). Siehe allgemein Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1987). Die derart transformierten Zellen sollen auch die Nachfahren dieser Zellen umfassen.
Große Mengen der Nukleinsäuren und Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden durch Exprimieren der Nukleinsäuren oder Abschnitte davon in Vektoren oder anderen Expressionsvehikeln in kompatiblen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erhalten. Die am häufigsten verwendeten prokaryontischen Wirte sind Stämme von E. coli, obschon auch andere Prokaryonten, wie etwa Bacillus subtilis oder Pseudomonas, verwendet werden können. Säuger- oder andere eukaryontische Wirtszellen, wie etwa die von Hefe, Fadenpilzen, Pflanzen, Insekten, Amphibien oder Vogel-Spezies, können ebenfalls zur Erzeugung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung nützlich sein.
Die Erfindung wurde durch direkte Beschreibung offenbart. Im folgenden finden sich Beispiele, die die Wirksamkeit der Methode in der Erzeugung löslicher, aktiver Polypeptide zeigen. Die Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollten in keinster Weise als Beschränkung des Rahmens der Erfindung verstanden werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Expression und Reinigung der Fusionsproteine
Die folgenden Materialien und Methoden wurden während der gesamten Beispiele angewendet, sofern nicht anders angegeben. Weitere Einzelheiten können den hierin zitierten Literaturstellen entnommen werden.
Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen. E. coli JM109 F-traD36 laclq del (IacZ)M15 proAB/recA1 endA1 gyrA96 thi hsdR17 supE44 relA1 del (lac-proAB).
E. coli W3110 DE3 F-thi (lambda-DE3-Lysogen; Studier und Moffat, J. Mol. Biol. 189: 113–130, 1986).
Diese Stämme wurden in L-Bouillon bei 37°C unter Belüftung gezüchtet, sofern nicht anders angegeben. Für Plasmid-enthaltende Stämme wurden, wo geeignet, dem Wachstumsmedium Antibiotika zugegeben.
Plasmide. Die in dieser Arbeit verwendeten Expressionsvektoren sind im wesentlichen identisch zu pJU1003 (Squires et al., J. Biol. Chem. 263: 16297–16302, 1988), mit der Ausnahme, dass die Sequenzen stromabwärts des Translationskopplers und Initiationscodons eingeführt wurden, welches für verschiedene Konfigurationen der folgenden Gene codiert: reifer humaner IGF-1 (70 aa), IGFBP-3 (264 aa), TGF-β2 (112 aa), TGF-β-Rezeptor (extrazelluläre Domäne, 136 aa) oder Maus-EGF-bindendes Kallikrein (237 aa). In jedem Fall folgt ein Terminationscodon diesen Sequenzen. Diese Plasmide weichen von pJU1003 auch darin ab, dass (a) sie nicht die synthetische 16 bp-Adaptorsequenz am 5'-Ende des tet-Gens in pJU1003 enthalten; und (b) sie eine DNA-Insertion an der unikalen PvuII-Stelle im pBR322-abgeleiteten Rückgrat enthalten, bestehend aus einem 385 bp-Fragment, das den par-Locus von pSC101 enthält (Meacock und Cohen, Cell 20: 529–542, 1980). Die Plasmide enthalten auch ein Gen, das eine leaderless E. coli periplasmatische Rotamase stromabwärts des Fremdgens und innerhalb derselben Transkriptionseinheit enthält. Die Signalsequenz des Rotamasegens wurde deletiert, wie beschrieben bei Liu und Walsh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4028–4032, 1990, und durch ein Initiator-Methionin-Codon ersetzt. Das Vorhandensein eines verkürzten Rotamasegens neutralisiert die Wachstums-inhibitorische Wirkung der Ubiquitin-Fusionen in E. coli-Wirtszellen, wie in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung, eingereicht am selben Datum, mit dem Titel "Methods and DNA-Expression Systems for Over-Expression of Proteins in Host Cells" mit der vom Anwalt zugeteilten Registriernummer 22095-20266.00, beschrieben.
Jedes Gen wurde zur Expression in vier getrennten Konfigurationen präpariert, um die Plasmide zu ergeben, die in Tabelle 1 aufgelistet sind: (1) mit den 76 Codons des Hefe-Ubiquitin ("Ubi"), inseriert in-frame mit und stromaufwärts der Gensequenz; (2) mit den 153 Codons für reifes humanes IL-1-β ("IL1β"), fusioniert in-frame zwischen das Initiationscodon und das Gen, und mit einem Linker, der Asp-Arg-Gly-Gly (SEQ ID NR: 6) codiert, inseriert zwischen die IL-1-β-Sequenz und die Gensequenz; (3) mit den 76 Codons des Hefe-Ubiquitins, inseriert zwischen den Linker und die Gensequenz der Konfiguration (2); und (4) mit den 189 Codons des reifen E. coli-DsbA, gefolgt von einem Linker, der His-His-His-His-His-His-Ser (SEQ ID NR: 7) codiert, was IL-1-β plus die Linkersequenzen der Konfiguration (3) ersetzt. Zusätzlich werden die Vektoren 12886 und 12887, in denen das Gen deletiert und durch einen Linker
(5' GGATCCCGTGGAGGATTAAACCATGGATGCATAAGCTTCGAATTCTGCCAGGCATGCAAGCTCAGATCC ... 3') (SEQ ID NR: 8) ersetzt ist, als Kontrollen verwendet.
Sechs Plasmide – pYZ22070, pYZ22096, pYZ9205, pYZ9206, pDM15426 und pDM15424 – enthalten die T7-Transkriptionseinheit der obigen Plasmide in einem pA-CYC184-Rückgrat (Chang und Cohen, J. Bacteriol. 134: 1141–1156, 1978). Spezifisch ersetzten in diesen sechs Plasmiden, das ClaI-ScaI-Fragment, das den T7-Promotor trägt, der Translationskoppler, das Genkonstrukt, das Rotamasegen und der T7-Terminator das 1,0 kb ClaI-NruI-Fragment von pACYC184. Das pYZ9205-Plasmid enthält die vollständige Codierungssequenz für DsbA im obigen Vektor-Rückgrat. Das pYZ9206-Plasmid ist identisch zu pYZ9205, außer, dass die Signalsequenz von DsbA durch ein Methionin-Codon ersetzt wurde. Das pDM15426-Plasmid ist identisch zu pYZ22070 (oben), außer, dass es die Signalsequenz von DsbA enthält. Das pDM15424-Plasmid enthält die Codierungssequenz für die IL-1-Rezeptor-Antagonisten ohne seine natürliche Signalsequenz.
Die Hefe-Ubiquitin- und Rotamase-Sequenzen wurden mittels der PCR-vermittelten Amplifikation der geeigneten genomischen DNAs erhalten. cDNA-Klone für IGFBP-3 wurden isoliert, wie beschrieben bei Spratt et al., Growth Factors 3: 63–72, 1990, und durch Substituieren des Amino-terminalen Drittels des Gens mit einer synthetischen DNA-Sequenz, die dieselben Aminosäuren wie das natürliche Gen codiert (nämlich die anfänglichen 288 Nukleotide der reifen Sequenz, bis zur unikalen BssHII-Stelle), doch unter Verwendung von für die Expression in E. coli optimierten Codonen modifiziert (siehe z. B. Fiers, Nature 260: 500, 1976). Die IGF-I-Sequenz wurde de novo aus synthetischer DNA und entsprechend verwendeten, für E. coli optimierten Codons konstruiert.
Die TGF-β2-Sequenz wurde durch PCR-vermittelte Modifikation eines cDNA-Klons erhalten, der von Dr. Michael Sporn, National Institutes of Health, erhalten wurde. Die TGF-β-Rezeptorsequenz wurde in ähnlicher Weise abgeleitet von pH2-3FF, einem cDNA-Klon von Dr. Herb Lin, Massachusetts Institute of Technology, und die Maus-EGF-bindende Kallikrein-Sequenz von pMS2-12A, einem cDNA-Klon von Dr. Ralph Bradshaw, University of California at Riverside. Alle PCR-abgeleiteten DNAs wurden vor der Verwendung sequenziert.
