FR2512819A1 - Derives de macbecine et leur preparation - Google Patents

Abstract

DERIVES DE MACBECINE ET LEUR PREPARATION. LES DERIVES DE MACBECINE SONT OBTENUS EN METTANT EN CONTACT DES MACBECINES AVEC UN MICRO-ORGANISME, OU SA MATIERE TRAITEE, DU GENRE STREPTOMYCES OU NOCARDIA, OU EN CULTIVANT UN MICRO-ORGANISME DU GENRE ACTINOSYNNEMA DANS UN MILIEU DE CULTURE. LES DERIVES DE MACBECINE SONT UTILISES COMME AGENTS ANTIBACTERIENS, ANTIFONGIQUES OU ANTIPROTOZOAIRES.

Description

Dérivés de macbécine et leur préparation.

La présente invention concerne de nouveaux dérivés de macbécine ayant une activité antibactérienne et d'autres activité et leurs procédés de préparation. Les antibiotiques C-14919 E-1 et E-2 ont été isolés comme antibiotiques nouveaux (demande de brevet japonaise publiée (sans examen) n 121704/1978 et 121705/1978)) Plus tard, leurs structuresfurent déterminées et ils ont été désignés par Macbecint I et I<, respectivement (par exemple, Tetrahedron

Letters, vol 21, No 3, page 309 ( 1980 >.

Les auteurs de la présente invention, c'est-à-dire Messieurs Masayuki Muroi et Makoto Kida, ont recherché un procédé pourtransformer la macbécine I et la macbécine II en d'autres composés à l'aide d'un microorganisme et ont découvert qu'en traitant la macbécine I ou la macbécine II avec le bouillon de culture d'un certain micro-organisme,ou bien une matière traitée dérivée de celui-ci, ils les transformaient en un composé ayant un groupe hydroxyle à la place du groupe méthoxy sur une position définie Plus tard, la recherche des inventeurs basée sur cette

découverte, a conduit à la présente invention.

En cherchant de nouveaux antibiotiques, les auteurs de la présente invention, c'est-à-dire Messieurs Toru Hasagawa, Masayuki Muroi et Seiichi Tanida, isolèrent un grand nombre de

micro-organismes à partir du sol et d'autres sources, recher-

chèrent des antibiotiques produits par les micro-organismes et ont découvert que certains sont des micro-organismes produisant des antibiotiques, c'est-à-dire des micro-organismes appartenant au genre Actinosynnema, et que les antibiotiques manifestant une activité contre les bactéries gram-positives, les champignons et

les protozoaires, pouvaient être accumulés dans un milieu ap-

proprié en cultivant ledit micro-organisme dans le milieu Ils isolèrent et purifièrent les antibiotiques eten se basant sur leurs propriétés caractéristiques, les reconnurent comme de nouveaux composés appartenant à la macbécineet les désignèrent par antibiotiques C-33196 E-3, E-3-R, E- 4, E-4-R, E-5, E-5-R,

E-6, E-6-R, E-7 et E-7-Rl Comme résultat des recherches ulté-

rieures basées sur les découvertes ci-dessus, les auteurs de la

présente invention ont complété celle-ci.

Ainsi, la présente invention concerne ( 1) des dérivés de macbécine de formule: R 10 (I) CH 3

X NH 1

dans laquelle un des R 1, R 2 et R 3 est de l'hydrogèneret chacun des deux symboles restant est un groupe méthyle, et X est: O r OH t ou t

O OH

( 2) un procédé de préparation des dérivés de macbécine de formule: R 1 O 18

( 1

dans laquelle un des RE' R 2 et des deux symboles restant est out R 3 est de l'bydrogene,et chacun un groupe méthyle, et X est: OH OH (I) qui comprend la mise en contact

CH 3 CH 3 C

1 H 2 NOCO

CH 3 O

H 3 CO y NH d'un composé de formule (II): (II) CH 3 dans laquelle X a la définition ci-dessus, avec le bouillon de culture obtenu en cultivant un micro-organisme appartenant au genre Streptomyces ou Nocardia et pouvant convertir le groupe méthoxy de la position 17, 18 ou 21 dudit composé (II) en un groupe hydroxyle, ou avec une matière traitée provenant dudit bouillon de culture, ( 3) un antibiotique C-33196 E-4 ou C-33196 E-4-K qui a les propriétés suivantes: a) Antibiotique C-33196 E-4: I) Point de fusion: 209-210 C II) Aspect: cristaux jaunes III) Pouvoir rotatoire spécifique:g 2 D 5 + 53 + 5 o (c= 0,5,CHC VI) Analyse élémentaire (%):

C 63,14 + 0,5

H 7,57 + 0,5

N 5,26 + 0,5

V) Spectre de masse (M+): m/z 532 VI) Spectre d'absorption ultra-violet: X Me OH 276 nm + 2 (Elcm% 272 + 20)

max lcm -

390 nm+ 2 E 1 % 33,5 + 5)

( EÀ 3 3 5 5

13) VII) Spectre d'absorption infra-rouge, pics principaux (cm-1):

1735, 1700, 1670, 1650, 1625, 1605, 1500,

1380, 1305, 1290, 1210, 1050

VIII) Solubilité: Faiblement soluble dans l'éther de pétrole, l'hexane, l'eau: Soluble dans le chloroforme, le chlorure de méthylène, le toluène, l'éther diéthylique; Facilement soluble dans l'acétone, l'acétate

d'éthyle, le méthanol, le diméthylsulfoxyde.

IX) Réactions colorées: Essai positif avec le permanganate de potassium (décoloration); Réaction avec la nihydrine et réaction 5 de Ehrlich

et Barton négatives.

X) Acidité, neutralité ou basicité: neutre b) Antibiotique C-33196 E-4-R (propriétés des cristaux contenant une molécule d'acétate d'éthyle comme solvant de cristallisation): I) Point de fusion: 224-225 C II) Aspect: cristaux incolores III) Pouvoir rotatoire spécifique: 25 + 32-+ 5 (c= 0,5, Me OH) IV) Analyse élémentaire (%):

C 60,96 + 0,5

H 8,25 + 0,5

N 4,59 + 0,5

V) Spectre de masse (M+): m/z 534 VI) Spectre d'absorption ultra-violet: Me OH 307 nm + 2 n( 1 % max lm VII) Spectre d'absorption infra-rouge, pics principaux -1 (cm-1)

1720, 1670, 1630, 1600, 1535, 1465, 1380,

1325, 1045

VIII) Solubilité: Faiblement soluble dans l'éther de pétrole, l'hexane, l'éther diéthylique, le chloroforme et l'acétate d'éthyle; Soluble dans le méthanol;

Très soluble dans le diméthylsulfoxyde.

r 2512 a 19 IX) Réactionscolorées Réaction de Barton positive; Réaction avec la ninhydrine et réaction de Ehrlich négatives X) Acidité, neutralité ou basicité: neutre, ( 4) Les antibiotiques C-33196 E-6, C- 33196 E-6-R, C-33196 E-7 ou C-33196 E-7-R, qui ont la structure chimique

CH 3 CH 3 'CH 3

Ri_

R 1 H 2 NOCO

18 OR 2

CH 3 CH 3

R 30 x/NH dans laquelle un des groupes R 1, R 2 et R 3 est un groupe méthyle, et les autres sont de l'hydrogène, et X est un groupe de formule:

0 OH

ont les propriétés suivantes OH a) Antibiotique C-33196 E-6: (I) Pouvoir rotatoire spécifique: 24 + 258,80 + 200 (c= 0,5,

CHC 13)

(II) Spectre d'absorption ultra-violet Me OH 273 nm + 2 nm '- 11 % l Ecm 44 + 45) max Me OH 397 N + 2 nm (e m 50,3 + 5) max lcm (III) Spectre d'absoption infra-rouge, pics principaux (cm-):

1720, 1705, 1670, 1650, 1610, 1505, 1380,

1325, 1265, 1210, 1090, 1040.

b) Antibiotique C-33196 E-6-R: (I) Pouvoir rotatoire spécifique:D 24 + 37, 80 + 40 (c= 0,5, Me OH) (II) Spectre d'absorption ultra-violet: A Me OH 1 % 37 + 30 )Me OH 255 n+ 2 nm +(E 1 % 337 + 30)

max ( -

1 % Me OH ma H 307 nm + 2 num (Elcm 91 + 9) max 1 cm (III) Spectre d'absorption infra-rouge, pics principau: -1 (cm-1):

1720, 1650, 1600, 1535, 1460, 1380, 1320,

1090, 1040, 1010

c) Antibiotique C-33196 E-7: (I) Pouvoir rotatoire spécifique l 4 + 37,4 + 4 (c= 0,5,

CHC 1 C 13)

(II) Spectre d'absorption ultra-violet: A Me OH 1 % max 274 nm + 2 nm (Elcm 502 + 50)

max m -

1 e H i-max'O 396 nm + 2 nm (Elcm 59,8 + 6) (III) Spectre d'absorption infra-rouge, pics principaux (cm-1):

1725, 1670, 1650, 1605, 1500, 1380, 1325,

1260, 1205, 1150, 1095, 1035

d) Antibiotique C-33196 E-7-R: (I) Pouvoir rotatoire spécifique N 4 + 18, 6 + 2 (c= 0,5 Li Me OH) (II) Spectre d'absorption ultra-violet: 1 A Me OH 250 nm + 2 nm (Elam 305 + 30) max Me OH 315 nm+ 2 nm (E 1 68 + lcm 7)

Max lcm -

(III) Spectre infra-rouge, pics principaux (cm 1):

1710, 1640, 1600, 1485, 1455, 1380, 1310,

1250, 1090, 1040,

et ( 5) un procédé de préparation des antibiotiques C-33196 E-3,

C-33196 E-3-R, C-33196 E-4, C-33196 E-4-R, C-33196 E-5,

C-33196 E-5-R, C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196 E-7 ou C-33196 E-7-R, qui comprend la culture d'un micro-organisme appartenant au genre Actinosynnema qui est capable de produire les antibiotiques C-33196 E-3, C-33196 E-3-R, C-33196 E-4,

C-33196 E-4-R, C-33196 E-5, C-33196 E-5-R, C-33196 E-6,

0-33196 E-6-R, C-33196 E-7 ou C-33196 E-7-Rdans un milieu de culture pour amener ledit micro-organisme à élaborer et accumuler ledit composé dans le bouillon de culture;et la récolte dudit

composé à partir du bouillon de culture.

Le composé de formule (I) dans laquelle R 1, R 2 et R 3 représentent chacun un groupe méthylelet X est: O O

est désigné par "Macbecin I", et le composé de formule structu-

rale ci-dessus (I) dans laquelle R 1, R 2 et R 3 représentent chacun le groupe méthyleet X est: OH OH est désigné par "Macbecin II" (demande de brevet japonaise publiée (non examinée) 121,704/1978, demande de brevet japonaise publiée (non examinée) 121,705/1978, brevet US n 4 187 292, Tetrahedron Letters, 21, 309 ( 1980), Tetrahedron, 37 ( 6),

1123 ( 1981)).

Le composé de formule (I) dans laquelle R 1 est de O l'hydrogène; R 2 et R 3 sont des groupes méthyle,et X est: est désigné par "Antibiotic C- 33196 E-3 ", le composé de formule (I), dans laquelle R 1 est de l'hydrogène R 2 et O R 3 sont des groupes méthyle 1 et X est: OH t OH est désigné par "Antibiotic C-33196 E-3-R"; le composé de formule (I) dans laquelle R 1 et R 3 sont des groupes méthyle; R est de l'hydrogène et X est: O est désigné par "Antibiotic C-33196 E-5 ", le composé de formule (I) dans laquelle R 1 et R 3 sont des groupes méthyle; R 2 est de l'hvdrogêne,et X est: OH i OH est désigné par "Antibiotic C-33196 E-5-R", le composé de formule (I) dans laquelle R 1 et R 2 sont des groupes méthyle; R 3 est de l'hydrogènetet X est: O O est désigné par " 21-O- demethylmacbecin I", et le composé de formule (I) dans laquelle R et R sont des groupes méthyle' R est de l'hydrogènelet X est: OH 3 OH

est désigné par " 21-0-demethylmacbecin II".

