DE3418023C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 6 angegebenen
Antitumor-Antibiotika.
Der Anspruch nennt ein Verfahren zu deren Herstellung und Anspruch 8 ein
pharmazeutisches Mittel, das diese Antibiotika enthält.
Anspruch 9 nennt diese Antitumor-Antibiotika
herstellenden Stämme.
Die Struktur der erfindungsgemäßen Antitumor-Antibiotika
konnte noch nicht geklärt werden. Diese mit BBM-1675
bezeichneten Antibiotika sind neue Verbindungen mit bestimmten
physikalischen, chemischen und biologischen
Eigenschaften.
Die europäische Patentanmeldung 95 154A1 beschreibt die
Fermentation von Actinomadura pulveraceus sp. nov. Nr.
6049 (ATCC 39100) zur Herstellung von Antitumor-Antibiotika,
die mit WS 6049-A und WS 6049-B bezeichnet werden.
Die Strukturen dieser WS 6049-Antibiotika konnte
noch nicht geklärt werden, die charakterisierenden Eigenschaften
dieser mit WS 60489-A und WS 6049-B bezeichneten
Antibiotika deuten jedoch darauf hin, daß ihre Struktur
derjenigen der erfindungsgemäßen BBM-1675 Antibiotika
ähnelt. Aufgrund von Spektraldaten steht jedoch fest, daß
weder WS 6049A noch WS 6049B mit irgendeiner der erfindungsgemäßen
BBM-1675-Verbindungen identisch ist. Außerdem
unterscheidet sich der in der europäischen Patentanmeldung
95 154A1 beschriebene, produzierende Organismus
deutlich von dem erfindungsgemäß eingesetzten Stamm
Actinomadura verrucosospora hinsichtlich der Farbe und
des Luftmycels auf ISP-Medium Nr. 2, 3 und 4, hinsichtlich
seiner positiven Peptonisierung von Milch und der
positiven Verwertung von D-Fructose, D-Mannit, Trehalose
und Cellulose.
Erfindungsgemäß wird ein neuer Antitumor-Antibiotikum-Komplex
bereitgestellt, der mit BBM-1675 bezeichnet wird.
Diesen Komplex kann man erhalten, indem man einen BBM-1675
produzierenden Stamm von Actinomadura verrucosospora,
nämlich Actinomadura verrucosospora
Stamm H964-92 (ATCC-39334) oder Actinomadura verrucosospora
Stamm A1327Y (ATCC-39638),
in einem wäßrigen, assimilierbaren Kohlenstoff- und
Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium unter submersen,
aeroben Bedingungen kultiviert, bis eine beträchtliche
Menge dieses BBM-1675-Komplexes durch den genannten
Organismus in dem genannten Kulturmedium produziert
worden ist. Gewünschtenfalls kann man den Komplex
aus dem Kulturmedium gewinnen.
Die beiden bioaktiven Hauptbestandteile
des BBM-1675-Komplexes werden mit BBM-1675 A₁
A₂ die vier bioaktiven Nebenbestandteile
dieses Komplexes mit
BBM-1675 A₃, A₄, B₁ und B₂ bezeichnet. Die Bestandteile
bzw. Komponenten können nach üblichen chromatographischen
Verfahren aufgetrennt und gereinigt werden.
Der BBM-1675-Komplex und seine bioaktiven Bestandteile
besitzen sowohl antimikrobielle als auch Antitumor-Aktivität.
Es zeigen
Fig. 1 das IR-Absorptionsspektrum von teilweise
gereinigtem BBM-1675 A₁ (KBr-Pille);
Fig. 2 das IR-Absorptionsspektrum von teilweise
gereinigtem BBM-1675 A₂ (KBr-Pille);
Fig. 3 das IR-Absorptionsspektrum von BBM-1675 A₃
(KBr-Pille);
Fig. 4 das IR-Absorptionsspektrum von BBM-1675 A₄
(KBr-Pille);
Fig. 5 das ¹H-NMR-Spektrum von teilweise gereinigtem
BBM-1675 A₁ in CDCl₃ (60 MHz);
Fig. 6 das ¹H-NMR-Spektrum von teilweise gereinigtem
BBM-1675 A₂ in CDCl₃ (60 MHz);
Fig. 7 das ¹H-NMR-Spektrum von BBM-1675 A₃ in
CDCl₃ (60 MHz);
Fig. 8 das ¹H-NMR-Spektrum von BBM-1675 A₄ in
CDCl₃ (60 MHz);
Fig. 9 das IR-Absorptionsspektrum von gereinigtem
BBM-1675 A₁ (KBr-Pille);
Fig. 10 das ¹H-NMR-Spektrum von gereinigtem
BBM-1675 A₁ in CDCl₃ (360 MHz);
Fig. 11 das ¹³C-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₁
in CDCl₃ (90,3 MHz);
Fig. 12 das ¹H-NMR-Spektrum von gereinigtem
BBM-1675 A₂ (KBr-Pille);
Fig. 13 das ¹H-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₂
in CDCl₃ (360 MHz); und
Fig. 14 das ¹³C-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₂
in CDCl₃ (90,3 MHz).
