DE3418023C2

DE3418023C2 -

Info

Publication number: DE3418023C2
Application number: DE3418023A
Authority: DE
Inventors: Masataka Kawasaki Jp Konishi; Kyoichiro Zushi Kanagawa Jp Saitoh; Hiroaki Tokio/Toyko Jp Ohkuma; Hiroshi Tokio/Tokyo Jp Kawaguchi
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1983-05-16
Filing date: 1984-05-15
Publication date: 1988-08-18
Also published as: IT8420928A1; PT78590A; FI81114C; JPH0555111B2; KE3846A; LU85362A1; SU1344249A3; SE8402619L; IE57444B1; IT8420928A0; ES532476A0; YU84984A; ES8700267A1; CA1241282A; SE8402619D0; DE3418023A1; HK9889A; DK163127B; FR2547594A1; GB2141425B

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 6 angegebenen Antitumor-Antibiotika.

Der Anspruch nennt ein Verfahren zu deren Herstellung und Anspruch 8 ein pharmazeutisches Mittel, das diese Antibiotika enthält. Anspruch 9 nennt diese Antitumor-Antibiotika herstellenden Stämme.

Die Struktur der erfindungsgemäßen Antitumor-Antibiotika konnte noch nicht geklärt werden. Diese mit BBM-1675 bezeichneten Antibiotika sind neue Verbindungen mit bestimmten physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften.

Die europäische Patentanmeldung 95 154A1 beschreibt die Fermentation von Actinomadura pulveraceus sp. nov. Nr. 6049 (ATCC 39100) zur Herstellung von Antitumor-Antibiotika, die mit WS 6049-A und WS 6049-B bezeichnet werden. Die Strukturen dieser WS 6049-Antibiotika konnte noch nicht geklärt werden, die charakterisierenden Eigenschaften dieser mit WS 60489-A und WS 6049-B bezeichneten Antibiotika deuten jedoch darauf hin, daß ihre Struktur derjenigen der erfindungsgemäßen BBM-1675 Antibiotika ähnelt. Aufgrund von Spektraldaten steht jedoch fest, daß weder WS 6049A noch WS 6049B mit irgendeiner der erfindungsgemäßen BBM-1675-Verbindungen identisch ist. Außerdem unterscheidet sich der in der europäischen Patentanmeldung 95 154A1 beschriebene, produzierende Organismus deutlich von dem erfindungsgemäß eingesetzten Stamm Actinomadura verrucosospora hinsichtlich der Farbe und des Luftmycels auf ISP-Medium Nr. 2, 3 und 4, hinsichtlich seiner positiven Peptonisierung von Milch und der positiven Verwertung von D-Fructose, D-Mannit, Trehalose und Cellulose.

Erfindungsgemäß wird ein neuer Antitumor-Antibiotikum-Komplex bereitgestellt, der mit BBM-1675 bezeichnet wird. Diesen Komplex kann man erhalten, indem man einen BBM-1675 produzierenden Stamm von Actinomadura verrucosospora, nämlich Actinomadura verrucosospora Stamm H964-92 (ATCC-39334) oder Actinomadura verrucosospora Stamm A1327Y (ATCC-39638), in einem wäßrigen, assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium unter submersen, aeroben Bedingungen kultiviert, bis eine beträchtliche Menge dieses BBM-1675-Komplexes durch den genannten Organismus in dem genannten Kulturmedium produziert worden ist. Gewünschtenfalls kann man den Komplex aus dem Kulturmedium gewinnen.

Die beiden bioaktiven Hauptbestandteile des BBM-1675-Komplexes werden mit BBM-1675 A₁ A₂ die vier bioaktiven Nebenbestandteile dieses Komplexes mit BBM-1675 A₃, A₄, B₁ und B₂ bezeichnet. Die Bestandteile bzw. Komponenten können nach üblichen chromatographischen Verfahren aufgetrennt und gereinigt werden. Der BBM-1675-Komplex und seine bioaktiven Bestandteile besitzen sowohl antimikrobielle als auch Antitumor-Aktivität.

Es zeigen

Fig. 1 das IR-Absorptionsspektrum von teilweise gereinigtem BBM-1675 A₁ (KBr-Pille);

Fig. 2 das IR-Absorptionsspektrum von teilweise gereinigtem BBM-1675 A₂ (KBr-Pille);

Fig. 3 das IR-Absorptionsspektrum von BBM-1675 A₃ (KBr-Pille);

Fig. 4 das IR-Absorptionsspektrum von BBM-1675 A₄ (KBr-Pille);

Fig. 5 das ¹H-NMR-Spektrum von teilweise gereinigtem BBM-1675 A₁ in CDCl₃ (60 MHz);

Fig. 6 das ¹H-NMR-Spektrum von teilweise gereinigtem BBM-1675 A₂ in CDCl₃ (60 MHz);

Fig. 7 das ¹H-NMR-Spektrum von BBM-1675 A₃ in CDCl₃ (60 MHz);

Fig. 8 das ¹H-NMR-Spektrum von BBM-1675 A₄ in CDCl₃ (60 MHz);

Fig. 9 das IR-Absorptionsspektrum von gereinigtem BBM-1675 A₁ (KBr-Pille);

Fig. 10 das ¹H-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₁ in CDCl₃ (360 MHz);

Fig. 11 das ¹³C-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₁ in CDCl₃ (90,3 MHz);

Fig. 12 das ¹H-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₂ (KBr-Pille);

Fig. 13 das ¹H-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₂ in CDCl₃ (360 MHz); und

Fig. 14 das ¹³C-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₂ in CDCl₃ (90,3 MHz).