Dans la présente spécification, l'antibiotique C-33196 E-3 est quelque fois désigné par "C-33196 E-3 ou simplement par "E-3 "; l'antibiotique C33196 E-3-R par "C-33196 E-3-R" ou simplement par "E-3-R"; l'antibiotique C-33196 E-4 par "C-33196 E-4 " ou simplement par "E-4 "; l'antibiotique C33196

E-4-R par "C-33196 E-4-R" ou simplement par "E-4-R"; l'anti-

biotique C-33196 E-5 par "C-33196 E-5 " ou simplement par "E-5 "; l'antibiotique C-33196 E-5-R par "C-33196 E-5-R" ou simplement par "E-5R",' l'antibiotique C-33196 E-6 par "C-33196 E-6 " ou simplement par "E-6 "; l'antibiotique C-33196 E-6-R par "C-33196 E-6-R" ou simplement par "E6-R"; l'antibiotique C-33196 E-7 par "C-33196 E-7 " ou simplement par "E7 ",et l'antibiotique C-33196 E-7-R par "C-33196 E-7-R" ou simplement

par "E-7-R".

Le micro-organisme à utiliser pour la production du composé (I) en transformant le composé (II) peut être un quelconque des micro-organismes appartenant au genre Streptomyce E ou Nocardia et capable de transformer le groupe méthoxy sur les positions 17, 18 ou 21 du composé (II) en un groupe hydroxyle,

et des mutants de ces micro-organismes Des exemples de micro-

organismes qui sont utilisables selon la présente invention sont le Streptomyces platensis et Nocardia mediterranei, plus particulièrement Streptomyces platensis IFO 12901 (ATCC 23948 =

13865) et Nocardia mediterranei ATCC 13685 (IFO 13415).

Les souches IFO 12901 et IFO 13415 mentionnées ci-dessus sont inscrites à l'Institute for Fermentation, Osaka, List of Cultures, 1978, 6 ème édition Les souches ATCC 23948 (= 13865) et ATCC 13685 sont inscrites dans l'American Type Culture Collection, Catalogue of Strains I, 14 ème édition, 1980 et

ème édition, 1982.

Les caractéristiques morphologiques du Streptomyces platensis sont décrites dans International Journal of Systematic Bacteriology, vol 18, No 4, p 360 ( 1968) Les caractéristiques morphologiques de Nocardia mediterranei ATCC 13685 sont décrites dans Mycopathologia vol 13, p 321330 ( 1960) La souche ATCC 13685 ci-dessus a d'abord été classée sous le genre Streptomyces mais plus tard, elle a été indiquée comme appartenant au genre Nocardia (voir Archiv fur Mikrobiologie, vol 67, p 147 ( 1969)) Les micro-organismes du genre Streptomyces et Nocardia ont comme trait général d'être labiles dans leurs propriétés caractéristiques Ainsi, leurs mutants peuvent facilement être obtenus par traitement mutagène artificiel tel que l'irradiation par les rayons X, les rayons ultra- violets ou d'autres rayons ou en utilisant des produits mutagènes artificiels (par exemple, N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, éthylène- imine) Une quelconque de ces espèces mutantes peut également être utilisée en effectuant le procédé de la présente invention quand elle est capable de transformer le groupe méthoxy sur la position 17, 18

ou 21 du composé (II) en groupe hydroxyle.

Le milieu de culture du micro-organisme ci-dessus utilise dans la pratique de la présente invention, peut être un milieu liquide ou solide tant qu'il contient des produits nutritifs que la souche peut utiliser, bien qu'un milieu liquide soit préféré, pour le traitement à grande échelle Le milieu doit contenir d'une façon adéquate des sources de carbone et d'azote assimilables ou digestibles par le micro-organisme ci- dessus, des matières minérales, des traces de matières nutritives, etc.

A titre d'exemple desdites sources de carbone, il faut mention-

ner le glucose, lactose, saccharose, maltose, dextrine, amidon, glycérol, mannitol, sorbitol, des graisses et des huiles (par exemple l'huile de soja, l'huile de lard, l'huile de poulet, etc) Les sources d'azote peuvent par exemple être des extraits de viande, extraits de levure, levures séchées, farine de soja, liqueur de macération du mais, peptone, farine de coton, mélasses épuisées,urée,sels d'ammonium (par exemple sulfate d'ammonium, chlorure d'ammonium, nitrate d'ammonium, acétate d'ammonium) et produits similaires Le milieu peut contenir encore des sels de sodium, potassium, calcium, magnésium, etc, des sels de fer, de manganèse, de zinc, de cobalt et de nickel, des phosphates, des borates, etc, et des sels d'acides organiques tels que acétates et propionates En outre, le milieu peut contenir des acides aminés (par exemple les acides glutamique,, aspartique, l'alanine, la lysine, la méthionine, la proline), des peptides (par exemple dipeptides, tripeptides,

etc), des vitamines(par exemple vitamines B 1,B 2, acide nicoti-

nique, vitamine B 12, vitamine C, E), des acides nucléiques (par exemple purines, pyrimidines et leurs dérivés) et produits similaires Dans le but de régler le p H du milieuon peut ajouter un acide minéral ou un acide organique, un produit

alcalin, un produit tampon ou similaire Des quantités appro-

priées d'huiles, de graisses, de tensio-actifs, etc peuvent

aussi être ajoutées au milieu en vue d'empêcher le moussage.

La culture peut être effectuée par un quelconque des procédés stationnaire, à secousses, aérobie immergé et autres procédés de culture Pour des essais de production en grand, la culture aérobie immergée est naturellement préférée Bien que les conditions de culture dépendent naturellement de l'état et de la composition du milieu, du type de souche, du procédé de

culture et d'autres facteurs, il est généralement préféré d'ef-

fectuer l'incubation à environ 20 '-45 QC avec un p H initial presque neutre Il est particulièrement souhaitable d'avoir une température de 24 à 370 C dans le stade intermédiaire de la culture, avec un p H initial de 6,5 à 8,5, la durée nécessaire

d'incubation va normalement d'environ 6 à 100 heures, de pré-

férence d'environ 10 à 48 heures. Lebouillon de culture utilisé selon la présente

invention est celui obtenu par la culture ci-dessus.

La "matière traitée" à utiliser selon la présente invention comprend les cellules microbiennes et les produits de désintégration des cellules contenant la déméthylase qui sont

obtenus à partir du bouillon de culture ci-dessus par des trai-

tements physiques ou chimiques tels que la filtration, la centrifugation, les ultra-sons, le traitement français à la presse (French press), le broyage avec 'l'alumine, le traitement avec l'enzyme lytique et le traitement avec un tensio-actif ou

un solvant organique Cette matière comprend également la dé-

méthylase obtenue par un procédé de purification classique et les cellulesou la déméthylaseimmobilisées par un procédé classique. Le procédé de la présente invention est effectué en mettant en contact le composé de départ (Il) avec le bouillon de culture du micro-organisme ci- dessus,ou avec une matière traitée de ce micro-organisme La concentration du composé de

départ (II) dans le mélange réactionnel est comprise de pré-

férence entre 10 et 1 000,g/nl -La température de la réaction est de préférence d'environ 20 à 50 QC, mieux d'environ 24 à 40 'C, et le p H est compris de préférence entre environ 5 et 10 et

mieux, entre environ 6 et 9 Il est bon d'effectuer la réac-

tion pendant environ 1 à 100 heures, de préférence pendant environ 16 à 72 heures La réaction peut être effectuée à l'état stationnairepar secousses, aéré ou agité, bien que les

secousses, l'état aéré ou agité soient préférés.

Si l'un quelconque des composés (I) seul est le produit de réaction, le composé désiré (I) peut être isolé sous forme cristalline en extrayant simplement le bouillon de culture avec un solvant organique non-miscible avec l'eau, par exemple

avec de l'acétate d'éthyle, puis en concentrant l'extrait.

Cependant, en général, la réaction donne un mélange de composée

(I) Par conséquent, dans un but de purification, il est pré-

férable de transformer les composés 21-O-déméthylmacbécine II, E-5-R et E3-R en les quinones correspondantesf en utilisant un agent d'oxydation avant le procédé de séparation L'agent oxydant comprend ceux des agents oxydants qui sont généralement utilisés pour l'oxydation des hydroquinones en benzoquinones, tels que le chlorure ferrique, le sulfate ferrique et l'oxyde d'argent.

Dans certains cas, selon le taux des composés 21-O-dé-

méthylmacbécine I, E-5 et E-3 et des impuretés, il est préfé-

rable de traiter les produits sous la forme d'hydroquinone 6 & Les composés qui sont sous la forme d'hydroquinone, à savoir les composés 21O-déméthylmacbécine II, E-5-R et E-3-R, peuvent

être obtenus en faisant réagir les composés 21-0-déméthyl-

macbécine I,E-5 ou E-3 avec un agent réducteur utilisé dans la réduction des benzoquinonestel que l'hydrosulfite de sodium.

Les taux de rendement parmi les composés 21-0-déméthyl-

macbécine I, E-5 et E-3 varie en fonction du type de micro-

organisme utilisé etapar conséquent, le procédé approprié pour leur purification peut varier Toutefois, en général, les procédésde purification ordinaires qui sont utilisés pour

séparer les métabolites lipophiles produits par les micro-

organismes sont utilisés;par exemplelextraction avec un solvant organique non-miscible avec l'eaulet l'adsorption par du charbon

actif ou par une résine macroporeuse non-ionique.

Le solvant organique utilisé pour ladite extraction comprend des esters, tels que l'acétate d'éthyle et l'acétate de n-butyle; des alcools tels que l'isobutanol; des hydrocarbures halogénés tels que le chlorure de méthylène, et des cétones

telles que la méthylisobutylcétone.

En particulier, le bouillon de culture est filtré, le filtrat est rendu neutre ou faiblement acide et extrait avec un solvant organique tel que l'acétate d'éthyle>et l'extrait est traité avec un oxydant tel que le chlorure ferrique ou un réducteur tel que l'hydrosulfite de sodium, puis concentré sous pression réduite L'addition d'un solvant non-polaire tel que l'hexane, donne un produit brut Le)ou les,composés désirsl estou sont; isolé(s) du produit brut d'une façon appropriée par la chromatographie d'adsorption utilisant un support tel que le gel de silice ou l'alumine En particulier, leou lesdit)composant)peuttou peuvent/être isolde), par exemple par la chromatographie sur colonne ou en couche mince utilisant le gel de silice avec un solvant mélangé tel

qu'un système acétate d'éthyle-n-hexane ou chloroforme-méthanol.

Les six produits O-déméthylés;qui peuvent être isolés par le procédé cidessus, peuvent être respectivement récupérés sous la forme cristalline à partir de l'acétate d'éthyle, un mélange acétate d'éthyle-n-hexane ou un mélange chlorure de

méthylène-n-hexane par exemple.

Les propriétés physico-chimiques de la 21-0-déméthyl-

macbécine I, C-33196 E-5 et C-33196 E-3;obtenues dans l'exemple 2 décrit plus loin 1 sont indiquées dans le tableau 1 et le

tableau 2 ci-après.

Tableau 1

1 *

21-O /

démdthylmacbecine I Point de fusion > 300 C Spectre de masse (M+) m/z 544 Spectre d'absorption 274 nm ( 440) ultraviolet Me OH 1 397 nm ( 4513) Xmax (Elcm) m ( 3 Spectre d'absorption 1730, 1705, 1655 infra-rouge 1615, 1510, 1095 cm-1 K Br max

Indices R dans la chromato-

graphie e couche mince

(gel de siliee).

