DE3153618C2

DE3153618C2 -

Info

Publication number: DE3153618C2
Application number: DE3153618A
Authority: DE
Inventors: James Harrison Ft. Lauderdale Fla. Us Carter; Stephen Lawrence Hialeah Fla. Us Ledis; Harold Richardson Miami Fla. Us Crews
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1980-06-16
Filing date: 1981-06-15
Publication date: 1992-10-15
Anticipated expiration: 2001-06-16
Also published as: NL8102855A; GB2147999B; GB2077916A; DE3123669A1; JPH0358067B2; SE8800040L; IL63093A; ZA814004B; DE3123669C2; MX171614B; AU7184881A; SE453693B; FR2484649A1; ES503067A0; NZ197422A; JPH0327865B2; JPS5713356A; NO163426C; CH660791A5; AU572382B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein isotonisches Verdünnungsmittel zum Verdünnen von Gesamtblut. Ein derartiges Blutverdünnungsmittel wird bei der elektronischen Zählung und Größenbestimmung von Blutkörperchen, zur Bestimmung des Hämoglobins und der Gesamtwerte sowie der Blutplättchenparameter in einer einzigen Blutzellenprobe mittels elektronischer Geräte verwendet. Es wird angestrebt, Reagenzien und Methoden für das automatische Blutzählgerät, Coulter Counter Modell S Plus, das von Coulter Electronics, Inc., Hialeah, Florida, hergestellt wird, zu schaffen, die in der Lage sind, bei den Zellenvolumenwerten, die von einem Coulter Channelyzer gesammelt werden, zwei Leukozytenpopulationen voneinander zu unterscheiden, und zwar (1) eine lymphoide Population (Lymphozyten) und (2) eine myeloide Population (Neutrophile, Monozyten, Eosinophile und Basophile). Derartige Werte sind als Klassifizierungsmittel geeignet, um abnormale Leukozytenverhältnisse festzustellen. Die abnormalen Verhältnisse, die diese Methode anzeigt, liefern Informationen von diagnostischer Bedeutung und für andere Untersuchungen.

Die Trennung von normalen menschlichen Leukozyten durch Volumenverteilung, bei der das Prinzip der Zählung und der Größenbestimmung ausgenutzt wird, das von Wallace H. Coulter entwickelt wurde und in den Coulter Counter-Geräten zur Anwendung kommt, wird heutzutage als klinische Diagnosemethode verwendet. Diese Methode basiert auf der fundamentalen Eigenschaft aller lebenden Zellen, ihr Zellenvolumen durch genetische Code-Informationen zu regulieren. Jede Art von Zellen im Blutkreislauf hat ihr eigenes charakteristisches Volumen, das von so wenig wie drei Kubikmikrometer für Blutplättchen bis zu 450 Kubikmikrometer für polymorphonukleare Zellen reicht. Es sind weiterentwickelte Coulter Counter-Geräte geschaffen worden, die diesen Volumenunterschied zum Zwecke des Zählens und der Bestimmung der Größenverteilung von Blutplättchen und Erythrozyten ausnutzen, um pathologische Stadien festzustellen und zu überwachen.

Allerdings überlappen sich Erythrozyten und lymphoide Leukozyten hinsichtlich der Zellengröße, weshalb es nicht möglich ist, die einen in Gegenwart der anderen nur durch Unterscheidung der Größe zu zählen. Nach der herkömmlichen Praxis wird ein stark lytisches, oberflächenaktives Reagens eingesetzt, das die Erythrozyten stromatolisiert, wodurch sie zu sehr kleinen Teilchen zerkleinert werden, oder das eine Membranauflösung herbeiführt, so daß das Zytoplasma sowohl von den lymphoiden wie von den myeloiden Leukozyten freigesetzt wird und lediglich die lyseresistenten Kerne zur Zählung zurückbleiben. Da das ursprüngliche Zellenvolumen drastisch beeinträchtigt und auf ein Minimum verkleinert wird, ist lediglich eine Population bei der Größenbestimmungsanalyse sichtbar.