Die Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikum-Komplexes
BBM-1675
erfolgt durch Fermentation bestimmter
Actinomadura verrucosospora-Stämme, nämlich durch
Fermentation des Actinomadura verrucosospora Stamms
H964-92 und eines Mutanten davon, der als Actinomadura
verrucosospora Stamm A1327Y bezeichnet wird. Der obengenannte
Urstamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die
am Pto Esperanza, Misiones, Argentinien gesammelt worden
war. Eine biologisch reine Kultur dieses Organismus ist
bei der American Type Culture Collection, Washington,
D. C., hinterlegt worden und wird dort unter der Bezeichnung
ATCC 39334 aufbewahrt. Anschließend wurde der Mutantenstamm
A1327Y aus dem Stamm H964-92 erhalten, indem
letzterer einer üblichen Behandlung mit Nitrosoguanidin
(NTG) unterworfen wurde. Der Mutantenstamm A1327Y wurde
bei der American Type Culture Collection mit der Bezeichnung
ATCC 39638 hinterlegt.
Wie bei vielen, Antibiotika produzierenden Kulturen, führt
die Fermentation des Actinomadura verrucosospora-Stamms
H964-92 oder des Stamms A1327Y zur Produktion einer Mischung
oder eines Komplexes von Bestandteilen. Zwei bioaktive
Hauptbestandteile, BBM-1675 A₁ und A₂, und vier
bioaktive Nebenbestandteile, BBM-1675A₃, A₄, B₁ und B₂,
wurden aus dem durch das Fermentationsverfahren hergestellten
BBM-1675-Komplex isoliert.
BBM-1675 und seine Bestandteile BBM-1675 A₁, A₂, A₃, A₄,
B₁ und B₂ besitzen gegenüber einem breiten Spektrum von
Mikroorganismen, insgesondere gegenüber grampositiven
Bakterien, antimikrobielle Aktivität. Der BBM-1675-Komplex
und die davon abgetrennten, bioaktiven Bestandteile
führen bei lysogenen Bakterien zur Bildung
von Phagen. Zwei dieser Bestandteile, nämlich BBM-1675 A₁
und A₂, wurden in vivo-Screening-Tests unter Verwendung
verschiedener Mäusetumorsysteme untersucht. Sie
besitzen inhibierende Wirkung gegenüber L-1210 Leukämie,
P-388 Leukämie, B16-Melanom und Lewis-Lungenkarzinom.
Es wurde ferner festgestellt, daß BBM-1675 A₃
und A₄ gegen P-388 Leukämie bei Mäusen wirksam sind.
Der Komplex und seine bioaktiven Bestandteile können
daher als antimikrobielle Agentien oder als Antitumor-Agentien
zur Inhibierung von Tumoren bei Säugetieren
inklusive des Menschen eingesetzt werden.
Der Actinomycetes-Stamm Nr. H964-92 wurde aus einer Bodenprobe
isoliert und zur Charakterisierung nach üblichen
Verfahren als biologisch reine Kultur bereitgestellt.
Der Stamm H964-92 bildet auf dem Luftmyzel kurze Sporenketten,
die eine gerade, sich schlängelnde oder hakenförmige
Form besitzen. Die Sporen sind sphärisch oder
oval geformt und besitzen eine warzenförmige Oberfläche.
Auf den meisten Medien bildet sich nur ein geringes Luftmyzel.
Die Farbe der Masse an der Luft ist weiß und bekommt
später einen rosa Schatten. Auf einigen Agarmedien
tritt eine weitere Farbänderung zum Bläulichen hin
auf. Das Substratmycel ist farblos oder blaßrosa. Die
Wachstumstemperaturen liegen zwischen 15 und 43°C. Die
Zusammensetzung der Zellwand-Aminosäuren und die Zuckerbestandteile
des gesamten Zellhydrolysats zeigen, daß
der Stamm H964-92 zu dem Zellwand-Typ IIIB gehört. Das
Menachinon wurde als MK-9(H₆) · MK-9(H₈) identifiziert.
Aufgrund der wesentlichen morphologischen und physiologischen
Eigenschaften sowie der Eigenschaften der Kultur
und der chemischen Zusammensetzung der Zellwand kann der
Stamm H964-92 als zum Genus Actinomadura gehörend klassifiziert
werden.
Obwohl der ursprüngliche Stamm H964-92 nur sehr mäßig
wuchs und ein kärgliches, löchriges Luftmyzel bildete,
wurde durch Behandlung dieses H964-92-Stamms mit Nitrosoguanidin
(NTG) eine Variante erhalten, die gute Wachstumseigenschaften
bildet. Diese Variante, die mit Stamm A1327Y bezeichnet
wird, erleichterte die weitere taxonomische
Untersuchung und wurde anschließend als Actinomadura
verrucosospora identifiziert.
Es wurden solche Medien und Kohlehydrate verwendet sowie
solche Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften der
Kultur eingesetzt, die von dem International Streptomyces
Project (Intl. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340, 1966)
empfohlen wurden. Es wurden auch zusätzliche Medien eingesetzt,
die von S. A. Waksman (The Actinomycetes, Band 2)
und G. M. Luedemann (Intl. J. Syst. Bacteriol. 21, 240-247,
1971) beschrieben wurden. Die Aminosäurezusammensetzung
der Zellwand und der Zuckerbestandteile des Gesamtzellhydrolysats
wurden gemäß den von Becker et al. in Appl.
