NO163426B - Lyseringsreagens og fremgangsmaate ved lysering. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et lyseringsreagens for forskjellsbestemmelse av leukocyttpopulasjoner og for å gi minst et tovolum leukocytthistogram med separering av minst to leukocyttpopulasjoner med automatisk tellingssystem.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte ved lysering under anvendelse av dette reagens.

Det har vært ønskelig å utvikle reagenser og fremgangsmåter for anvendelse til "Coulter Counter", modell S Plus automatisert blodteller, noe som muliggjør at cellevolumdata akkumulert på et "Coulter Channelyzer" å diskriminere to populasjoner leukocytter: (1) en lymfoid (lymfocytt) populasjon og (2) en myeloid (neutrofi ler, monocytter, eosinofiler og basofiler) populasjon. Den slags data er nyttige som sorteringsverktøy for å oppdage unormale leukocyttoppførsel. Unormale situasjoner som signaliseres ved denne metode gir informasjoner som har betydning for diagnoser og som tjener til ytterligere studier.

Separering av vanlige menneskelige leukocytter ved volumfor-deling under anvendelse av det prinsipp for telling og størrelsesbestemmelse som er er utviklet av Wallace H. Coulter og som anvendes i instrumenter av typen "Coulter Counter", tillempes nu som en klinisk diagnostiseringsmetode. Denne metode baserer seg på den fundamentale egenskap hos alle levende celler til å regulere sitt cellevolum ved genetisk kodeinformasjon. Hver celletype i det sirkulerende blod har sitt eget karakteristiske volum som strekker seg fra en så liten verdi som 3 ym<3>for plater til 450 pm<3>for polymorfonukleære celler. Avanserte "Coulter Counter"-instrumenter er konstruert for å benytte seg av denne volumforskjell i det formål å telle og å bestemme størrelses- fordelingen av plater og erytrocytter for å detektere og overvåke patologiske tilstander.

Erytrocytter og lymfoide leukocytter overlapper hverandre beklageligvis i stor grad når det gjelder cellestørrelse og det er ikke mulig å telle én av dem når den andre er tilstede kun ved størrelsesdiskriminering. Vanlig praksis omfatter anvendelse av et kraftig lytisk overflateaktivt middel som stromatolyserer erytrocyttene og reduserer dem til meget små partikler eller forårsaker membranoppløselighet og skiller av cytoplasma fra både de lymfoide og de myeloide leukocytter og lar tilbake kun de lyse-resistente kjerner til telling. Ettersom de opprinnelige cellevolumer påvirkes drastisk og reduseres til et minimum, er kun én populasjon synlig ved størrelsesfordelingsanalyse.

"Coulter Counter" model S Plus automatisk blodcelleteller er konstruert til å fortynne en fullblodprøve i et isotonisk fortynningsmiddel og et lyseringsmiddel og deretter å påbegynne telling etter 7,5 sekunder. Data samles i 4 sekunder for erytrocytter og leukocytter og opp til 20 sekunder for plater. Et fortynnings-lyseringssystem måtte tilveiebringe en erytrocyttlyseringskinetikk tilstrekkelig hurtig til å medføre fullstendig stromatisering i lyserings-perioden, men ikke fullstendig å skalle av leukocyttene i denne tid. Dessuten måtte forandringene av leukocyttvolumene være minimale i dataoppsamlingstrinnet og skulle i idealtil-fellet være stabile 1 flere minutter. Reagenssystemet måtte også bevare integriteten i forbindelse med erytrocytt- og plateantallet og størrelsesfordeling, hemoglobinabsorbans-kurven og den totale leukocyttelling. Blod fra stikk i fingeren måtte være stabilt etter foruttynnlng i det isotekniske fortynningsmiddel :L det minste i 2 timer.

For å oppnå en. analyse av de relative populasjoner av lymfoide og myeloide celler i blodet må leukocyttvolum-histogrammet vise klart separerte lymfoide og myeloide topper med lavt erytrocyttavfall for å tillate deler meget nær basislinjen. Integrasjon av hver topp vil gl de relative populasjoner av de lymfoide og myeloide celler. Den lymfoide toppen er vist å inneholde lymfocytter og små ikke-typiske lymfocytter mens den myeloide topp inneholder polymorfonukleære celler, bånd, monocytter, eoslnofiler, basofiler og store typiske lymfocytter.