Die Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikum-Komplexes BBM-1675 erfolgt durch Fermentation bestimmter Actinomadura verrucosospora-Stämme, nämlich durch Fermentation des Actinomadura verrucosospora Stamms H964-92 und eines Mutanten davon, der als Actinomadura verrucosospora Stamm A1327Y bezeichnet wird. Der obengenannte Urstamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die am Pto Esperanza, Misiones, Argentinien gesammelt worden war. Eine biologisch reine Kultur dieses Organismus ist bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C., hinterlegt worden und wird dort unter der Bezeichnung ATCC 39334 aufbewahrt. Anschließend wurde der Mutantenstamm A1327Y aus dem Stamm H964-92 erhalten, indem letzterer einer üblichen Behandlung mit Nitrosoguanidin (NTG) unterworfen wurde. Der Mutantenstamm A1327Y wurde bei der American Type Culture Collection mit der Bezeichnung ATCC 39638 hinterlegt.

Wie bei vielen, Antibiotika produzierenden Kulturen, führt die Fermentation des Actinomadura verrucosospora-Stamms H964-92 oder des Stamms A1327Y zur Produktion einer Mischung oder eines Komplexes von Bestandteilen. Zwei bioaktive Hauptbestandteile, BBM-1675 A₁ und A₂, und vier bioaktive Nebenbestandteile, BBM-1675A₃, A₄, B₁ und B₂, wurden aus dem durch das Fermentationsverfahren hergestellten BBM-1675-Komplex isoliert.

BBM-1675 und seine Bestandteile BBM-1675 A₁, A₂, A₃, A₄, B₁ und B₂ besitzen gegenüber einem breiten Spektrum von Mikroorganismen, insgesondere gegenüber grampositiven Bakterien, antimikrobielle Aktivität. Der BBM-1675-Komplex und die davon abgetrennten, bioaktiven Bestandteile führen bei lysogenen Bakterien zur Bildung von Phagen. Zwei dieser Bestandteile, nämlich BBM-1675 A₁ und A₂, wurden in vivo-Screening-Tests unter Verwendung verschiedener Mäusetumorsysteme untersucht. Sie besitzen inhibierende Wirkung gegenüber L-1210 Leukämie, P-388 Leukämie, B16-Melanom und Lewis-Lungenkarzinom. Es wurde ferner festgestellt, daß BBM-1675 A₃ und A₄ gegen P-388 Leukämie bei Mäusen wirksam sind. Der Komplex und seine bioaktiven Bestandteile können daher als antimikrobielle Agentien oder als Antitumor-Agentien zur Inhibierung von Tumoren bei Säugetieren inklusive des Menschen eingesetzt werden.

Beschreibung des Mikroorganismus

Der Actinomycetes-Stamm Nr. H964-92 wurde aus einer Bodenprobe isoliert und zur Charakterisierung nach üblichen Verfahren als biologisch reine Kultur bereitgestellt. Der Stamm H964-92 bildet auf dem Luftmyzel kurze Sporenketten, die eine gerade, sich schlängelnde oder hakenförmige Form besitzen. Die Sporen sind sphärisch oder oval geformt und besitzen eine warzenförmige Oberfläche. Auf den meisten Medien bildet sich nur ein geringes Luftmyzel. Die Farbe der Masse an der Luft ist weiß und bekommt später einen rosa Schatten. Auf einigen Agarmedien tritt eine weitere Farbänderung zum Bläulichen hin auf. Das Substratmycel ist farblos oder blaßrosa. Die Wachstumstemperaturen liegen zwischen 15 und 43°C. Die Zusammensetzung der Zellwand-Aminosäuren und die Zuckerbestandteile des gesamten Zellhydrolysats zeigen, daß der Stamm H964-92 zu dem Zellwand-Typ III_B gehört. Das Menachinon wurde als MK-9(H₆) · MK-9(H₈) identifiziert.

Aufgrund der wesentlichen morphologischen und physiologischen Eigenschaften sowie der Eigenschaften der Kultur und der chemischen Zusammensetzung der Zellwand kann der Stamm H964-92 als zum Genus Actinomadura gehörend klassifiziert werden.

Obwohl der ursprüngliche Stamm H964-92 nur sehr mäßig wuchs und ein kärgliches, löchriges Luftmyzel bildete, wurde durch Behandlung dieses H964-92-Stamms mit Nitrosoguanidin (NTG) eine Variante erhalten, die gute Wachstumseigenschaften bildet. Diese Variante, die mit Stamm A1327Y bezeichnet wird, erleichterte die weitere taxonomische Untersuchung und wurde anschließend als Actinomadura verrucosospora identifiziert.

