DE60132598T2

DE60132598T2 - Verfahren und reagens zur analyse von blutproben, im besonderen für tierärztliche anwendungen

Info

Publication number: DE60132598T2
Application number: DE60132598T
Authority: DE
Inventors: Wilhelmus Hermanus Kieftenbeld
Original assignee: Mallinckrodt Baker BV
Current assignee: Avantor Performance Materials BV
Priority date: 2000-08-17
Filing date: 2001-08-17
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2021-08-18
Also published as: AU2001292439A1; PT1309862E; ATE384951T1; EP1309862B1; DE60132598D1; ES2300362T3; US20040014152A1; EP1309862A1; EP1182457A1; JP2004506899A; WO2002014861A1; DK1309862T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse von Blutproben und auf Reagenzien zur Verwendung in einem solchen Verfahren.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Analyse von Blutproben, welches für tierärztliche Anwendungen bestimmt ist, z. B. für die Analyse des Bluts von Haustieren und/oder anderen nicht-menschlichen Säugern und auf Reagenzien zur Verwendung in solch einem Verfahren.
In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Analyse von von Katzen, Hunden und/oder Pferden erhaltenen Blutproben und auf Reagenzien zur Verwendung in einem solchen Verfahren.
Verfahren zur Analyse von menschlichen Blutproben sind in der Technik wohl bekannt. In diesen bekannten Verfahren werden üblicherweise die Mengen der Erythrozyten (rote Blutzellen oder "RBCs"), der Thrombozyten (Plättchen oder "PLTs") und/oder der Leukozyten (weiße Blutzellen oder "WBCs") in der Blutprobe bestimmt. Dabei werden die Leukozyten üblicherweise weiter differenziert in drei Subpopulationen, z. B. die Lymphozyten, die sogenannte "gemischte Zellpopulation", welche im Wesentlichen aus Monozyten besteht, und die Granulozyten, wovon die letzteren sogar weiter differenziert werden können in Neutrophile, Eosinophile und Basophile. Abnormitäten in den relativen oder absoluten Mengen von einer oder mehreren dieser Typen von Blutzellen kann bei der Diagnose von bestimmten Krankheitszuständen und/oder Erkrankungen hilfreich sein oder kann diese sogar anzeigen.
Allgemein wird bei diesen bekannten Verfahren die Menge jedes spezifischen Zelltyps durch Zählen der in der Probe vorhandenen Zahl von Zellen dieses Typs bestimmt. Dies wird üblicherweise unter Verwendung einer automatisierten Zellzähleinrichtung, welche auch als "Zellsortierer" oder "Zellzähler" bezeichnet wird, durchgeführt, welche basierend auf Unterschieden in der Zellgröße, zwischen den in einer Probe vorhandenen Zellen differenzieren und sie so zählen kann.
Da solche Zellsortierer in der Technik gut etabliert sind, brauchen sie hier nicht im Detail diskutiert zu werden. Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung sollte jedoch angemerkt werden, dass Zellsortierer allgemein unterschieden werden können in Öffnung-Impedanz-Apparate und Lichtstreuapparate, abhängig von der spezifischen Technik, welche zum Messen/Detektieren der einzelnen Zellen verwendet wird, wenn sie durch den Zellsortierer hindurchtreten. Obwohl beide Apparatetypen zum im Wesentlichen gleichzeitigen Messen/Detektieren aller obigen Zelltypen verwendet werden können, haben Zellsortierer, welche auf der Basis von Öffnung-Impedanz arbeiten allgemein den Vorteil, dass sie weniger teuer sind. Auch die hierin offenbarte Erfindung ist besonders zur Verwendung mit Öffnung-Impedanz-Apparaten bestimmt (obwohl sie in ihrem breitesten Sinne nicht darauf beschränkt ist).
Mit keinem Zellsortierertyp können die unterschiedlichen Typen von Blutzellen in einer Probe jedoch direkt gezählt werden, d. h. in der Blutprobe als solche. Das ist so, weil die in der Probe vorhandenen verschiedenen Zelltypen allgemein etwa dieselbe Größe aufweisen, so dass sie das Zählen jedes individuellen Typs stören. Beispielsweise können nicht lysierte Erythrozyten das Zählen der Leukozyten stören; ebenso können die unterschiedlichen Subpopulationen der Leukozyten das Zählen einer spezifischen Subpopulation stören.
Somit ist es bei allen bekannten Verfahren zur Analyse menschlicher Blutproben notwendig, die Blutprobe vorzubehanden, um eine Differenzierung zwischen den verschiedenen Zelltypen während einer Messung/Zellzählung zu erlauben.
