SE503205C2 - Lyseringsreagens - Google Patents

Description

Coulter Counterüäikmel S Plus automatiserad blodcellräknare är konstruerad att utspäda ett helblodsprov i ett isotoniskt utspädningsmedel och ett lyse- ringsagens och därefter påbörja räkning efter 7,5 sekunder. Data uppsamlas under Å sekunder för erytrocyter och leukocyter och upp till 20 sekunder för plättar. Ett utspädnings-lyseringssystem måste åstadkomma erytrocytlyserings- kinetik tillräckligt snabb för att medföra fullständig stromatisation under lyseringsperioden, men skalar icke fullständigt leukocyterna under denna tid.

Dessutom måste ändringarna av leukocytvolymen vara minimala under datauppsam- lingssteget och den skulle i idealfallet vara stabil under åtskilliga minu- ter. Reagenssystemet måste även bevara integriteten ifråga om erytrocyt- och plättantal och storleksfördelning, hemoglobinabsorbanskurvan och den totala leukocyträkningen. Blod från stick i fingrar måste vara stabilt efter förut- spädning i det isotoniska utspädningsmedlet under åtminstone två timmar.

För att ernå en analys av de relativa populationerna av lymfoida och myeloi- da celler i blodet måste leukocytvolymhistogrammet visa klart separerade lym- foida och myeloida toppar med ringa erytrocytavfall för att tillåta dalar mycket nära baslinjen. Integration av varje topp kommer att giva de relativa populationerna av de lymfoida och myeloida cellerna. Den lymfoida toppen har visats innehålla lymfocyter och små icke typiska lymfocyter under det att den myeloida toppen innehåller polymorfonukleära celler, band, monocyter, eosinofiler, basofiler och stora icke typiska lymfocyter.

I det amerikanska patentet 3,87ü,852 (1975) har inkluderats en formel för en sammansättning, som innehåller kvartärt ammoniumsalt-detergent och cyanid att användas som ett lyserings- och kromagenbildande reagens för erhållande av en- volymleukocyträkning och hemoglobinbestämning i Coulter Counter Model S. Yt- terligare undersökning erfordrades för att använda kvartärt ammoniumsalt som lyseringsagens för erhållande av tvåpopulation- leukocyträkning.

Enl. US-patentet ü,286,963 innehåller ett lytiskt utspädníngsmedel för snabb lysering av röda blodceller i helblod för att göra en skillnadsbestämning av lymfoida/myeloida populationer av leukocyter och även för mätning av hemoglo- bin genom kromagenbildning en blandning av vattenhaltig saltlösning av åtmins- tone ett kvartärt ammoniumsalt med ytaktiva egenskaper och vissa tillsatser, såsom 2-fenoxietanol.

Volymfördelningsanalysen är besvärlig på grund av att med många utspädningsme- del de två populationerna snabbt går över till en så att det icke förefinns tillräckligt med tid, inom vilken beräkningarna för analysen skall ske. \ i.) (II Den föreliggande uppfinningen avser ett lyseringsreagenssystem för att till- låta rutinberäkning av traditionella hemogramvärden, liksom presentation och beräkning av de lymfoida/myeloída histogrammen för leukocyterna och deras re- lativa koncentrationer, särskilt i automatiska räkningssystem, exempelvis den automatiserade Coulter Counter utrustningen med omodifíerad programmering och möjligheterna hos ett yttre eller inre leukocyt-Channelyser instrument.

Ett isotoniskt blodutspädningsmedel omfattar en blandning av organiska buff- rar, anestetika och germocider i en osmotiskt balanserad och i huvudsak neut- ral lösning och tjänar till att sakta ned kinetiken ifråga om cytoplasmisk skalning från leukocyterna under stabilisering av de traditionella hemogram- pê Fametfa Fila.

Lyseríngsreagenset är en blandning av en vattenlösning av åtminstone två kvartära ammoniumsalter med ytaktiva egenskaper och en alkalimetallcyanid in- om ett koncentrationsområde, som är verksamt att giva tvåvolymleukocythisto- gram. Presentationen av data kan ske under användning av Coulter Counter utrustning av standardtyp i förening med en Channelyzer och en X-Y-skriva- re. Underordnade beräknings- och databehandlingsanordningar är önskvärda för fullständig automatisering, men är icke väsentliga för mätningarnas genomfö- rande.

I enlighet med uppfinningen har åstadkommits: Ett lyseringsreagens omfattande en blandning av en vattenhaltig lösning av åtminstone två kvartära ammoniumsalter med ytaktiva egenskaper och en alkali- metallcyanid inom ett koncentrationsområde, som är verksamt att giva tvåvo- lymleukocythistogram.