Microbiol. 13, 236-243, 1965, und von Lechevalier und
Lechevalier in The Actinomycetes, Herausg. H. Prauser,
Jena, Gustav Fischer Verlag, Seiten 393-405, 1970, beschriebenen
Verfahren analysiert. Das Menachinon wurde
massenspektrometrisch nach den Verfahren von Collins et al.
in J. Gen. Microbiol. 100, 221-230, 1977, identifiziert.
Die Menachinon-Zusammensetzung wurde beschrieben
auf Basis des von Yamada et al. in J. Gen. Appl. Microbiol.
23, 331-335, 1977, beschriebenen Systems.
Der Stamm H964-92 bildet sowohl Substrat- als auch Luftmyzele.
Das Substratmyzel ist lang, verzweigt und nicht
in kurze Filamente fragmentiert. In dem Luftmyzel bilden
sich kurze Sporenketten monopodial oder an der Hyphenspitze.
Wirbelähnliche Verzweigungen der Sporenkette
werden auch in der Nähe der Hyphenspitze beobachtet. Diese
Sporenketten enthalten 2 bis 10 Sporen in einer Kette
und sind gerade, gekrümmt oder hakenartig geformt. Die
Sporen besitzen eine warzenähnliche Oberfläche und eine
sphärische bis elliptische (0,5-0,6 × 0,6-1,4 µm) Form
mit runden oder spitzen Enden. Nach dem Reifen wird
jede Spore oft mit leerer Hülle abgetrennt. Motile Sporen,
Sporangia oder sklerotische Körnchen werden in
keinem der untersuchten Medien beobachtet.
Der Stamm H964-92 wächst sowohl in chemisch definierten
Medien als auch in natürlichen, organischen Medien nur
schlecht bis mäßig. Im allgemeinen bildet sich nur ein
schwaches Luftmyzel. In einem Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3
Medium), anorganischen Salzen-Stärke-Agar (ISP-Nr. 4 Medium)
und Bennett's-Agar bildet sich jedoch ein mäßiges
Luftmyzel. Spontane Varianten ohne Luftmyzel bilden sich
bei einer hohen Frequenz. Die Farbe des Luftmyzels ist
weiß. Sie wird später in Hafermehl-Agar, anorganischen
Salzen-Stärke-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr. 5
Medium) blaßrosa. Die Farbe der Luftmasse verändert sich
weiterhin nach langer Inkubation (5 Monate) in Hafermehl-Agar,
Glycerin-Asparagin-Agar und Tyrosin-Agar zum Bläulichen
hin. Das Substratmyzel ist in Czapek's Agar,
Tyrosin-Agar, Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP Nr. 2
Medium), Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP Nr. 6 Medium)
Bennett's Agar farblos oder gelblich gefärbt. In Glucose-Asparagin-Agar
und Glycerin-Asparagin-Agar ist die Farbe
rosa. Melanoide und andere diffusionsähnliche Pigmente
werden nicht gebildet. Die aus dem ursprünglichen Stamm
erhaltene Variante Nr. A1327Y bildet vorwiegend ein
blaßblaues Luftmyzel und trägt eine üppige Luftsporenmasse.
Der Stamm H964-92 wächst bei 15°C, 28°C, 37°C und 43°C,
nicht jedoch bei 10°C oder bei 47°C. Er ist empfindlich
gegenüber NaCl (7%), jedoch gegenüber Lysozym in einer
Konzentration von 0,01% resistent.
Die kulturellen und physiologischen Charakteristika des
produzierenden Stamms sind in den Tabellen 1 und 2
aufgeführt. Die Verwertung der Kohlenstoffquellen ist
in Tabelle 3 gezeigt.
Beobachtet nach 3wöchiger Inkubation bei 28°C
Basalmedium: Pridham-Gottlieb anorganisches Medium.
Basalmedium: Pridham-Gottlieb anorganisches Medium.
Gereinigte Zellwand des Stammes H964-92 enthält Mesodiaminopimelinsäure,
jedoch kein Glycin. Das Hydrolysat
der gesamten Zelle zeigt die Gegenwart von Madurose
(3-0-Methyl-D-galactose), Glucose und Ribose. Aufgrund
der Aminosäure in der Zellwand und der Zuckerbestandteile
der gesamten Zelle gehört der Stamm H964-92 zu dem
Zellwand-Typ IIIB. Zwei Hauptbestandteile von Menachinon
wurden als MK-9(H₆) und MK-0(H₈) indentifiziert.
Der Stamm H964-92 besitzt die folgenden Hauptcharakterisika:
(1) Luftsporenketten: kurze, gerade, gekrümmte
oder hakenartige Form. (2) Sporen: warzenartige Oberfläche.
(3) Luftmyzel: rosa oder bläulich gefärbt. (4)
Substratmyzel: in einigen Medien rosa. (5) Diffusionsfähiges
Pigment: keines. (6) Mesophil. (7) Zellwand-Typ
IIIB. (8) Menachinon-System: MK-9(H₆) und MK-9(H₈).
Diese Hauptcharakteristika zeigen an, daß der Stamm H964-92
zu dem Genus Actinomadura gehört. Frühe Species des
Genus Actinomadura wurden von Säugetieren isoliert. Einige
Stämme wurden auch aus Pflanzenmaterialien erhalten.