Allgemein wird dies in einem Zweischrittverfahren durchgeführt, von welchem der erste Schritt ein Verdünnen der Blutprobe unter Verwendung eines isotonischen Verdünnungsmittels umfasst. Danach wird in einem zweiten Schritt ein Lysierungsagens zu der verdünnten Probe zugesetzt. Dieses Lysierungsagens entfernt das Zytoplasma von den Leukozyten – was auch als "Strippen" bezeichnet wird – was zu Unterschieden in der Größe zwischen verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen führt, welche dann jeweils getrennt in dem Zellsortierer detektiert/gezählt werden können. Das Lysierungsagens lysiert auch (z. B. Stromatolyse) die roten Blutzellen, um das Hämoglobin daraus freizusetzen, welches dann entweder als ein Cyanomethämoglobin-Komplex (Zyanid-basiert) oder als ein Hämatin-artiger Komplex (Zyanid-frei) bestimmt werden kann, abhängig davon, ob ein Zyanid-basiertes oder ein Zyanid-freies Lysierungsagens verwendet wird.
Zusätzlich zum Lysierungsschritt kann ein Teil der nach dem ersten Verdünnungsschritt erhaltenen Blutprobe auch weiter verdünnt werden und kann dann in einem separaten Schritt verwendet werden, um die Menge von roten Blutzellen, Menge von Blutplättchen zu bestimmen und/oder das mittlere Korpuskular-Volumen (MCV) zu bestimmen.
Bei den derzeit verfügbaren Zellsortierern werden die obigen Verdünnungs- und Lysierungsschritte auch automatisch ausgeführt. Der Bediener muss somit nur die Blutprobe in den Zellzähler einführen und dann die Ausgabe einsammeln, welche die Ergebnisse der Detektion/Zellzählungen enthält.
Um eine saubere Differenzierung zwischen den unterschiedlichen Zelltypen zu erlauben, sollte die Zusammensetzung des Verdünnungsagens und des Lysierungsagens sorgfältig ausgewählt werden. Praktisch werden meist ein Verdünnungsagens und ein Lysierungsagens verwendet, welche spezifisch zur Verwendung miteinander und auch zur Verwendung mit einem spezifischen Zellsortierertyp vorgesehen/formuliert sind. Solche Verdünnungsmittel und Lysierungsagenzien werden auch als kommerzielle Präparationen/Formulierungen vermarktet, beispielsweise durch den Anmelder.
EP-A-044241 beschreibt ein Zyanid-freies Reagens zur Zählung der Leukozytenzahl und Messung der Hämoglobinkonzentration im Blut.
Für eine weitere Beschreibung der obigen Verfahren zur Analyse menschlicher Blutproben und von Verdünnungsmitteln und Lysierungsagenzien zur Verwendung in solchen Verfahren wird auf den Stand der Technik, wie US-A-4485175 , US-A-4346018 und den weiteren darin erwähnten Stand der Technik, verwiesen.
Obwohl die obigen Techniken und Reagenzien jetzt routinemäßig für die Analyse menschlicher Blutproben verwendet werden, beschreibt der Stand der Technik keine ähnlichen Techniken für tierärztliche Anwendungen, z. B. für die Analyse des Bluts von Tieren. Daher ist es eine erste Aufgabe der Erfindung, ein solches Verfahren bereitzustellen und insbesondere ein solches Verfahren für die Analyse des Bluts von Katzen, Hunden oder anderen Haustieren sowie Pferden und anderen Säugern von Interesse bereitzustellen.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein solches Verfahren bereitzustellen, das unter Verwendung von per se für die Analyse von menschlichen Blutproben bekannten Zellsortierern und insbesondere unter Verwendung einer per se be kannten Öffnung-Impedanz-Einrichtung durchgeführt werden kann. Das hätte den Vorteil, dass jedes solches Verfahren unter Verwendung von bereits (kommerziell) erhältlichen Apparaten ausgeführt werden kann und daher keine spezifisch gestaltete Einrichtung erfordern würde.
Um dieses Ziel zu erreichen, haben die Erfinder bei ihrer zu der vorliegenden Erfindung führenden Forschung zuerst versucht, für die Analyse von menschlichem Blut bekannte Verdünnungsmittel und Lysierungsagenzien auf die Analyse des Bluts von Tieren anzuwenden. Dabei haben die Erfinder jedoch herausgefunden, dass diese bekannten Verdünnungsmittel und Lysierungsagenzien für die Analyse des Bluts von Tieren tatsächlich nicht geeignet sind.
Insbesondere wurde herausgefunden, dass, bedingt durch die Unterschiede zwischen menschlichem Blut und tierischem Blut (d. h. dem Blut von nicht-menschlichen Säugern), die für die Analyse von menschlichem Blut bekannten Verdünnungsmittel und Lysierungsagenzien, wenn sie bei der Analyse von tierischem Blut verwendet werden, keine ausreichende Differenzierung in die unterschiedlichen Subpopulationen der Leukozyten erlauben und zu mangelhaftem MCV und mangelhafter Plättchenmessung führen können. Es wurde auch herausgefunden, dass die Zellen und insbesondere die Leukozyten von tierischem Blut oft weit anfälliger/sensitiver als die Zellen von menschlichem Blut sind und dass das zu Problemen mit der Zellstabilität während der Detektion/Zählung der Zellen führen kann, wenn Verdünnungsmittel und/oder Lysierungsagenzien für die Analyse von menschlichem Blut verwendet werden.