Bei dem automatischen Blutzellenzählgerät Coulter Counter Modell S Plus wird eine Probe Gesamtblut in einem isotonischen Verdünnungsmittel verdünnt, ein lysierendes Reagens zugegeben und dann nach 7,5 sec mit dem Zählen begonnen. Die Werte für die Erythrozyten und Leukozyten werden 4 sec lang gesammelt und die Werte für die Blutplättchen bis zu 20 sec. Demzufolge muß ein Verdünnungs-/Lyse-System zu einer Erythrozytenlysekinetik führen, die hinreichend schnell verläuft, um eine vollständige Stromatisierung während der Lyseperiode zu erreichen, die jedoch die Leukozyten während dieses Zeitraums nicht vollständig freilegt. Darüber hinaus müssen Veränderungen des Leukozytenvolumens während dieses Datenspeicherungsvorganges minimal sein, wobei es im Idealfall mehrere Minuten unverändert bleiben sollte. Das Reagens-System muß weiterhin die Unversehrtheit der Erythrozyten und Blutplättchenzahl, der Größenverteilung, der Hämoglobinabsorptionskurve und der gesamten Leukozytenzählung gewährleisten. Durch Fingeranstechen erhaltenes Blut muß wenigstens zwei Stunden stabil bleiben, wenn es in dem isotonischen Verdünnungsmittel vorverdünnt wird.

Um eine Analyse der relativen Populationen von lymphoiden und myeloiden Zellen im Blut zu erreichen, muß das Leukozytenvolumenhistogramm scharf getrennte lymphoide und myeloide Peaks mit wenig Erythrozytentrümmern aufweisen, so daß die Minima der Grundlinie sehr nahe kommen. Die Integration jedes Peaks gibt die relative Population der lymphoiden und myeloiden Zellen wieder. Es ist festgestellt worden, daß der lymphoide Peak Lymphozyten und kleine atypische Lymphozyten aufweist, während der myeloide Peak polymorphonukleare Zellen, Bänder, Monozyten, Eosinophile, Basophile und große atypische Mymphozyten enthält.

In der US-PS 38 74 852 ist eine Formel angegeben, die eine Verbindung einschließt, die ein quaternäres Ammoniumsalzdetergens und Cyanid enthält und als lysierendes und Chromagen bildendes Reagens eingesetzt wird, um eine einzige Volumenleukozytenzählung und Hämoglobinbestimmung in dem Coulter Counter Modell S durchzuführen. Es sind weitere Untersuchungen durchgeführt worden, bei denen quaternäre Ammoniumsalze als lysierende Reagenzien verwendet wurden, um Leukozytenzählungen von zwei Populationen zu erhalten.

Die zwei Volumen-Verteilungsanalyse ist wegen der vielen Verdünnungsmittel schwierig, wobei die beiden Populationen sich rasch in eines bewegen, so daß nicht genügend Zeit verbleibt, in der eine Zählung zur Analyse durchgeführt werden kann.

Die Erfindung bezieht sich auf ein isotonisches Mehrzweckblutverdünnungsmittel, mit dem, wenn es in Kombination mit einem lysierenden Reagenssystem verwendet wird, eine routinemäßige Zählung der herkömmlichen Hämogrammwerte durchgeführt werden kann und die Darstellung und Berechnung des lymphoiden und myeloiden Histogramms der Leukozyten und deren relativer Konzentrationen, insbesondere mit einem automatischen Zählgerät, wie dem automatischen Coulter Counter-Gerät mit nicht modifiziertem Programm und einem externen oder internen Leukozyten Channelyzer-Gerät möglich ist.

Das erfindungsgemäße isotonische Blutverdünnungsmittel ist im Anspruch 1 angegeben. Es dient dazu, die Kinetik der Zytoplasmafreisetzung von Leukozyten zu verlangsamen und gleichzeitig die traditionellen Hämogrammparameter zu stabilisieren.

Das lysierende Reagens, mit dem das erfindungsgemäße Verdünnungsmittel in Kombination verwendet wird, ist vorzugsweise ein Gemisch von Dodecyltrimethylammoniumchlorid und Tetradecyltrimethylammoniumbromid in einer wäßrigen Lösung, und zwar zusammen mit einem Alkalimetallcyanid in einem Konzentrationsbereich, der Leukozytenhistogramme mit zwei Volumen liefert. Die Wiedergabe der Daten kann mit Hilfe eines Standard Coulter Counter-Geräts in Verbindung mit einem Channelyzer und einem X-Y-Aufzeichnungsgerät erreicht werden. Zusätzliche Rechen- und Datenverarbeitungsgeräte sind für eine vollständige Automatisierung erwünscht, jedoch für eine Durchführung der Messungen nicht wesentlich.