Jedoch wurden viele der kürzlich vorgeschlagenen,
neuen Species aus Bodenproben isoliert. Gemäß der zahlenmäßig
bewerteten Taxonomie und nach dem Übersichtsartikel
von Goodfellow et al. in J. Gen. Microbiol. 112, 95-111
(1979), über Actinomadura und ähnliche Actinomycetes gehören
die meisten der aus Bodenproben stammenden Actinomadura-Species
zu dem Cluster Nr. 7 von den beschriebenen
vierzehn Clustern. Der Stamm H964-92 ähnelt am meisten
den Species des Clusters 7. Nonomura und Ohara berichten
in J. Ferment. Technol. 49, 904-912 (1971). über
fünf saprophytische Species des Genus Actinomadura, und
Nonomura [J. Ferment. Technol. 52, 71-77 (1974)] und
Preobrazhenskaya et al. [Actinomycetes and Related
Organisms 12, 30-38 (1977)] veröffentlichten die Schlüssel
zur Identifizierung und Klassifizierung der Actinomadura-Species.
Nach Vergleich mit den Beschreibungen
von 30 Species, wozu auch solche Organismen gehören, die
in Patenten offenbart sind, scheint der Stamm H964-92
dem in der obigen Literaturstelle von Preobrazhenskaya
et al. beschriebenen Actinomadura coerulea und dem in
den obigen Druckschriften von Nonomura beschriebenen
Actinomadura verrucosospora sehr ähnlich zu sein.
Der Stamm Nr. H964-92 wurde direkt mit dem A. verrucosospora-Stamm
KCC A-0147 verglichen. Es wurde gefunden,
daß er hinsichtlich der morphologischen, kulturellen
und physiologischen Charakteristika mit A. verrucosospora
eng verwandt ist. Der Stamm H964-92 wird somit als
neuer Stamm von Actinomadura verrucosospora klassifiziert.
Die erfindungsgemäßen BBM-1675-Antibiotika werden hergestellt,
indem man einen BBM-1675 produzierenden
Stamm von Actinomadura verrucosospora, nämlich einen
Stamm von Actinomadura verrucosospora mit den identifizierenden
Charakteristika von ATCC 39334 oder ATCC 39638,
in einem üblichen, wäßrigen
Nährmedium kultiviert. Der Organismus wächst in einem
Nährmedium, das bekannte Nährquellen, d. h. assimilierbare
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gewünschtenfalls
anorganische Salze und andere bekannte Wachstumsfaktoren,
für Actinomycetes enthält. Vorzugsweise arbeitet
man bei submersen, aeroben Bedingungen, um große Mengen
des Antibiotikums herzustellen. Für die Herstellung
von kleineren Mengen können auch Oberflächenkulturen und
Flaschen verwendet werden. Die für andere Actinomycetes
eingesetzten, allgemeinen Verfahren können auch erfindungsgemäß
angewendet werden.
Das Nährmedium sollte eine geeignete, assimilierbare Kohlenstoffquelle
enthalten, z. B. Glycerin, L(+)-Arabinose,
D-Xylose, D-Ribose, L-Rhamnose, D-Glucose, D-Fructose,
Saccharose, Cellobiose, lösliche Stärke, D-Mannit oder
Inosit. Als Stickstoffquellen kann man Ammoniumchlorid,
Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat
und dgl. entweder allein oder zusammen mit organischen
Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt,
Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenmehl
und dgl., einsetzen. Gewünschtenfalls kann man auch
anorganische Nährsalze zugeben, um Natrium, Kalium, Calcium,
Ammonium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Bromid,
Carbonat, Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und
dgl. bereitzustellen.
Die Herstellung der BBM-1675 Antibiotika kann man bei jeder
Temperatur durchführen, bei der der produzierende
Organismus ein befriedigendes Wachstum zeigt, z. B. bei
15 bis 45°C. Gewöhnlich arbeitet man bei einer Temperatur
von etwa 27 bis 32°C. Im allgemeinen erhält man eine
optimale Produktion nach einer Inkubation von etwa 68 bis
180 Stunden, in Abhängigkeit davon, ob die Fermentation
mit Schüttelflaschen, Rührgefäßen oder mit Tanks durchgeführt
wird. Bei der Tankfermentation ist es wünschenswert,
ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe herzustellen,
indem man die Kulturbrühe mit einer Schrägkultur
oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur des
produzierenden Organismus animpft. Nachdem man auf diese
Weise ein aktives Inokulum erhalten hat, überführt man es
aseptisch in das Medium des Fermentationstanks. Die Antibiotikaproduktion
kann mit Hilfe des Papierscheiben-Agar-Diffusionsassays
unter Verwendung von Staphylococcus
aureus 209P als Testorganismus überwacht werden.
Nachdem die Fermentation vollständig ist, kann man den
BBM-1675-Komplex aus der Brühe nach üblichen Isolationsverfahren,
z. B. Lösungsmittel-Extraktion, erhalten. So
kann man z. B. die gesamte Brühe durch Filtrieren oder
Zentrifugieren in den Myzelkuchen und die überstehende
Brühe auftrennen. Die Antibiotika in dem Myzelkuchen
kann man gewinnen, indem man den Kuchen in Methanol suspendiert,
unlösliche Materialien abfiltriert und den
methanolischen Extrakt konzentriert. Aktive Bestandteile
in der überstehenden Brühe kann man durch Extraktion mit
n-Butanol gewinnen. Die obigen n-Butanol- und Methanol-Extrakte
vereinigt man dann und verdampft azeotrop bis
zu einer wäßrigen Lösung, worauf sich die meisten der
Antibiotika als öliger Feststoff absetzen. Diesen Feststoff
kann man dann in Methanol lösen und die Lösung
filtrieren. Das Filtrat konzentriert man und gibt es zu
einer Ethylacetat-Wasser-Mischung. Der erhaltene, organische
Extrakt enthält den rohen BBM-1675-Komplex, den
man aus der Lösung durch Zugabe eines "Anti-Lösungsmittels",
wie n-Hexan, ausfällt.