I US-PS 3 874 852 er det inkludert en formel for en sammensetning som inneholder en kvaternær ammoniumsalt-detergens og cyanid til anvendelse som lyserings- og kromagendannende reagens for å oppnå en envolumleukocytttel1 ing og hemoglobin-bestemmelse i "Coulter Counter" modell S. Videre under-søkelser var nødvendige for å anvende kvaternært ammoniumsalt som lyseringsreagens for å oppnå en topopulasjon-leukocytt-telling.

Det er også kjent produkter som inneholder et lytisk fortynningsmiddel for hurtig lysering av røde blodceller i fullblod for å foreta en forskjellsbestemmelse av lymfoide/- myeloide populasjoner av leukocytter og også for måling av hemoglobin ved kromagendannelse, en blanding av vannholdig saltoppløsning av minst ett kvaternært ammoniumsalt med overflateaktive egenskaper og visse tilsetninger som 2-fenoksyetanol.

Volumfordelingsanalysen er besværlig på grunn av at de to populasjoner ved mange fortynningsmidler hurtig går over til én, slik at det ikke er tilstrekkelig tid til at beregningene for analysen skal kunne skje.

Foreliggende oppfinnelse angår et isotonisk lyseringsreagens og en fremgangsmåte for anvendelse av dette lyseringsreagens i et lyseringsreagenssystem for å tillate rutineberegning av tradisjonelle hemogramverdier samt presentasjon og beregning av de lymfoide/- myeloide histogrammer for leukocytter og deres relative konsentrasjoner, spesielt i automatiske beregningssystemer, for eksempel den automatiske "Coulter Counter"-utrustning med umodifisert programmering og mulighetene for et ytre eller indre leukocytt-"Channelyzer"-instrument.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse et lyseringsreagens av den innledningsvis kjente type og dette karakteriseres ved at det er ment til bruk sammen med et isotonisk fortynningsmiddel for å oppnå en fortynnet fullblodprøve, og ved at lyseringsreagensen omfatter en vandig blanding tildannet ved å blande minst to i det vesentlige rene kvaternaere ammoniumsalter, idet minst ett av de kvaternaere ammoniumsalter har formelen Ia og det andre av de kvaternaere salter har formelen Ib:

der R^a er en alkylrest med 12 karbonatomer og R<*>b er valgt innenfor en gruppe som består av alkylrester med 14 karbonatomer, 16 karbonatomer og blandinger derav, samt der R^,R<3>og R<4>er alkylrester med 1 til 6 karbonatomer og X~ er en skalldannende rest valgt blant Cl~, Br~, I~, PO3, HS04~ og CHgSO^—.

Presentasjonen av data kan skje under anvendelse av "Coulter Counter"-utrustning av standardtype i forbindelse med en "Channelyzer" og en X-Y-skriver. Underordnede beregnings- og databehandlingsanordninger er ønskelige for fullstendig automatisering, men er ikke vesentlige for målingenes gj ennomf0 r i ng.

Oppfinnelsen angår som nevnt innledningsvis også en fremgangsmåte ved lyserIng og denne karakteriseres ved at det anvendes et lyseringsreagens som beskrevet ovenfor i kombinasjon med et isotonisk blodfortynningsmiddel omfattende et anestetikum som inkluderer 4-aminobensosyreesterderivat, minst en organisk buffer og minst et germicid.

En måte for bestemmelse av leukocytter og hemoglobin i blodet er et lyseringsreagens som inneholder en vannholdig oppløs-ning av et kvaternært ammoniumsalt med overflateaktive egenskaper og et alkalimetallcyanid anvendes for å stromatolysere erytrocytter og plateceller og omdanne hemoglobin til kromagen, med det nevnte kvaternære ammoniumsalt med 3 alkylgrupper med kort kjede og en alkylgruppe med lang kjede bundet til nitrogen, omfatter at nevnte kvaternære ammoniumsalt og nevnte alkalimetallcyanid foreligger innen et konsentrasjonsområde effektivt til å gi tovolumleukocytthistogrammer og å tillate rutineberegning av leukocyttenes lymfoide/myeloide histogrammer og deres relative konsentrasjoner, spesielt i automatiske beregningssystemer.