Verfahren

Es wurden solche Medien und Kohlehydrate verwendet sowie solche Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften der Kultur eingesetzt, die von dem International Streptomyces Project (Intl. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340, 1966) empfohlen wurden. Es wurden auch zusätzliche Medien eingesetzt, die von S. A. Waksman (The Actinomycetes, Band 2) und G. M. Luedemann (Intl. J. Syst. Bacteriol. 21, 240-247, 1971) beschrieben wurden. Die Aminosäurezusammensetzung der Zellwand und der Zuckerbestandteile des Gesamtzellhydrolysats wurden gemäß den von Becker et al. in Appl. Microbiol. 13, 236-243, 1965, und von Lechevalier und Lechevalier in The Actinomycetes, Herausg. H. Prauser, Jena, Gustav Fischer Verlag, Seiten 393-405, 1970, beschriebenen Verfahren analysiert. Das Menachinon wurde massenspektrometrisch nach den Verfahren von Collins et al. in J. Gen. Microbiol. 100, 221-230, 1977, identifiziert. Die Menachinon-Zusammensetzung wurde beschrieben auf Basis des von Yamada et al. in J. Gen. Appl. Microbiol. 23, 331-335, 1977, beschriebenen Systems.

Morphologie

Der Stamm H964-92 bildet sowohl Substrat- als auch Luftmyzele. Das Substratmyzel ist lang, verzweigt und nicht in kurze Filamente fragmentiert. In dem Luftmyzel bilden sich kurze Sporenketten monopodial oder an der Hyphenspitze. Wirbelähnliche Verzweigungen der Sporenkette werden auch in der Nähe der Hyphenspitze beobachtet. Diese Sporenketten enthalten 2 bis 10 Sporen in einer Kette und sind gerade, gekrümmt oder hakenartig geformt. Die Sporen besitzen eine warzenähnliche Oberfläche und eine sphärische bis elliptische (0,5-0,6 × 0,6-1,4 µm) Form mit runden oder spitzen Enden. Nach dem Reifen wird jede Spore oft mit leerer Hülle abgetrennt. Motile Sporen, Sporangia oder sklerotische Körnchen werden in keinem der untersuchten Medien beobachtet.

Kulturelle und physiologische Charakteristika

Der Stamm H964-92 wächst sowohl in chemisch definierten Medien als auch in natürlichen, organischen Medien nur schlecht bis mäßig. Im allgemeinen bildet sich nur ein schwaches Luftmyzel. In einem Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3 Medium), anorganischen Salzen-Stärke-Agar (ISP-Nr. 4 Medium) und Bennett's-Agar bildet sich jedoch ein mäßiges Luftmyzel. Spontane Varianten ohne Luftmyzel bilden sich bei einer hohen Frequenz. Die Farbe des Luftmyzels ist weiß. Sie wird später in Hafermehl-Agar, anorganischen Salzen-Stärke-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr. 5 Medium) blaßrosa. Die Farbe der Luftmasse verändert sich weiterhin nach langer Inkubation (5 Monate) in Hafermehl-Agar, Glycerin-Asparagin-Agar und Tyrosin-Agar zum Bläulichen hin. Das Substratmyzel ist in Czapek's Agar, Tyrosin-Agar, Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP Nr. 2 Medium), Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP Nr. 6 Medium) Bennett's Agar farblos oder gelblich gefärbt. In Glucose-Asparagin-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar ist die Farbe rosa. Melanoide und andere diffusionsähnliche Pigmente werden nicht gebildet. Die aus dem ursprünglichen Stamm erhaltene Variante Nr. A1327Y bildet vorwiegend ein blaßblaues Luftmyzel und trägt eine üppige Luftsporenmasse.

Der Stamm H964-92 wächst bei 15°C, 28°C, 37°C und 43°C, nicht jedoch bei 10°C oder bei 47°C. Er ist empfindlich gegenüber NaCl (7%), jedoch gegenüber Lysozym in einer Konzentration von 0,01% resistent.

Die kulturellen und physiologischen Charakteristika des produzierenden Stamms sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Die Verwertung der Kohlenstoffquellen ist in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 1

Charakteristika der Kultur des Stamms H964-92 (ursprünglicher Stamm ATCC 39334 und Variante A1327Y)

Tabelle 2

Physiologische Charakteristika des Stamms H964-92

Tabelle 3

Verwertung von Kohlenstoffquellen

Beobachtet nach 3wöchiger Inkubation bei 28°C
Basalmedium: Pridham-Gottlieb anorganisches Medium.

Zellwandzusammensetzung und Zuckerbestandteile der Gesamtzelle

Gereinigte Zellwand des Stammes H964-92 enthält Mesodiaminopimelinsäure, jedoch kein Glycin. Das Hydrolysat der gesamten Zelle zeigt die Gegenwart von Madurose (3-0-Methyl-D-galactose), Glucose und Ribose. Aufgrund der Aminosäure in der Zellwand und der Zuckerbestandteile der gesamten Zelle gehört der Stamm H964-92 zu dem Zellwand-Typ III_B. Zwei Hauptbestandteile von Menachinon wurden als MK-9(H₆) und MK-0(H₈) indentifiziert.