Der rohe BBM-1675-Komplex ist eine Mischung verschiedener
Bestandteile. Dazu zählen zwei bioaktive Hauptkomponenten,
BBM-1675 A₁ und A₂, und vier bioaktive Nebenbestandteile,
BBM-1675 A₃, A₄, B₁ und B₂. Diese bioaktiven Bestandteile
können nach üblichen chromatographischen Verfahren
aufgetrennt und gereinigt werden. Bei einem dieser
Verfahren löst man den rohen BBM-1675-Komplex zuerst in
Methanol und reinigt dann unter Verwendung einer Sephadex
LH-20-Chromatographiesäule, wobei man Methanol als
Eluierungsmittel verwendet. Diesen teilweise gereinigten
Komplex kann man dann über eine Silikagelsäule chromatographieren
und stufenweise unter Verwendung von Chloroform
und einer zunehmenden Konzentration an Methanol eluieren,
wobei man A₁, eine Mischung von BBM-1675 A₂, A₃
und A₄ und eine Mischung von BBM-1675 B₁ und B₂ erhält.
Den Bestandteil A₁ kann man weiter chromatographisch unter
Verwendung einer Sephadex LH-20-Säule reinigen, wobei
man Methanol als Eluierungsmittel einsetzt. Die Mischung
von A₂, A₃ und A₄ kann man chromatographisch auf einer
Bondapak C₁₈-Säule auftrennen,
wobei man zunehmende Konzentrationen von wäßrigem Acetonitril
als Eluierungsmittel einsetzt. Die Mischung der
Bestandteile B₁ und B₂ kann man auf einer Silikagelsäule
chromatographisch trennen, wobei man eine Mischung von
Chloroform und Methanol als Eluierungsmittel einsetzt.
Weitere Einzelheiten der bevorzugten, chromatographischen
Trennverfahren sind in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Die sechs bioaktiven Bestandteile des BBM-1675-Komplexes
können voneinander mit Hilfe zweier Dünnschichtchromatographie-Systeme
unterschieden werden, wie dies in der
folgenden Tabelle gezeigt ist.
Die Trennung von BBM-1675 A₂, A₃ und A₄ unter Verwendung
von TLC-Systemen mit einer gewöhnlichen Phase ist schwierig,
konnte jedoch mit einer Umkehrphasen-TLC erzielt
werden.
Die einzelnen BBM-1675-Bestandteile zeigen eine ähnliche
Löslichkeit und ähnliche Farbreaktionen. So sind sie z. B.
in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol
löslich, in Benzol und Wasser wenig löslich und in n-Hexan
und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich. Sie ergeben
mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagens
eine positive Reaktion, im Sakaguchi-, Ninhydrin- und
Anthron-Test jedoch eine negative Reaktion.
Die charakteristischen, physiko-chemischen Eigenschaften
der BBM-1675-Bestandteile sind in der nachfolgenden
Tabelle 5 aufgeführt.
Die UV-Absorptionsmaxima der BBM-1675 Bestandteile wurden
bei 253, 282 und 320 nm beobachtet. Eine Verschiebung
nach Zugabe einer sauren oder alkalischen Lösung konnte
nicht beobachtet werden. Die IR- oder PNMR-Spektren von
BBM-1675 A₁, A₂, A₃ und A₄ sind in den Fig. 1 bis 4 bzw.
Fig. 5 bis 8 gezeigt. Das 360 MHz-¹H-NMR-Spektrum von
BBM-1675 A₁ zeigt eine Acetylgruppe (δ : 2,11 ppm), eine
N-CH₃-Gruppe (2,52 ppm), vier OCH₃-Gruppen (3,42, 3,80,
3,88 und 3,98 ppm) und eine Exomethylengruppe (4,75 und
5,48 ppm) neben zwei aromatischen Protonen (7,50 und
8,59 ppm) und einem NH-Proton (11,79 ppm). Das CNMR-Spektrum
von BBM-1675 A₁ zeigt 55 Kohlenstoffsignale. Dazu
zählt auch ein Signal dreifacher Intensität (δ :
56,0 ppm, OCH₃). Basierend auf den Protonen- und ¹³C-NMR-Spektren,
der Mikroanalyse und der Bestimmung des
Molekulargewichts durch HPLC und SIMS (secondary ion
mass spectrometry) wurde die Molekülformel von BBM-1675 A₁
mit C₅₇H₇₂N₄O₃₂ abgeleitet.
Nach Behandlung mit 0,5 N HCl-CH₃OH bei Raumtemperatur
verliert BBM-1675 A₁ seine Bioaktivität und ergibt neben
verschiedenen, nichtidentifizierten Fragmenten eine lipophile,
chromophore Substanz (Verbindung I). Das UV-Absorptionsspektrum
der Verbindung I ähnelt derjenigen der
Stammverbindung. Dies deutet darauf hin, daß die Verbindung
I die chromophore Struktur von BBM-1675 A₁ behält.
