SE453693B - Sett for skillnadsbestemning av lymfoida och myeloida leukocyter, samt ett blodcellsstabiliserande isotoniskt utspedningsmedel - Google Patents

Description

453 693 ' 1 Coulter Counter <:) Model S Plus automatiserad blodcellräknare är konstruerad att utspäda ett helblodsprov | ett isotoniskt utspädningsmedel och ett lyserings- reagens och därefter påbörja räkning efter 7,5 sekunder. Data uppsamlas under 4 sekunder för erytrocyter och leukocyter och upp till 20 sekunder för plättar.

Ett utspädnings-lyseringssystem måste åstadkomma erytrocytlyseringskinetik till- räckligt snabb för att medföra fullständig stromatisatíon under lyserinqsperi- oden, men skalar icke fullständigt leukocyterna under denna tid. Dessutom måste ändringarna av leukocytvolymen vara minimala under datauppsamlingssteget och den skulle i idealfallet vara stabil under åtskilliga minuter. Reagenssystemet måste även bevara integriteten ifråga om erytrocyt- och plättantal och storleksfördel- ning, hemoglobinabsorbanskurvan och den totala leukocyträkningen. Blod från stick i fingrar måste vara stabilt efter förutspädning i det isotoniska utspädnings- medlet under åtminstone två timmar.

För att ernå en analys av de relativa populationerna av lymfoida och myeloida celler i blodet måste leukocytvolymhistogrammet visa klart separerade lymfoida och myeloida, toppar med ringa erytrocytavfall för att tillåta dalar mycket nära baslinjen. Integration av varje topp kommer att giva de relativa populationerna av de lymfoida och myeloida cellerna. Den lymfoida toppen har visats innehålla lymfocyter och små icke typiska lymfocyter under det att den myeloida toppen in- nehåller polymorfonukleära celler, band, monocyter, eosinofiler, basofiler och stora icke typiska lymfocyter.

I det amerikanska patentet 3, 87k, 852 (l97S) har inkluderats en formel för en sammansättning som innehåller kvartärt ammoniumsalt-detergent och cyanid att användas som ett lyserings- och kromagenbildande reagens för erhållande av en- volymieukocyträkning och hemoglobinbestämning i Coulter Counter Model S.

Ytterligare undersökning erfordrades för att använda kvartärt ammoniumsalt som lyseringsreagens för erhållande av tvåpopulation-leukocyträkning.

Enligt ett patent US Å286963 innehåller ett lytiskt utspädningsmedel för snabb lysering av röda blodceller i helblod för att göra en skillnadsbestämning av lymfoida/myeloida populationer av leukocyter och även för mätning av hemoglo- bin genom kromagenbildning en blandning av vattenhaltig saltlösning av åtminst- one ett kvartärt ammoniumsalt med ytaktiva egenskaper och vissa tillsatser, så- som 2-fenoxietanol.

Volymfördelningsanalysen är besvärlig på grund av att med många utspädnings- medel de två populationerna snabbt går över till en så att det icke förefinns tillräckligt med tid inom vilken beräkningarna för analysen skall ske. 453 693 Den föreliggande uppfinningen avser ett sätt att använda ett utspädningsmedel med ett lyseringsreagenssystem för att tillåta rutinberäkning av traditionella hemogramvärden liksom presentation och beräkning av de lymfoida/myeloida histo- grammen för leukocyterna och deras relativa koncentrationer, särskilt i automa- tiska räkningssystem, exempelvis den automatiserade Coulter Counter utrust- ningen med omodifierad programmering och möjligheterna hos ett yttre eller inre leukocyt-Channelyzer instrument.

Detta isotoniska blodutspädningsmedel omfattar en blandning av organiska buff- rar, anestetika och germocider i en osnbtiskt balanserad och i huvudsak neutral lösning och tjänar till att sakta ned kinetiken ifråga om cytoplasmisk skalning från leukocyterna under stabilisering av de traditionella hemogramparametrarna.