Taxonomische Stellung des Stamms H964-92

Der Stamm H964-92 besitzt die folgenden Hauptcharakterisika: (1) Luftsporenketten: kurze, gerade, gekrümmte oder hakenartige Form. (2) Sporen: warzenartige Oberfläche. (3) Luftmyzel: rosa oder bläulich gefärbt. (4) Substratmyzel: in einigen Medien rosa. (5) Diffusionsfähiges Pigment: keines. (6) Mesophil. (7) Zellwand-Typ III_B. (8) Menachinon-System: MK-9(H₆) und MK-9(H₈).

Diese Hauptcharakteristika zeigen an, daß der Stamm H964-92 zu dem Genus Actinomadura gehört. Frühe Species des Genus Actinomadura wurden von Säugetieren isoliert. Einige Stämme wurden auch aus Pflanzenmaterialien erhalten. Jedoch wurden viele der kürzlich vorgeschlagenen, neuen Species aus Bodenproben isoliert. Gemäß der zahlenmäßig bewerteten Taxonomie und nach dem Übersichtsartikel von Goodfellow et al. in J. Gen. Microbiol. 112, 95-111 (1979), über Actinomadura und ähnliche Actinomycetes gehören die meisten der aus Bodenproben stammenden Actinomadura-Species zu dem Cluster Nr. 7 von den beschriebenen vierzehn Clustern. Der Stamm H964-92 ähnelt am meisten den Species des Clusters 7. Nonomura und Ohara berichten in J. Ferment. Technol. 49, 904-912 (1971). über fünf saprophytische Species des Genus Actinomadura, und Nonomura [J. Ferment. Technol. 52, 71-77 (1974)] und Preobrazhenskaya et al. [Actinomycetes and Related Organisms 12, 30-38 (1977)] veröffentlichten die Schlüssel zur Identifizierung und Klassifizierung der Actinomadura-Species. Nach Vergleich mit den Beschreibungen von 30 Species, wozu auch solche Organismen gehören, die in Patenten offenbart sind, scheint der Stamm H964-92 dem in der obigen Literaturstelle von Preobrazhenskaya et al. beschriebenen Actinomadura coerulea und dem in den obigen Druckschriften von Nonomura beschriebenen Actinomadura verrucosospora sehr ähnlich zu sein.

Der Stamm Nr. H964-92 wurde direkt mit dem A. verrucosospora-Stamm KCC A-0147 verglichen. Es wurde gefunden, daß er hinsichtlich der morphologischen, kulturellen und physiologischen Charakteristika mit A. verrucosospora eng verwandt ist. Der Stamm H964-92 wird somit als neuer Stamm von Actinomadura verrucosospora klassifiziert.

Antibiotika-Produktion

Die erfindungsgemäßen BBM-1675-Antibiotika werden hergestellt, indem man einen BBM-1675 produzierenden Stamm von Actinomadura verrucosospora, nämlich einen Stamm von Actinomadura verrucosospora mit den identifizierenden Charakteristika von ATCC 39334 oder ATCC 39638, in einem üblichen, wäßrigen Nährmedium kultiviert. Der Organismus wächst in einem Nährmedium, das bekannte Nährquellen, d. h. assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gewünschtenfalls anorganische Salze und andere bekannte Wachstumsfaktoren, für Actinomycetes enthält. Vorzugsweise arbeitet man bei submersen, aeroben Bedingungen, um große Mengen des Antibiotikums herzustellen. Für die Herstellung von kleineren Mengen können auch Oberflächenkulturen und Flaschen verwendet werden. Die für andere Actinomycetes eingesetzten, allgemeinen Verfahren können auch erfindungsgemäß angewendet werden.

Das Nährmedium sollte eine geeignete, assimilierbare Kohlenstoffquelle enthalten, z. B. Glycerin, L(+)-Arabinose, D-Xylose, D-Ribose, L-Rhamnose, D-Glucose, D-Fructose, Saccharose, Cellobiose, lösliche Stärke, D-Mannit oder Inosit. Als Stickstoffquellen kann man Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat und dgl. entweder allein oder zusammen mit organischen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenmehl und dgl., einsetzen. Gewünschtenfalls kann man auch anorganische Nährsalze zugeben, um Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Bromid, Carbonat, Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dgl. bereitzustellen.

Die Herstellung der BBM-1675 Antibiotika kann man bei jeder Temperatur durchführen, bei der der produzierende Organismus ein befriedigendes Wachstum zeigt, z. B. bei 15 bis 45°C. Gewöhnlich arbeitet man bei einer Temperatur von etwa 27 bis 32°C. Im allgemeinen erhält man eine optimale Produktion nach einer Inkubation von etwa 68 bis 180 Stunden, in Abhängigkeit davon, ob die Fermentation mit Schüttelflaschen, Rührgefäßen oder mit Tanks durchgeführt wird. Bei der Tankfermentation ist es wünschenswert, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe herzustellen, indem man die Kulturbrühe mit einer Schrägkultur oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur des produzierenden Organismus animpft. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inokulum erhalten hat, überführt man es aseptisch in das Medium des Fermentationstanks. Die Antibiotikaproduktion kann mit Hilfe des Papierscheiben-Agar-Diffusionsassays unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P als Testorganismus überwacht werden.