Zwei weitere, chromophore Fragmente, die der Verbindung
I ähneln, erhält man durch alkalische Hydrolyse von BBM-1675 A₁:
Hydrolyse mit 0,05 N KOH-CH₃OH bei 55°C während
1 h ergibt die Verbindung II mit UV-Absorptionsmaxima
bei 252, 284, 297 (Schulter) und 322 nm, während die Umsetzung
in 1 N KOH-CH₃OH zu einer sauren, chromophoren
Substanz führt, die als Verbindung III bezeichnet ist.
Die physiko-chemischen Eigenschaften der Verbindungen I,
II und III sind in der folgenden Tabelle 6 aufgeführt.
Strukturinformationen hinsichtlich der Verbindungen II
und III konnten aus den nachfolgenden Spektraldaten und
den chemischen Transformationen gewonnen werden. Das
¹³C- und ¹H-NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit von vier
OCH₃-Gruppen, einer =CH₂-Gruppe, sieben
zwei C=O-Gruppen und einer NH-Gruppe in der Verbindung
II. Das NMR-Spektrum der Verbindung III ähnelt demjenigen
der Verbindung II, unterscheidet sich jedoch nur
dadurch, daß eine der vier bei der Verbindung II beobachteten
OCH₃-Gruppen nicht vorhanden ist. Aufgrund dieses
Unterschiedes und der sauren Natur der Verbindung
III wird angenommen, daß die Verbindung II ein Methylester
der Verbindung III ist. Kocht man die Verbindung
II mit 1 N methanolischer KOH am Rückfluß, dann wird sie
quantitativ in die Verbindung III überführt, während die
Verbindung III durch Behandlung mit Diazomethan in die
Verbindung II überführt wird. Die Behandlung der Verbindung
II mit NaBH₄ in C₂H₅OH ergibt ein Reduktionsprodukt
(Verbindung IV, M⁺: m / z 267), bei dem im NMR-Spektrum
anstelle der -COOCH₃-Gruppe der Verbindung II
eine -CH₂OH-Gruppe vorhanden war. Nach Hydrierung mit
Palladium-auf-Kohle ergibt die Verbindung II ein Dihydroderivat
(Verbindung V, M⁺: m / z 297). Das ¹H-NMR-Spektrum
der Verbindung V zeigt ein neues Methylsignal
(Dublett). Das Signal für die in der Verbindung II vorhandene
Exomethylengruppe fehlt jedoch. Außerdem erscheint
bei der Verbindung V eines der Signale für die
OCH₃-Gruppen bei höherem Feld (δ :3,50 ppm). Diese Ergebnisse
deuten darauf hin, daß eine
in
der Verbindung II vorliegt, die durch Hydrierung zu einer
in Verbindung V reduziert wird. Die Verbindung
II wurde mit 1,5 N methanolischem Chlorwasserstoff
3 h bei 80°C erwärmt. Das Hydrolysat wurde über eine
Silikagelsäule chromatographiert. Man erhält eine
schwachbasische Verbindung (Verbindung VI, M⁺: m / z 211).
Das IR-Spektrum und die physiko-chemischen Eigenschaften
zeigen, daß in der Verbindung VI eine NH₂-Gruppe vorhanden
ist. Die Verbindung VI wurde durch Vergleich der IR-
und NMR-Untersuchungen mit einer authentischen Probe als
Methyl-4,5-dimethoxy-antranilat identifiziert. Folglich
besitzen die Verbindungen II bis VI die nachstehend
angegebenen Strukturen.
Nach Behandlung mit 0,05 N KOH-CH₃OH bei 55°C wurde die
Verbindung I in ein neues, chromophores Fragment (Verbindung
VII, C₁₅H₂₁NO₇, M⁺: m / z 327) und einen Zucker
(Verbindung VIII) gespalten. Das NMR-Spektrum von VII
zeigt ein C-CH₃-Singulett und zwei OCH₃-Gruppen bei hohem
Feld sowie drei OCH₃-Gruppen bei niedrigem Feld und
zwei aromatische Protonen, die gewöhnlich bei den Verbindungen
II, V und VI beobachtet werden. Die weitere
Hydrolyse von VII mit 1,5 N methanolischem Chlorwasserstoff
ergibt die Verbindung VI, die mit der zuvor aus
II erhaltenen identisch ist. Nach Entfernen von VI wurde
das Hydrolysat mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin behandelt,
wobei ein gelber Feststoff ausfiel, der als 2,4-Dinitrophenylhydrazon
von Brenztraubensäure identifiziert
wurde. Bei der Verbindung VII handelt es sich somit
um Methyl-4,5-dimethoxy-N-(2′-2′-dimethoxypropionyl)-anthranilat.