( 1) Chloroformen-éthanol ( 9:1) O 63 ( 2) Acétate d'éthyle-n-hexane 0131

( 4:1)

Table'au 2

C-33196 E-5 C-33196 E-3

Point de fusion 115-116 o C,> 3000 C

-H;

lal D(CHC 13) + 28714 + 29010 Spectre de masse (M)/z 544 m/z 544 Analyse élémentaire (%) Formule moléculaire C 29 H 40 N 208 ' C 29 40 N 208

CH 3 COOC 2 H 5

3 25

Calculé C 62164 63195 H 7 t 65 740

N 4143 5114

Trouvé C 62 174 63187

H 7746 7139

N 4134 5133

Tableau 2 (suite)

C-33196 E-5 C-33196 E-3

Spectre d'absorption ultraviolet 274 nm ( 412) 274 nm ( 455) Me OH (E 1 %) 397 nm ( 4110) 397 nm ( 47,5) max lcm Spectre d'absorption 1740, 1705, 1740, 1700, infra-rouge 1670, 1660, 1655, 1610, VK Br 1615, 1510, 1510, 1095 _ 1 max 1095 cm-1 cm

Indice Rfdans la chroma-

tographie en couche mince (gel de silice) ( 1) Chloroforme -methanh 1O 65 O 070

( 9:1)

( 2) Acétate d'éthyle-n 0 23 0136 hexane ( 4:1)

Les caractéristiques physico-chimiquesde 21-O-déméthyl-

macbécine II, C-33196 E-5-R et C-33196 E-3-Rltelles qu'obtenues dans l'exemple 3 >sont indiquées dans le tableau 3 et le tableau

4 ci-après.

Tableau 3

21-O-démethyl-

macbécine II S Fectre de masse (M+) m/z 546 Spectre d'absorption 255 nm ( 278) ultraviolet Me OH (E 1 % 306 nm ( 82) max lcm Spectre d'absorption 1715, 1650, infra-rouge 1595 1530

19, 13,

K Br 1450, 1375, Vmax 1320, 1090, 1035 cm-1

Indices Rf dans la c#roma-

tographie en couche mince (qel de silice) ( 1) Chloroforme-métbanol ( 9:1) 0,29 ( 2) Acétate d'éthvle-n Or 10 hexane

2512819-

Tableau 4

C-33196 E-S-R C-33196 E-3-R

Point de fusion 142-1430 C 224-225 OC 125 Me H 5605160 la D <MQ> + 96 + 57 Spectre de Masse (be) m/z 546 m/z 546 Analyse él&mentaire (% Fonnuleemoléculaire C H NO O C H N'O

294228 294228

H O k CH COOC H

2 2 3 25

Calculé C 61126 63 72

H 7 79 774

N 4 61 51

Trouvé C 61 < 70 63 45

H 7186 7 65

N 4; 65 5,09 q Spectre d'absorption 255 nm, ( 288) 255 nm ( 273) ultraviolet 306 nm ( 72) 306 nm ( 80) X Me OH (E 1 % max 1 cm, Spectre cl 'absorption 1715, 1640, * 1720, 1650,

infra-roucie 1595, 1530, 1630, 1605,.

KR Br 1460, 1380, 1540, 1460, Vmax 1320, 1085, 11390, 1336, 1035 cm-1 1320, 1200, cm Indices R, dans la chromai toaraphie-'en couche mince (gel de silice) < 1) Chloroformne-méthanol

( 9:1) O 45 0 49

( 2) Acétate d'éthyle-n-

hexane < 4:1) 0 T 1 l O 19 Pour chacun des composés 21-0déméthylmacbécine I, E-5 et E-3, la valeur M+ est trouvée à m/z 544 dans le spectre de masse Ainsi, les composés sont des isomères ayant la même formule moléculaire C 29 H 40 N 208, qui est la formule moléculaire pour le composé de départ (II), C 30 H 42 N 208, avec un groupe CH 2 en moins Dans le spectre RMN H, les signaux pour les trois groupes OCH 3 sont trouvés pour le composé (II), tandis que deux groupes OCH 3 sont seulement trouvés pour chacun des composés 21-0-déméthylmacbécine I, E-5 et E-3 Par conséquent, ces

derniers composés sont regardés comme des produits O-déméthylés.

Les trois produits déméthylés, c'est-à-dire la 21-0-déméthyl-

macbécine I, le E-5 et le E-3 sont différents dans le déplacement chimique dû au groupe OCH 3 déméthylé Leursstructures sont respectivement identifiées par un essai fin de découplage de spin et il en a été conclu que la 21-0-déméthylmacbécine I est un produit de déméthylation sur la position 21, le E-5 est un produit de déméthylation sur la position 18,et le E-3 est un

produit de déméthylation sur la position 17.

Le composé benzoquinone obtenu (notamment la 21-0-

déméthylmacbécine I, le E-5 ou le E-3) et le composé hydro-

quinone (notamment la 21-0-déméthylmacbécine II, le E-5-R ou le

E-3-R) sont convertibles les uns dans les autres.

La conversion de la forme benzoquinone en la forme hydroquinone peut être effectuée par un procédé classique de réduction des benzoquinones Ainsi, par exemple, l'agent réducteur peut être l'hydrosulfite de sodium, le bisulfite de sodium, le borohydrure de sodium ou produits analoguesjet le

solvant peut être un quelconque des solvants inertes par rap-

port à la réaction ci-dessustels que des esters (par exemple acetate d'éthyle), des alcools (par exemple méthanol, étha 4 gl) et l'eau et des mélanges de ces solvants En outre, un système binaire, constitué par de l'eau et un solvant organique non-miscible avec l'eau 1 peut aussi être utilisé avantageusement La réaction est effectuée généralement à une température d'environ 0-40 C, normalement à la température ordinaire;et est complète en environ 30 secondes à 24 heures selon la température de la réaction. Pour la conversion de la forme hydroquinone en la forme benzoquinone, une quelconque méthode classique utilisée pour l'oxydation des hydroquinones est utilisable Ainsi, par exemple, l'oxydant comprend le chlorure ferrique, le sulfate ferrique, l'oxyde d'argent et produit similaire, et le solvant peut être un quelconque des solvants qui n'interfère pas avec la réaction, par exemple un ester (par exemple l'acétate d'éthyle) une cétone(par exnemple acétate)eau ou un mélange de ces solvants Un système binaire de solvants)constitué par de l'eau et un solvant organique non-miscible avec l'eau peut aussi être utilisé favorablement. La température de réaction n'est pas critique et la

réaction est effectuée généralement à environ 0-40 C, de pré-

férence à la température ordinaire Selon la température réaction-

nelle, la réaction est facilement terminée, généralement à

environ 30 secondes -à 24 heures.

Les dérivés de macbécine ainsi obtenus, c'est-à-dire les composés (I), ont des activités antibactériennes, antifongiques

et antiprotozoaires et ont une activité antimitotique attendue.

En outre, ils peuvent être utilisés comme matière de départ

pour la synthèse de dérivés utiles.

Chacun des produits E-5, E-5-R, E-3 et E-3-R inhibe le Staphylococcus aureus et le Bacillus subtilis, la MIC étant de -100 mcg/ml Par conséquent, ils sont utilisables comme agents antibactériens En ce qui concerne la toxicité aigie, la valeur LD 50 pour le E-5-R par exemple, est de 100 à 200 mg/kg (souris, ip) indique une faible toxicité dudit composé Les composés (I)

sont supposés avoir une faible toxicité.

Les composés (I) de la présente invention peuvent être utilisés comme désinfectants sous la forme de solutionsaqueuse 5 contenant de l'éthanol (par exemple 5 % (v/v) d'éthanol) et qui contiennent les composés (I) à une concentration de 10 à 100 ug/ml Ces solutions peuvent être utilisées pour désinfecter les cages aoiseaux, les niches de chiens, les écuries, les appareils et matériels expérimentaux, etc. Le micro-organisme à utiliser pour effectuer la produc-

tion de E-3, E-3-R, E-4, E-4-R, E-5, E-5-R, E-6, E-6-R, E-7 et/ou E-7-R, (ces composés désignés collectivement par "Antibiotiques C-33196 E-3 à E7-R") peuvent être un quelconque des micro-organismes appartenant au genre Actinosynnema et capable de produire ledit;ou lesdits antibiotique(s) Un exemple type est la souche Actinosynnema sp No C-33196 (désignée par la suite également par"souche C-33196 "). Les caractéristiques taxonomiques de la souche C-33196 sont examinées par des procédés analogues à ceux de Shirling et Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology, vol 16, pp 313-340 ( 1966 i Les résultats des observations à 28 C pendant 21 jours sont les suivants: 1) Caractéristiques morphologiques Le mycelium végétatif qui est incolore à jaune pâle ou jaune orangé s'étend bien et se développe en branchesà la fois sur un milieu d'agar et dans les milieux liquides Les hyphes mesurent le plus souvent 0,5 à 1,2 micron de diamètre etau dernier stade d'incubation, se fragmentent en éléments bacillaires ou bacillaires allongés ou en longueurscourte 5 ramifiéesdes hyphes La souche donne un bon développement sur les divers milieux taxonomiques avec la croissance du mycelium aérien sur le mycelium végétatif Dans un grand nombre de cas, les mycelia aériens apparaissent comme s'ils s'étaient développés

sur un grand nombre de coremia ( 50 à 180 pm x 400 à 1 500 /m).

Un grand nombre d'hyphes aériens sont flexueux ou droits, mais certains apparaissent être faiblement en spirale mais dans des cas rares L'examen au microscope des cultures vieillies révèle

que dans certains cas réels, les spores se produisent apparem-

ment en chaine%, un peu de ce qu'on appelle conidia ou spore existant ici Si on examine sous un microscope un échantillon de la suspension cellulaire prélevé à la surface d'une telle culture, on remarque la présence d'un grand nombre de cellules ellipsoidales allongées ( 0,5 à 1, 2 m x 4,8 à 6,8 pm) et de cellules ellipsoldales ( 0,8 à 1,2 pm x 1,5 à 4 pm) qui se présentent comme des cellules fragmentées ou arthrospores,dont

la surface est lisse quand on les examine au microscope élec-

tronique Le mycelium aérien est généralement dispersé et bien qu'il se développe correctement sur un grand nombre de milieux pendant 3 à 7 jours d'incubation, il disparaît quelquefois

lorsque la culture est effectuée pendant plus de 10 jours.

Quand les mycelia aériens vieillis sont plongés dans un milieu liquide, des cellules vivantes se libèrent après 15 à minutes L'examen au microscope électronique de ces cellules vivantes révèle de longues flagelles péritriches autour des cellules Quand elle est cultivée dans des milieux liquides, la souche dans les dernières phases de l'incubation, forme quelquefois des hyphes polymorphes fragmentés dont quelques-uns

sont vivants.

2) Constituants des cellules La souche est cultivée par la méthode de secousses dans un milieu ISP No l modifié à 280 C pendant 66 à 99 heures et, dans

la phase stationnaire bien développée, les cellules sont recueil-

* lies et rincées Par la méthode de B Becker et al (Applied Microbiology, vol 12, p 421 ( 1964)) et la méthode de M B. Lechevalier (Journal of Laboratory and Clinical Medicine, vol. 71, p 934 ( 1968)), les cellules ci-dessus sont examinées pour leur composition en acide diaminopimellique et en sucres L'acide est trouvé être de la forme meso et quand auxsucre$> une tache correspondant au galactose est observée Un échantillon des parois des cellules est préparé par la méthode de B Becker et al (Applied Microbiology, vol 13, p 236 ( 1965)) et analysé pour déterminer l'acide diaminopimellique, les sucres et les acides aminés En ce qui concerne l'acide diaminopimellique, la forme meso est décelée En ce qui concerne les sucres, on

trouve une grande quantité de lactose mais pas d'arabinose.

Quand aux acides aminés, on trouve nettement l'acide glutamique et l'alanine tandis que la lysine et la glycine ne peuvent se trouver qu'en traces Ainsi, la souche appartient au type III

dans la classification type-paroi cellulaire.