Lyseringsreagenset är en blandning av en vattenlösning av åtminstone ett kvar* tärt ammoniumsalt med ytaktiva egenskaper, och en alkalimetallcyanid inom ett koncentrationsområde som är verksamt att giva tvåvolymieukocythistogram. Pres- entationen av data kan ske under användning av Coulter Counter utrustning av standardtyp i förening ned en Channelyzer och en X-Y-skrivare.

I enlighet med uppfinningen har-âstadkommits: Ett sätt för skillnadsbestämning av lymfoida och myeloida populationer av leuko- cyter liksom för mätning av hemogramvärden, särskilt i automatiska räkninqssy- stem, som kännetecknas av användningen i kombination av: A. Ett isotoniskt utspädningsmedel omfattande en blandning av en vattenhaltig lösning av l. anestetiska föreningar inkluderande M-aminobensoesyraesterderlvat; 2. organiska buffrar; och 3. germicider; inställt till ett pH av 7,0 3 0,1 ned natriumhydr0xid eller saltsyralösning i enlighet med vad som är nödvändigt och till en osmolalitet av 320 3 5 millios- moi per kilogram med natriumsulfat och natriumklorid, och; B. Ett lyseringsreagens omfattande en blandning av en vattenhaltig lösning av åtminstone ett kvartärt ammoniumsalt med ytaktiva egenskaper och en alkali- metallcyanid inom ett koncentrationsområde som är verksamt att giva tvåvolym- leukocythistogram.

Ett sätt att bestämma leukocyter och hemoglobin i blodet där ett lyseringsrea- gens som innehåller en vattenhaltig lösning av ett kvartärt ammoniumsalt med 453 693 4 ytaktiva egenskaper och en alkalimetallcyanid användes för att stromatolysera erytrocyter och plättceller och omvandla hemoglobin till kromagen, med detnåmn- da kvartära ammoniumsaltet med tre alkylgrupper med kort kedja och en alkylgrupp med lång kedja bundna till kväve, varvid nämnda kvartära ammoniumsalt och nämnda alkalimetallsalt finns inom ett koncentrationsomrâde effektivt att giva tvåvolym- leukocythistogram och tillåta rutinberäkning av leukocyternas lymfoída/myeloida histogram och deras relativa koncentrationer, särskilt i automatiska räkningssy- Stelll.

Ett isotoniskt utspädningsmedel kännetecknas av en vattenhaltig lösning av: l. organiska buffrar; 2. anestetika, som inkluderar Å-aminobensoesyracsterderivat; och 3. germicider; med det nämnda utspädningsmedlet inställt till ett pH av 7,0 ¿ 0,l genom natrium- hydroxid eller sàltsyralösning i enlighet med vad som erfordras och till en osmo- lalitet av 320 3 5 milliosmol per kilogram med natriumklorid och natriumsulfat.

En föredragen formel för det isotoniska utspädningsmedlet är: Beståndsdel Verksamt koncentrationsområde Prokainhydroklorid 0,ll g/l N-(2-acetamid)iminodiättiksyra (ADA) l,h0 g/l Klorhexidindíacetat 0,02 g/l Dimetylurea l,0O g/l Natrium l-hydroxipyridín-2-tion 0,50 g/l Natriumhydroxid 0,50 g/l Natríumsulfat, vattenfritt 9,72 g/l Natriumklorid 4,50 g/l Vatten tillräckligt för l liter Detta utspädningsmedel inställes till pH 7,0 3 0,1 medelst natríumhydroxid eller saltsyralösning i enlighet med vad som fordras. Osmolaliteten inställes till 320 f 5 milliosmol per kilogram med natriumklorid.

Det är känt att blodceller innehåller ATPas-enzymer som transporterar alkali- metallkatjoner som hör samman med små anjoner (exempelvis klorid) in i och ut ur cellen genom en energikrävande mekanism för att bibehålla den osmotiska ba- lansen, cellens tergiditet och korrekta membranpotentialer. Natriumjoner sam- hörande med den mycket större-Sufiäïëfljfinêfl kommer tydligen icke att transpor- 453 693 teras så lätt på grund av större skillnader 1 laddningstäthet mellan sulfat- och kloridanjoner och potentialändringen i membranladdningen när joner trans- porteras in i eller ut ur cellen. Balans ifråga om det inre osmotiska trycket inuti cellen bibehålles genom inneslutning av ungefär 30 milliosmol natrium- klorid. Natriumsulfat är känt för sin förmåga att göra abnorma plasmaglobuliner lösliga eller att minska eller eliminera grumlighet i hemoglobinlösningen på grund av höga leukocyträkningar.