Mit der Verbindung VIII konnte kein Molekülionenpeak
erhalten werden. Der M-OCH₃-Peak im Massenspektrum
erschien bei m / z 131. Dies ist in Übereinstimmung
mit der Molekülformel C₇H₁₄O₄. Das NMR-Spektrum
zeigt eine 2,6-Didesoxyhexopyranose-Struktur für die Verbindung
VIII. Diese Zuordnung wird durch das ¹³C-NMR-Spektrum
der Verbindung I unterstützt, die zu einem
C-CH₃-Signal, einem -CH₂-Signal, drei O-CH-Signalen
und einem anomeren Kohlenstoffatom sowie 15 Kohlenstoffsignalen
führt, wobei letztere der Verbindung VII zugeordnet
werden können. Das Proton an C₃ beim Zucker erschien
bei niedrigem Feld (δ : 5,39 ppm, Oktett). Die
C₃-OH-Gruppe des Zuckers war somit mit der Carboxylgruppe
von VII verestert. Die obigen Ergebnisse können wie
folgt zusammengefaßt werden:
Das Molekulargewicht der Verbindung I (457) macht in
etwa ein Drittel des gesamten Moleküls von BBM-1675 A₁
aus (vorgeschlagene Formel C₅₇H₇₂N₄O₃₂; berechnetes Molekulargewicht = 1324).
Es wird angenommen, daß BBM-1675 A₁
folgende Teilstruktur besitzt:
Claims (9)
1. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC
39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₁, das in
gereinigter Form folgende Eigenschaften besitzt: es
- (a) bildet weiße bis fahlgelbe Kristalle,
- (b) ist in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich, in Benzol und Wasser wenig löslich und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich;
- (c) gibt mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz eine positive Reaktion und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion;
- (d) besitzt das in Fig. 9 gezeigte IR-Absorptionsspektrum (KBr);
- (e) besitzt in CDCl₃ gelöst das in Fig. 10 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum;
- (f) besitzt einen Schmelzpunkt von 156 bis 158°C;
- (g) besitzt eine optische Drehung von [α ] = -191° (c = 0,5, CHCl₃);
- (h) besitzt ein massenspektroskopisch bestimmtes, scheinbares Molekulargewicht von 1248;
- (i) besitzt folgende Elementarzusammensetzung: 52,17% C,6,15% H, 4,63% N, 9,09% S und 27,96% Sauerstoff (durch Differenz);
- (j) führt bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,74 und führt bei der Umkehrphasen-Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75 : 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,18;
- (k) führt, wenn in Methanol in einer Konzentration von 0,011356 g/l gelöst, zu den folgenden UV-Absorptionsmaxima und Absorptionsvermögen: λ max (nm)Absorptionsvermögen32012,4 280Schulter 25325,1 21025,5(nach Zugabe einer Säure oder einer Base ergeben sich keine signifikanten Änderungen):
- (l) führt bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer C₁₈-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-0,1M CH₃COONH₄ (5 : 2 : 3, V/V) zu einer Retentionszeit von 13,3 Minuten;
- (m) inhibiert das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze;
- (n) induziert Phophagen bei lysogenen Bakterien; und
- (o) inhibiert das Wachstum von P-388 Leukämie, L-1210 Leukämie, B16 Melanom und Lewis-Lungenkarzinom bei Mäusen, wobei die Fig. 9 und 10 Bestandteile dieses Anspruchs sind.
2. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC
39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₂, das in
gereinigter Form folgende Eigenschaften besitzt: es
- (a) bildet weiße Kristalle,
- (b) ist in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich, in Benzol und Wasser wenig löslich und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich;
- (c) führt mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz zu einer positiven Reaktion und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test zu einer negativen Reaktion;
- (d) besitzt das in Fig. 12 gezeigte IR-Absorptionsspektrum (KBr);
- (e) besitzt in CDCl₃ gelöst das in Fig. 13 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum;
- (f) besitzt einen Schmelzpunkt von 147 bis 149°C;
- (g) führt zu einer optischen Drehung von [α ] = -179,4° (c = 0,5, CHCl₃);
- (h) besitzt ein massenspektroskopisch bestimmtes, scheinbares Molekulargewicht von 1248;
- (i) besitzt folgende Elementarzusammensetzung: 52,71% C; 5,94% H, 3,94% N, 9,39% S und 28,96% O (durch Differenz);
- (j) führt bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,71 und führt bei der Umkehrphasen-Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75 : 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,21;
- (k) führt, wenn in einer Konzentration von 0,02052 g/l in Methanol gelöst, zu den folgenden UV-Absorptionsmaxima und Absorptionsvermögen: λ max (nm)Absorptionsvermögen32012,2 28216,3 25226,2 21425,8(nach Zugabe einer Säure oder einer Base ergeben sich keine signifikanten Änderungen):
- (l) führt bei der (HPLC) mit einer C₁₈-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-0,1M CH₃COONH₄ (5 : 2 : 3, V/V) zu einer Retentionszeit von 17,3 Minuten;
- (m) inhibiert das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze;
- (n) induziert Phophagen bei lysogenen Bakterien; und
- (o) inhibiert das Wachstum von P-388 Leukämie, L-1210 Leukämie, B16-Melanom und Lewis-Lungenkarzinom bei Mäusen, wobei die Fig. 12 und 13 Bestandteile dieses Anspruchs sind.
3. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC 39638
erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₃, das
- (a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslich ist und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;
- (b) mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;
- (c) das in Fig. 3 gezeigte IR-Absorptionsspektrum (KBr) besitzt;
- (d) das in Fig. 7 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum besitzt, wenn in CDCl₃ gelöst;
- (e) einen Schmelzpunkt von 125 bis 127°C besitzt;
- (f) zu einer optischen Drehung von [α ] = -161° (c = 0,5, CHCl₃) führt;
- (g) folgende Elementarzusammensetzung besitzt: 54,55% C, 6,46% H, 3,73% N, 7,49% S und 27,77% O (durch Differenz);
- (h) bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,72 und bei der Umkehrphasen-Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75 : 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,28 führt;
- (i) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt,
wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃OH und 0,01N NaOH-CH₃OH
gelöst,
UV λ max nm (E )in Methanol
253 (286)
282 (158)
320 (122)in 0,01N HCl-CH₃OH
253 (287)
282 (160)
320 (126)in 0,01N NaOH-CH₃OH
252 (280)
283 (162)
318 (120) - (j) bei der HPLC mit einer C₁₈-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-0,1M CH₃COONH₄ (5 : 2 : 3, V/V) eine Retentionszeit von 8,0 Minuten besitzt;
- (k) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert;
- (l) Phophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und
- (m) das Wachstum von P-388 Leukämie bei Mäusen inhibiert, wobei die Fig. 3 und 7 Bestandteile dieses Anspruchs sind.
4. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC
39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₄, das
- (a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslich ist und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;
- (b) mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;
- (c) das in Fig. 4 gezeigte IR-Absorptionsspektrum (KBr) besitzt;
- (d) das in Fig. 8 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum besitzt, wenn in CDCl₃ gelöst;
- (e) einen Schmelzpunkt von 123 bis 126°C besitzt;
- (f) zu einer optischen Drehung von [α ] = -176° (c = 0,5, CHCl₃) führt;
- (g) folgende Elementarzusammensetzung besitzt: 54,65% C, 6,29% H, 3,51% N, 8,07% S und 27,48% O (durch Differenz);
- (h) bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,71 und bei der Umkehrphasen-Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75 : 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,78 führt;
- (i) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt,
wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃OH und 0,01N NaOH-CH₃OH
gelöst,
UV λ max nm (E )in Methanol
253 (257)
282 (153)
320 (117)in 0,01N HCl-CH₃OH
253 (258)
282 (155)
320 (118)in 0,01N NaOH-CH₃OH
252 (266)
283 (160)
318 (118) - (j) bei der HPLC mit einer C₁₈-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-0,1M CH₃COONH₄ (5 : 2 : 3, V/V) eine Retentionszeit von 5,1 Minuten besitzt;
- (k) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert;
- (l) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und
- (m) das Wachstum von P-388 Leukämie bei Mäusen inhibiert, wobei die Fig. 4 und 8 Bestandteile dieses Anspruchs sind.
5. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC
39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 B₁, das
- (a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslich ist und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;
- (b) mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;
- (c) einen Schmelzpunkt von 159 bis 161°C besitzt;
- (d) zu einer optischen Drehung von [α ] = -171° (c = 0,5, CHCl₃) führt;
- (e) bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,63 und bei der Umkehrphasen-Silikageldünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75: 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,23 führt;
- (f) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt,
wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃O und 0,01N NaOH-CH₃OH
gelöst,
UV λ max nm (E )in Methanol
253 (225)
282 (140)
320 (104)in 0,01N HCl-CH₃OH
253 (225)
282 (140)
320 (105)in 0,01N NaOH-CH₃OH
252 (236)
283 (141)
318 (105) - (g) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert; und
- (h) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und
6. Mit Actinomadura verrucosospora ATCC 39334 oder ATCC
39638 erhältliches Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 B₂, das
- (a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslich ist und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;
- (b) mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen's-Reagenz eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;
- (c) einen Schmelzpunkt von 156 bis 159°C besitzt;
- (d) zu einer optischen Drehung [α ] = -122° (c = 0,5, CHCl₃) führt;
- (e) bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5 : 1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,60 und bei der Umkehrphasen-Silikageldünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75: 25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,16 führt;
- (f) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt,
wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃O und 0,01N NaOH-CH₃OH
gelöst,
UV λ max nm (E ):in Methanol
248 (212)
279 (141)
318 (103)in 0,01N HCl-CH₃OH
248 (210)
279 (140)
318 (103)in 0,01N NaOH-CH₃OH
248 (233)
278 (150)
318 (110) - (g) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert; und
- (h) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und
7. Verfahren zur Herstellung der Antitumor-Antibiotika
BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄,
BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂, dadurch gekennzeichnet,
daß man einen BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄,
BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂ produzierenden Actinomadura
verrucosospora-Stamm mit den identifizierenden Charakteristika
des Actinomadura verrucosospora-Stamms H964-92 (ATCC 39334)
oder des Actinomadura verrucosospora-Stamms A1327Y (ATCC 39638)
in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff-
und Stickstoffquellen enthält, unter submersen,
aeroben Bedingungen so lange kultiviert, bis eine wesentliche
Menge an BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃,
BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂ durch den genannten
Organismus in dem genannten Kulturmedium produziert
worden ist, und daß man anschließend BBM-1675 A₁,
BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder
BBM-1675 B₂ aus dem Kulturmedium gewinnt.
8. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend BBM-1675 A₁,
BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder
BBM-1675 B₂, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutischen
Träger und/oder Verdünnungsmittel.
9. Das Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₁, -A₂, -A₃,
-A₄, -B₁ und -B₂ herstellender Stamm Actinomadura verrucosospora
ATCC 39334 oder ATCC 39638.
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