Et for flere formål ment isotonisk fortynningsmiddel er en vannholdig oppløsning av: 1. organiske buffere; 2. anestetika som inkluderer 4-aminobenzosyreesterderivater; og 3. germicider;

med det nevnte fortynningsmiddel innstilt til en pH-verdi på 7,0 + 0,1 ved hjelp av natriumhydroksyd eller saltsyre-oppløsning i forbindelse med det som er nødvendig til en osmolalitet på 320 + 5 mosmol/kg med natriumklorid og natriumsulfat.

Et foretrukket isotonisk fortynningsmiddel er:

Dette fortynningsmiddel innstilles til en pH-verdi på 7,0 + 0,1 ved hjelp av natriumhydroksyd eller saltsyreoppløsning i henhold til det som er nødvendig. Osmolaliteten innstilles til 320 + 5 mosmol/kg med natriumklorid.

Det er kjent at blodceller inneholder ATPasF-enzymer som transporterer alkalimetallkatloner som hører sammen med små anioner (for eksempel klorid) inn i og ut av cellen gjennom en energikrevende mekanisme for å bibeholde den osmotiske balanse, cellens tergiditet og korrekte membranpotensialer. Natriumioner som hører sammen med et meget større sulfatanion vil tydeligvis ikke transporteres så lett på grunn av de større forskjeller i ladningstettheten mellom sulfat- og kloridanioner og potensialendringen i membranladningen når ioner transporteres inn I eller ut av cellen. Balansen når det gjelder det indre osmotiske trykk I cellen bibeholdes ved inneslutning av omtrent 30 mosmol natriumklorid. Natriumsulf at er kjent for sin evne til å gjøre abnorme plasmaglobuliner oppløselige eller å redusere eller fjerne uklarhet i hemoglobinoppløsningen på grunn av høye leukocyt-tellinger.

Prokainhydroklorid, som av en klasse anestetika (bedøvelses-midler) inkludert 4-aminobenzosyreesterderivater og deres salter, er sagt å oppvise en stabiliserende virkning på erytrocyttmembranet, men virkningsmåten er usikker.

Anvendelsen av N-(2-acetamid)iminodieddiksyre (ADA), en organisk buffer, er basert på dennes evne til å understøtte det svake lyseringsmiddel i form av det kvaternære ammoniumsalt for å redusere lysert erytrocyttavfall til partikkel-størrelser som elektrisk er mindre enn 45 pm<3>og således hindre erytrocyttforstørrelse av tellingen av leukocytter og fordelingen til to distinkte populasjoner (lymfoide og myeloide).

Selv om mekanismen det er snakk om med henblikk på virkningen av ADA Ikke er undersøkt nøyaktig, er det kjent at den er en rimelig sterk ligand for gruppe II-alkalimetaller og gruppe IIB-overgangsmetaller samt også en rimelig effektiv buffer. Da den 1 høy grad ligner en aminosyre, blir tydeligvis ADA trukket til og også bragt i vekselvirkning med cellemembran proteiner. Den koordineres da med metallkationer og gir den ytre membranoverflaten "oppførselen" av en mere positiv ladning overfor den omgivende oppløsning og oppmuntrer således oppløsning og anionattraksjon rundt den ytre membran. Denne belegning av oppløsningsmolekyler og deres anioner hindrer på effektiv måte tilnærming til og sammenliming med andre celler i suspensjon. Buffervirkningen hos ADA hindrer endringer i denne "lokale" omgivelse og oppløsning og tap av stabilitet.

Denne mekanisme koblet til virkningen av et lokalt anestetikum, for eksempel prokainhydroklorid, og natriumsulfat hjelper til med stablisering av blodprøvens celleformlge komponenter og gjør dem i det vesentlige uforandret fra deres opprinnelige tilstand i blodprøven når det gjelder antall, størrelsesfordeling og form. Denne faktor er av stor diagnostisk betydning ved tolking av de tradisjonelle hemogramparametre.