Isolierung und Reinigung

Nachdem die Fermentation vollständig ist, kann man den BBM-1675-Komplex aus der Brühe nach üblichen Isolationsverfahren, z. B. Lösungsmittel-Extraktion, erhalten. So kann man z. B. die gesamte Brühe durch Filtrieren oder Zentrifugieren in den Myzelkuchen und die überstehende Brühe auftrennen. Die Antibiotika in dem Myzelkuchen kann man gewinnen, indem man den Kuchen in Methanol suspendiert, unlösliche Materialien abfiltriert und den methanolischen Extrakt konzentriert. Aktive Bestandteile in der überstehenden Brühe kann man durch Extraktion mit n-Butanol gewinnen. Die obigen n-Butanol- und Methanol-Extrakte vereinigt man dann und verdampft azeotrop bis zu einer wäßrigen Lösung, worauf sich die meisten der Antibiotika als öliger Feststoff absetzen. Diesen Feststoff kann man dann in Methanol lösen und die Lösung filtrieren. Das Filtrat konzentriert man und gibt es zu einer Ethylacetat-Wasser-Mischung. Der erhaltene, organische Extrakt enthält den rohen BBM-1675-Komplex, den man aus der Lösung durch Zugabe eines "Anti-Lösungsmittels", wie n-Hexan, ausfällt.

Der rohe BBM-1675-Komplex ist eine Mischung verschiedener Bestandteile. Dazu zählen zwei bioaktive Hauptkomponenten, BBM-1675 A₁ und A₂, und vier bioaktive Nebenbestandteile, BBM-1675 A₃, A₄, B₁ und B₂. Diese bioaktiven Bestandteile können nach üblichen chromatographischen Verfahren aufgetrennt und gereinigt werden. Bei einem dieser Verfahren löst man den rohen BBM-1675-Komplex zuerst in Methanol und reinigt dann unter Verwendung einer Sephadex LH-20-Chromatographiesäule, wobei man Methanol als Eluierungsmittel verwendet. Diesen teilweise gereinigten Komplex kann man dann über eine Silikagelsäule chromatographieren und stufenweise unter Verwendung von Chloroform und einer zunehmenden Konzentration an Methanol eluieren, wobei man A₁, eine Mischung von BBM-1675 A₂, A₃ und A₄ und eine Mischung von BBM-1675 B₁ und B₂ erhält. Den Bestandteil A₁ kann man weiter chromatographisch unter Verwendung einer Sephadex LH-20-Säule reinigen, wobei man Methanol als Eluierungsmittel einsetzt. Die Mischung von A₂, A₃ und A₄ kann man chromatographisch auf einer Bondapak C₁₈-Säule auftrennen, wobei man zunehmende Konzentrationen von wäßrigem Acetonitril als Eluierungsmittel einsetzt. Die Mischung der Bestandteile B₁ und B₂ kann man auf einer Silikagelsäule chromatographisch trennen, wobei man eine Mischung von Chloroform und Methanol als Eluierungsmittel einsetzt. Weitere Einzelheiten der bevorzugten, chromatographischen Trennverfahren sind in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.

Physiko-chemische Eigenschaften der BBM-1675-Bestandteile

Die sechs bioaktiven Bestandteile des BBM-1675-Komplexes können voneinander mit Hilfe zweier Dünnschichtchromatographie-Systeme unterschieden werden, wie dies in der folgenden Tabelle gezeigt ist.

Tabelle 4

Dünnschichtchromatographie (TLC) der BBM-1675-Bestandteile

Die Trennung von BBM-1675 A₂, A₃ und A₄ unter Verwendung von TLC-Systemen mit einer gewöhnlichen Phase ist schwierig, konnte jedoch mit einer Umkehrphasen-TLC erzielt werden.

Die einzelnen BBM-1675-Bestandteile zeigen eine ähnliche Löslichkeit und ähnliche Farbreaktionen. So sind sie z. B. in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich, in Benzol und Wasser wenig löslich und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich. Sie ergeben mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagens eine positive Reaktion, im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test jedoch eine negative Reaktion.

Die charakteristischen, physiko-chemischen Eigenschaften der BBM-1675-Bestandteile sind in der nachfolgenden Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5

Physiko-chemische Eigenschaften der BBM-1675-Bestandteile

Die UV-Absorptionsmaxima der BBM-1675 Bestandteile wurden bei 253, 282 und 320 nm beobachtet. Eine Verschiebung nach Zugabe einer sauren oder alkalischen Lösung konnte nicht beobachtet werden. Die IR- oder PNMR-Spektren von BBM-1675 A₁, A₂, A₃ und A₄ sind in den Fig. 1 bis 4 bzw. Fig. 5 bis 8 gezeigt. Das 360 MHz-¹H-NMR-Spektrum von BBM-1675 A₁ zeigt eine Acetylgruppe (δ : 2,11 ppm), eine N-CH₃-Gruppe (2,52 ppm), vier OCH₃-Gruppen (3,42, 3,80, 3,88 und 3,98 ppm) und eine Exomethylengruppe (4,75 und 5,48 ppm) neben zwei aromatischen Protonen (7,50 und 8,59 ppm) und einem NH-Proton (11,79 ppm). Das CNMR-Spektrum von BBM-1675 A₁ zeigt 55 Kohlenstoffsignale. Dazu zählt auch ein Signal dreifacher Intensität (δ : 56,0 ppm, OCH₃). Basierend auf den Protonen- und ¹³C-NMR-Spektren, der Mikroanalyse und der Bestimmung des Molekulargewichts durch HPLC und SIMS (secondary ion mass spectrometry) wurde die Molekülformel von BBM-1675 A₁ mit C₅₇H₇₂N₄O₃₂ abgeleitet.