3) Caractéristiques de la culture sur les milieux taxonffiques La souche donne une croissance relativement bonne d'une façon invariable sur divers milieuxet la couleur du mycelium végétatif va de l'incolore au jaune pâle dans les premières phases de l'incubation, mais elle est brun jaunâtre clair à brun jaunâtre dansles derniers stades L'organisme ne produit pas de pigment soluble dans la plupart des milieux taxonomiques Le mycelium aérien est poudreuxil se développe généralement à un degré modéré, et a unecouleur blanche à jaune ou brun jaunâtre clair Le mycelium aérien disparaît sur un grand nombre de milieux en prolongeant la culture (environ deux semaines ou davantage), la surface du mycelium végétatif commençant à devenir brillante Les caractéristiques de la culture de cette souche particulière sur divers milieux taxonomiques sont

résumées dans le tableau 5 ci-dessous.

Tableau 5

Propriétés des cultures de la souche n C-33196 sur milieux taxonomiques (A) Sucrose-nitrate-agar Développement (G): modéré, mince, ivoire clair( 2 ca Mycélium aérien (AM): peu développé, blanc Pigment soluble (SP): aucun (B) Glycérol-nitrate-agar G: modéré, ivoire clair ( 2 ca)* AM: peu développé, blanc SP: aucun (C) Glucose-asparagine-agar G: modéré, jaune ( 3 ga); corpuscules formés semblable au coremium AM: peu développé, jaune melon clair ( 3 ea) SP: aucun (D) Glycérol-aspargine-agar G: modéré, ivoireclair ( 2 ca); corpuscules formés semblables au coremium AM: peu développé, blanc à ivoire clair ( 2 ca) SP: aucun (E) Agar nutritif G: abondant, jaune brillant ( 2 ea) AM: aucun SP: aucun (F) Malate de calcium-agar G: peu développé, ivoire clair ( 2 ca)* AM: peu développé, blanc SP: aucun (G) Extrait de levure-extrait de malt-agar G: abondant, jaune brillant ( 3,a) AM: peu développé, blanc SP: aucun (H) Flocon d'avoine-agar G: modéré, blé clair ( 2 ca)* ( 3 na); corpuscules formés semblables au coremium AM: peu développé, blanc SP: aucun (I) Sel minéralamidon-agar G: modéré, ivoire clair ( 2 ca) à jaune melon clair ( 3 ea) AM: peu développé, blé clair ( 2 ea) SP: aucun (J) Peptone-extrait de levure-fer-agar G: modéré, jaune brillant ( 3 a)* AM: aucun SP: aucun (K) Tyrosine agar G: modéré, jaune brillant ( 31 a) AM: peu développé, blanc SP: aucun Code de couleurs selon le Color Harmony Manual, 4 ème édition

(Container Corporation of America, 1958).

4) Caractères physiologiques Les caractères physiologiques de la souche sont indiqués dans le tableau 6 La gamme de température pour le développement

va de 12 C à 35 C La gamme de température dans laquelle un bon.

développement aérien apparalt sur l'agar (ISP n 2) est de 16 à

320 C.

Tableau 6

Caractères physiologiques de la souche n C-33196 Gamme de températures pour le développement 12 C 35 C il pour le développement aérien 16 C 32 C Liquéfaction de la gélatine positive Hydrolyse de l'amidon positive Réduction des nitrates positive Peptonisation du lait positive Coagulation du lait négative Décomposition de la caséine positive Production de pigments mélanoides négative Décomposition de la tyrosine positive Décomposition de la xanthine négative Décomposition de l'hypoxanthine négative Tolérance à la lysozyme positive Tolérance au chlorure de sodium 2 % 5) Utilisation de diverses sources de carbone

L'utilisation de diverses sources de carbone est recher-

chée en utilisant un milieu de base contenant:asparagine O,05 %, phosphate dipotassique 0,05 %, sulfate de magnésium 0,02 %,

sulfage ferreux 0,001 %, sulfate d'ammonium 0,1 % et agar 2 %.

Les résultats obtenus sont montrés sur le tableau 7.

Tableau 7

Utilisation des sources de carbone par la souche n C-33196 Source de carbone D-xylose L-arabinose D-glucose D-galactose D-fructose L-rhamnose D-mannose Saccharose Lactose Maltose Tréhalose

Dévelop-

pement ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ Source de carbone Raffinose Mélibiose iinositol D-sorbitol D-mannitol Glycérol Amidon soluble Témoin

Dévelop-

pement ++ ++ + + ++ + ++ + + ++ Note: ++ Développement abondant + Développement modéré + Faible développement 6) Autres caractéristiques

Les cellules sont récoltées par le procédé décrit pré-

cédemment en 2),et le DNA est préparé par un procédé analogue à celui de J Marmur et col lJournal of Molecular Biology, Vol 3, 208, 19613 La teneur G-C (Guanine-cytosine) du DNA

atteint environ 72 % en mole.

L'essai de coloration Gram du mycélium végétatif de

cette souche donne une réaction positive.

Les caractéristiques ci-dessus de la souche n C-33196

sont comparées avec la description de S A Waksman's "The

Actinomycetes" Vol 2 lThe Williams et Wilkins Co, 1961); R E Buchanan et N E Gibbons, (ed)"Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 ème éd, 1974 "; et autres références bibliographiques. Les observations cidessus,à savoir 1) que la souche dans les dernières phases de la propagation végétative forme des hyphes polymorphes fragmentés dont la motilité de certains est observée, 2) que les cellules vivantes péritriches se forment à partir des hyphes aériens développés, 3) que les hyphes aériens forment des coremia ou des synnemata sur certains des milieux d'agar et 4) que la souche appartient au type III de paroi cellulaire /coupléesavec d'autres caractéristiques,indiquent

clairement que la souche appartient au genre Actinosynnema.

Par conséquent, les auteurs de la présente invention ont

désigné cette souche par Actinosynnema sp No C-33196.

Le genre Actinosynnema est un genre de l'ordre des Actinomycetales et les caractéristiques bactériennes de ceux-ci sont indiquées par Haseawa et al dans International Journal of Systematic Bacteriology, vol 28, pp 304-310 ( 1978) et sont

décrites dans le même journal, vol 30, p 245 ( 1980).

La souche C-33196 a été déposée le 11 août 1981 à l'Institute for Fermentation, Osaka, Japon (IFO) sous le numéro matricule IFO 14127, et elle a été déposée le 26 août 1981,au Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japon (FRI) sous le numéro matricule FERM P-6138, le dépôt étant transformé en un dépôt dans le Budapest Treaty,

et a été stocké au FRI sous le numéro matricule FERM BP-166.

Généralement, les micro-organismes du genre Actinosynnema ont des propriétés variables et peuvent subir des mutations spontanées ou sous l'influence de produits mutagènes Par exemple, la plupart des souches mutantes que l'on peut obtenir par irradiation avec les rayons X, les rayons gamma et les rayons ultra-violets, etc, par isolation des spores, par culture sur des milieux contenant divers produits chimiques ou par d'autres moyens engendrant la mutation, ainsi que les mutants obtenus spontanément à partir de la souche ne devraient pas être considérés comme représentant une quelconque autre

espèce distincte en comparaison avec les propriétés bactério-

logiques précitées, mais un quelconque de ces mutants et variants s'il est capable d'élaborer lesdits antibiotiques, peut invariablement être utilisé dans les applications de la présente

invention A titre d'exemple, les divers traitements engen-

drant la mutation d'une souche, capable d'élaborer lesdits antibiotiques, peuvent donner des mutants qui produisent des pigments solubles dont la couleur va du jaune clair au brun jaunâtre clair ou au brun, des mutants qui donnent des mycelia végétatifs incolores, des mutants qui donnent des mycelia végétatifs brun rougeâtre à rouge orangé, des mutants qui produisent des mycelia végétatifs vert jaunâtre ou des pigments solubles, des mutants qui donnent des mycelia aériens blancs abondants, et des mutants dont les mycelia sont aptes à se fragmenter. Le milieu à utiliser dans la culture d'un micro-organisme capable d'élaborer lesdits antibiotiques peut être sous forme liquide ou sous forme solide à condition qu'il contienne les produits nutritifs utilisables par ce microorganisme, bien qu'un milieu liquide soit préféré pour des opérations à grande échelle Une formule convenable du milieu contient des sources de carbone et d'azote qui peuvent être assimilées et digérées par le microorganisme pouvant élaborer lesdits anti Piotiques,

des matières minérales et des traces de matières nutritives.

Des exemples de la source de carbone sont le glucose, lactose, saccharose, maltose, dextrine, amidon, glycérol, mannitol, sorbitol, des graisses et des huiles (par exemple l'huile de

soja, l'huile de lard, l'huile de pouletset la n-paraffine.

Les sources d'azote peuvent par exemple être l'extrait de viande l'extrait de levure, la levure séchée, la farine de soja, la liqueur de macération du mais, la peptone, la farine de coton, les mélasses épuisées, l'uréeet des sels d'ammonium (par exemple sulfate d'ammonium, chlorure d'ammonium, nitrate d'ammonium, acétate d'ammonium) Le milieu peut contenir encore z des sels de sodium, potassium, calcium, magnésium, etc, des sels de fer, de manganèse, de zinc, de cobalt, de nickel, et d'autres sels métalliques, des phosphates, des borates, etc,

et des sels d'acides organiques tels que acétates et propionates.

En outre, le milieu peut contenir des acides aminés (par exemple les acides glutamique, aspartique, l'alanine, la lysine, la méthionine, la proline), des peptides (par exemple dipeptides, tripeptides), des vitamines (par exemple vitamines Bl, B 2, acide nicotinique, vitamine B 12, vitamine C), des acides nucléiques (par exemple purine, pyrimidine et leurs dérivés), etc Dans le but de régler le p H du milieu, on peut ajouter un acide minéral ou un acide organique, un produit alcalin ou un produit tampon ou similaire; des quantités appropriées d'huile ou de graisse, d'un tensio-actif ou similaire, peuvent aussi être ajoutées en vue d'empêcher le moussage. La culture peut être effectuée par un quelconque des procédés stationnaire, à secousses, aérobie immergé 1 et autres procédés de culture Pour des essais de production en gros volume, la culture dite "aérobie immergée est naturellement préférée Bien que les conditions de la culture dépendent naturellement des états et de la composition du milieu, du type de la souche, du procédé de culture et d'autres facteurs, il est

normalement préférable d'effectuer l'incubation à environ 20 -

320 C avec un p H initial presque neutre Il est particulièrement souhaitable d'avoir une température de 25 à 28 QC dans un stade

intermédiaire de la culture, avec un p H initial de 6,5 à 7,5.

Bien que la durée d'incubation dépende des mêmes facteurs

mentionnés ci-dessus, il est avantageux de poursuivre l'incu-

bation jusqu'à ce que le titre de l'antibiotique désiré soit maximum Dans le cas o on utilise la culture par secousses ou la culture aérobie immergéedans un milieu fluide, la durée

nécessaire va normalement d'environ 48 à 96 heures.

Lesdits antibiotiques obtenus dans le bouillon de culture peuvent être récupérés par un procédé choisi d'une

façon appropriée en utilisant les procédés classiques d'iso-

lation et de purification desmétabolite 5 produits par les microorganismes, puisque lesdits antibiotiques sont neutres et liposolubles Par exemple, le moyen utilisant la différence de solubilité des impuretés, la chromatographie par adsorption utilisant un grand nombre d'adsorbants tels que le charbon actif, les résines macroporeuses non-ioniques, le gel de silice et l'alumine, et d'autres moyens sont utilisés seuls ou en combinaison. Bien que lesdits antibiotiques apparaissent d'abord dans le filtrat du bouillon de culture, ils peuvent être extraits également des cellules si nécessaire Pour l'extraction des cellules microbiennes, un solvant organique miscible avec l'eau, tel qu'un alcool inférieur lpar exemple méthanol, éthanols, ou une cétone (par exemple acétone iméthyléthylcétone)ou un

mélange de ces solvants avec l'eau peut être utilisé L'ex-

traction peut aussi être effectuée avec un solvant organique non-miscible avec l'eau, tel que l'acétate d'éthyle ou un ester semblable En outre, les antibiotiques peuvent être extraits en ajoutant un solvant organique miscible avec l'eautel que le

méthanol ou l'acétone à la totalité du bouillon de culture.