Klorheksidendiacetat, som vanligvis anvendes som vlrocid og germicid, er kun marginalt effektivt I seg selv ved den anvendte konsentrasjon, men understøtter signifikant ADA til å redusere bakgrunnsavfallet som forstyrrer beregningen av leukocyttstørrelsesfordelingen. Klorheksidendiacetat har også likhet med aminarglnin og guanidin og kan forventes å vekselvirke med membranproteiner ved koordinering hydrogen-binding. Som sådan understøtter det tydeligvis lyserings-agensene i fullstendig å stromatolysere erytrocyttmembranene.

Dimetylolurinstoff, et kondensat av formaldehyd og urin-stoff, er ansett å reagere meget langsomt 1 oppløsning med nøytral pH-verdi med leukocyttmembranet for å gl et mål på stabiliteten ved henstand som ikke er tydelig når denne forbindelsen ikke er tilstede. Det er kjent som bakterio-statisk antiseptisk forbindelse som hindrer vekst av mikroorganismer ved moderate konsentrasjoner. Andre forbindelser som er tilført for å stabilisere leukocytter er heksametylentetramin og N-hydroksymetylacetamid.

Natrium-l-hydroksypyridin-2-tion er kjent for anvendelse som fungicid og baktericid og fungicid som ikke oppviser noen tydelig forstyrrende virkning på formen, størrelsesfordel-ingen eller antall celleformige komponenter i menneskelig fullblod.

Anvendelse av kombinasjonen av dimetylolurinstoff og natrlum-l-hydroksypyridin-2-tion gir et meget bakteriocid produkt som er overlegent det som kan op>pnås med noen av stoffene alene. Denne kombinasjon gir et stabilt hemogram for såvel normale som anormale prøver samtidig som den tillater informasjon på volumfordelingen av hvite celler som skal samles av et automatisk instrumeringssystem.

Det primære mål for dette fortynningssystem er å stabilisere cellestørrelse, form og integritet for alle celleformige komponenter i blodet i et omfang som tidligere ikke har vært mulig for herved å fremme diagnostlseringsnøyaktigheten i blodhistogrammer som stammer fra automatisert volumfor-del ingsanalyse og telling. Foreliggende oppfinnelse tillater en utstrekning og forbedring av teknikkens stand ved å gjøre cellenes blodstrømningstilstand relativt uforandret ved fortynning og preparering for automatisert blodcelletelling og størrelsesbestemmelse. Anvendt i forbindelse med et egnet lyseringsmiddel kan teknikkens stand strekkes til å oppnå tovolumfordelingsinformasjoner med henblikk på leukocytter.

Det beskrevne fortynningsmiddel vil gi nøyaktige hemogrammer ved hjelp av en hvilken som helst halvautomatisk eller helautomatisk "Coulter"-blodcelleteller, men vil gi tovolumleukocytthistogrammer kun anvendt i forbindelse med lyseringsreagensen ifølge oppfinnelsen.

Lyseringsreagensen er en vandig oppløsnig av minst ett kvaternært ammoniumsalt med overflateaktive egenskaper og et alkalimetallcyanid som generelt beskrevet i US-PS 3 874 825, for oppnåelse av en eneste envolumleukocyttelling. Det virksomme området og konsentrasjonen av bestanddelene som er gitt må spesifikt følges for å oppnå topopulasjonstelling av leukocytter i henhold til foreliggende oppfinnelse.

I de foretrukne sammensetninger har alkyl med lang kjede i den følgende formel 12 - 16 karbonatomer, og de korte kjeder er trimetyl og X~ er klorid eller bromid: Det detergens som utgjøres av det kvaternære ammoniumsalt har formelen:

der Ri er en alkylrest med lang kjede og med 10 - 18 karbonatomer og R£, R3og R4er alkylradikaler med kort kjede og med 1-6 karbonatomer og X~ er et salt som danner en rest som Cl, Br, I, PO4og CH3SO4.