Jedes Plasmid wurde in W3110DE3 durch Calciumchlorid-vermittelte Transformation und Selektion für Antibiotikum-Resistenz eingeführt.
Enzyme und Reagenzien. Die Enzyme und Reagenzien wurden erworben von New England Biolabs, Beverly, MA; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Pharmacia, Piscataway, NJ; BRL, Gaithersburg, MD; US Biochemical, Cleveland, OH; und Clontech, Palo Alto, CA.
Allgemeine Techniken. Restriktions-Verdaus, Agarose-Gelelektrophorese, Ligationen, Transformationen, DNA-Präparierung, DNA-Sequenzierung, Zellkultur, SDS-PAGE, Western Blots, ELISA, und weitere herkömmliche molekularbiologische Techniken, wie beschrieben bei Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Bd. 1–3, Hrg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 und Current Protocols in Molecular Biology, Hrg. F. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987 und periodische Überarbeitungen.
Zellanzucht und Ernte. Ein E. coli-Stamm W3110DE3, der eines der obigen Plasmide enthielt, wurde in 5 ml Luria-Bouillon (LB) eingeführt, die Tetracyclin (15 μg/ml) oder Chloramphenicol (20 μg/ml) enthielt, und bis zur Sättigung über Nacht unter Belüftung bei 37°C gezüchtet. Zwei ml der frischen Übernacht-Kultur wurden in 100 ml LB, ergänzt mit 0,2% Glucose, verdünnt. Die Kultur wurde unter Belüftung für mehrere Stun den bei derselben Temperatur gezüchtet. Die optimale Dichte der Kultur wurde durch das frühe logarithmische Wachstum verfolgt, bis die optische Dichte (600 nm) 0,4 erreicht hatte. Dann wurde eine Teilmenge von ein ml entfernt und die Zellen abgeerntet ("0 Minuten"-Zeitpunkt).
Isopropyl-Thiogalactopyranosid (IPTG) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM zugesetzt und die Inkubation der Kultur für zwei Stunden fortgesetzt. Eine zweite Teilmenge der Zellen wurde entfernt ("120 Minuten"-Zeitpunkt).
Teilmengen von diesen Zeitpunkten wurden zur Zubereitung von "Ganzzell-Lysaten" (WCL) wie nachstehend beschrieben verwendet. Der Rest der Kultur wurde mittels Zentrifugation geerntet, dann behandelt mit (1) dem "TEX-Pufterextraktionsprotokoll" oder (2) einer Variante des TEX-Protokolls ohne den TEX-Schritt, dem "einfachen Beschallungsprotokoll".
TEX-Pufferextraktionsprotokoll. Die Zellen wurden in 1/10 des ursprünglichen Kulturvolumens des TEX-Puffers (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 0,1% Triton X-100) resuspendiert und für 20–60 Minuten auf Eis platziert. Nach der Zentrifugation in einer Beckman TJ-6-Zentrifuge bei 3000 UpM für 15 Minuten bei 4°C wurde der Überstand ("TEX-Extrakt" oder "T" in den Figuren) entfernt, und das Zellpellet wurde in demselben Volumen von TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Beschallung unter Verwendung eines Branson-Ultraschallgeräts aufgebrochen (2 × 30 Sekunden Bursts). Bei einigen Experimenten wurde die Lyse durch Zugabe von 0,2 mg/ml Hühnerlysozym zum Lysepuffer verstärkt, obschon dieser Schritt als nicht erforderlich erschien. Die aufgebrochenen Zellen wurden in einer Beckman TJ-6-Zentrifuge bei 3000 UpM für 15 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand ("cytoplasmatische Fraktion", oder "C" in den Figuren) wurde entfernt. Das Pellet wurde nochmals in TE gewaschen und in einem gleichen Volumen des TE-Puffers für die Analyse weiter resuspendiert ("unlösliche Fraktion" oder "I" in den Figuren).
Einfaches Beschallungsprotokoll. Die Zellen wurden in 1/10 des ursprünglichen Kulturvolumens von TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und beschallt. Alle anschließenden Schritte waren dieselben wie für das TEX-Pufferextraktionsproto koll nach der Beschallung. Der nach der Beschallung bei diesem Protokoll erhaltene Überstand wird jedoch als die "lösliche" Fraktion bezeichnet (gekennzeichnet mit "S" in den Figuren) (und stellt die Summe aus den "TEX"- und "cytoplasmatischen" Fraktionen) dar.
Ganzzell-Extrakte wurden für die Elektrophorese durch Resuspendieren jeder Ganzzell-Teilmenge, die aus der Kultur während des Wachstums in 100 μl SDS-PAGE-Probenpuffer entfernt wurde, und Kochen für 5 Minuten resuspendiert. "Lösliche" und "unlösliche" Fraktionsproben wurden durch Zugeben eines Volumens von 2 × Probenpuffer (1% SDS, 10% Glycerol, 0,1% Bromphenol Blau) und Inkubieren bei 65°C für 15 Minuten präpariert.
Beispiel 2: Homologie zwischen den Proteinen
1 zeigt einen Vergleich der Sequenzen (Alignment) der fünf Mitglieder der IL-1-artigen Proteinfamilie: (1) E. coli-DsbA, (2) humanes IL-1-β, (3) humanes IL-1-β und (4) humane basische und (5) humane saure Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs). Zur Maximierung des Alignments wurden die geeigneten Regionen der längeren Mitglieder aus dem Vergleich ausgeschlossen, nämlich die Oxidoreduktase-Aktivzentrumschleife von DsbA (Reste 21 bis 35) und eine andere große Schleife an anderer Stelle in DsbA (Reste 126–157).
Bei optimalem Alignment in dieser Weise zeigen die verschiedenen Mitglieder dieser Gruppe und das Toxin-coregulierte Pilus-(TcpG)-Polypeptid ein bakterielles Homologon von E. coli-DsbA aus Vibrio cholerae (Peek und Taylor, op. cit.), und zeigen die in 2 dargestellten Homologien zu IL-1-β. Über die festgestellten Homologien hinaus können mehrere konservative Substitutionen an verschiedenen Positionen in den in 1 gezeigten Sequenzen beobachtet werden, z. B. IL-->Val, Phe-->Tyr und Asp-->Glu an mehreren Positionen.
Beispiel 3: Akkumulation und präferentielle Freisetzung der DsbA-Polypeptide und deren Fusionen aus Bakterienzellen
E. coli-DsbA wurde zur Veranschaulichung der breiten Anwendbarkeit der Polypeptidfusionen an DsbA-Polypeptide ausgewählt, um die Akkumulation und präferentielle Freisetzung der Fusionsproteine aus Bakterienzellen zu erreichen. Die reife Sequenz von E. coli-DsbA wurde exprimiert, d. h. ihre natürlich codierte Amino-terminale Signalsequenz wurde durch ein einzelnes Methionin-Initiatorcodon ersetzt (pDM15424 und pYZ9206; p15433 ist identisch zu pY9206, außer, dass Codons V22 bis Q35 der DsbA durch Codons V22 bis P77 des Gen III des Bakteriophagen m13 ersetzt wurden; die erwartete Größe des mutierten Genprodukts beträgt etwa 27 kD).
3 zeigt die Akkumulation und SDS-PAGE-Fraktionierung von E. coli-DsbA. 3a zeigt Ganzzell-Lysate ("WCL") zu 0, 60 und 120 Minuten-Zeitpunkten von Zellen, die reife DsbA exprimieren (d. h. denen eine Leadersequenz fehlt); 3b, WCL zu 0, 60 und 120 Minuten-Zeitpunkten von Zellen, die eine "mutierte" reife DsbA mit einer Ersetzung der Aktivzentrumschleife durch etwa 55 Aminosäuren aus Gen III des Bakteriophagen m13 exprimieren (Codons V22 bis Q35 von DsbA wurden ersetzt durch Codons V22 bis P77 des m13-Gens III); 4c, TEX-Extrakt ("T") und "cytoplasmatische" ("C") Fraktionen von Zellen, die reifes Wildtyp-DsbA exprimieren; und 4d, "T"- und "C"-Fraktionen von Zellen, die "mutiertes" DsbA exprimieren. Die erwartete Größe des exprimierten Polypeptids beträgt etwa 22 kD.