Ett sätt att bestämma leukocyter och hemoglobin i blodet, där ett lyserings- reagens, som innehåller en vattenhaltig lösning av två kvartära ammoniumsal- ter med ytaktiva egenskaper och en alkalimetallcyanid användes för att strom- atolysera erytrocyter och plättceller och omvandla hemoglobin till kromagen, med det nämnda kvartära ammoniumsaltet med tre alkylgrupper med kort kedja och en alkylgrupp med lång kedja bundna till kväve, kännetecknas av, att nämnda kvartära ammoniumsalter och nämnda alkalimetallsalt finns inom ett koncentrationsområde effektivt att giva tvåvolymleukocythistogram och till- låta rutinberäkning av leukocyternas lymfoida/myeloida histogram och deras relativa koncentrationer, särskilt i automatiska räkningssystem. .-- -»~ r " "' ï '-~ =E;n Ütspädningsmedlet kommer att återgiva noggranna hemïâyam genom vilken som helst halvautomatíserad eller automatiserad Coulter blodcellräknare och kommer att frambringa tvåvolymleukocythistogram använd i förening med ly- seringsreagenset enl. uppfinningen.

Lyseringsreagenset är en vattenhaltig lösning av åtminstone två kvarrära am- moniumsalter med ytaktiva egenskaper och en alkalimetallcyaníd, såsom all- mänt beskrivits i det amerikanska patentet 3,87h,852, för erhållande av en- dast envolymleukocyträkning. Det verksamma området och koncentrationen av beståndsdelarna, som här givits, måste specifikt följas för erhållande av -tvåpopulationsräkningen av leukocyter enl. denna uppfinning.

I de föredragna sammansättningarna har alkyl med lång kedja i den följande formeln 12 - 16 kolatomer och de korta kedjorna är trímetyl och X- är klo- rid eller bromid. Det detergent, som utgöres av kvartärt ammoniumsalt har formeln: där RI är en alkylradikal med lång kedja och med 10 till 18 kolatomer och R2, R3 och Rh är alkylradikaler med kort kedja och med 1 till 6 kolatomer och X' är ett salt, som bildar enlradikal, såsom Cl, Br, I, PD¿ och CH3S0h.

En föredragen sammansättning av lyseringsreagenset är: Beståndsdel Verksamt koncentrationsområde Dodecyltrimetylammoniumkiorid 60 g/l ü0 - 70 g/l S0 2 lösning Tetradecyltrimetylammoniumbromid 6 g/l H - 7 g/l Mytab Kaliumcyanid 300 mg/l 250 - S00 mg/l Vatten tillräckligt för l liter Det nyssnämnda lyseringsreagenset är mycket svagare och långsammare ifråga om reaktionshastigheten än det för närvarande använda Lyse S . Aläfišnativa kvartära ammoniumsalter som även är verïâšmma inkluderar Cetrimide (hexa- decyltrimetylammoniumbromid) och Bretol (cetyldimetyletylammoníumbromid), såväl ensamma som i kombination med dodecyltrímetylammoniumklorid. Utspäd- ningssystemet är tydligen i stånd att stabilisera leykocytmembranen tillräck- ligt för att sakta ned Iyseringsreagensreaktionens kinetik till en punkt, där det är möjligt att skilja den mindre volymen lymfoida celler från den större volymen myeloida serier (neutrofiler, monocyter, eosinofiler och basofiler).

Upprepade mätningar av leukocytstorleksfördelningen har visat att histogram- men är stabila upp till 30 sekunder före degenereringen. Experimentella re- sultat anger att lymfoida celler minskas till i huvudsak deras minimicellvo- lymer inom lyseringstiden 7,5 sekunder. De myeloida cellerna uppträder två till tre gånger deras slutvolym under upp till 30 sekunder efter tillsätt- ningen av lyseringsreagenset och efter denna tid kommer volymen att långsamt minskas till dess att den myeloida fraktionen blandar sig med den lymfoida fraktionen.

Vid användning av en erytrocytkalibrerad Coulter(:) Model S Plus och en ka- librerad Coulter Model C-1000 Channelyzer visade sig volymerna hos de lymfoida och myeloida topparna efter behandling med reagenssystemet ligga i närheten av 85 um3 resp. 260 um3 med smala fördelningsbredder. Leukocyte er- hållna från färskt helblod genom enkel sedimentering på en Ficoll-Paque(f) gradient uppvisade volymer av ungefär 260 um3 för den lymfoida toppen och 500 um3 för den myeloida toppen med mycket bredare fördelningsbredder. Ett prov på färskt blod avskilt genom centrifugering_på en Ficoll-Paque gradi- ent under användning av standardteknik frambragte mononukleära celler (lymfo- cyter och monocyter) skilda från granulocyter (neutrofiler, eosinofiler och basofiler). Lymfocyterna visade sig sammanfalla med den lymfoida toppen vid 260 um3, under det att monocyterna visade sig vara centrerade runt 550 um3.