Eine bevorzugte Formulierung des erfindungsgemäßen isotonischen Verdünnungsmittels besteht aus:

Bestandteil
Wirksamer Konzentrationsbereich
Procainhydrochlorid\|0,11 g/l
N-(2-acetamido)-Iminodiessigsäure (ADA)	1,40 g/l
Chlorhexidendiacetat	0,02 g/l
Dimethylolharnstoff	1,00 g/l
Natrium-1-hydroxypyridin-2-thion	0,50 g/l
Natriumhydroxid	0,50 g/l
Natriumsulfat, wasserfrei	9,72 g/l
Natriumchlorid	4,50 g/l
Wasser	auf einen Liter aufgefüllt

Dieses Verdünnungsmittel wird erforderlichenfalls mit einer Natriumhydroxid- oder Chlorwasserstoffsäurelösung auf pH 7,0±0,1 eingestellt. Die Osmolalität wird auf 320±5 Milliosmol/kg mit Natriumchlorid eingestellt.

Es ist bekannt, daß Blutzellen ATPase-Enzyme enthalten, die mit kleinen Anionen (z. B. Chlorid) assoziierte Alkalimetallkationen in oder aus der Zelle durch einen energieverbrauchenden Mechanismus transportieren, um das osmotische Gleichgewicht, die Unversehrtheit der Zelle und die richtigen Membranpotentiale aufrechtzuerhalten. Natriumionen, die mit den viel größeren Sulfatanionen assoziiert sind, werden offenbar nicht so leicht transportiert, und zwar wegen der größeren Unterschiede der Ladungsdichten zwischen Sulfat- und Chloridanionen und der Potentialänderung der Membranladung, wenn Ionen in oder aus der Zelle transportiert werden. Das Gleichgewicht des internen osmotischen Drucks innerhalb der Zelle wird dadurch aufrechterhalten, daß etwa 30 Milliosmol Natriumchlorid eingeschlossen sind. Es ist bekannt, daß Natriumsulfat abnormale Plasmaglobuline auflöst und die Trübung der Hämoglobinlösung auf Grund der erhöhten Leukozytenzahl vermindert oder beseitigt.

Das erfindungsgemäße Verdünnungsmittel enthält ein oder mehrere anästhetische Mittel, wie Procainhydrochlorid oder 4-Aminobenzoesäureesterderivate und deren Salze, die einen stabilisierenden Einfluß auf die Erythrozytenmembran ausübt, wobei die Wirkungsweise ungewiß ist.

N-(2-acetamido)-Iminodiessigsäure (ADA) als organischer Puffer besitzt die Fähigkeit, schwache quaternäre Ammoniumsalzlysereagenzien bei der Zerkleinerung lysierter Erythrozytentrümmer auf eine Teilchengröße von weniger als 45 Kubikmikrometer elektrisch zu unterstützen, wodurch eine Beeinträchtigung der Zählung und der Verteilung der Leukozyten in zwei unterschiedliche Populationen (lymphoide und myeloide) durch Erythrozyten verhindert wird.

Obwohl die Wirkungsweise des ADA nicht intensiv untersucht worden ist, ist sie als mäßig starker Ligand für Alkalimetalle der Gruppe II und Übergangsmetalle der Gruppe IIB bekannt, desgleichen als hinreichend wirksamer Puffer. Da sie einer Aminosäure sehr ähnlich ist, wird ADA anscheinend von den Zellenmembranproteinen angezogen und tritt mit denselben in Wechselwirkung. Es wird dann mit den Metallkationen koordiniert, wodurch die äußere Membranoberfläche für die umgebende Lösung positiver geladen erscheint, so daß die Solvatation und die Anziehung der Anionen um die äußere Membran unterstützt wird. Diese Beschichtung mit Lösungsmittelmolekülen und Amionen verhindert in wirksamer Weise die Annäherung und Agglomerierung mit anderen Zellen in der Suspension. Die puffernde Wirkung der ADA verhindert Veränderungen in dieser lokalen Umgebung, wodurch eine Entsolvatisierung und ein Stabilitätsverlust vermieden werden.