Nahezu das gesamte exprimierte DsbA-Protein wurde in der TEX-Fraktion gefunden. Die Transferierbarkeit zu einem extrahierbaren Kompartiment ging nicht verloren, wenn die Aktivzentrumschleife von DsbA durch Sequenzen eines nicht-verwandten Gens ersetzt wurde.
4 zeigt die Fraktionierung von Zellen, in denen verschiedene Fusionen von DsbA mit humanem IGF-I oder TGF-β-Rezeptor exprimiert wurden. (1) DsbA-Ubi-IGF (pYZ22070), mit einer erwarteten Größe von etwa 37 kD; und (2) DsbA-Ubi-TGFR (pDM15428), mit einer erwarteten Größe von etwa 46 kD.
Die beiden SDS-PAGE-Gele in 4, links, zeigen WCL zu 0 und 120-Minuten-Zeitpunkten der E. coli-Zellen, die diese beiden Fusionspolypeptide exprimieren. Die beiden SDS-PAGE-Gele in 4, rechts, zeigen TEX und "cytoplasmatische" Fraktionen für diese beiden Fusionspolypeptide. Zur Kennzeichnung der Bande des Fusions polypeptids wurden Punkte verwendet, wobei dort, wo ein zweiter Punkt vorhanden ist, das Vorhandensein eines Abbauprodukts des Fusionspolypeptids angezeigt wird.
In allen vier Fällen wurden beträchtliche Anteile der Fusionsproteine in der TEX-Fraktion gefunden. Folglich wurden diese Fusionen der IL-1-artigen Proteine aus Zellen ebenfalls in beträchtlichem Maße in das extrahierbare Kompartiment übertragen.
Um eine ähnliche Lokalisation der TEX-Fraktion wie das reife DsbA zu bestätigen, wurden Oxidoreduktase-Assays an Rohextrakten vorgenommen, wie beschrieben von Holmgren (J. Biol. Chem. 254: 9627–9632, 1979), mit Ausnahme der folgenden Modifikationen: die Assays wurden bei Raumtemperatur vorgenommen; DTT wurde zu 0,1 mM verwendet; und das Insulinsubstrat betrug 1 mg/ml. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. DsbA, dem eine Leadersequenz fehlt, wird sekretiert, was zu seiner Lokalisation in der TEX-Fraktion führt.

T: TEX-Fraktion;
C: cytoplasmatische Fraktion

Beispiel 4: Akkumulation der löslichen Fusionspolypeptide in Bakterien
DsbA-Fusionspartner zeigten eine ausgeprägte und zuträgliche Wirkung auf die Löslichkeit einer Vielzahl strukturell nicht-verwandter heterologer Proteine, die in Bakterien exprimiert werden.
In 5 bis 8 sind die Ergebnisse zusammengestellt, die erhalten wurden, wenn die "löslichen" (S) und "unslöslichen" (I) Fraktionen der induzierten Zellen, die Konstrukte für jedes von vier verschiedenen Humangenen trugen, verglichen wurden.
In 5 wurden TGF-β2-Fusionskonstrukte analysiert. 5, links, zeigt Coomassie-angefärbte SDS-Polyacrylamidgele von Ganzzell-Lysaten ("WCL") zu 0 und 120-Minuten-Zeitpunkten und lösliche ("S") und unlösliche ("I") Fraktionen von E. coli-Zellen, die mit pDJ16920 transformiert sind, die ein Ubiquitin-TGF-β2-Fusionspolypeptid mit einer erwarteten Größe von etwa 20 kD codieren. Nahezu dieses gesamte Fusionspolypeptid wurde in der "unlöslichen" Fraktion festgestellt. Mit diesem Plasmid pYZ22096, das eine DsbA-Ubiquitin-TGF-β2-Fusion von etwa 42 kD codiert, 5, rechts, wurde jedoch gezeigt, dass das Protein nahezu vollständig löslich war. Diese Ergebnisse sind auch darin signifikant, dass sie zeigen, dass lösliches TGF-β2 bei 37°C erhalten werden kann. Vorangegangene Versuche zum Erhalt von löslichem TGF-β2 beruhten auf einer Anzucht bei Niedertemperatur (z. B. bei 30°C), was weniger erwünscht ist, da eine Anzucht bei Niedertemperatur für das Wachstum von E. coli-Wirtszellen suboptimal ist und eine kostspielige Reaktorkühlung erfordert.
In 6 sind die mit mehreren IGF-1-Fusionen erhaltenen Ergebnisse gezeigt.
6, rechts, zeigt Gele von Extrakten von E. coli-Zellen, die mit pYZ22070 transformiert sind, welches reifes DsbA-Ubiquitin-IGF (d. h. DsbA, dem eine Signalsequenz fehlt) mit einer erwarteten Größe von etwa 37 kD exprimiert, oder mit pDM15426, welches DsbA-Ubi-IGF exprimiert, worin DsbA seine native Signalsequenz beibehält und eine erwartete Größe von etwa 37 kD besitzt.
7 zeigt die mit Fusionen an IGFBP-3 erhaltenen Ergebnisse. Panel [i] zeigt die Ubiquitin-IGFBP-3-Fusion mit einer erwarteten Größe von 38 kD (pDJ12875); und [ii] DsbA-Ubiquitin-IGFBP-3, mit einer erwarteten Größe von etwa 60 kD (pDM15427).
9, Panel [i], zeigt Ganzzell-Lysate zu 0 und 120 Minuten-Zeitpunkten und "lösliche" ("S") und "unlösliche" ("I") Fraktionen von E. coli-Zellen, die eine Ubiquitin-TGF-βR-Fusion mit einer erwarteten Größe von etwa 24 kD exprimieren (pDJ16921), Panel [ii], eine DsbA-Ubiquitin-TGF-βR-Fusion mit einer erwarteten Größe von etwa 46 kD (pDM15428; βR ist die extrazelluläre Domäne des TGF-β-Rezeptors). Die Ubiquitin- TGF-βR-Fusion war weitgehend unlöslich. In deutlichem Kontrast dazu war die DsbA-Ubiquitin-TGF-βR-Fusion nahezu vollständig löslich.
Beispiel 5: Biologische Aktivität des humanen IGF-I, wie aus Fusionsproteinen in bei 37°C gezüchteten Bakterienzellen erhalten
11 zeigt die Wirkungen der Temperatur und der Fusion an DsbA-Polypeptid auf die in vivo-Faltung von IGF-I zu einer biologisch aktiven Konformation.
Die Fusionsproteine wurden aus Extrakten dieser Kulturen durch Leiten der "löslichen" Fraktionen, die aus 100 ml induzierten Zellen, wie oben beschrieben ("einfaches Ultraschallprotokoll") präpariert waren, durch eine Q-Sepharose-(Pharmacia)-Säule (5 ml-Bettvolumen), äquilibriert in 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, ausgereinigt. Die Säule wurde in zwei Säulenvolumina desselben Puffers gewaschen und die Probe in 8 ml desselben Puffers mit zusätzlichen 0,4 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde auf einer Centricon-30-Membran (Amicon) auf ein Volumen von 0,5 ml konzentriert.
Ubiquitinhydrolase-Spaltung. Dem obigen Konzentrat wurden 10 μl Rohextrakt des Enzyms Ubiquitinhydrolyse zugesetzt, welcher aus einem das Plasmid 23344 enthaltenden Stamm wie nachstehend in Beispiel 6 beschrieben hergestellt worden war.