Prokainhydroklorid, som en av en klass anestetika (bedövningsmedel) inkluderande h-aminobensoesyraesterderivat och deras salter, har rapporterats uppvisa ett stabiliserande inflytande på erytrocytmembranen men verkningssättet är osäkert.

Användnirigen av N-(2-acetamid)iminodiättiksyra (ADA), en organisk buffer, i den föreliggande uppfinningen, har grundats på densammas förmåga att hjälpa det svaga lyseringsreagenset i form av det kvartära ammoniumsaltet att minska lyser- at erytrocytavfall till partikelstorlekar som elektriskt är mindre än hålpmš och sålunda hindra erytrocytstörning av räkningen av leukocyter och fördelningen till två distinkta populationer (lymfoida och myeloida).

Ehurd mekanismen ifråga om verkan av ADAicke har undersökts noggrant, är det känt att densamma är en rimligt stark ligand för grupp ll alkalimetaller och grupp llß övergångsmetaller liksom även en rimligt effektiv buffer: Då den i hög grad liknar en aminosyra kommer tydligen ADA att attraheras till och växel- verka med cellmembranproteiner. Den koordineras då med metallkatjoner och ger den yttre membranytan "uppträdandet" av en mera positiv laddning till den om- givande lösningen och uppmuntrar sålunda lösning och anjonattraktion runt den yttre membranen..Denna beläggning av lösningsmolekyler och anjoner hindrar på ett effektiv sätt närmande till och hoplimning med andra celler i suspension.

Bufferverkan hos ADA hindrar ändringar i denna "lokala" omgivning och upplösning och förlust av stabilitet.

Denna mekanism kopplad till verkan av ett lokalt anestetikum, exempelvis pro- kainhydroklorid, och natriumsulfat hjälper till med stabiliserlngen av blod- provets cellformiga komponenter och gör dem i huvudsak oförändrade från deras a ursprungliga tillstånd i blodprovet ifråga om antal, storleksfördelning och form. Denna faktor är av stor diagnostisk betydelse vid tolkningen av de tra- dit ionel la hemogramparametrarna.

Klorhexidendiacetat, som vanligen användes som en virocid och germicid, är end- ast marginellt effektivt i nu sig sjalvt vid den använda koncentrationen men hjälp- er signifikant ADA att minska bakgrundsavfallet som stör räknandet av leukocyt- storleksfördelningen. Klorhexidendiacetat har även likhet med aminarginin och 453 693 5 guadinin och kan förväntas att växelverka med membranproteiner gènom koordination och vätebindning. Som sådant hjälper det tydligen lyseringsreagenserna att full- ständigt stromatolysera erytrocytmembranen.

Dimetylolurea, ett kondensat av formaldehyd och urea, har ansetts reagera mycket sakta i lösning med neutralt pH med leukocytmembranen för att giva ett mått på stabiliteten vid stillastående som icke är tydligt vid borttagandet av denna för- ening. Det är känt som en baktetiostatisk antiseptisk förening som hindrar växan- det av mikroorganismer vid moderata koncentrationer. Andra föreningar som tillförts för att stabilisera leukocyter är hexametylenteramin och N-hydroximetylacetamid.

Natrium I-hydroxipyridin-2-tion är känd för sin användning som en fungicid och bakteriocid i schamponeringsmedel mot mjäll. Det användes här S0m en bakteriocid och fungicid som icke uppvisar några tydliga förstörande verkningar på formen, storleksfördelningen eller antalet cellformiga komponenter i mänskligt helblod.