Strukturuntersuchungen mit BBM-1675 A₁

Nach Behandlung mit 0,5 N HCl-CH₃OH bei Raumtemperatur verliert BBM-1675 A₁ seine Bioaktivität und ergibt neben verschiedenen, nichtidentifizierten Fragmenten eine lipophile, chromophore Substanz (Verbindung I). Das UV-Absorptionsspektrum der Verbindung I ähnelt derjenigen der Stammverbindung. Dies deutet darauf hin, daß die Verbindung I die chromophore Struktur von BBM-1675 A₁ behält. Zwei weitere, chromophore Fragmente, die der Verbindung I ähneln, erhält man durch alkalische Hydrolyse von BBM-1675 A₁: Hydrolyse mit 0,05 N KOH-CH₃OH bei 55°C während 1 h ergibt die Verbindung II mit UV-Absorptionsmaxima bei 252, 284, 297 (Schulter) und 322 nm, während die Umsetzung in 1 N KOH-CH₃OH zu einer sauren, chromophoren Substanz führt, die als Verbindung III bezeichnet ist. Die physiko-chemischen Eigenschaften der Verbindungen I, II und III sind in der folgenden Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 6

Eigenschaften der Verbindungen I, II und III

Strukturinformationen hinsichtlich der Verbindungen II und III konnten aus den nachfolgenden Spektraldaten und den chemischen Transformationen gewonnen werden. Das ¹³C- und ¹H-NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit von vier OCH₃-Gruppen, einer =CH₂-Gruppe, sieben

zwei C=O-Gruppen und einer NH-Gruppe in der Verbindung II. Das NMR-Spektrum der Verbindung III ähnelt demjenigen der Verbindung II, unterscheidet sich jedoch nur dadurch, daß eine der vier bei der Verbindung II beobachteten OCH₃-Gruppen nicht vorhanden ist. Aufgrund dieses Unterschiedes und der sauren Natur der Verbindung III wird angenommen, daß die Verbindung II ein Methylester der Verbindung III ist. Kocht man die Verbindung II mit 1 N methanolischer KOH am Rückfluß, dann wird sie quantitativ in die Verbindung III überführt, während die Verbindung III durch Behandlung mit Diazomethan in die Verbindung II überführt wird. Die Behandlung der Verbindung II mit NaBH₄ in C₂H₅OH ergibt ein Reduktionsprodukt (Verbindung IV, M⁺: m / z 267), bei dem im NMR-Spektrum anstelle der -COOCH₃-Gruppe der Verbindung II eine -CH₂OH-Gruppe vorhanden war. Nach Hydrierung mit Palladium-auf-Kohle ergibt die Verbindung II ein Dihydroderivat (Verbindung V, M⁺: m / z 297). Das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung V zeigt ein neues Methylsignal (Dublett). Das Signal für die in der Verbindung II vorhandene Exomethylengruppe fehlt jedoch. Außerdem erscheint bei der Verbindung V eines der Signale für die OCH₃-Gruppen bei höherem Feld (δ :3,50 ppm). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß eine

in der Verbindung II vorliegt, die durch Hydrierung zu einer

in Verbindung V reduziert wird. Die Verbindung II wurde mit 1,5 N methanolischem Chlorwasserstoff 3 h bei 80°C erwärmt. Das Hydrolysat wurde über eine Silikagelsäule chromatographiert. Man erhält eine schwachbasische Verbindung (Verbindung VI, M⁺: m / z 211). Das IR-Spektrum und die physiko-chemischen Eigenschaften zeigen, daß in der Verbindung VI eine NH₂-Gruppe vorhanden ist. Die Verbindung VI wurde durch Vergleich der IR- und NMR-Untersuchungen mit einer authentischen Probe als Methyl-4,5-dimethoxy-antranilat identifiziert. Folglich besitzen die Verbindungen II bis VI die nachstehend angegebenen Strukturen.