HPLC-Umkehrphasen-Chromatographie. Die HPLC-Umkehrphasen-Chromatographie wurde wie folgt vorgenommen. Nach der Inkubation mit Ubiquitinhydrolase für 60 Minuten bei 37°C wurde der Verdau direkt auf eine C-18-(Vydac)-Umkehrphasen-Säule aufgebracht und einer HPLC-Chromatographie in einem Zwei-Puffersystem unterzogen: Puffer A bestand in wässriger 0,1% Trifluoressigsäure (TDA), und Puffer B war 0,1% TFA in Acetonitril. Die Säule wurde wie folgt entwickelt: 0–22% B in 4 Minuten; Waschen in 22% B für 6 Minuten; Eluieren in einem 22–42% B-Gradienten bei 0,5% pro Minute (40 Minuten insgesamt). Der IGF-1-Standard eluiert bei 31,4% B unter diesen Bedingungen. Die Peaks wurden abgesammelt, dann für den IGF-Bioassay (unten) verdünnt oder einer PAGE-Analyse unterzogen. Der Peak, der von der 31,4%-Position in allen Proben entnommen wurde, enthielt eine einzelne Proteinbande, die bei 7,5 kD wanderte, wie mittels PAGE bestimmt, wobei die Proteinbande durch Silberanfärbung sichtbar gemacht wurde. Keine kontaminierenden Proteine wurden in dieser Fraktion beobachtet. Die Peak-Höhen wurden daher zur Beurteilung der Menge an vorhandenem IGF im Vergleich zu einem kommerziellen IGF-Standard verwendet.
IGF-Bioassay. Im IGF-Bioassay wurden MG63-Zellen (ATCC CRL #1427, eine männliche Osteosarkom-Zelllinie) in 96-Well-Mikrotiterplatten bei 5000 Zellen pro Vertiefung ausplattiert und 16 Stunden lang bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Das Kulturmedium wurde angesaugt, und Proben (einschließlich handelsüblicher IGF-Standards, wie etwa beziehbar von Imcera, Terre Haute, IN) wurden den Vertiefungen in RPMI-Medium, 2 mM Glutamin, 50 E/ml Penicillin, 50 mg/ml Streptomycin, 0,05% Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben.
Zweifache Reihenverdünnungen jeder Probe wurden getestet. Unter Anwendung des Zellproliferations-Kits (Katalog Nr. RPN.210, Amersham) wurden die Zellen 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert, das Medium abgeschöpft und 100 μl des Markierungsreagens des Kits nach Anleitung im gleichen Medium verdünnt und jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden dann bei 37°C für drei Stunden inkubiert.
Nach dem Abschöpfen des Reagens wurden die Zellen in kaltem PBS dreimal gewaschen und dann durch Zugabe von 100 μl an 90% Ethanol, 5% Essigsäure, in jede Vertiefung fixiert. Die fixierten Zellen wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann dreimal jeweils in (a) PBS – 0,1% Tween-20; (b) PBS + 0,1% Triton X-100, und (c) PBS – 0,1% Tween-20 gewaschen. Anschließend wurden die Wells für 15 Minuten bei Raumtemperatur in PBS + 0,1% Tween-20 + 1% entrahmter Trockenmilch (NFDM, Marke Carnation) blockiert und mit der im Kit bereitgestellten Antikörper-Markierung gemäß dem Protokoll des Herstellers (Amersham) behandelt. Das A₄₀₅/A₄₉₀-Verhältnis wurde gemessen, um die 5-Brom-2-dioxyuridin-(BRDU)-Aufnahme zu bestimmen. Die Konzentration des IGF-I in jeder Probe wurde durch Vergleich mit einer standardmäßigen Kurve bestimmt. Alle Proben wurden im Triplikat untersucht.
Im Anschluss an die Bindungsreaktion wurden Proben durch Zugabe von 0,3 mM Disuccinimidylsuberat bei 4°C für 30 Minuten chemisch vernetzt. Die Vernetzung wurde durch Zugabe von Tris-HCl, pH 7,5, auf eine Konzentration von 20 mM, gefolgt von Kochen für 10 Minuten, festgestellt. Eine Portion der vernetzten Probe wurde durch Inku bation mit N-Glykosidase F bei 37°C für drei Stunden in Gegenwart von 0,2% 2-Mercaptoethanol und 2% SDS enzymatisch deglykosyliert. Im Anschluss an diese Inkubation wurde eine zweite Teilmenge der N-Glykosidase F hinzugefügt und die Probe eine weitere Stunde lang inkubiert. Die Produkte der Bindungsreaktion wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung eines 8%-Gels aufgetrennt. Die markierten Spezies wurden nach Fixierung des Gels in 10% Essigsäure, 40% Methanol, durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
9A und 9B zeigen die HPLC-Umkehrphasen-Elutionsprofile von Ubiquitinhydrolase-gespaltenem IGF-1, wie aus Kulturen von DsbA-Ubiquitin-IGF und Ubiquitin-IGF-Konstrukten, jeweils gezüchtet bei 30°C, abgeleitet. 9C und 9D zeigen die entsprechenden Daten von Kulturen von DsbA-Ubiquitin-IGF und Ubiquitin-IGF-Konstrukte, jeweils gezüchtet bei 37°C. Die Position des IGF-I bei 31,4% Puffer B wurde durch Vergleich mit einem handelsüblichen gereinigten IGF-Standard festgestellt. Aus 9D ist klar, dass die Ubiquitin-Fusion bei 37°C keinen korrekt gefalteten IGF-I erzeugte (IGF-I liegt bei etwa 35% B), doch die Ubiquitin-Fusion korrekt gefalteten IGF-I bei 300°C erzeugte. Obschon die Temperaturabhängigkeit der IGF-I-Faltung als solche nicht unerwartet war, so war doch die deutliche Wirkung eines DsbA-Fusionspartners auf die Gewinnung des korrekt gefalteten IGF-1 überraschend (vgl. 11C und 11D).
Die spezifische Aktivität der IGF-Peaks (gezeigt in 9 als eingerahmte Werte, willkürliche Einheiten) wurde durch den IGF-Bioassay festgestellt. Bei diesem Assay betrug die spezifische Aktivität des authentischen IGF-10,206. Im Gegensatz dazu betrug die spezifische Aktivität von Peak #2, dem Hauptpeak in 9D (Ubiquitin-Fusion, 37°C) 0,004.
Die Amino-terminale Proteinsequenz für den IGF-1-Peak in 9C wurde durch Edman-Abbau in einem Sequenzierautomaten (Applied Biosystems, Foster City, CA) festgestellt. Eine einzelne Hauptspezies wurde mit der Sequenz Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-X-Gly-Ala-Glu-Leu (SEQ ID NR: 9) gewonnen. Dies war die erwartete Amino-terminale Sequenz für das reife IGF-1, was wiederum zeigt, dass Ubiquitinhydrolase so präzise wie erwartet spaltete.
Um die unwahrscheinliche Möglichkeit auszuschließen, dass die Reinigung der IGF-I-Probe vor der HPLC die Ergebnisse beeinflusst haben könnte, wurden die Rohextrakte ("lösliche" Fraktion) von Stämmen, die die in Tabelle 3 aufgelisteten Konstrukte trugen, mit Ubiquitinhydrolase behandelt, auf eine Gesamtproteinkonzentration eingestellt und für den IGF-Bioassay verdünnt. Die Spaltung des Fusionsproteins wurde durch SDS-PAGE in jedem Fall bestätigt. Die groben Bioaktivitäten (in willkürlichen Einheiten) betrugen:
Diese Ergebnisse bestätigten die frühere Beobachtung, dass ein DsbA-Fusionspartner die Gewinnung des biologisch aktiven IGF-I aus E. coli wesentlich erhöht. Die erhaltenen IGF-1-DsbA-Fusionen zeigten auch die korrekte Amino-terminale Sequenz (GPETLXGA ...) (SEQ ID NR: 10) nach Spaltung mit Ubiquitinhydrolase.
Zusammengefasst weisen diese Ergebnisse den Nutzen der DsbA-Fusionspartner in der Produktion, Akkumulation und Gewinnung von biologisch aktivem IGF-I in Bakterienzellen nach.