Dieser Mechanismus in Verbindung mit der Wirkung eines lokalen Anästhetikums, wie Procainhydrochlorid, sowie Natriumsulfat unterstützen die Stabilisierung der Zellbestandteile der Blutprobe, wobei dieselben im wesentlichen gegenüber ihrem ursprünglichen Zustand in der Blutprobe hinsichtlich Zahl, Größenverteilung und Form unverändert bleiben. Dieser Faktor ist von großer diagnostischer Bedeutung bei der Interpretation der traditionellen Hämogrammparameter.

Obgleich Chlorhexidendiacetat üblicherweise als Virozid und keimtötendes Mittel verwendet wird, ist es bei der verwendeten Konzentration als solches nur wenig wirksam, jedoch unterstützt es ADA erheblich bei der Zerkleinerung des Hintergrundteilchen, die die Zählung der Leukozyten nach der Größenverteilung beeinträchtigen. Ferner weist Chlorhexiden eine gewisse Ähnlichkeit mit den Aminen Arginin und Guanidin auf, so daß es mit den Membranproteinen durch Koordination und Wasserstoffbindung in Wechselwirkung treten dürfte. Es unterstützt als solches offenbar die lysierenden Reagenzien bei der vollständigen Stromatolyse der Erythrozytenmembranen.

Es wird angenommen, daß Dimethylharnstoff, ein Kondensat aus Formaldehyd und Harnstoff, nur sehr langsam in Lösung bei neutralem pH mit den Leukozytenmembranen reagiert, wodurch eine Stabilität beim Stehenlassen in einem Ausmaß erreicht wird, das bei der Entfernung dieser Verbindung nicht erreicht wird. Er ist als bakteriostatische, antiseptische Verbindung bekannt, die das Wachstum von Mikroorganismen bei mäßigen Konzentrationen verhindert. Andere Verbindungen, die zugegeben werden können, um die Leukozyten zu stabilisieren, sind Hexamethylentetramin und N-Hydroxymethylenacetamid.

Natrium-1-hydroxypyridin-2-thion ist als Fungizid und Bakterizid in Schuppen-Haarschampoos bekannt. Es kann im erfindungsgemäßen Verdünnungsmittel ebenfalls als keimtötendes Mittel, und zwar als Bakterizid und Fungizid verwendet werden, das offensichtlich die Form, die Größenverteilung oder die Anzahl der Zellenbestandteile im menschlichen Gesamtblut nicht beeinträchtigt.

Durch die Verwendung der Kombination von Dimethylolharnstoff und Natrium-1-hydroxypyridin-2-thion kommt ein sehr bakterizides Produkt zustande, das dem, das durch den alleinigen Einsatz einer dieser Substanzen erhältlich ist, überlegen ist. Diese Kombination führt zu einem stabilen Hämogramm sowohl bei normalen wie bei abnormalen Proben, wobei gleichzeitig Informationen über die Volmenverteilung der weißen Zellen erhalten werden können, die von einem automatischen Gerät gespeichert werden.

Die Hauptaufgabe des erfindungsgemäßen Verdünnungssystems besteht darin, die Zellengröße und -form zu stabilisieren und die Unversehrtheit sämtlicher Zellenbestandteile des Blutes zu gewährleisten, und zwar in einem Ausmaß, wie es bisher nicht erreicht worden ist, um die diagnostische Genauigkeit der Bluthämogramme zu verbessern, die durch die automatische Volumenverteilungsanalyse und Zählung erhalten werden. Durch die Erfindung wird eine Weiterbildung und Verbesserung des Standes der Technik erreicht, indem die Bedingungen der Zellen im Blutkreislauf im wesentlichen unverändert bleiben, wenn sie verdünnt und für die automatische Blutzellenzählung und -größenbestimmung vorbereitet werden. In Verbindung mit einem geeigneten lysierenden Reagens wird der Stand der Technik derart weitergebildet, daß eine Verteilungsinformation über zwei Volumina der Leukozyten erhältlich ist.