Användningen av kombinationen av dimetylolurea och natrium l-hydroxi-pyridin-2- tion ger en mycket bakteriocidal produkt som är överlägsen den som kan erhållas med endera substansen ensam. Denna kombination ger ett stabilt hemogram för såväl normala som onormala prover samtidigt som den tillåter information avseende vo- iymfördelning av vita celler att uppsamlas av ett automatiserat instrumenterings- system.

Det primära målet för detta utspädningssystem är att stabilisera cellstorlek, form och det ofördärvade skicket av alla cellformiga komponenter i blodet i en omfattning som tidigare icke uppnåtts för att härigenom främja diagnosticerings- noggrannheten hos blodhistogram som härletts från automatiserad volymfördelnings- analys och räkning. Den föreliggande uppfinningen tillåter en utsträckning och förbättring av teknikens tidigare ståndpunkt genom att göra cellernas blodströms- tillstånd jämförelsevis oförändrat vid utspädning och iordningställande för automatiserad blodcellräkning och storleksbestämning. Använd i förening med ett lämpligt lyseringsreagens kan teknikens tidigare ståndpunkt utsträckas att åstad- komma tvåvolymfördelningsinformation avseende leukocyter.

Det beskrivna utspädningsmedlet kommer att återgiva noggranna hemogram genom vilken som helst halvautomatiserad eller automatiserad Coulter blodcellräk- nare men kommer att frambringa tvåvolymleukocythistogram endast använd i fören- ing med ett lyseringsreagens.

Lyseringsreagenset är en vattenhaltig lösning av åtminstone ett kvartärt ammo- niumsalt med ytaktiva egenskaper och en alkalimetallcyanid, såsom allmänt be- skrivits i det amerikanska patentet 3.87Å.8S2, för erhållande av endast envolym- 455 693 leukocyträkning. Det verksamma området och koncentrationen av beståndsdelarna som här givits måste specifikt följas för erhållande av tvåpopulationsräkningen av leukocyter.

I de föredragna sammansättningarna har alkyl med lång kedja i den följande form- eln l2-l6 kolatomer, och de korta kedjorna är trimetyl och X- är klorid eller bromid. Det detergent som utgöres av kvartärt ammoniumsalt har formeln: R1\ /Rz + IQ )(' 113'/I \\I{4 där R1 är en alkylradikal med läng kedja och med 10 till l8 kolatomer och R2, R3 och Ru är alkylradikaler med kort kedja och med 1 till 6 kolatomer, och X är ett salt som bildar en radikal såsom Cl, Br, l, POÄ och CHBSOÅ.

En föredragen sammansättning av lyseringsreagenset är: Beståndsdel Verksamt koncentrationsomrâde Dodecyltrimetylammoniumkiorid 60 g/l RD-70 g/l 50% lösning Tetradecyltrimetylammoniumbromid 6 g/l Å~7 g/l Mytab Kaliumcyanid 300 mg/l 250-500 mg/l Vatten tillräckligt för 1 liter Det nyssnämnda lyseringsreagenset är mycket svagare och låzgšammare ifråga om reaktionshastigheten än det för närvarande använda Lyse S ll. Alternativa kvartära ammoniumsalter som även är verksamma inkfuderar Cetrimide (hexade~ cyltrimetylammoniumbromid) och Bretol (cetyidimetyletylammoniumbromid), så- väl ensanma somi kombination med dodecyltrirnetylannwnimklorid.Ufspädningssystemet är tydligen i stånd att stabllisera leukocytmembranen tillräckligt för att sakta ned lyseringsreagensreaktionens kinetik till en punkt där det är möjligt att skilja den mindre volymen lymfoida celler från den större volymen myeloida se- rier (neutrofiler, monocyter, eosinofller och basofiler). Upprepade mätningar av leukocytstorleksfördelningen har visat att histogrammen är stabila upp till sekunder före degenereringen. Experimentella resultat anger att lymfoida cel- ler minskas till i huvudsak deras minimicellvolymer inom lyseringstiden 7,5 Se' kunder. De myeloida cellerna uppträder tvâ till tre gånger deras slutvolym un-_ der upp till 30 sekunder efter tillsättningen av lyseringsreagenset§ och efter 453 695 denna tid kommer volymen att långsamt minskas till dess att den myeloida frak- tionen blandar sig med den lymfoida fraktionen.