Beispiel 6: Erzeugung von Hefe-Ubiquitinhydrolase in Bakterienzellen und Coexpression der Fusionspolypeptide
Ubiquitinhydrolase-(UH)-Expressionsvektoren wurden von einem cDNA-Klon von UBP-1 abgeleitet (Tobias und Varshavsky, J. Biol. Chem. 266: 12021–12028, 1991) durch Deletieren der 92 Amino-terminalen Codons des Gens stromaufwärts der unikalen BglII-Stelle und Ersetzen dieser DNA durch (a) die ersten 12 Codons des phi-10-Gens des Bakteriophagen T7, um Plasmid 23344 zu erhalten; (b) die 153 Codons des reifen hu manen IL-1-β, gefolgt von einem Linker, der Asp-Arg-Gly-Asp-Pro-His-His-His-His-His-His-Glu (SEQ ID NR: 11) codiert, zum Erhalt von Plasmid 23399; oder (c) die 189 Codons von E. coli-DsbA, gefolgt von einem Linker, der His-His-His-His-His-His-Ser (SEQ ID NR: 7) codiert, gefolgt von den ersten 75 Codons (nach Methionin) des Hefe-Ubiquitins, gefolgt von einem Linker, der Asp-Pro-His-His-His-His-His-His-Glu (SEQ ID NR: 12) codiert, um Plasmid 27246 zu erhalten. In jedem Fall führten die In-Frame-Fusionen zu einem Fusionsgen unter der Kontrolle des T7-Promotors. Das Vektor-Rückgrat und andere Einzelheiten der bei diesen Experimenten verwendeten Transkriptionseinheit sind in Beispiel 1 beschrieben.
Die Zellen des E. coli-Stamms W3110 DE3 wurden mit Kombinationen von kompatiblen Plasmiden wie folgt transformiert:
Nach Induktion mit IPTG, wie in Beispiel 1 beschrieben, zeigten sich die Hauptbande auf den Coomassie-angefärbten SDS-Polyacrylamidgelen, die den erwarteten Größen des IGF-Fusionsproteins und des Produkts seiner Spaltung mit UH entsprachen.
Die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse zeigen klar, dass eine auf den periplasmatischen Raum über einen allgemeinen Sekretionsweg gezielte Proteinfusion relativ immun ge genüber einer Spaltung durch UH-Enzym, fusioniert an DsbA, ist, doch das identische Fusionsprotein, das über den alternativen Weg, der von reifem DsbA (d. h. dem eine Signalsequenz fehlt) genutzt wird, sequestriert wurde, entweder durch cytoplasmatisches oder DsbA-fusioniertes UH-Enzym wirksam gespalten wird. Trotz der für DsbA-Polypeptide und deren Fusionen beobachteten selektiven Extraktion, wenn in E. coli exprimiert (Beispiel 3), scheinen diese Polypeptide in einer Weise sequestriert zu werden, die von der bei klassischen periplasmatischen Proteinen verschieden ist. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass coexprimierte Ubiquitinhydrolase-Gene ein Fusionspolypeptid in vivo wirksam spalten können, das ein DsbA-Polypeptid umfasst, das von einem Polypeptid von Interesse, z. B. IGF, durch einen Linker getrennt ist, der eine Ubiquitinhydrolase-Spaltstelle enthält.
Beispiel 7: Reinigung des TGF-Rezeptorfrapments und Vernetzungsassay
Die aus induzierten Zellen (100 ml Kulturvolumen) präparierte "lösliche" Fraktion, die Plasmid pDM15428 enthielt, wurde über ein 1 ml-Bettvolumen einer Ni-NTA-Affinitätssäule (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA) geleitet, äquilibriert, gewaschen und gemäß den Empfehlungen des Herstellers entwickelt. Das Eluat wurde gegen den ursprünglichen Beladungspuffer dialysiert, mit einem teilweise gereinigten Präparat der Ubiquitinhydrolase verdaut und über eine Ni-NTA-Säule geleitet, die identisch zu der oben beschriebenen war. Der Durchlauf wurde auf einer Centricon-10-Membran (Amicon) auf ein Endvolumen von 0,5 ml konzentriert und für Vernetzungsassays wie folgt verwendet: 20 μl dieser Probe wurden über Nacht mit 100 pM ¹²⁵I-TGF-β1 (250 nM) inkubiert. Die Probe wurde mit 0,3 mM Disuccinimidylsuberat (Pierce Chemical, Rockford, IL) für 15 Minuten bei 4°C vernetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines Drittel des Volumens an 4 × Laemmli-Gel-Probenpuffer, enthaltend 50 mM Dithiothreitol, gelöscht. Die Probe wurde für zwei Minuten (100°C) gekocht und einer SDS-PAGE unterzogen. Das Gel wurde getrocknet und mittels Autoradiographie bei einer Übernacht-Belichtung bei –80°C sichtbar gemacht.
10 zeigt das Ergebnis der Vernetzungs-Experimente unter Verwendung von ¹²⁵I-radiomarkiertem TGF-β1 und teilgereinigtem TGF-βR (extrazelluläre Domäne von 136 Aminosäuren). Das erwartete Vernetzungsprodukt wird als bei 30 kD wandernd beo bachtet. Dieses Produkt wird durch eine spezifische Bindungs-Interaktion gebildet, da sein Auftreten durch Zugabe eines (1000-fach molaren) Überschusses an kaltem TGF-β1 völlig wegfällt. Diese Daten zeigen, dass mithilfe des DsbA-Fusionspartners ein funktioneller TGF-β-Rezeptor in Bakterien erzeugt werden kann.
Beispiel 8: IGFBP-3-Dot-Blot-Assay
Für den IGFBP-3-Dot-Blot-Assay wurde eine vorgeschnittene Immobilon-P-Membran (Millipore) 5 Sekunden lang in Methanol eingeweicht, mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) gespült und dann in TBS für 10 Minuten eingeweicht. Die Membran wurde auf einen Dot-Blot-Apparat aufgebracht, und in jede Vertiefung wurden 50 μl TBS eingebracht. Die Proben wurden auf die Membran mittels Vakuumansaugung aufgebracht. Die Membran wurde dann in TBS + 3% entrahmter Trockenmilch (Marke CARNATION) bei Raumtemperatur für zwei Stunden blockiert. ¹²⁵I-radiomarkierter IGF-I (1 μl pro ml Blockierpuffer) wurde zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Der Puffer wurde verworfen und der Filter in TBS gewaschen (2 × 15 Minuten-Waschgänge bei Raumtemperatur). Die Membran wurde dann für 10 Minuten luftgetrocknet, daraufhin mit einem Kodak XR-Omat-Film über Nacht bei –80°C belichtet.
11 zeigt die Ergebnisse eines Dot-Blot-Bindungsassays unter Verwendung von ¹²⁵I-radiomarkiertem IGF-I zum Messen der Bindungsaktivität in Rohextrakten ("lösliche" Fraktion) von Stämmen, die (1) eine DsbA-Ubiquitin-IGFBP-3-Fusion (pDM15427), (2) eine Ubiquitin-IGFBP-3-Fusion (pDJ12875) oder (3) eine "lediglich Vektor"-Kontrolle (pDJ12887) exprimierten. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, ob die Proben nun mit Ubiquitinhydrolase (+UH) vorbehandelt oder nicht behandelt (–UH) waren, was darauf hinwies, dass die intakten Fusionsproteine den Liganden ebenso wirksam binden können wie das gespaltene IGFBP-3-Protein. In diesem Fall ist keine Ubiquitin-Spaltung erforderlich, um ein aktives Protein zu erhalten.
Die Ergebnisse zeigen klar, dass der DsbA-Fusionspartner die Gewinnung des bioaktiven IGFBP-3 um das etwa 16-fache (4-fache Reihenverdünnungen wurden auf dem Blot angewendet) steigerte.