En foretrukken sammensetning av lyseringsmidlet er:

Det nettopp nevnte lyseringsmiddel er meget svakere og langsommere når det gjelder reaksjonshastigheten enn det I dag anvendte "Lyse S" II. Alternative kvaternære ammoniumsalter som også er virksomme inkluderer "Cetrimide"

(heksadecyltrimetylammoniumbromld), både alene og i kombinasjon med dodecyltrimetylammoniumklorld. Fortynningssystemet er tydeligvis istand til å stabilisere leukocyttmembranene i tilstrekkelig grad til å sinke lyseringsagensreaksjonens kinetikk til et punkt der det er mulig å skille det mindre volum lymfoide celler fra det større volum av den myeloide serie (neutrofiler, monocytter, eosinofiler og basofiler). Gjentatte målinger av leukocyttstørrelsesfordelingen har vist at histogrammene er stabile opp til 30 sekunder før degene-rering. Eksperimentelle resultater angir at" lymfoide celler forminskes til i det vesentlige deres minimicellevolumer innen lyseringstiden 7,5 sekunder. De myeloide celler opptrer 2-3 ganger deres sluttvolum i opptil 30 sekunder etter tilsetningen av lyseringsmidlet, og etter dette tidspunkt reduseres volumet langsomt Inntil den myeolide fraksjon blander seg med den lymfoide fraksjon.

Ved anvendelse av en erytrocyttkalibrert "Coulter" modell S Plus og en kalibrert "Coulter" modell C-1000 "Channelyzer" viste det seg at volumene.for de lymfoide og myeloide topper etter behandling med reagenssystemet lå i nærheten av 85 pm<3>henholdsvis 260 ym<3>med smale fordelingsbredder. Leukocytter oppnådd fra ferskt fullblod ved enkel sedimentering på en "Ficoll-Paque"-gradient oppviste volumer på ca. 260 pm<3>for den lymfoide toppen og 500 pm<3>for den myeloide toppen med meget bredere fordelingsbredder. En prøve på fullblod separert ved sentrifugering på en "Ficoll-Paque"-gradient under anvendelse av standardteknikk ga mononukleære celler (lymfocytter og monocytter) adskilt fra granulocytter (neutrofiler, eosinofiler og basofiler). Lymfocyttene viste seg å falle sammen med den lymfoide topp ved 260 pm mens monocyttene viste seg å være sentrert rundt 550 pm* Granulocyttfraksjonen dannet en ganske bred topp sentrert rundt 500 pm* Separering av de to populasjonene var meget mere distinkt med det kjemiske lyserte blod fra eksperimen- tene med "Coulter Counter" modell S Pluss enn med de livskraftige leukocytter oppnådd ved "Ficoll-Paque"-metoden. Det er derfor tydelig at lyseringsmidlet skader leukocyttene betydelig ettersom deres volumer reduseres 2-3 ganger sammenlignet med leukocytter oppnådd fra "Ficoll-Paque"-separering av samme blodprøve.

I foreliggende oppfinnelse har innarbeiding av dodecyltrimetylammoniumklorid vist seg fortrinnsvis å minske volumet hos de lymfoide celler (nemlig en reduksjon til en tredjedel av volumet fra 260 pm<3>til 85 pm<3>), men påvirker volumet av de myeloide celler i meget mindre grad (nemlig en halvering av volumet fra 500 pm<3>til 260 pm<3>). Dodecyltrimetylammoniumklorid er i seg selv et dårlig lyseringsmiddel. Det bevirker å mildne de kraftige lytiske virkninger av "Mytab" og sinker lyseringskinetikken i en grad som tillater måling av de forskjellige cellekjernevolumer. Innarbeiding av dodecyltri-metylammoniumbromid gir også en meget klarere og hurtigere lysering av erytrocyttene og hurtigere omdanning av hemoglo-binet med lavere konsentrasjoner av "Mytab" og medfører således bedre stabilitet hos leukocyttpopulasjonene.

Preliminære data for mer enn ett hundre normale og anormale prøver på ferskt blod oppnådd fra en blodgiversentral og lokale sykehus angir en høy grad av korrelasjon mellom leukocyttpopulasjonsdata fra "Coulter Counter" modell S Plus - "Channelyzer"-systemet og 100 manuelle celleseparasjoner. Selv om en liten variasjon observeres i myeloid- og lym-foidfraksjonene, er det ikke observert drastiske avvik fra korrelasjonen.