Vid användning av en erytrocytkalibrerad_Co lter <:) Model S Plus och en kali- brerad Coulter Model C-lBOO Channelyzer à visade sig volymerna hos de lym- foida och myeloida topparna efter behandling med reagenssystemet ligga i närhe- ten av 85}mê resp. 260)mê med smala fördelningsbredder. Leukocyter erhållna från färskt helblod genom enkel sedimentering på en Ficoll-Paque gradient uppvisade volymer av ungefär 260)mP för den lymfoida toppen och SÛO)mê för den myeloida toppen med mycket bredare fördelningsbredder. Ett prov på färskt blod avskilt genom centrifugering på en Ficoll-Paque gradient under användning av standardteknik frambragte mononukleära celler (lymfocyter och monocyter) skilda från granulocyter (neutrofiler, eosinofiler och basofiler). Lymfocyterna visade sig sammanfalla med den lymfoida toppen vid 260 )m§ under det att monocyterna visade sig vara centrerade runt 5504pnP. Granulocytfraktionen bildade en ganska bred topp centrerad kring 500Äpm3. Särskiljandet av de två populationerna var mycket distinktare med det kemiskt iyserade blodet från experimenten med Coulter Counter Model S Plus än med de livskraftiga leukocyter som erhållits genom Ficoll-Paque metoden. Det är därför tydligt att lyseringsreagenset skadar leukocyterna avsevärt eftersom deras volymer minskas två till tre gånger i jäm- förelse med leukocyter erhållna från Ficoll-Paque separation av samma blod- prov.

I den föreliggande uppfinningen har införlivandet av dodecyltrimetylammonium- klorid visat sig företrädesvis minska volymen hos de lymfoida cellerna (näm- ligen en trefaldig minskning i volym från 260 fm3 till 85 IJmB) men påverkar voly- men av de myeloida cellerna i mycket mindre omfattning (nämligen en tvåfaldig minskning i volym från Sßfljmê till 260)mP). Dodecyltrimetylammoniumklorid är i själva verket i sig ett'dâligt lyseringsreagens. Det verkar att mildra de kraft- iga lytiska verkningarna av Mytab och sakta ned lyseringskinetiken till en grad som tillåter mätning av de skilda cellkärnevolymerna. lnföriivandet av do- decyltrimetyiammoniumbromid ger även en mycket klarare och snabbare lysering av erytrocyterna och snabbare omvandling av hemoglobinet med lägre koncentrationer av Mytab och medför sålunda bättre stabilitet hos leukocytpopulationerna.

Preliminära data för mera än etthundra normala och onormala prover på färskt blod erhållna från en blodgivarcentral och lokala sjukhus anger en hög grad av korrelation mellan leukocytpopulationsdata från Coulter Counter Model 5 Plus - Channelyzer systemet och manuella l00 cellskillnader. Ehuru en ringa variation observerades i myeioid- och lymfoidfraktioner har inga drastiska av- vikelser från korrelation observerats. 9 453 693 Under användning av kombinationen av utspädnings- och lyseringsreagenset enligt uppfinningen har spektroskopíska avaökníngar (våglän d versus absorbans) hos lyserat blod från leukocytbadet i Coulter Counter <:g Model S Plus frambragt hemo- globinkurvor i huvudsak identiska med dem som frambragts av Lyse S Il, men absorbansen vid SÅO nm och de resulterande beräknade hemoglobinvärdena är unge- fär 0,2 g/l högre 'än vid kombinationen lsoton ll och Lyse ll. Cellmedel- volymvärden har även noterats vara 1,0 till l,5 /må större i de nya två reagens- systemen. Alla andra parametrar är egentligen identiska med dem som frambragts genom kombinationen av lsoton li och Lyse ll.