Beispiel 9: Expression von Mini-DsbA und Fusionen
Um die Wirkung einer Entfernung der gesamten Region um die doppelte Cystein-Aktivzentrumschleife von DsbA herum zu testen, wurde der DsbA-Expressionsvektor pYZ9206 (in obigem Beispiel 1 beschrieben) modifiziert durch Ersetzen der DNA zwischen den unikalen BssHII und BglII-Stellen dieses Plasmids durch synthetische DNA der Sequenz:
5' ... GCGCGCCTTCTGGTTCTTTCATGGGTGGTGACCTGGGCAAAGATCT ... 3' (SEQ ID NR: 17). Die Wirkung dieser Ersetzung (im folgenden als "Mini-DsbA" bezeichnet) besteht in der Ersetzung der Aminosäuren Ser-Gly-Ser durch die Aminosäuren #21–62 der ursprünglichen (reifen) DsbA. Die doppelte Cystein-Aktivzentrumschleife, lokalisiert bei #30–33, wird durch diese Verfahrensweise deletiert. Das resultierende Plasmid, pDM25452, wurde durch Fusionieren von Ubiquitin und den IGF-Sequenzen an das Carboxy-terminale Ende des Mini-DsbA zum Erhalt von pDM25486 weiter modifiziert. pDM25499 stellt eine Variante von pDM25486 dar, worin die für die Amino-terminalen 45 Aminosäuren des Ubiquitin codierende DNA außerdem deletiert wurde.
Die DNA-Sequenzen der Leader-deletierten Mini-DsbAs, codiert durch pDM25452, pDM25486 und pDM25499, sind in 28, 42 bzw. 41 aufgelistet.
12 zeigt die durch diese Plasmide exprimierten Proteine, wenn sie wie für die Konstrukte in obigem Beispiel 10 beschrieben getestet werden. Panels "A" und "B" zeigen einen Vergleich von pYZ9206 (Leader-deletiertes DsbA) und pDM25452 (Leaderdeletiertes Mini-DsbA). In jedem Fall wurden die induzierten Proben zu TEX (T), Rest lösliche (S) und unlösliche (I) Fraktionen, fraktioniert. Panel "C" zeigt die mit pDM25499 erhaltenen Ergebnisse.
Die Ergebnisse zeigen, dass Mini-DsbA ohne weiteres aus dem Cytoplasma transloziert wird und sich in löslicher Form akkumuliert. Das Vorhandensein der doppelten Cystein-Aktivzentrumschleife ist offensichtlich für die Transportfunktion des Leader-deletierten DsbA irrelevant.
Untenstehende Tabelle 5 beschreibt die Plasmide, die in den hierin enthaltenen Beispielen verwendet wurden.
Beispiel 10: Expression von in vivo-biotinyliertem DsbA
Ein neuerer Bericht (Schatz, Bio/Technology 11: 1138–1143, 1993) identifiziert eine Konsensus-13-mer-Peptidsequenz, die offensichtlich das Zielsubstrat für E. coli-Biotin-Holoenzym-Synthetase nachahmt. Um die Wirkung des Addierens dieser Sequenz an den Carboxy-Terminus von dsbA zu untersuchen, wurde das Leader-deletierte DsbA-Gen im Vektor pYZ22055 (ähnlich zu pYZ9206, oben, außer, dass die Sequenz stromabwärts des Carboxy-terminalen Lysincodons 189 synthetisch ist:
5' ... CATCATCACCATCATCACAGCATGCCCGGGCTCGAGTAAGCTTATGCAT ... 3' (SEQ ID NR: 18); Terminationscodon unterstrichen) durch Inserieren der synthetischen Sequenz:
5' ... GCATGGGTTCTCTGAAACCTATCTTTGACGCTCAGAAGATTGAGTGGCGTCATAGCATGCACCGCGGTCTCGAG ... 3' (SEQ ID NR. 19) zwischen den unikalen SphI- und XhoI-Stellen innerhalb des Carboxy-terminalen Linkers der DsbA-Sequenz in pYZ22055 modifiziert. Diese Manipulation fusioniert die Biotinylierungssubstrat-Peptidsequenz unmittelbar stromabwärts der Leader-deletierten DsbA-Sequenz. Das resultierende Plasmid ist pDM25450. Das Kontroll-Plasmid pDM25453 ist zu pDM25450 identisch, außer, dass die native DsbA-Leadersequenz in pDM25453 wieder instand gesetzt wurde.
Die in pYZ22055, pDM25450, pDM25453 und pDM15449 vorhandenen DNA-Sequenzen sind in 27, 21, 20 bzw. 35 aufgelistet.
13 zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn die durch diese Plasmide exprimierten Proteine wie in den vorangegangenen Beispielen (siehe Beispiele 1 und 9 oben) beschrieben analysiert werden. Lediglich die TEX-Fraktionen wurden der Analyse unterzogen. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau angefärbt und photographiert, oder Western-blotted und mit einem Reagens-Kit behandelt, der auf den Nachweis des biotinylierten Proteins hin gestaltet war (Clontech's GENE-TECT Cat. #K1035-1; Palo Alto, CA).
Bahnen "A", "B", "C" und "D" in jedem Panel wurden mit Extrakten entsprechend pYZ22055, pDM25450, pDM15449 und pDM15457 beladen. Die beiden das 13-mer-Biotinylierungs-Substratpeptid (pDM25450 und pDM15457) exprimierenden Konstrukte ergeben klare positive Signale beim Western-Blot, wohingegen dies bei den Kontrollen nicht der Fall war.
Um dieses Nachweissystem weiter zu testen, wurden die TEX-Extrakte von pDM25450 und pDM25453 (die beide für das 13-mer-Biotinylierungssubstrat codieren) einer Ni-NTA-Affinitätschromatographie (QIAGEN, Inc. Chatsworth, CA) gemäß den Anleitungen des Herstellers unterzogen. Der modifizierte Carboxy-Terminus des DsbA-Proteins, wie durch diese beiden Plasmide codiert, enthält einen Ablauf von sechs Histidin-Resten, was die Bindung an das Ni-NTA-Harz erleichtert. Nach der Sekretion des pDM25453-Proteins (wenn der Leader von der Leader-Peptidase abgespalten wird) sollte das Protein zur Leader-deletierten Version, wie durch pDM25450 codiert, identisch sein. Daher besteht der einzige nominale Unterschied zwischen den beiden in diesem Experiment ausgereinigten DsbA-Proteinen im Weg, auf dem sie aus dem Cytoplasmas heraustransportiert wurden: das pDM25453-Produkt auf dem allgemeinen Sekretionsweg, und das pDM25450-Produkt (vermutlich) mittels eines neuartigen Mechanismus. Werden sie getestet (Panels "E" bzw. "F"), so zeigen diese gereinigten Proteine eine mindestens zehnfache Differenz hinsichtlich der Effizienz, mit der sie biotinyliert wurden.
Separate Tests ergeben keine Differenz in der spezifischen enyzmatischen Aktivität (Oxidoreduktase) der beiden Proteine, wenn wie in Beispiel 3 beschrieben untersucht. Dies legt nahe, dass beide Proteine korrekt gefaltet sind.
Zusammengefasst liefern diese Daten den starken Beweis für einen unabhängigen Modus des extracytoplasmatischen Transports von Leader-deletiertem DsbA-Protein.
Beispiel 12: Expression der DsbA-Hefe-MAT-Alpha-2-Homeodomäne
Etwa 60 Aminosäuren der Hefe-Alpha-2-Homeodomäne reichen zur Bindung der DNA aus (Wolberger et al., Cell 67: 517–528, 1991). Unter Verwendung der Primer
5' ... GGCGGGCATGCACGGTTCAAGTACTAAACCTTACAGAGGA ... 3' (SEQ ID NR: 20) und
5' ... GGGGAATTCATGCATTATATTGTTTTTTCTTTACGACGACGATTCGAAACCCAGTTTTTGA ... 3' (SEQ ID NR: 21) und S. cerevisiae-genomische DNA (Sigma. Chem. Co., Sankt Louis, MO) als einem Substrat wurde ein 0,22 kb-PCR-Fragment generiert, mit SphI + NsiI gespalten und in pYZ22055-Vektor (oben) kloniert, der mit denselben Enyzmen geschnitten war. Das resultierende Plamid, pDM15478, trägt eine In-Frame- Fusion zwischen dem Carboxy-terminalen Ende von DsbA und dem Amino-terminalen Ende der Alpha-2-Homeodomäne. Stämme, die dieses Plasmid tragen, wurden wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben getestet.