Pour récupérer lesdits antibiotiques à partir du filtrat du bouillon de culture, on peut utiliser des solvants organiques non-miscibles avec Veautels que des esters d'acide aliphatique (par exemple l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle), des alcools (par exemple butanol), des hydrocarbures halogénés

(par exemple chloroforme) et des cétones( par exemple méthyl-

isobutylcétone) Lesdits antibiotiques peuvent être obtenus à l'état brut en lavant l'extrait avec de l'eau, en concentrant

cet extrait et en ajoutant du n-hexane ou produit similaire.

Dans le cas o un desdits antibiotiques est le constituant principal, c'est-à-dire contenu en une quantité plus grande, il peut quelquefois être isolé sous la forme cristalline par un procédé simple d'extraction avec un solvant organique, puis

par concentration.

Lesdits antibiotiques peuvent également être récupérés du bouillon de culture par adsorption sur une résine macroporeuse non-ionique telle que la "Diaion HP-10 " (Mitsubishi Chemical Industries, Japon) suivie d'une élution avec un alcool ou une

cétone aqueux ou produit similaire.

Quand le produit brut obtenu de la façon ci-dessus à partir du bouillon deculture au moyen des stades d'extraction, de concentration, etc est un mélange desdits antibiotiques, diverses techniques de chromatographie par adsorption peuvent être utilisées pour séparer les constituants L'adsorbant peut être un support classique tel que gel de silice, alumine, ou une résine adsorbante ou bien des supports à phase inversée

tels que le"Micro Bondapak C 18 " (Waters Associates Inc USA).

Si l'adsorbant est le gel de silice, le développement est généralement effectué avec une combinaison d'un solvant organique polaire et d'un solvant organique non-polaire, par exemple un mélange de solvantsconstitué par de l'acétate d'éthyle et du n-hexane;ou par du méthanol et du chloroformelpour séparer les constituants les uns des autres Par exemple, les constituants peuyent être séparés en effectuant d'abord le développement avec un solvant non-polaire et en effectuant l'élution tout en

augmentant par paliers, la proportion du solvant polaire.

Dans le cas o le produit pulvérulent brut est un mélange de plusieurs constituants et/ou contient des impuretés en quantité relativement importante, les constituants respectifs peuvent être séparés les uns des autres en répétant la chromatographie avec diverses combinaisons de solvantrorganiquer,

Lesdits antibiotiques comprennent la forme benzoquinone-

et la forme hydroquinone qui sont convertibles l'une dans l'autre.

Par conséquent, en vue de la purification, il est avantageux de réduire le nombre de constituants à la moitié en transformant la forme hydroquinone en la forme benzoquinoneou bien la forme benzoquinone en ia forme hydroquinone;par oxydation ou par

réductionrespectivement.

L'oxydation peut être effectuée par un procédé géné-

ralement utilisé pour l'oxydation des hydroquinones Ainsi, l'agent oxydant est par exemple le chlorure ferrique, le sulfate ferrique, le ferricyarure de potassium ou l'oxyde d'argent)et le solvant peut être un quelconque des solvants inertes vis-à-vi E de la réaction, par exemple un ester tel que l'acétate d'éthyle, une cétone telle que l'acétone, l'eau ou un mélange de ces solvants En outre, un système binaire constitué par de l'eau et un solvant organique non-miscible avec 1 ' eau, peut aussi être avantageusement utilisé La température réactionnelle n'est pas critiquemais la réaction est généralement effectuée à environ 0-40 'C, de préférence à la température ordinaire 1 et parvient facilement à la fin, généralement enenviron 30 secondes à 24

heures selon la température réactionnelle.

La réduction est effecutée d'une façon classique pour la réduction des benzoquinones Ainsi, l'agent réducteur comprend

l'hydrosulfite de sodium, le bisulfite de sodium et le boro-

hydrure de sodium 1 et le solvant comprend un quelconque des solvants inertes vis-à-vis de la réactiontels que des esters (par exemple acétate d'éthyle), des alcools (par exemple méthanol, éthanol), l'eau et des solvants mélangés composés de ces solvants En outre, un système binaire constitué par l'eau et un solvant organique non-miscible avec l'eau peut aussi être avantageusement utilisé La réaction est effectuée généralement à une température d'environ 0-400 C, de préférence à la température ordinaireiet la réaction parvient facilement à la fin en environ

30 secondes à 24 heures selon la température réactionnelle.

Dans la réalisation de la chromatographie sur gel de silice, les antibiotiques sont purifiés généralement sous la forme benzoquinone Dans quelques cas, toutefois, la forme hydroquinone est mieux appropriée pour la purification Par conséquent, les constituants doivent être séparés en choisissant d'une façon appropriée, soit le procédé d'oxydation, soit le procédé de réduction en tenant compte des impuretés dans le

mélange et de leur taux.

Les constituants ainsi obtenus peuvent être cristallisés dans un solvant approprié tel que l'acétate d'éthyle, le

méthanol, le chlorure de méthylène ou un mélange méthanol-eau.

Les caractéristiques physico-chimiques de i' antibiotiulc-

C-33196 E-4 et de l'antibiotique C-33196 E-4-R;qui contiennent une molécule d'acétate d'éthyle comme solvant de cristallisation, tel qu'obtenusdans l'exemple 8 et l'exemple 6 qui seront

mentionnés plus loin, sont indiquées dans le tableau 8 ci-dessous.

Tableau 8

Antibiotique Antibiotique

C-33196 E-4 C-33196 E-4-R

Point de fusion 209 210 C 224 225 C Aspect Cristaux jaunes Cristaux incolores a 25 + 538 32 D -(c= 05, CHC 13) (c= 05, Me OH) Analyse C: 62 94 61 34 élémentaire (%) H: 7 63 8116

N: 5 24 4766

pectre de Spectre ce+ m/z 532 m/z 534 masse (M) Formule moléculaire C 28 H 4 N 208 C H 28 42 N 2 prévue 284028 284228

CH 3 COOC 2 H 5

Spectre d'absorption ultraviolet 276 nm ( 272) 307 nn ( 75) Me OH 1 % Max (Elcm) 390 nm ( 3315) Spectre d'absorption 1735,1700,1670 1720,1670,1630, infra-rouge 1650,1625,1605 1600,1535,1465, JBr 1500,1380,1305 1380,1325, 1045 1 Vmax 1290,1210,1050 cm Vmaxcm Solubilité Faiblement soluble éther de pétrole, éther de pétrole,

dans hexane, eau hexane, diéthyl-

ether, chloroform e

acétate d' éthyle.

Antibioti que Antibiotique

C-33196 E-4 C-33196 E-4-R

Solubilité l

Soluble dans Chloroforme, Methanol.

chlorure de méthylène

toluene, diéthyl-

éther. Très soluble dans Acetone acétate Dimethyl

d'éthyle,méthanol, sulfoxyde.

dimlthyl -

sulfoxyde. Réactions oolorées Essai avec le perman Réaction de Barton,

Positive ganate de potassiumEssai avec le perman-

ganate de potassium (décoloration) (decoloration). Negative Ninhydrine, Ninhydrine,

Ehrlich, Ehrlich.

Barton. Chromatographie en couche mince (TLC) (Rf)

Chloroforme-

mithanol ( 9:1) 0752 0127

Acétate d'éthyle -n-

Àhexane ( 4:1) O 27 O 012 Itr N O utr Acidité, neutralité, ou basicité Neutre Neutre Les propriétés physico-chimiques des antibiotiques C-33196 E-6 et E-6-R tels qu'obtenus dans l'exemple 11 et celles des antibiotiques C-33196 E-7 et E-7-R tels qu'obtenus dans l'exemple 10 sont indiquées dans le tableau 9 et le tableau 10, respectivement.

Tableau 9 -

C-33196 E-6 C-33196 E-6-R

Point de fusion > 3000 C 176-1770 C Couleur jaune incolore

24 8

lul 24 + 258 t 80 C + 37,80 (c= 015, CHC 13) (c= 015, Me OH) Analyse élémentair t%)

C 6349 6135:

H 7728 7 r 52 N 5 r 27 5 07 Spectre de masse m/z 530 (M) m/z 532 (M) Spectre d'absorption ultraviolet Me OH 1 % 273 nm ( 454) 255 nm ( 337) max (=lcm> 397 nm ( 50; 3) 307 nm ( 91) Spectre d'absorption infrarouge 1720,1705,1670, 1720,1650,16 D 0, (pics principaux) 1650,1610,1505, 1535, 1460,1380, K Br 1380,1325,1265, 1320,1090,1040, V Max 1210,1090,1040 1010 -cm 1 max -1 cm -1 cm Solubilité Difficilement soluble Soluble Très soluble éther de pétrole,

n-hexane, eau.

diéthyléther,

acetate d 'éthyle.

chloroforme méthanol,a 'tone,

dimethyl-

sulfoxyde éther de pétrole,

n-hexane, diéthyl-

e'ther, eau.

acétate d'éthyle.

dimethyl-

sulfoxyde, méthanol.

C-33196 E-6

C-33196 E-6-R

Réaction colorée Décoloration du Réaction de Positive réactif Barton, permanganate de décoloration du

potassium réactif parmanga-

nate de potassium.

Negative Ninhydrine, Ninhydrine, réactions de réactions de Ehrlich, Ehrlich, de Barton,de Greig de Greig Leaback Leaback Indices f dans la chromatographie en couche mince

chloroforme-

méthanol ( 9:1) O 41 O T 22 Acétate d'éthyle-n nexane ( 4:1) 0,14 0106 Acide, neutre ou neutre neutre basique

Tableau 10

C-33196 E-7

C-33196 E-7-R

Point de fusion 158-1590 C 205-2060 C Couleur jaune incolore a D 24 + 37, 4 o + 18 > 6 o (c= 015,CHC 13) (c= 0,5, Me OH) Analyse élémentaire C 62 t 45 61 t 36 H 7 r 16 7 r 36 N 5 t O Ol 4 r 97 Spectre de masse m/z 530 (M) m/z 532 (M) Spectre d'absorption ultraviolet 274 nm ( 502) 250 nm ( 305) 396 nm ( 59/8) 315 nm ( 68) Spectre d'absorption infrarouge, 1725,1670, 1650, 1710,1640,1600,

1605,1500,1380, 1485,1455,1380,

(pics principaux) 1325,1260,1205, 1310,1250,1090, K Br Àmax 1150,1095, 1035 1040 -1 cm cm Solubilité Difficilement soluble éther de pétrole, éther de pétrole,

n-hexane, eau n-hexane, di-

éthyléther,eau.

Soluble diéthyléther, acétate d'éthyle.

acétate d'éthyl

Très soluble chloroforme diméthyl-

méthanol, sulfoxyde,

acdtone, di méthanol.

méthylsulfoxyde. T Réaction colorée Décoloration du Réaction de Barton, Positive réactif perman Décoloration du

ganate de potassium réactif perman-

ganate de potassium Negative Ninhydrine, Ninhydrine, réactions de réactions de Ehrlich, de Barton, Ehrlich, de Barton, de Greig Leaback de Greig Leaback Indices Rf dans la chromatographie en couche mince

chloroform e-

methanol ( 9:1) 0165 O r 18

Acétate d'éthyle n-

hexane ( 4:1) r 65 006 Acide, neutre ou neutre neutre basique Le spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) est

indiqué dans le tableau 11.