Strukturen der Verbindungen II, III, IV, V und VI

Nach Behandlung mit 0,05 N KOH-CH₃OH bei 55°C wurde die Verbindung I in ein neues, chromophores Fragment (Verbindung VII, C₁₅H₂₁NO₇, M⁺: m / z 327) und einen Zucker (Verbindung VIII) gespalten. Das NMR-Spektrum von VII zeigt ein C-CH₃-Singulett und zwei OCH₃-Gruppen bei hohem Feld sowie drei OCH₃-Gruppen bei niedrigem Feld und zwei aromatische Protonen, die gewöhnlich bei den Verbindungen II, V und VI beobachtet werden. Die weitere Hydrolyse von VII mit 1,5 N methanolischem Chlorwasserstoff ergibt die Verbindung VI, die mit der zuvor aus II erhaltenen identisch ist. Nach Entfernen von VI wurde das Hydrolysat mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin behandelt, wobei ein gelber Feststoff ausfiel, der als 2,4-Dinitrophenylhydrazon von Brenztraubensäure identifiziert wurde. Bei der Verbindung VII handelt es sich somit um Methyl-4,5-dimethoxy-N-(2′-2′-dimethoxypropionyl)-anthranilat. Mit der Verbindung VIII konnte kein Molekülionenpeak erhalten werden. Der M-OCH₃-Peak im Massenspektrum erschien bei m / z 131. Dies ist in Übereinstimmung mit der Molekülformel C₇H₁₄O₄. Das NMR-Spektrum zeigt eine 2,6-Didesoxyhexopyranose-Struktur für die Verbindung VIII. Diese Zuordnung wird durch das ¹³C-NMR-Spektrum der Verbindung I unterstützt, die zu einem C-CH₃-Signal, einem -CH₂-Signal, drei O-CH-Signalen und einem anomeren Kohlenstoffatom sowie 15 Kohlenstoffsignalen führt, wobei letztere der Verbindung VII zugeordnet werden können. Das Proton an C₃ beim Zucker erschien bei niedrigem Feld (δ : 5,39 ppm, Oktett). Die C₃-OH-Gruppe des Zuckers war somit mit der Carboxylgruppe von VII verestert. Die obigen Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden:

Strukturen der Verbindungen I, VII und VIII

Das Molekulargewicht der Verbindung I (457) macht in etwa ein Drittel des gesamten Moleküls von BBM-1675 A₁ aus (vorgeschlagene Formel C₅₇H₇₂N₄O₃₂; berechnetes Molekulargewicht = 1324). Es wird angenommen, daß BBM-1675 A₁ folgende Teilstruktur besitzt:

Claims

1. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC 39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₁, das in gereinigter Form folgende Eigenschaften besitzt: es

(a) bildet weiße bis fahlgelbe Kristalle,
(b) ist in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich, in Benzol und Wasser wenig löslich und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich;
(c) gibt mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz eine positive Reaktion und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion;
(d) besitzt das in Fig. 9 gezeigte IR-Absorptionsspektrum (KBr);
(e) besitzt in CDCl₃ gelöst das in Fig. 10 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum;
(f) besitzt einen Schmelzpunkt von 156 bis 158°C;
(g) besitzt eine optische Drehung von [α ] = -191° (c = 0,5, CHCl₃);
(h) besitzt ein massenspektroskopisch bestimmtes, scheinbares Molekulargewicht von 1248;
(i) besitzt folgende Elementarzusammensetzung: 52,17% C,6,15% H, 4,63% N, 9,09% S und 27,96% Sauerstoff (durch Differenz);
(j) führt bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,74 und führt bei der Umkehrphasen-Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75 : 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,18;
(k) führt, wenn in Methanol in einer Konzentration von 0,011356 g/l gelöst, zu den folgenden UV-Absorptionsmaxima und Absorptionsvermögen: λ _max (nm)Absorptionsvermögen32012,4 280Schulter 25325,1 21025,5(nach Zugabe einer Säure oder einer Base ergeben sich keine signifikanten Änderungen):
(l) führt bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer C₁₈-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-0,1M CH₃COONH₄ (5 : 2 : 3, V/V) zu einer Retentionszeit von 13,3 Minuten;
(m) inhibiert das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze;
(n) induziert Phophagen bei lysogenen Bakterien; und
(o) inhibiert das Wachstum von P-388 Leukämie, L-1210 Leukämie, B16 Melanom und Lewis-Lungenkarzinom bei Mäusen, wobei die Fig. 9 und 10 Bestandteile dieses Anspruchs sind.

2. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC 39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₂, das in gereinigter Form folgende Eigenschaften besitzt: es

(a) bildet weiße Kristalle,
(b) ist in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich, in Benzol und Wasser wenig löslich und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich;
(c) führt mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz zu einer positiven Reaktion und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test zu einer negativen Reaktion;
(d) besitzt das in Fig. 12 gezeigte IR-Absorptionsspektrum (KBr);
(e) besitzt in CDCl₃ gelöst das in Fig. 13 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum;
(f) besitzt einen Schmelzpunkt von 147 bis 149°C;
(g) führt zu einer optischen Drehung von [α ] = -179,4° (c = 0,5, CHCl₃);
(h) besitzt ein massenspektroskopisch bestimmtes, scheinbares Molekulargewicht von 1248;
(i) besitzt folgende Elementarzusammensetzung: 52,71% C; 5,94% H, 3,94% N, 9,39% S und 28,96% O (durch Differenz);
(j) führt bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,71 und führt bei der Umkehrphasen-Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75 : 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,21;
(k) führt, wenn in einer Konzentration von 0,02052 g/l in Methanol gelöst, zu den folgenden UV-Absorptionsmaxima und Absorptionsvermögen: λ _max (nm)Absorptionsvermögen32012,2 28216,3 25226,2 21425,8(nach Zugabe einer Säure oder einer Base ergeben sich keine signifikanten Änderungen):
(l) führt bei der (HPLC) mit einer C₁₈-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-0,1M CH₃COONH₄ (5 : 2 : 3, V/V) zu einer Retentionszeit von 17,3 Minuten;
(m) inhibiert das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze;
(n) induziert Phophagen bei lysogenen Bakterien; und
(o) inhibiert das Wachstum von P-388 Leukämie, L-1210 Leukämie, B16-Melanom und Lewis-Lungenkarzinom bei Mäusen, wobei die Fig. 12 und 13 Bestandteile dieses Anspruchs sind.

3. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC 39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₃, das

(a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslich ist und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;
(b) mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;
(c) das in Fig. 3 gezeigte IR-Absorptionsspektrum (KBr) besitzt;
(d) das in Fig. 7 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum besitzt, wenn in CDCl₃ gelöst;
(e) einen Schmelzpunkt von 125 bis 127°C besitzt;
(f) zu einer optischen Drehung von [α ] = -161° (c = 0,5, CHCl₃) führt;
(g) folgende Elementarzusammensetzung besitzt: 54,55% C, 6,46% H, 3,73% N, 7,49% S und 27,77% O (durch Differenz);
(h) bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,72 und bei der Umkehrphasen-Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75 : 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,28 führt;
(i) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt, wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃OH und 0,01N NaOH-CH₃OH gelöst, UV λ _max nm (E )in Methanol
253 (286)
282 (158)
320 (122)in 0,01N HCl-CH₃OH
253 (287)
282 (160)
320 (126)in 0,01N NaOH-CH₃OH
252 (280)
283 (162)
318 (120)
(j) bei der HPLC mit einer C₁₈-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-0,1M CH₃COONH₄ (5 : 2 : 3, V/V) eine Retentionszeit von 8,0 Minuten besitzt;
(k) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert;
(l) Phophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und
(m) das Wachstum von P-388 Leukämie bei Mäusen inhibiert, wobei die Fig. 3 und 7 Bestandteile dieses Anspruchs sind.

4. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC 39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₄, das

(a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslich ist und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;
(b) mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;
(c) das in Fig. 4 gezeigte IR-Absorptionsspektrum (KBr) besitzt;
(d) das in Fig. 8 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum besitzt, wenn in CDCl₃ gelöst;
(e) einen Schmelzpunkt von 123 bis 126°C besitzt;
(f) zu einer optischen Drehung von [α ] = -176° (c = 0,5, CHCl₃) führt;
(g) folgende Elementarzusammensetzung besitzt: 54,65% C, 6,29% H, 3,51% N, 8,07% S und 27,48% O (durch Differenz);
(h) bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,71 und bei der Umkehrphasen-Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75 : 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,78 führt;
(i) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt, wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃OH und 0,01N NaOH-CH₃OH gelöst, UV λ _max nm (E )in Methanol
253 (257)
282 (153)
320 (117)in 0,01N HCl-CH₃OH
253 (258)
282 (155)
320 (118)in 0,01N NaOH-CH₃OH
252 (266)
283 (160)
318 (118)
(j) bei der HPLC mit einer C₁₈-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-0,1M CH₃COONH₄ (5 : 2 : 3, V/V) eine Retentionszeit von 5,1 Minuten besitzt;
(k) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert;
(l) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und
(m) das Wachstum von P-388 Leukämie bei Mäusen inhibiert, wobei die Fig. 4 und 8 Bestandteile dieses Anspruchs sind.

5. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC 39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 B₁, das

(a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslich ist und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;
(b) mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;
(c) einen Schmelzpunkt von 159 bis 161°C besitzt;
(d) zu einer optischen Drehung von [α ] = -171° (c = 0,5, CHCl₃) führt;
(e) bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,63 und bei der Umkehrphasen-Silikageldünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75: 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,23 führt;
(f) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt, wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃O und 0,01N NaOH-CH₃OH gelöst, UV λ _max nm (E )in Methanol
253 (225)
282 (140)
320 (104)in 0,01N HCl-CH₃OH
253 (225)
282 (140)
320 (105)in 0,01N NaOH-CH₃OH
252 (236)
283 (141)
318 (105)
(g) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert; und
(h) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und

6. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC 39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 B₂, das

(a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslich ist und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;
(b) mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;
(c) einen Schmelzpunkt von 156 bis 159°C besitzt;
(d) zu einer optischen Drehung [α ] = -122° (c = 0,5, CHCl₃) führt;
(e) bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,60 und bei der Umkehrphasen-Silikageldünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75: 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,16 führt;
(f) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt, wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃O und 0,01N NaOH-CH₃OH gelöst, UV λ _max nm (E ):in Methanol
248 (212)
279 (141)
318 (103)in 0,01N HCl-CH₃OH
248 (210)
279 (140)
318 (103)in 0,01N NaOH-CH₃OH
248 (233)
278 (150)
318 (110)
(g) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert; und
(h) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und

7. Verfahren zur Herstellung der Antitumor-Antibiotika BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂, dadurch gekennzeichnet, daß man einen BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂ produzierenden Actinomadura verrucosospora-Stamm mit den identifizierenden Charakteristika des Actinomadura verrucosospora-Stamms H964-92 (ATCC 39334) oder des Actinomadura verrucosospora-Stamms A1327Y (ATCC 39638) in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen so lange kultiviert, bis eine wesentliche Menge an BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂ durch den genannten Organismus in dem genannten Kulturmedium produziert worden ist, und daß man anschließend BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂ aus dem Kulturmedium gewinnt.

8. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel.

9. Das Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₁, -A₂, -A₃, -A₄, -B₁ und -B₂ herstellender Stamm Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC 39638.