15A zeigt die Expression des Fusionsproteins und seine Teilfraktionierung zu TEX (T) und dem Rest aus löslichen (S) Fraktionen. Unter Anwendung der in Beispiel 10 beschriebenen Ni-NTA-Methode wurde gereinigtes Fusionsprotein aus (T) und (S)-Fraktionen präpariert. Diese gereinigten Fraktionen sind in Panels N1 und N2 der 19A gezeigt.
15 zeigt, dass beide gereinigte Fraktionen eine DNA-Bindungsaktivität zeigen. Die Oligonukleotide sind exakt wie bei Wolberger et al. (ibid.) beschrieben, und die Kontroll-Panels sind (a) kein Protein, (b) DsbA-Standard (erworben von Epicentre Technologies, Madison, WI) und (c) biotinyliertes DsbA; siehe obiges Beispiel 10. (d) und (e) sind die gereinigten Fusionsprotein-Proben N1 und N2. Alle Proben werden im Duplikat auf ein TBE-Acrylamid-Gradientengel (4 bis 20%) aufgeladen. Nach der Elektrophorese wird das Gel mit Ethidiumbromid angefärbt (1 μg/ml) und photographiert.
Die Ergebnisse zeigen eindeutig eine DNA-Bindungsaktivität der Fusionsprotein-Proben, doch nicht der Kontrollen.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin durch Bezugnahme im gleichen Umfang mitaufgenommen, als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln als durch Bezugnahme mitaufgenommen genannt worden wäre.

Claims

Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein oder -Polypeptid codiert, welches Fusionsprotein oder -Polypeptid ein E. coli-DsbA-Polypeptid, ein Linker-Peptid und ein interessierendes Protein oder Polypeptid umfasst, wobei das Linker-Peptid zwischen dem DsbA-Polypeptid und dem interessierenden Protein oder Polypeptid positioniert ist und wobei das DsbA-Polypeptid den Amino-Terminus des Fusionsproteins oder -Polypeptids darstellt und ihm eine Signalsequenz fehlt.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Linker-Peptid eine Polypeptid-Spaltstelle umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei das Linker-Peptid ein Ubiquitin-Molekül umfasst.
Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das DsbA-Polypeptid reifes E. coli-DsbA ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das E. coli-DsbA-Polypeptid ein Leaderdeletiert translozierendes Polypeptid ist.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Fusionspartner eine mutierte E. coli-Dsba-Polypeptid-Variante ist, wobei dem mutierten E. coli-DsbA-Polypeptid-Fragment eine doppelte Cystein-Aktivzentrum-Schleifen-Domäne fehlt.
Nukleinsäure nach Anspruch 6, wobei der Variante die Aminosäuren entsprechend den Aminosäuren 21 bis 62 des reifen E. coli-DsbA fehlen und wobei diese durch die Sequenz Ser-Gly-Ser ersetzt sind.
Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das interessierende Polypeptid ein heterologes Polypeptid ist.
Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein oder -Polypeptid codiert, welches Fusions-Polypeptid ein E. coli-DsbA-Polypeptid, ein Linker-Peptid, das ein Ubiquitin-Molekül umfasst, und ein interessierendes Protein oder Polypeptid umfasst, wobei das Linker-Peptid zwischen dem DsbA-Polypeptid und dem interessierenden Protein oder Polypeptid positioniert ist und wobei das DsbA-Polypeptid den Amino-Terminus des Fusions-Proteins oder -Polypeptids darstellt und ihm eine Signalsequenz fehlt.
Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein oder -Polypeptid codiert, welches Fusionsprotein oder -Polypeptid umfasst: a) ein Polypeptid, welches reifes E. coli-DsbA oder eine mutierte Polypeptid-Variante von reifem E. coli-DsbA ist, dem eine doppelte Cystein-Aktivzentrum-Schleifen-Domäne fehlt; b) ein Linker-Peptid, das ein Ubiquitin-Molekül umfasst; und c) ein interessierendes Protein oder Polypeptid, wobei das DsbA oder die Variante des DsbA den Amino-Terminus des interessierenden Fusions-Proteins oder -Polypeptids darstellt und ihm eine Signalsequenz fehlt.
Expressionsvektor, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche.
Wirtszelle, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einen Expressionsvektor nach Anspruch 11.
Wirtszelle, welche umfasst: a) einen Expressionsvektor, der zum Exprimieren in der Wirtszelle eines Fusionsproteins oder -Polypeptids fähig ist, welches Fusionsprotein oder -Polypeptid umfasst: i) ein E. coli-DsbA-Polypeptid, ii) ein Linker-Peptid, das eine proteolytische Enzym-Spaltstelle umfasst, und iii) ein interessierendes Protein oder Polypeptid, wobei das Linker-Peptid zwischen dem DsbA-Polypeptid und dem interessierenden Protein oder Polypeptid positioniert ist und wobei außerdem das DsbA-Polypeptid den Amino-Terminus des Fusions-Proteins oder -Polypeptids darstellt und ihm eine Signalsequenz fehlt; und eine Nukleinsäure, die zum Exprimieren im Cytoplasma einer Wirtszelle eines proteolytischen Enzyms fähig ist, welches die proteolytische Enzym-Spaltstelle spezifisch erkennt.
Wirtszelle, welche umfasst: a) einen Expressionvektor, der zum Exprimieren in der Wirtszelle eines Fusionsproteins oder -Polypeptids fähig ist, welches Fusionsprotein oder -Polypeptid umfasst: i) ein reifes E. coli-DsbA-Polypeptid oder eine mutierte Polypeptid-Variante des reifen E. coli-DsbA, dem eine doppelte Cystein-Aktivzentrum-Schleifen-Domäne fehlt, ii) ein Linker-Peptid, das eine proteolytische Enzym-Spaltstelle umfasst, und iii) ein interessierendes Protein oder Polypeptid, wobei das Linker-Peptid zwischen dem DsbA-Polypeptid und dem interessierenden Protein oder Polypeptid positioniert ist und wobei außerdem das DsbA-Polypeptid den Amino-Terminus des Fusions-Proteins oder -Polypeptids darstellt und ihm eine Signalsequenz fehlt; und eine Nukleinsäure, die zum Exprimieren im Cytoplasma einer Wirtszelle eines proteolytischen Enzyms fähig ist, welches die proteolytische Enzym-Spaltstelle spezifisch erkennt.
Wirtszelle nach Anspruch 13 oder 14, wobei das proteolytische Enzym Ubiquitin-Hydrolase ist und die Spaltstelle eine Ubiquitin-Hydrolase-Stelle ist.
Fusions-Polypeptid, welches umfasst: a) einen Fusionspartner, der zum Steuern des extracytoplasmatischen Transports fähig ist, bestehend im wesentlichen aus mindestens einem Fragment eines reifen E. coli-DsbA-Polypeptids, und b) ein interessierendes Protein oder Polypeptid, wobei das Protein oder Polypeptid entfernt vom Carboxy-Terminus des Fusionspartners positioniert ist.
Fusions-Polypeptid nach Anspruch 16, welches außerdem ein Linker-Peptid umfasst, das zwischen dem Fusionspartner und dem interessierenden Protein oder Polypeptid positioniert ist.
Fusions-Polypeptid nach Anspruch 17, wobei das Linker-Peptid eine Spaltstelle umfasst.
Fusions-Polypeptid nach Anspruch 18, wobei die Spaltstelle eine Ubiquitin-Hydrolase-Spaltstelle ist.
Fusions-Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei das reife E. coli-DsbA-Polypeptid ein Leader-deletiert translozierendes Polypeptid ist.
Fusions-Polypeptid nach Anspruch 16, wobei der Fusionspartner ein mutiertes E. coli-DsbA-Polypeptid-Fragment ist, und wobei außerdem dem mutierten E. coli-DsbA-Polypeptid-Fragment eine doppelte Cystein-Aktivzentrum-Schleifen-Domäne fehlt.