Tableau ll

Spectre RMN 1 H (deutério-acétone) ( 90 M 4 Hz)

-E-6 E -7

c S(ppm) 0187 ( 3 H,d) 0 75 ( 3 H,d) 0 i 97 ( 3 Hd) 1 17 ( 3 H 1,d > i 03 ( 3 H,d) 1 25 ( 3 H,d > 1163 ( 3 H,bs) 1 70 ( 3 H,bs) 1 i 94 ( 3 H,bs) 1 98 < 3 H,bs) 3 29 ( 3 H,s) 3 31 ( 3 H,s) 4 81 < 1 H,m) 4163 ( 1 H,m) 30 (l Hbs) 4 i 98 (l H,bs) î 66 (l H,t) 5162 (l H,bd) 5182 < 2 H,bs) 5 t 75 < 2 H,bs) 85 (l H,d) 5 83 (l H,t 6 31 ( 1 H,t) 6 38 ( 1 H,t) 6 63 (l H,dd) 6 t 68 ( 1 H,t) 7 20 (l H,bd) 7 20 (l H,bd) 7 î 23 (l H,d) 7 t 27,( 1 H, d) 8194 (l H,s) 8173 ( 1 H,s) Note: s: singlet, t: doublet, t: triplet, multiplet, b: large

En se basant sur les propriétés physico-chimiques ci-

dessus,et les résultats du spectre RMN, on suppose que les antibiotiquesde la présente invention, notamment les C-33196 E-6, E-6-R, E-7 et E-7-R, ont la formule générale suivante:

CH 3 CH 3 CH 3

Rio y 1 H 2 NOCO X OR 2

I

CH 3 O CH 3

R 30 X / NH

dans laquelle R 1, R 2, R 3 et X ont les définitions données plus haut On suppose également que dans E-6 et E-7, X est: O et, dans E-6-R et E-7-R, X est: OH Comme on peut le voir ci-dessus, les antibiotiques de la présente invention, c'est-à-dire les C-33196 E-6, E-6-R, E-7 et E-7-R, sont probablement de nouveaux composés si l'on en juge d'après leurs propriétés physico-chimiques, leur spectre RMN et

leurs formules structurelles.

En ce qui concerne le mélange contenant au moins deux de ces antibiotiques C-33196 E-3 à E-7-R, la proportion entre eux ou parmi les composants constituant ledit mélange n'est pas critique, maispar exemplejla quantité d'un composant dans chacul

des mélanges n'est pas inférieure à environ 5 %.

Les antibiotiques C-33196 E-3 à E-7-R ont des activités antibactériennes, antifongiques et antiprotozoaires Puisqu'ils manifestent des effets cytocides contre les cellules tumorales, on s'attend à ce qu'ils aient une activité antimitotique En outre, ils peuvent être utilisés comme matièresde départ dans la

synthèse de dérivés utiles.

Les antibiotiques C-33196 E-3 à E-7-R, dont la MIC contre le Staphylococcus aureus et le Bacillus subtilis va de 50 à 100 pg/ml, sont presque comparables dans l'activité

antibactérienne contre lesdites espècesauk Macbecinej I et II.

Dans l'essai par le procédé de dilution du bouillon, E-6 et E-7 empêchent la croissance du Tetrahymena pyriformis W à 10 pg/ml et 40/ig/mlrespectivement Par conséquent, les antibiotiques

C-33196 E-3 à E-7-R peuvent être utilisés comme agents anti-

bactériens et antiprotozoaires.

En ce qui concerne la toxicité aig Ue, la LD 50 de E-5-R

par exemple, est de 100 à 200 mg/kg (souris, voie intrapéri-

tonéale), indiquant que sa toxicité est plus faible comparée à celle des Macbécines 1 et II L'antibiotique C-33196 E-7-R a une faible toxicité comme le montrent les résultats des toxicités aigiiesc'est-à-direune LD 50 intrapéritonéale chez les souris au moins supérieures 400 mg/kg Par conséquent, on suppose que les antibiotiques C-33196 E-3 à E-7-R ont une

faible toxicité aig e.

Les antibiotiques C-33196 E-3 à E-7-R peuvent être utilisés comme désinfectants pour les cages d'oiseaux, les appareils et le matériel expérimenta, les écuries, les étables, etc, par exemple sous la forme de solutionsà 10-100 pg/ml dans de l'eau contenant de l'éthanol La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ciaprès dans lesquels, sauf indication contraire, les pourcentages sont exprimés en poids/ volume. Exemple 1 Un milieu (p H 7,2) contenant 1 % de dextrine, 1 % de glucose, 1 % de glycérol, 0,5 % de peptone, 0,5 % d'extrait de levure, 0,5 % d'extrait de viande, 0,3 % de chlorure de sodiumet 0,5 % de carbonate de calcium précité, estensemencé avec le Streptomyces platensis IFO 12901, et on effectue la culture par secousses à 28 C pendant 17 heures La Macbécine I ( 1,9 g) est ajoutée à 20 litres dubouillon de culture obtenu et la réaction est effectuée à 28 C,tout en secouant,pendant 24 heures Le bouillon de culture après la réaction, a un taux de Macbecine I qui a diminué et contient des produits O-déméthylés, comme le

montre la chromatographie en couche mince (TLC).

Exemple 2 Ie filtrat obtenu par filtration de 20 litres du bouillon de culture réactionnelle tel qu'obtenu dans l'exemple 1 avec de l'"Hyflo Super Cel" (Johns Manville, USA) ajouté audit bouillon, est réglé à p H 6 et extrait avec deux portions de 10 litres d'acétate d'éthyle L'extrait est lavé avec de l'eau et concentré à 1 litre Ensuite, sont ajoutés 500 ml d'une solution aqueuse à 2 % de chlorure ferrique et le mélange est agité pendant 1 heure Ensuite, la couche d'acétate d'éthyle est lavée deux fois avec de l'eau et concentrée L'addition de

n-hexane donne 1,45 g d'une poudre brute.

La poudre brute est soumise à la chromatographie sur colonne en utilisant 65 g de gel de silice (E Merck A G, Allemagne de l'Ouest) et éluée d'abord avec du n-hexane ( 200 ml) puis avec un mélange hexane-acétate d'éthyle l 1:1 ( 300 ml), 1:2 ( 300 ml), 1:4 ( 300 ml) et 1:9 ( 300 ml) successivementl, ce qui

fait que la matière de départ restante (Macbé'cine I), E-3, 21-0-

déméthylmacbécine I et E-5 sont élués dans cet ordre Chaque fraction est vérifiée par la chromatographie en couche mince,

et les fractions contenant chaque composé seul sont concentrées.

On a ainsi obtenu 43 mg de 21-0-déméthylmacbécine I, 248 mg de

E-5 et 111 mg de E-3.

Exemple 3

La Macbécine II (lg) est ajoutée à 10 litres du bouillon de culture tel qu'obtenu dans l'exemple 1, et la réaction est effectuée à 28 Ctout en secouantpendant 24 heures L'analyse par TLC confirme que la Macbecint II a été transformée en

composés O-déméthylé dans le bouillon de culture réactionnelle.

Après l'addition de Hyflo Super Cel, 10 litres du bouillon de culture réactionnelle sont filtrés,et le filtrat est réglé à p H 6 et extrait avec deux portions de 3,5 litres d'acétate d'éthyle L'extrait est lavé avec de l'eau et concentré à 1 litre Après l'addition de 500 ml d'une solution aqueuse à 2 % de chlorure ferrique, le mélange est agité pendant 1 heure Ensuite, la couche d'acétate d'éthyle est lavée avec de l'eau et concentrée Par addition de n-hexane,

on obtient 610 mg d'une poudre brute.

Cette poudre est soumise à la chromatographie sur colonne en utilisant 30 g de gel de silice (E Merck A G, Allemagne de l'Ouest) et éluée avec du nhexane, des mélanges n-hexane-acétate d'éthyle ( 1:1), n-hexane-acétate d'éthyle ( 1:2), n-hexane-acétate d'éthyle ( 1:4) et n-hexane-acétate d'éthyle ( 1:9) dans cet ordre Les fractions éluées avec le mélange nhexane-acétate d'éthyle ( 1:2) sont concentrées à siccité, le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle, réduit avec de l'hydrosulfite de sodium aqueux à 2 %, lavé avec de l'eau

et concentré pour donner 62 mg de E-3-R.

Les fractions éluées avec le mélange n-hexane-acétate d'éthyle ( 1:4) sont concentrées à siccité et le résidu est encore purifié par la TLC préparative en utilisant du gel de silice (E Merck A G, Allemagne de l'Ouest) (n-hexane-acétate d'éthyle = 1:4), puis dissous dans l'acétate d'éthyle et réduit avec de l'hydrosulfite de sodium aqueux à 2 % La couche d'acétate

d'éthyle lavée avec de l'eau et concentrée donne 23 mg de 21-0-

déméthylmacbecine II.

Les fractions éluées avec le mélange n-hexane-acétate d'éthyle ( 1:9) de la colonne de gel de silice, sont concentrées à siccité et le résidu après purification par la TLC préparative sur gel de silice similaire (nhexane-acétate d'éthyle = 1:4), est dissous dans l'acétate d'éthyle et réduit avec Na 25204 aqueux à 2 % La couche d'acétate déthyle est lavée

avec de l'eau et concentrée pour donner 116 mg de E-5-R.

Exemple 4

Du Nocardia mediterranei IFO 13415 est cultivé par secousses dans un milieu contenant 1 % de glucose, 1 % de Tryptone (Difco, USA) et 0,6 % d'extrait de levuret,à 30 C/ pendant 2 jours Le bouillon de culture est utilisé pour ensemencer un milieu de fermentation ayant la même composition que ci-dessus à la taille d'inocculum de 5 % Apres l'incubation à 30 C pendant 24 heures, le bouillon de fermentation obtenu est centrifugé et les cellules ainsi recueillies sont lavées avec de l'eau stérilisée et mises en suspension dans l'eau stérilisée en une quantité d'l/5 du bouillon de fermentation pour donner une suspension de celluleslavées A 4,5 ml de cette suspension de cellules, sont ajoutés 0,2 ml de tampon phosphate 1 M (p H 7) et 0,2 ml d'une solution de Macbécin-I à 20 mg/ml dans le méthanol La réaction est effectuée dans un tube à essai,à

Ctout en secouant,pendant 20 heures Le mélange réaction-

nel liquide est extrait avec une quantité égale d'acétate d'éthyle, l'extrait est lavé avec de l'eau, deux volumes de chlorure ferrique aqueux à 2 % sont ajoutés;et le mélange est agité Ensuite, 5/lde la couche d'acétate d'éthyle sont déposés sur une plaque de gel de silice (E Merck A G,

F 254) et développés avec de l'acétate d'éthyle saturé d'eau.

En utilisant pour l'essai un appareil d'exploration CS-910 de TLC à double longueur d'onde "Shimadzu" (Shimadzu Seisakusho Ltd, Japon) on voit qu'une conversion de 80 % de la Macbecint

I est alimentée en composé 0-déméthylé%.

Exemple 5

La Macbecint I ( 500 mg) est ajoutée à 1,3 litre du bouillon de fermentation obtenu par le procédé de l'exemple 4, et la réaction est effectuée à 30 C/tout en secouantpendant heures Le mélange réactionnel liquide est filtré et le filtrat est réglé à p H 6,5 et extrait avec deux portions de 650 ml d'acétate d'éthyle L'extrait est lavé avec de l'eau, 1, 1 litre de chlorure ferrique aqueux à 2 % et le mélange est agité pendant 1 heure Ensuite, la couche d'acétate d'éthyle est lavée deux fois avec de l'eau et concentrée En ajoutant

du n-hexane, on obtient 400 mg d'une poudre brute.

La poudre brute ( 400 mg) est soumise à la chromatographie sur colonne en utilisant 65 g de gel de silice (Merck) et développée successivement avec du n-hexane et des mélanges n-hexane-acétate d'éthyle 2:1,1:1, 1:2 et 1:4 Les fractions contenant le produit de réaction principal sont combinées et concentrées à siccité puis soumises à la chromatographie sur colonne de gel de silice ( 40 g) puis développées avec du n-hexan et des mélanges de chloroforme-méthanol ( 100:1 > 100:2 > 100:3) dans cet ordre Les fractions à une seule tache sont combinées et concentrées presque à siccitéjet le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle Par refroidissement, on obtient 84 mg de E-3 sous forme de cristaux jaunes Une seconde récolte ( 51 mg)

de E-3 est récupérée à partir des eaux mères.