Under anvendelse av kombinasjonen av fortynningsmiddel og lyseringsreagens ifølge oppfinnelsen har spektroskoplske avsøkninger (bølgelengde mot absorbans) hos lysert blod fra leukocyttbadet i "Coulter Counter" modell S Plus gitt hemoglobinkurver i det vesentlige identiske med de som ble frembragt av "Lyse S" II, men absorbansen ved 540 nm og de resulterende beregnede hemoglobinverdier er ca. 0,2 g/l høyere ved kombinasjonen "Isoton" II og "Lyse" II. Celle-middelvolumet er også notert å være 1,0 - 1,5 pm<3>i de nye to reagenssystemer. Alle andre parametre er så og si identiske med de som ble oppnådd ved en kombinasjon av "Isoton" II og "Lyse" II.

Claims (8)

1. Lyseringsreagens for forskjellsbestemmelse av leukocyttpopulasjoner og for å gi minst et tovolum leukocytthistogram med separering av minst to leukocyttpopulasjoner med automatisk tel1ingssystem,karakterisertved at lyseringsreagensen er ment til bruk sammen med et isotonisk fortynningsmiddel for å oppnå en fortynnet fullblodprøve, og ved, at lyseringsreagensen omfatter en vandig blanding tildannet ved å blande minst to i det vesentlige rene kvaternære ammoniumsalter, idet minst ett av de kvaternære ammoniumsalter har formelen Ia og det andre av de kvaternære salter har formelen Ib:

der R^a er en alkylrest med 12 karbonatomer og R<*>b er valgt innenfor en gruppe som består av alkylrester med 14 karbonatomer, 16 karbonatomer og blandinger derav, samt der R<2>, R<3>og R<4>er alkylrester med 1 til 6 karbonatomer og X~ er en skalldannende rest valgt blant Cl-, Br~, I~, PO3-, HSO4- og CH3S04~.

2. Lyseringsreagens ifølge krav 1,karakterisertved at R<2>, R<3>og R<4>er alkylrester med 1 til 2 karbonatomer .

3. Lyseringsreagens ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat de kvaternære ammoniumsalter er en blanding av dodecyltrimetylammoniumklorid og tetradecyl-trimetyltrimetylammoniumbromid.

4. Lyseringsreagens ifølge krav 3,karakterisertved at bestanddelens konsentrasjon er som følger: a. 40 - 70 g/l dodecyltrimetylammoniumklorid 50 i oppløsning b. 4 - 7 g/l tetradecyltrimetylammoniumbromid c. 250 - 500 g/l kaliumcyanid d. Vann til 1 liter.

5. Lyseringsreagens ifølge krav 4,karakterisertved at det har følgende utforming: a. 60 g/l dodecyltrimetylammoniumklorid 50 i oppløsning b. 6 g/l tetradecyltrimetylammoniumklorid c. 300 mg/l kaliumcyanid d. Vann til 1 liter.

6. Lyseringsreagens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5,karakterisert vedet isotonisk blodfortynningsmiddel som omfatter en vannholdig oppløsning av en blodcellestabiliserende blanding i en egnet konsentrasjon for å få sinket den foreliggende kinetikk med cyto-plasmaavskalling fra leukocyttene, mens de tradisjonelle hemogramparametrene stabiliseres og det nevnte fortynningsmiddel i hovedsaken er nøytralt.

7. Lyseringsreagens ifølge krav 6,karakterisertved:

1. N-(2-acetamid, iminoeddiksyre),

2. Prokainhydroklorid,

3. En eller flere cellemembranstabilisatorer valgt blant dimetylolurea, heksametyltetramin, og N-hydroksimetylacetamid, og

4. Ett eller flere germlcider valgt blant: klorheksideniacetat, dimetylourea, og natrium 1-hydrok-sypyridin-2-tioner.

8. Fremgangsmåte ved lysering,karakterisertved at det anvendes et lyseringsreagens ifølge ett av kravene 1 - 4 i kombinasjon med et isotonisk blodfortynningsmiddel omfattende et anestetikum som inkluderer 4-aminobensosyreesterderivat, minst en organisk buffer og minst et germicid.