Fusionsprotein nach Anspruch 21, wobei dem mutierten E. Coli-DsbA die Aminosäuren entsprechend den Aminosäuren 21 bis 62 des reifen E. coli-DsbA fehlen und wobei diese durch die Sequenz Ser-Gly-Ser ersetzt sind.
Fusions-Polypeptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das interessierende Polypeptid ein Protein umfasst, welches ein Enzym, ein Wachstumsfaktor, ein Antikörper-Polypeptid, ein DNA-Binde-Protein, ein RNA-Binde-Protein oder ein Membranrezeptor ist.
Fusions-Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei das interessierende Polypeptid ein heterologes Polypeptid ist.
Fusions-Polypeptid, welches umfasst: a) einen Fusionspartner, der im wesentlichen aus einem reifen E. coli-DsbA oder einer mutierten Polypeptid-Variante des reifen E. coli-DsbA besteht, der eine doppelte Cystein-Aktivzentrum-Schleifen-Domäne fehlt, wobei der reifen E. coli-DsbA oder mutierten Polypeptid-Variante eine Signalsequenz fehlt; b) ein Linker-Peptid, das ein Ubiquitin-Molekül umfasst; und c) ein interessierendes Protein oder Polypeptid, wobei das interessierende Protein oder Polypeptid entfernt vom Carboxy-Terminus des Fusionspartners positioniert ist, und wobei außerdem das Linker-Peptid zwischen dem Fusionspartner und dem interessierenden Protein oder Polypeptid positioniert ist.
Verfahren zur Erzeugung eines Fusionsproteins oder -Polypeptids, welches ein E. coli-DsbA-Polypeptid und ein interessierendes Protein oder Polypeptid umfasst, wobei das DsbA-Polypeptid den Amino-Terminus des interessierenden Proteins oder Polypeptids darstellt und ihm eine Signalsequenz fehlt, welches Verfahren umfasst: a) Einführen einer Nukleinsäure, die für das Fusionsprotein oder -Polypeptid codiert, in eine Wirtszelle, wobei eine transformierte Wirtszelle erzeugt wird; b) Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zum Exprimieren des Fusionsproteins oder -Polypeptids geeignet sind; und c) Reinigen des Fusionsproteins oder -Polypeptids.
Verfahren zur Erzeugung eines im wesentlichen gereinigten interessierenden Proteins oder -Polypeptids, welches Verfahren umfasst: a) Einführen in eine Wirtszelle einer Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein oder -Polypeptid codiert, welches Fusionsprotein oder -Polypeptid umfasst: i) einen Fusionspartner, der zum Steuern des extracytoplasmatischen Transports fähig ist, bestehend im wesentlichen aus mindestens einem Fragment eines reifen Polypeptids, wobei das reife Polypeptid ein E. coli-DsbA-Polypeptid ist, ii) interessierendes Protein oder Polypeptid, wobei das interessierende Polypeptid entfernt vom Carboxy-Terminus des Fusionspartners positioniert ist, und iii) Linker-Peptid, das für eine Spaltstelle codiert, wobei das Linker-Peptid zwischen dem Fusionspartner und dem interessierenden Polypeptid positioniert ist; dabei Erzeugen einer transformierten Wirtszelle; b) Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zum Exprimieren des Fusions-Polypeptids geeignet sind, dabei Exprimieren des Fusions-Polypeptids; c) Spalten des Fusions-Polypeptids mit einem proteolytischen Enzym oder Spaltagens, welches die proteolytische Spaltstelle erkennt, dabei Erzeugen des interessierenden Polypeptids; und d) Reinigen des interessierenden Proteins oder Polypeptids.
Verfahren zur Erzeugung eines im wesentlichen gereinigten interessierenden Proteins oder Polypeptids, welches Verfahren umfasst: a) Einführen in eine Wirtszelle einer Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein oder -Polypeptid codiert, welches Fusionsprotein oder -Polypeptid umfasst: i) einen Fusionspartner, der zum Steuern des extracytoplasmatischen Transports fähig ist, bestehend im wesentlichen aus mindestens einem Fragment eines reifen Polypeptids, wobei das reife Polypeptid ein E. coli-DsbA-Polypeptid ist, ii) ein interessierendes Protein oder Polypeptid, wobei das interessierende Protein oder Polypeptid entfernt vom Carboxy-Terminus des Fusionspartners positioniert ist, und iii) ein Linker-Peptid, das für eine Spaltstelle codiert, wobei das Linker-Peptid zwischen dem Fusionspartner und dem interessierenden Protein oder Polypeptid positioniert ist; dabei Erzeugen einer transformierten Wirtszelle; b) Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zum Exprimieren des Fusionsproteins oder -Polypeptids geeignet sind, dabei Exprimieren des Fusions-Polypeptids; c) Reinigen des Fusionsproteins oder -Polypeptids, dabei Erzeugen eines im wesentlichen gereinigten Fusionsproteins oder -Polypeptids: d) Spalten des im wesentlichen gereinigten Fusionsproteins oder -Polypeptids mit einem proteolytischen Enzym oder Spaltagens, welches die proteolytische Spaltstelle erkennt, dabei Erzeugen des interessierenden Proteins oder Polypeptids; und d) Reinigen des interessierenden Proteins oder Polypeptids, dabei Erhalten eines im wesentlichen gereinigten interessierenden Proteins oder Polypeptids.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei der Fusionspartner im wesentlichen aus einem Polypeptid besteht, welches ein reifes E. coli-DsbA oder ein mutiertes Polypeptid-Fragment des E. coli-DsbA ist, dem eine doppelte Cystein-Aktivzentrum-Schleifen-Domäne fehlt.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Fusionsprotein wie in Anspruch 22 definiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei das proteolytische Enzym Ubiquitin-Hydrolase ist und die Spaltstelle eine Ubiquitin-Hydrolase-Stelle ist.
Verfahren zur Erzeugung eines im wesentlichen gereinigten interessierenden Proteins oder Polypeptids, welches umfasst: a) Einführen in eine Wirtszelle einer Nukleinsäure, die für ein Fusions-Polypeptid codiert, welches Fusions-Polypeptid umfasst: i) einen Fusionspartner, der zum Steuern des extracytoplasmatischen Transports fähig ist, bestehend im wesentlichen aus mindestens einem Fragment eines reifen Polypeptids, wobei das reife Polypeptid E. coli-DsbA-Polypeptid ist, ii) ein interessierendes Protein oder Polypeptid, wobei das interessierende Protein oder Polypeptid entfernt vom Carboxy-Terminus des Fusionspartners positioniert ist, und iii) ein Linker-Peptid, das für eine Spaltstelle codiert, wobei das Linker-Peptid zwischen dem Fusionspartner und dem interessierenden Protein oder Polypeptid positioniert ist; und wobei außerdem die Wirtszelle eine Nukleinsäure umfasst, die zum Exprimieren in der Wirtszelle eines proteolytischen Enzyms fähig ist, welches die Spaltstelle spezifisch erkennt; dabei Erzeugen einer transformierten Wirtszelle; b) Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zum Exprimieren des Fusionsproteins oder -Polypeptids und des proteolytischen Enzyms geeignet sind, dabei Exprimieren des Fusionsproteins oder -Polypeptids, Bewirken der in vivo-Spaltung des Fusionsproteins oder -Polypeptids, und Erzeugen des interessierenden Proteins oder Polypeptids; und c) Reinigen des interessierenden Fusionsproteins oder Polypeptids, dabei Erhalten eines im wesentlichen gereinigten interessierenden Proteins oder Polypeptids.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Fusionspartner im wesentlichen aus reifem E. coli-DsbA oder einer mutierten Polypeptid-Variante von reifem E. coli-DsbA besteht, dem eine doppelte Cystein-Aktivzentrum-Schleifen-Domäne fehlt.
Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, wobei das proteolytische Enzym Ubiquitin-Hydrolase ist und die Spaltstelle eine Ubiquitin-Hydrolase-Spaltstelle ist.