Exemple 6

Un milieu de culture à ensemencer (p H 7), dans un flacon Erlenmeyer de 200 ml qui contient 2 % de glucose, 3 % d'amidon soluble, 1 % de farine de soja grossière, 1 % de liqueur de macération du mais, 0,5 % de peptone, 0,3 % de Na Cl et 0,5 % de Ca C 03, est inocculé avec l'Actinosynnema sp No C-33196

(IFO 14127, FERM BP-166) développé sur extrait de levure-

extrait de malt-agar,et l'incubation est effectuée sur une secoueuse rotative;à 28 Cpendant 48 heures Une portion de ml du bouillon de culture ainsi obtenu est transférée dans un flacon Sakaguchi de 2 litres contenant 500 ml du même milieu de culture ensemencé L'incubation est effectuée sur une secoueuse à va-et-vient à 28 C pendant 48 heures 1 litre du bouillon de culture ainsi obtenu est utilisé pour ensemencer litres du même milieu de culture ensemencé dans un récipient en acier inoxydable de 200 litres L'incubation est effectuée à 28 C et avec une vitesse d'aération de 100 litres par minute, tout en agitant à 200 tours/minute,pendant 48 heures, ce qui donne un bouillon de culture ensemencé Une portion de 60 litres de ce bouillon de culture ensemencé est transférée dans un récipient en acier inoxydable de 2 000 litres contenant 1200 litres d'un milieu de fermentation contenant % de glycérol, 2 % de liqueur de macération du mais, 2 % de levure séchée, 0,5 % de Mg C 12, 2 % de KH 2 PO 4 et 0,1 % de Ca CO 3, et l'incubation est effectuée à 28 C, avec une vitesse d'aération de 1 200 litres par minute/tout en agitant à 150 tours/minute, sous une pression intérieure de 1 bar pendant 114 heures Le bouillon de fermentation ( 1100 litres) est filtré avec 61, 8 kg dee Hyflo Super Cel Le filtrat et les eaux de lavage sont combinés ( 1200 litres), réglés à p H 6,5 et extraits avec 600 litres d'acétate d'éthyle L'extrait est lavé avec de l'eau et concentré sous pression réduite jusqu'à environ 40 litres,

puis 20 litres de chlorure ferrique aqueux à 2 % sont ajoutés.

Ensuite, le mélange est agité pendant 1 heure Après le 2512 f 19 processus d'oxydation, la couche d'acétate d'éthyle est lavée avec deux portions de 20 litres d'eau puis concentrée sous pression réduite Le résidu huileux (environ 200 ml) est lavé avec deux portions de 1 litre de n-hexane Au résidu,(environ 100 ml)sont ajoutés 500 ml d'acétate d'éthyle, et le mélange est abandonné au repos dans un endroit froid, ce quifait précipiter des cristaux Les cristaux sont séparés par filtration et les eaux-mères sont concentrées et le résidu est soumis à la chromatographie sur colonne en utilisant 450 g de gel de silice (E Merck A G) La colonne est lavée avec du n-hexane ( 500 ml) puis développée successivement avec des mélanges

n-hexane-acétate d'éthyle ( 4:1 2:1 1:l 1:2 1:4-

1:8) Le E-3 est trouvé dans les fractions éluées avec le mélange n-hexaneacétate d'éthyle ( 1:2), l'antibiotique C-33196 E-4 est trouvé dans les fractions éluées avec le mélange n-hexane-acétate d'éthyle ( 1:4),et le E5 est trouvé dans les

fractions éluées avec le mélange n-hexane-acétate d'éthyle ( 1:8).

Chacun des produits ainsi obtenus n'est pas composé avec un seul constituant comme jusqu'ici et par conséquent,il est

* purifié une fois de plus par chromatographie sur gel de silice.

Le mélange dont le constituant principal est le E-3 est adsorbé sur une colonne de 100 g de gel de silice et développé

avec de l'hexane, du chloroforme et des mélanges chloroforme-

méthanol ( 100:1 25:l)tdans cet ordre La concentration des fractions combinées montrant chacune une tache unique en TLC donne 66 mg de E-3 La liqueur-mère est réduite avec une solution aqueuse d'hydrosulfite de sodium à 2 % Le produit de réduction est soumis à la chromatographie sur colonne en utilisant du gel de silice (l O Og) Le développement avec de l'hexane, du chloroforme et des mélanges chloroforme-méthanol ( 50:150:4)/dans cet ordre,et la concentration des fractions montrant une tache unique en TLC donne 170 mg de E-3-R à l'état cristallin.

Le mélange dont le constituant principal est l'anti-

biotique C-33196 E-4 est adsorbé sur une colonne de gel de silice ( 150 grammes) et développé successivement avec de l'hexane, du chloroforme et des mélanges chloroforme-méthanol ( 50:1 410:1) Les fractions contenant le produit désiré sont combinées et concentrées, le résidu est dissous dans l'acétate

d'éthyle et traité avec de l'hydrosulfite de sodium aqueux à 2 %.

Le produit de la réduction est encore soumis à la chromatographie sur colonne de gel de silice ( 130 g) Le développement avec de l'hexane, du chloroforme et des mélanges chloroforme-méthanol ( 25:l 5:l),dans cet ordre/suivi d'une combinaison et d'une concentration des fractions à tache unique donne des cristaux

( 430 mg) de l'antibiotique C-33196 E-4-R.

La fraction dans laquelle le E-S est le constituant principal est adsorbée sur une colonne de 200 g de gel de silice et développée successivement avec de l'hexane, du chloroforme et des mélanges chloroforme-méthanol ( 25:1 10:1) Les fractions contenant le E-5 sont combinées et concentrées, le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle et traité avec l'hydrosulfite de sodium à 2 % Le produit de la réduction est soumis encore à la

chromatographie sur colonne de gel de silice ( 130 g) et dévelop-

pé avec du n-hexane, du chloroforme et des mélanges chloroforme-

méthanol ( 50:1 410:1),dans cet ordre La concentration des fractions a tache uniquetcombinéesdonne des cristaux ( 1 325 g)

de E-5-R.

Exemple 7

Du méthanol ( 1 litre) est ajouté à une portion de 1 litre du bouillon de fermentation obtenu de la même façon que dans l'exemple 6, et le mélange est filtré Le méthanol est chassé du filtrat par distillation, le résidu est réglé à p H 6-7 et extrait avec deux portions de 500 ml d'acétate d'éthyle;et l'extrait est lavé avec de l'eau et concentré La TLC du concentré confirme la présence de l'antibiotique C-33196 E-4, les antibiotiques

C-33196 E-4-R, E-5, E-5-R, E-3 et E-3-R.

Exemple 8

Dans 100 ml d'acétate d'éthyle) sont dissous 100 mg d'antibiotique C33196 E-4-R obtenu dans l'exemple 6 A ceci, sont ajoutés 50 ml de chlorure ferrique aqueux à 2 % et le mélange est agité pendant 1 heure Ensuite, l'acétate d'éthyle est séparé, lavé avec de l'eau et concentré pour donner 88 mg

d'antibiotique C-33196 E-4.

Exemple 9

Les E-5-R et E-3-R obtenus dans l'exemple 6 sont traités de la même façon que dans l'exemple 8 pour donner les

E-5 et E-3 respectivement, chacun à l'état cristallin.

Les caractéristiques physico-chimiques de E-5 et de E-3 obtenus dans l'exemple 6 et dans l'exemple 9, et celles de E-5-R et de E-3-R sont identiques à celles des produits obtenus dans les

emoples 2 et 3.

Exemple 10

Un milieu de culture à emseencer(p H 7) dans un flacon d' Erlenmeyer de 200 ml qui contient 2 % de glucose, 3 % d'amidon soluble, 1 % de farine de soja grossière, 1 % de liqueur de macération du maïs, 0,5 % de peptone, 0,3 % de Na Cl et 0,5 % de Ca CO 3, estensemencé avec l'Actinosynnema sp No C-33196

(IFO 14127, FERM BP-166) développé sur de l'extrait de levure-

extrait de malt-agar;et l'incubation est effectuée sur une secoueuse rotativelà 28 Cpendant 48 heures Une portion de ml du bouillon de culture ainsi obtenu est transférée dans un flacon de Sakaguchi de 2 litres contenant 500 ml du même milieu de culture ensemencé L'incubation est effectuée sur une secoueuse à va-et-vientà 28 Ctpendant 48 heures 1 litre du bouillon de culture ainsi obtenu est utilisé pourensemencer litres du même milieu de culture ensemencé dans un récipient en acier inoxydable de 200 litres L'incubation est effectuée à 28 C avec une vitesse d'aération de 100 litres par minute, tout en agitant à 200 tours/minutependant 48 heures, ce qui donne un bouillon de culture ensemencé Une portion de 60 litres du bouillon de culture ensemencé est transférée dans un récipient en acier inoxydable de 2 000 litres contenant 1 200 litres d'un milieu de fermentation contenant 5 % de glycérol, 2 % de liqueur de macération du mais, 2 % de levure séchée, 0,5 % de Mg C 12, 2 % de KH 2 PO 4 et 0,1 % de Ca CO 3, et l'incubation est effectuée à 28 C avec une vitesse d'aération de 1 200 litres par minutetout en agitant à 150 tours/minute/sous une pression intérieure de 1 bar pendant 114 heures Le bouillon de fermentation ( 1 100 litres) est filtre avec 61,8 kg d' Hyflo Super Cel Le filtrat et les eaux de lavage sont combinés ( 1 200 litres), réglés à p H 6,5 et extraits avec 650 litres

d'acétate d' éthyle.

La chromatographie en couche mince Céluant: chloroforme-

méthanol ( 9:1)3 de l'extrait révèle la présence de E-7 (Rf: 0,65) et de E-7-R (Rf: 0,18). Pour isoler et purifier plus facilement les produits désirés, le E-7-R dans l'extrait est oxydé une fois en E-7, lequel est ensuite purifié et encore réduit en E-7-R Ainsi, l'extrait est lavé avec 300 litres d'eau, puis concentré sous pression réduite (à 28 litres) A ceci 7 sont ajouis 14 litres de solution aqueuse à 2 % de chlorure ferrique et le mélange est agité Une heure plus tard, la couche d'acétate d'éthyle est lavée avec deux portions de 14 litres d'eau et concentrée Le concentré huileux est lavé avec quatre portions de 500 ml de n-hexane et le résidu visqueux restant est dissous dans 500 ml d'acétate d'éthyle La solution est mélangée avec 250 g de 1 j gel de silice e Kieselgel 60, E Merck A G, République Fédérale d'Allemagne) Le mélange résultant est concentré à siccité et placé sur une colonne de gel de silice ( 500 g) La colonne entière est lavée avec du n-hexane et éluée successivement avec des mélanges n-hexane acétate d'éthyle ( 4:1) 2:1 l:l 1:2 > 1: 4 1:8) Les fractions éluées avec les mélanges

n-hexane-'acétate d'éthyle 2:1 > 1:1 contiennent le C-33196 E-7.

Ces fractions sont combinées et concentrées jusqu'à environ 50 ml, puis diluées avec 200 ml d'acétate d'éthyle Ensuite, ml d'une solution aqueuse à 2 % d'hydrosulfite de sodium sont ajoutés et le mélange est agité Apres avoir éliminé la couche aqueuse, le traitement réducteur est répété une fois de plus de la même façon La couche organique est lavée avec de

l'eau, séchée et concentrée sous pression réduite à 20 ml.

Ensuite, 10 g de gel de silice sont ajoutés et le mélange est concentré à siccité Le résidu est placé sur une colonne de gel de silice ( 50 g) près 1 ' avoir développéeavec le n-hexane, la colonne entière est éluée succesivement avec du chloroforme

et des mélanges chloroforme-méthanol ( 100:1 > 50:1 4:1).