Claims (9)

453 693 m P A T E N T K R A V 1. Sätt för skillnadsbestämning av lymfoida och myeloida leuko- cytpopulationer, liksom för att mäta hemogramvärden ur ett helblodsprov, särskilt i automatiska räkningssystem, k ä n n e t e c k n a t av att sättet omfattar stegen att: A. . utspäda ett helblodsprov med ett isotoniskt utspädningsmedel som omfattar en vattenhaltig lösning av: 1. en eller flera anestesiföreningar, inkluderande 4-aminobensoe- syraesterderivat för stabilisering av blodprovets cellformiga komponenter, 2. en eller flera organiska buffrar för att hindra erytrocytstör- ning av skillnadsbestämningen av leukocyter, 3. en eller flera membranstabilisatorer för åstadkommande av ett ytterligare mått av stabilitet hos leukocytmembranen, och med utspädningsmedlet uppvisande ett pH-värde av i huvudsak 7 till 8 och en osmolalitet mellan 300 och 380 milliosmol, och B. lysering av det nämnda blodprovet med ett reagens som omfattar en vattenhaltig lösning av ett eller flera kvartära ammoniumsaltdeter- genter valda inom en grupp föreningar med formeln där R1 är en alkylradikal med lång kedja och med 10 till 18 kolatomer och R2, R3 och R4 är alkylradikaler med kort kedja och med 1 till 6 kolatomer och X' är en saltbildande radikal, exempelvis Cl, Br, I, P04, HS04 och CHBSO4, och en alkalimetallcyanid inom ett koncentrationsområde som är verksamt att medföra tvëvolymleukocythistogram. 2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av användning av ett isotoniskt utspädningsmedel som omfattar:

1. prokainhydroklorid,

2. N-(2-acetamid) iminodiättiksyra, 3. en eller flera cellmembranstabilisatorer valda bland den grupp som består av dimetylurea, hexametylteramin och N-hydroximetylacetamid, och u 455 693 4. en eller flera germicider valda inom den grupp som består av klorhexidendiacetat, dimetylurea och natrium 1-hydroxi- pyridin-2-tion.

3. Sätt enligt krav 1 och 2, k ä n n e t e c k n a t av att dimetylolurea inkluderats som en cellmembranstabilisator och en germicid.

4. Sätt enligt något av kraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda kvartära ammoniumsalt är åtminstone ett av hexadecyltrimetyl- ammoniumklorid, hexadecyltrimetylammoniumbromid eller dodecyltrimetyl- ammoniumklorid eller blandningar härav.

5. Sätt enligt något av kraven 1-4, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda kvartära ammoniumsalt är en blandning av dodecyltrimetyl- ammoniumklorid och tetradecyltrimetylammoniumbromid.

6. Isotoniskt utspädningsmedel, k ä n n e t e c k n a t av en vattenhaltig lösning av en blodcellsstabiliserande blandning av: 1. en eller flera anestesiföreningar som inkluderar 4-aminoben- soesyraesterderivat för stabilisering av blodprovets cellfor- miga komponenter, 2. en eller flera organiska buffrar för att hindra erytrocytstör- ning av skillnadsbestämningen av leukocyter, 3. en eller flera cellmembranstabilisatorer för åstadkommande av en ytterligare grad av stabilitet hos leukocytmembranen.

7. Isotoniskt utspädningsmedel enligt krav 6, k ä n n e t e c k- nat av en vattenhaltig lösning av: 1. prokainhydroklorid, N-(2-acetamid)iminodiättiksyra, en eller flera cellmembranstabilisatorer valda bland den grupp som består av dimetylolurea, hexametylentetramin och N-hydroximetylacetatamid, och 4. en eller flera germicider valda bland den grupp som består av klorhexidendiacetat, dimetylolurea och natrium-1-hydroxi- pyridin-2-tion.

8. Isotoniskt utspädningsmedel enligt krav 6 eller 7, k ä n n e- t e c k n a t av att det inkluderar dimetylolurea som en cellmembran- stabilisator och som en germicid.

9. Isotoniskt utspädningsmedel enligt något av kraven 6-8, k ä n- n e t e c k n a t av att detsamma är kombinerat med ett lyserings- reagens som är en blandning av dodecyltrimetylammoniumklorid och tetra- decyltrimetylammoniumbromid. -g..