Durch das beschriebene Verdünnungsmittel werden mit einem halbautomatischen oder automatischen Coulter-Blutzellenzählgerät genaue Hämogramme erhalten. Leukozytenhistogramme mit zwei Volumina werden insbesondere dann erhalten, wenn es in Verbindung mit dem lysierenden Gemisch verwendet wird, das im Anspruch 5 angegeben ist.

Eine bevorzugte Formulierung dieses lysierenden Gemischs lautet folgendermaßen:

Das vorstehende lysierende Gemisch oder Reagens ist viel schwächer und weist eine geringere Reaktionsgeschwindigkeit auf, als das gegenwärtig verwendete Lyse S II. Andere quaternäre Ammoniumsalze, die gleichfalls wirksam sind, umfassen Cetrimide (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) und Bretol (Cetyldimethyläthylammoniumbromid), und zwar sowohl allein wie in Kombination mit Dodecyltrimethylammoniumchlorid. Das Verdünnungssystem ist offenbar in der Lage, die Leukozytenmembran so ausreichend zu stabilisieren, daß die Geschwindigkeit der Reaktion des lysierenden Reagens auf einen Punkt herabgesetzt wird, bei dem es möglich ist, das kleinere Volumen der lymphoiden Zellen von den größeren Volumen der myeloiden Arten (Neutrophile, Monozyten, Eosinophile und Basophile) zu unterscheiden. Wiederholte Messungen der Verteilung der Leukozytengröße haben gezeigt, daß die Histogramme bis zu 30 sec stabil sind, bevor eine Degeneration erfolgt. Die Versuchsergebnisse zeigen an, daß die lymphoiden Zellen innerhalb einer lysierenden Zeit von 7,5 sec im wesentlichen auf ihr minimales Zellenvolumen verkleinert werden. Die myeloiden Zellen weisen das zwei- bis dreifache ihres Endvolumens bis zu 30 sec nach der Zugabe des lysierenden Reagens auf, nach welchem Zeitraum sich das Volumen langsam verkleinert, bis die myeloide Fraktion sich mit der lymphoiden Fraktion vermischt.

Bei Verwendung eines kalibrierten Erythrozyten Coulter Modell S Plus und eines kalibrierten Coulter Modell C-1000 Channelyzer, hat sich gezeigt, daß die Volumina der lymphoiden und myeloiden Peaks nach der Behandlung mit dem Reagenssystem etwa 85 Kubikmikrometer bzw. 260 Kubikmikrometer betragen, und zwar mit geringen Verteilungsbreiten. Leukozyten, die aus frischem Gesamtblut durch einfache Sedimentation mittels eines Ficoll-Paque Gradienten erhalten wurden, zeigten Volumina etwa von 260 Kubikmikrometer beim lymphoiden Peak und 500 Kubikmikrometer beim myeloiden Peak mit viel breiteren Verteilungsbreiten. Eine frische Blutprobe, die durch Zentrifugieren mit einem Ficoll-Paque Gradienten nach einem Standardverfahren aufgetrennt wurde, ergab mononukleare Zellen (Lymphozyten und Monozyten), die von Granulozyten (Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen) getrennt waren. Es stellte sich heraus, daß die Lymphozyten mit dem lymphoiden Peak bei 260 Kubikmikrometer zusammenfielen, während sich die Monozyten um 550 Kubikmikrometer zentrierten. Die Granulozytenfraktion bildete einen ziemlich breiten Peak, der sich um 500 Kubikmikrometer zentrierte. Die Trennung der beiden Populationen war mit dem chemisch lysierten Blut bei den Versuchen mit dem Coulter Counter Modell S Plus viel schärfer als mit den lebensfähigen Leukozyten, die mit der Ficoll-Paque-Methode erhalten wurden. Dies verdeutlicht, daß das lysierende Reagens die Leukozyten erheblich beschädigt, da deren Volumen auf das zwei- bis dreifache verkleinert wird, verglichen mit den Leukozyten, die nach der Ficoll-Paque-Trennung der gleichen Blutprobe erhalten werden.