Les fractions éluées avec le mélange chloroforme-méthanol 4:1 qui contiennent le C-33196 E-7-R sont concentrées sous

25.12819

pression réduite;et le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle Par refroidissement, la solution donne 423 mg de

C-33196 E-7-R sous forme de cristaux incolores.

La dissolution de 200 mg de C-33196 E-7-R dans 100 ml d'acétate d'éthyle, l'oxydation avec 100 ml d'une solution aqueuse à 2 % de chlorure ferrique, le lavage à l'eau, la concentration et l'addition de n-hexane;donnent 180 mg de

C-33196 E-7 sous forme d'une poudre jaune.

Exemple 11

Des parties aliquotes de 2 ml chacune de la culture ensemencée,obtenues par culture dans le flacon Erlenmeyer de l'exemple 10,sont transplantées dans un flacon Erlenmeyer de 200 ml contenant 40 ml d'un milieu de culture principal contenant 5 % de glycérol, 2 % de levure séchée, 2 % de liqueur de macération du mais et 3 % de phosphate mono-ammonique (p H 7) L'incubation est effectuée sur une secoueuse rotative, à 280 C;pendant 90 heures 5 litres du bouillon de culture sont filtrés avec l'Hyflo Super Cef'l et le filtrat est réglé à p H 7 et extrait avec deux portions de 2, 5 litres d'acétate

d'éthyle.

La chromatographie en couche mince Céluant: chloroforme-

méthanol ( 9:1) révèle la présence de E-6 (Rf: 0,41) et de

E-6-R (Rf: 0,22).

Pour isoler convenablement les produits désirés, le E-6-R contenu dans l'extrait est oxydé en E-6, lequel est isolé et purifié en même temps que le E-6 produit au départ par le micro-organisme Donc, après lavage à l'eau,la couche d'acétate d'éthyle est concentrée à un litre, 500 ml d'une solution aqueuse à 2 % de chlorure ferrique sont ajoutés, le mélange est agité pendant 1 heure puis la couche d'acétate d'éthyle est lavée à l'eau et concentrée Au concentré (environ 30 ml),sont ajoutés 10 g de gel de silice, le mélange est encore concentré à siccité et le résidu est placé sur une colonne de gel de

silice ( 50 g).

La colonne entière de gel de silice est développée successivement avec du n-hexane, du chloroforme, et des mélanges chloroforme-méthanol ( 100:1 30:1) Les fractions contenant le E-6 (confirmées par la chromatographie en couche mince) sont

12819

combinées et concentrées pour donner 160 mg de C-33196 E-6 sous

forme de cristaux jaunes.

A la liqueur-mère, sont ajoutés 5 g de gel de silice, le mélange est concentré à siccité, le résidu est placé sur une colonne de gel de silice ( 25 g) La colonne entière est développée de la même manière que cidessus Les fractions éluées contenant le E-6 sont concentrées, dissoutes dans 100 ml d'acétate d'éthyle, et réduites avec deux portions de 50 ml d'hydrosulfite de sodium à 2 % La couche d'acétate d'éthyle est lavée à l'eau, séchée et concentrée,pour donner 45 mg de

C-33196 E-6-R sous forme de cristaux incolores.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1 Dérivé formule: déméthylmacbécine représenté par la CH 3 dans laquelle un des symboles R 1, R et R est de l'hydrogène,

2 3

et les autres sont des groupes méthyle, et X est un groupe de formule: O OH

OIL -

OH 2 Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que R 1 est un groupe méthyle; R 2 est un groupe méthyle; R 3 est de l'hydrogène, et X est: O O 3 O 3 Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que R 1 est un groupe méthyle, R 2 est un groupe méthyle, R 3 est de l'hydrogène)et X est: OH OH 4 Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que R 1 est un groupe méthyle; R 2 est de l'hydrogène, R 3 est un groupe méthyle;et X est: O 3 t Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que R 1 est un groupe méthyle; R 2 est de l'hydrogène; R 3 est un groupe méthyle, et X est: OH

3 OH

OH 6 Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que R 1 est de l'hydrogène; R 2 est un groupe méthyle; R 3 est un groupe méthyle/et X est: O 7 Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que R 1 est de l'hydrogène, R 2 est un groupe méthyle, R 3 est un groupe méthyle;et X est: OH OH O OH 8 Antibiotique C-33196 E-4 ou C-33196 E-4-R, ayant les propriétés suivantes: a) Antibiotique C-33196 E-4: I) Point de fusion: 209-210 C II) Aspect: cristaux jaunes III) Pouvoir rotatoire spécifique J 2 + 530 + 5 (c= 0,5, IV) Analyse élémentaire (%) : CHC 13)

C 63,14 + 0,5

H 7,57 + 0,5

N 5,26 + 0,5

V) Spectre de masse (M): m/z 532 VI) Spectre d'absorption ultra-violet: Me OH 276 nm + 2 nm(Elm 272 + 20) max -cm

1

390 nm + 2 nm(Elcm 33,5 + 5) VII) Spectre d'absorption infra-rouge, pics principaux (cm-1):

1735, 1700, 1670, 1650, 1625, 1605, 1500,

1380, 1305, 1290, 1210, 1050

VIII) Solubilité: Faiblement soluble dans l'éther de pétrole, l'hexane, l'eau; Soluble dans le chloroforme, le chlorure de méthylène, le toluène, le diéthyléther; Très soluble dans l'acétone, l'acétate d'éthyle,

le méthanol, le diméthylsulfoxyde.

IX) Réactions colorées: Essai positif avec le permanganate de potassium (décoloration); Réaction avec la ninhydrine, réaction de Ehrlich et

de Barton/négatives.

X) Acidité, neutralité ou basicité: neutre b) Antibiotique C-33196 E-4-R (propriétés des cristaux contenant une molécule d'acétate d'éthyle comme solvant de cristallisation I) Point de fusion: 224-225 C II) Aspect: cristaux incolores III) Pouvoir rotatoire spécifique:lg 25 + 32 + 5 (c= 0,5, D Me OH) IV) Analyse élémentaire (%):

C 60,96 + 0,5

H 8,25 + 0,5

N 4,59 + 0,5

V) Spectre de masse (M+): m/z 534 VI) Spectre d'absorption ultra-violet: A Me OH 307 nm + 2 nm(Elcm 75 + 8) max 1 cm VII) Spectre d'absorption infra-rouge, pics principaux (-1 (cm-1):

1720, 1670, 1630, 1600, 1535, 1465, 1380,

1325, 1045

VIII) Solubilité: Faiblement soluble dans l'éther de pétrole, l'hexane, le diéthyléther, le chloroforme et l'acétate d'éthyle; Soluble dans le méthanol; Très soluble dans le diméthylsulfoxyde IX) Réactions colorées: Réaction de Barton positive; Réaction avec la nihydrine et réaction de Ehrlich, négatives X) Acidité, neutralité ou basicité: neutre 9 Antibiotiques C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196 E-7 ou C-33196 E-7-R, qui ont la structure chimique suivante:

CH 3 CH 3 CH 3

R 1

R 1 17 H 2 NOCO

18 02

CH 3 O < CH 3

RO 3 NH

dans laquelle un des symboles R 1, R 2 et R 3 est un groupe méthyle<et les autres sont de l'hydrogène, et X est un groupe ayant la formule:

O OH

t CLI t; et qui ont les propriétés suivantes: OH (a) Antibiotique C-33196 E-6: (I) Pouvoir rotatoire spécifique llj 4 + 258,8 + 20 (c 0, 5,CH Cl 3) (II) Spectre d'absorption ultra-violet: 3 A Me OH 273 nm + 2 nm (E 1 % 454 + 45) max (lem -Me OH 397 nm + 2 nm (Eli m 50,3 + 5) max l Ecm5, (III) Spectre d'absorption infra-rouge, pics principaux (-1 (cm-1):

1720, 1705, 1670, 1650, 1610, 1505, 1380,

1325, 1265, 1210, 1090, 1040

(b) Antibiotique C-33196 E-6-R: (I) Pouvoir rotatoire spécifique N 4 + 37, 8 + 4 (c= 0,5,Me OH) (II) Spectre d'absorption ultra-violet: >e H 1 SX Me OH 255 nm + 2 nm (E 337 + 30) -max 'Ec 37 + O A Me OH 307 nm + 2 nm (E 1 % 91 + 9) max lcm (III) Spectre d'absorption infra-rouge, pics principaux -1 (cm):

1720, 1650, 1600, 1535, 1460, 1380, 1320,

1090, 1040, 1010

(c) Antibiotique C-33196 E-7: (I) Pouvoir rotatoire spécifique J 4 + 37,4 + 4 (c= 0,5, CHC 13) (II) Spectre d'absorption ultra-violet: Me O Hi 274 nm + 2 nm (E 1 % 502 + 50)

max lcm -

Me OH 1 % lMe OH 396 mn + 2 nm (Elcm 59,8 + 6) Àmax (III) Spectre d'absorption infra-rouge, pics principaux -1 (cm-1):

1725, 1670, 1650, 1605, 1500, 1380, 1325,

1260, 1205, 1150, 1095, 1035

(d) Antibiotique C-33196 E-7-R: (I) Pouvoir rotatoire spécifique 32 D + 18,60 20 (c= 0,5, Me OH) (II) Spectre d'absorption ultra-violet: Me OH 250 nm + 2 nm (Elcm 305 + 30) max (Ec 35 m Me OH 315 nm + nm (E 1 cm 68 + 7)

max (lcm -

(III) Spectre d'absorption infra-rouge, pics principaux (cm):

1710, 1640, 1600, 1485, 1455, 1380, 1310,

1250, 1090, 1040

Composé selon la revendication 9, caractérisé par

le fait que le composé est l'antibiotique C-33196 E-6.

11 Composé selon la revendication 9, caractérisé par

le fait que le composé est l'antibiotique C-33196 E-6-R.

12 Composé selon la revendication 9, caractérisé par

le fait que le composé est l'antibiotique C-33196 E-7.

13 Composé selon la revendication 9, caractérisé par

le fait que le composé est l'antibiotique C-33196 E-7-R.

14 Procédé de préparation d'un composé de dérivés déméthylmacbécine représentéspar la formule:

-CH 3 O CH 3

21 NH

R 30 ' H

dans laquelle un des symboles R 1, R 2 et R 3 est de l'hydrogènel et les autres sont des groupes méthyle, et X est un groupe de formule: o OH

Q 5 u-

o qui comprend la mise en contact d'un composé représenté par la formule:

CH 3 CH 3 CH 3

\ 13 H 2 Noc 6 I OCH 3

\ H 2 OCO

a 1 O 113

3 CH 3

H

CH 30 X/ NH

dans laquelle X est un groupe de formule:

O OH

o

O OH

avec un bouillon de culture, y compris une matière traitée du bouillon de culture, d'un micro-organisme appartenant au genre Streptomyces ou au genre Nocardiaqui est capable de transformer un des groupes méthoxy sur les positions 17, 18 et 21 dudit

composé de départ en groupe hydroxyle.

Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que le microorganisme est le Streptomyces platensis

ou le Nocardia mediterranei.

16 Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que le micro-organisme est le Streptomyces platensis

IFO 12901 ou le Nocardiamediterranei IFO 13415.

17 Procédé de préparation des antibiotiques C-33196 E-3,

C-33196 E-3-R, C-33196 E-4, C-33196 E-4-R, C-33196 E-S, C-33196

E-5-R, C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196 E-7 ou C-33196 E-7-R, qui comprend la culture d'un micro-organisme appartenant au genre Actinosynnema qui est capable de produire les antibiotique:

C-33196 E-3, C-33196 E-3-R, C-33196 E-4, C-33196 E-4-R,

C-33196 E-5, C-33196 E-5-R, C-33196 E-6, C-33196 E-6-R,

C-33196 E-7 ou C-33196 E-7-R idans un milieu de culture pour amener ledit micro-organisme à élaborer et à accumuler ledit composé dans le bouillon de culture;et la récolte dudit

composé à partir du bouillon de culture.

18 Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que le micro-organisme est l'Actinosynnema sp No.

C-33196.