Granulocytfraktionen bildade en ganska bred topp centrerad kring 500 um3.

Särskiljandet av de två populationerna var mycket distinktare med det ke- miskt lyserade blodet från experimenten med Coulter Counter Model S Plus än med de livskraftiga leukocyter, som erhållits genom Ficoll-Paque meto- den. Det är därför tydligt att lyseringsreagenset skadar leukocyterna avse- värt, eftersom deras volymer minskas två till tre gånger i jämförelse med Ieukocyter erhållna från Ficoll-Paque separation av samma blodprov.

I den föreliggande uppfinningen har införlivandet av dodecyltrimetylammonium- klorid visat sig företrädesvis minska volymen hos de lymfoida cellerna (näm- ligen en trefaldig minskning i volym från 260 um3 till 85 um3), men påverkar volymen av de myeloida cellerna i mycket mindre omfattning (nämligen en två- faldig minskning i volym från 500 um3 till 260 um3). Dodecyltrimetylammonium- klorid är i själva verket i sig ett dåligt lyseringsreagens. Det verkar att mildra de kraftiga lytiska verkningarna av Mytab(:) och sakta ned lyserings- kínetíken till en grad, som tillåter mätning av de skilda cellkärnevolymerna. lnförlivandet av dodecyltrimetylammoniumbromid ger även en mycket klarare och snabbare lyseríng av erytrocyterna och snabbare omvandling av hemoglobinet med lägre koncentrationer av Mytab och medför sålunda bättre stabilitet hos leukocytpopulationerna.

Preliminära data för mera än etthundra normala och onormala prover på färskt blod erhållna från en blodgivarcentral och lokala sjukhus anger en(É?g grad av korrelation mellan leukocytpopulationsdata från Coulter Counter Model S Plus - Channelyzer systemet och manuella 100 cellskillnader. Ehuru en ringa variation observerades i myeloid- och lymfoidfraktioner har inga dras- tiska avvikelser från korrelation observerats.

Under användning av kombinationen av utspädnings- och lyseringsreagenset enl. uppfinningen har spektroskopiska avsökningar (vågl"ngd versus absorbans) hos lyserat blod från leukocytbadet i Coulter Counter(É> Model S Plus frambragt hemoglobinkurvor i huvudsak identiska med dem som frambragts av Lyse S ll, men absorbansen vid SHO nm och de resulterande beæšrnade hemogläïšnvärdena är ungefär 0,2 g/l högre än vid kombinationen Isoton ll och Lyse Il. Cell- medelvolymvärden har även noterats vara 1,0 till 1,5 um3 större i de nya två reagenssystemen. Alla andra parametrar är egentligen identiska med dem som frambragts genom kombinationen av Isoton Il och Lyse Il.

Claims (4)

P A T E N T K R A V 1. Lyseringsreagens för användning tillsammans med ett isotoniskt utspädningsmedel för erhållande av ett utspätt helblodsprov för mätning av hemogramvärden och skillnads- bestämning av leukocytpopulationer, kännetecknat av en blandning av en vattenhaltig lösning bildad genom att blanda åtminstone två i huvudsak rena kvartära ammonium- salter, varvid åtminstone ett av nämnda kvartära ammo- niumsalter har formeln Ia och det andra av nämnda kvartära salter har formeln Ib: ""*_' 'F-*f R* R2 R; R2 \ / \ / Ia N X" lb N \\ X' Lß/ W m. i: där Ria är en alkylradikal med en lång kedja med 12 kolatomer och Rlb är vald inom den grupp som består av alkylradikaler med lång kedja med 14 kolatomer, 16 kolatomer och blandningar härav, och R2 och R3 och R4 är alkylradikaler med korta kedjor med 1 till 6 kolatomer och X" är en saltbildande radikal vald inom den grupp, som består av Cl", Br", I", PO"3, HSO"4 och CH3S0"4, med kombinationen av de nämnda salterna förefintlig i en mängd, som är sådan att den nämnda kombinationen uppvisar ytaktiva egenskaper verksamma att giva åtminstone ett tvåvolymleukocythistogram med avskiljande av åtminstone tvåleukocytpopulationer,medautomatiskaräkningssystem. (TI F; r :j f- \-' x) Lyseringsreagens enligt krav 1, kännetecknat av, att R2, R3 och R4 är alkylradikaler med kort kedja med 1 till 2 kolatomer. Lyseringsreagens enligt något av kraven 1-2, kännetecknat av, att nämnda kvartära ammoniumsalter är en blandning av dodecyltrimetylammoniumklorid och tetradecyltrimetyl- ammoniumbromid. Lyseringsreagens enligt krav 3, kännetecknat av, att beståndsdelarnas koncentration är följande: Beståndsdel Verksamt koncentra- tionsområde a) Dodecyltrimetylammonium- 40 till 70 g/1 klorid, 50% lösning b) Tetradecyltrimetylammo- 4 till 7 g/l niumbromid c) Kaliumcyanid 250 till 500 mg/1 d) Vatten tillräckligt för 1 liter. Lyseringsreagens enligt krav 4 kännetecknat av, att det har följande utformning: Beståndsdel Verksamt koncentra- tionsområde a) Dodecyltrimetylammonium- 60 g/l klorid 50% lösning b) Tetradecyltrimetylammo- 6 g/l niumbromid c) Kaliumcyanid 300 mg/l d) Vatten tillräckligt för 1 liter. Lyseringsreagens enligt något av kraven 1-5, kännetecknat av, att den nämnda kombinationen av de nämnda kvartära ammoniumsalterna uppvisar ytaktiva egenskaper, som är verksamma att företrädesvis minska lymfoidcellernas volym från ungefär 200 kubikmikron till ungefär 85 kubikmikron medan myeloidcellernas volym minskas i mindre omfattning från ungefär 500 kubikmikron till ungefär 260 kubikmikron under det nämnda automatiska räkningssystemets uppsamlingstid. Lyseringsreagens enligt något av kraven 1-6, kännetecknat av, att det tillhandahålles i kombination med ett isoto- niskt blodutspädningsmedel, som omfattar en vattenhaltig lösning av en blodcellstabiliserande blandning, med blandningen i lämplig koncentration för att sakta ned kinetiken ifråga om cytoplasmavskalning från leukocyterna, medan de traditionella hemogramparametrarna stabiliseras och det nämnda utspädningsmedlet är i huvudsak neutralt. Lyseringreagens enligt krav 7, kännetecknat av, att det nämnda utspädningsmedlet utgöres av:

1. N-(2-acetamid iminodiättiksyra,

2. Prokainhydroklorid,

3. en eller flera cellmembranstabiliserare valda inom den grupp som består av: - dimetylolurea, - hexametyltetramin och - N-hydroximetylacetamid och

4. en eller flera germicider valda ur den grupp, som består av: - klorhexidendiacetat, - dimetylolurea och - natrium 1-hydroxipyrídin-2-tion. (Il (I) (JJ 10. F) LH .'\ i) Sätt att bestämma åtminstone två populationer av leuko- cyter i ett helblodprov, kännetecknat av utspädning av det nämnda provet med ett isotoniskt utspädningsmedel och lysering med ett reagens, som omfattar en vattenhaltig lösning bildad genom att blanda åtminstone två i huvudsak rena kvartära ammoniumsalter, varvid åtminstone ett av nämnda kvartära ammoniumsalter har formeln Ia och det andra av de kvartära ammoniumsalterna har formeln Ib: ___ + --- -v-i + R1 R2 Rg R2 a _ \ / \ / la N x- lb /N \ X' +23/ J: där Ria är en alkylradikal med en lång kedja med 12 kolatomer och Rlb är vald inom den grupp, som består av alkylradikaler med lång kedja med 14 kolatomer, 16 kolatomer och blandningar härav, och R2 och R3 och R4 är alkylradikaler med korta kedjor med 1 till 6 kolatomer och X" är en saltbildande radikal vald inom den grupp, som består av Cl", Br", I", P0"3, HSO"4 och CH3S0"4, med kombinationen av de nämnda salterna förefintlig i en mängd, som är sådan att den nämnda kombinationen uppvisar ytaktiva egenskaper verksamma att stromatolysera erytro- cyter och plättceller och att medföra åtminstone ett tvåvolymleukocythistogram med särskiljande av åtminstone två leukocytpopulationer, under användning av ett automa- tiskt räkningssystem. Sätt enligt krav 9, kännetecknat av, att R2, R3 och R4 är alkylradikaler med kort kedja och med 1 till 2 kolatomer. ll. 12. H rf) Q) .J-I I Sätt enligt krav 10, kännetecknat av, att bestånds- delarnas koncentration är: Verksamt koncentra- tionsområde Beståndsdel a) Dodecyltrimetylammonium- 40 till 70 g/l klorid, 50% lösning b) Tetradecyltrinetylammo- 4 till 7 g/l niumbromid c) Kaliumcyanid 250 till 500 mg/l tillräckligt för 1 liter. d) Vatten Sätt enligt krav 10 och 11, kännetecknat av följande utformning: Beståndsdel Verksamt koncentra- tionsområde a) Dodecyltrimetylammonium- 60 g/l klorid 50% lösning b) Tetradecyltrimetylammo- 6 g/l niumbromid c) Kaliumcyanid 300 mg/l d) Vatten tillräckligt för 1 liter.