Es hat sich herausgestellt, daß durch die Zugabe von Dodecyltrimethylammoniumchlorid vor allem das Volumen der lymphoiden Zellen verkleinert wird (d. h. eine dreifache Herabsetzung des Volumens von 260 Kubikmikrometer auf 85 Kubikmikrometer), während das Volumen der myeloiden Zellen in geringerem Umfang beeinflußt wird (d. h. eine zweifache Herabsetzung des Volumens von 500 Kubikmikrometer auf 260 Kubikmikrometer). Dodecyltrimethylammoniumchlorid ist als solches ein nur wenig lysierendes Reagens. Anscheinend verringert es die stark lysierende Wirkung von Mytab, so daß die Lysierungsgeschwindigkeit auf ein Maß herabgesetzt wird, das eine Messung der verschiedenen Zellkernvolumina erlaubt. Die Zugabe von Dodecyltrimethylammoniumbromid führt auch zu einer viel sauberen und schnelleren Lyse der Erythozyten und einer schnelleren Umwandlung des Hämoglobins bei geringeren Konzentrationen von Mytab, so daß den Leukozytenpopulationen eine bessere Stabilität verliehen wird.

Vorläufige Werte von mehr als 100 normalen und abnormalen frischen Blutproben, die von einer Blutbank und lokalen Krankenhäusern erhalten wurden, zeigen einen hohen Grad an Korrelation zwischen Leukozytenpopulationswerten bei dem Coulter Counter Modell S Plus-Channelyzer-Gerät und manuellen 100 Zellendifferenzierungen. Obwohl eine leichte Variation der myeloiden und lymphoiden Fraktionen beobachtet wurde, konnten keine drastischen Abweichungen von der Korrelation festgestellt werden.

Beim Einsatz der Kombination von verdünnendem und lysierendem Reagens ergaben spektrophotometrische Aufnahmen (Wellenlänge gegenüber Absorption) des lysierten Blutes von dem Leukozytenbad des Coulter Counter Modell S Plus Hämoglobinkurven, die im wesentlichen mit jenen, die mit Lyse S II erzeugt werden, identisch waren. Allerdings waren die Absorption bei 540 nm und die erhaltenen errechneten Hämoglobinwerte etwa 0,2 g/l höher als bei der Kombination von Isoton II und Lyse S II. Auch wurde festgestellt, daß die mittleren Zellenvolumenwerte um 1,0 bis 1,5 Kubikmikrometer in dem neuen Zwei-Reagenziensytem größer waren. Alle anderen Parameter waren im wesentlichen mit jenen identisch, die mit der Kombination von Isoton II und Lyse S II erhalten wurden.

Claims

1. Isotonisches Verdünnungsmittel zum Verdünnen von Gesamtblut mit einer wäßrigen Lösung eines Gemisches von Verbindungen zum Stabilisieren von Blutzellen bestehend aus

a) einem oder mehreren anästhetischen Mitteln wie Procainhydrochlorid, oder einem 4-Aminobenzoesäureesterderivat,
b) N-(2-Acetamido)-Iminodiessigsäure (ADA) als organischem Puffer,
c) einer oder mehreren Verbindungen aus der Gruppe bestehend aus Chlorhexidendiacetat, Dimethylolharnstoff oder Natrium-1-hydroxypyridin-2-thion als keimtötende Mittel,

wobei das Verdünnungsmittel erforderlichenfalls mit einer Natriumhydroxid- oder Chlorwasserstoffsäure-Lösung auf einen pH-Wert von 7,0±0,1 und mit Natriumchlorid und Natriumsulfat auf eine Osmolalität von 320±5 Milliosmol pro kg eingestellt ist.

2. Isotonisches Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich wenigstens eine der Verbindungen Hexamethylentetramin und N-Hydroxymethylacetamid enthält.

3. Isotonisches Verdünnungsmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Procainhydrochlorid 0,11 g/l beträgt.

4. Isotonisches Verdünnungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von N-(2-Acetamido)-Iminodiessigsäure 1,4 g/l beträgt.

5. Verwendung eines isotonischen Verdünnungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einem Gemisch von Dodecyltrimethylammoniumchlorid und Tetradecyltrimethylammoniumbromid.