Ein weiteres Problem, welches beim Entwickeln eines Verfahrens für die Analyse des Bluts von Tieren und beim Entwickeln von Verdünnungsmitteln und Lysierungsagenzien zur Verwendung in einem solchen Verfahren auftritt, ist, dass das Blut einer gegebenen Tierart (Säuger) sich nicht nur vom Blut von Menschen unterscheidet, sondern sich auch vom Blut anderer Tierarten (Säugern) unterscheidet. Beispielsweise enthält des Blut von Katzen, Hunden und Pferden unterschiedliche Hämoglobinstrukturen, welche unterschiedlich oxidieren können.
Ein Verdünnungsmittel und ein Lysierungsagens, die für die Analyse des Bluts einer Tierart geeignet sind, müssen somit nicht notwendigerweise für die Analyse des Bluts einer anderen Art (gleich) geeignet sein. Es wäre jedoch weder praktisch noch ökonomisch möglich, ein unterschiedliches Verdünnungsmittel und/oder ein unterschiedliches Lysierungsagens für jede Tierart bereitzustellen.
Es ist somit ein spezifisches Ziel der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen sowie ein Verdünnungsmittel und ein Lysierungsagens zur Verwendung in einem solchen Verfahren bereitzustellen, welches gleich zur Analyse des Bluts von Katzen, Hunden und/oder Pferden verwendet werden kann.
Es ist herausgefunden worden, dass durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Zyanid-freien Lysierungsagens die unterschiedlichen Hämoglobinstrukturen, die von Tierart zu Tierart auftreten können, in einer gleich geeigneten Weise bestimmt werden können.
Durch die Verwendung des Verdünnungsmittels und Lysierungsagens stellt die Erfindung somit vorteilhafterweise ein Verfahren und die Verwendung von Reagenzien für die Analyse von nicht-menschlichem Säugetierblut bereit, welches für die Analyse des Bluts unterschiedlicher Arten von nicht-menschlichen Säugern und insbesondere von Katzen, Hunden und Pferden gleich geeignet ist, was eine Differenzierung der Leukozyten in zumindest zwei und vorzugsweise drei unterschiedliche Subpopulationen, basierend auf Unterschieden in der Größe, er laubt und was die Messung von Hämoglobin ohne die Notwendigkeit erlaubt, irgendein Zyanid-enthaltendes Reagens zu verwenden.
Demgemäß stellt die Erfindung die Verwendung eines Zyanidfreien Lysierungsagens bereit, was bedeutet, dass Zyanid nicht länger erforderlich ist, um die Hämoglobinarten zu analysieren. Die Verwendung dieses Lysierungsagens sieht vorteilhafterweise auch eine 2- oder 3-teilige Differenzialanalyse vor. Diese Kombination von Merkmalen (d. h. ein Zyanidfreies Lysierungsagens und eine 2- oder 3-teilige Analyse) ist im Stand der Technik noch nicht erreicht gewesen: Die einzigen derzeit auf dem Markt befindlichen Lysierungsagenzien, welche eine 2- oder 3-teilige Differenzialanalyse bereitstellen können, enthalten immer Zyanid.
Das in der Erfindung verwendete Verfahren und Lysierungsagens unterscheidet sich (weiterhin) von bekannten Verfahren und Lysierungsagenzien (d. h. für die Analyse von menschlichem Blut) in der Konzentration der quaternären Ammoniumverbindungen (siehe unten) in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung (siehe ebenfalls unten), welche erfindungsgemäß niedriger ist (d. h. zwischen 1,5 und 4,5 g/l für die Erfindung verglichen mit zwischen 4,5 und 7,5 g/l für die Analyse von menschlichem Blut).
Weiterhin kann die Effizienz des Lysierungsagens durch die Verwendung weiterer Bestandteile weiter verbessert werden, wie z. B. unten kurz dargestellt.
Demgemäß betrifft ein erster Aspekt der Erfindung ein Lysierungsagens zur Verwendung bei der Analyse des Bluts und/oder einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers, wobei das Lysierungsagens eine wässrige Lösung umfasst, welche

– so ist, dass sie nach Verdünnung auf die endgültige WBC/Hb-Verdünnung (d. h. die Lösung, in welcher die WBCs und der Hb gemessen/gezählt werden) einen pH von zwischen 4,0 und 7,5 für die endgültige WBC/Hb-Verdünnung bereitstellt, und welche
– mindestens eine quaternäre Ammoniumverbindung in einer solchen Konzentration enthält, dass nach Verdünnung auf die endgültige WBC/Hb-Verdünnung die Gesamtkonzentration quaternärer Ammoniumverbindungen in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung zwischen 1,5 und 4,5 Gramm pro Liter ist,

Im Hinblick auf den pH, die Konzentration der Ammoniumverbindung(en) und der "endgültigen WBC/Hb-Verdünnung" sollte beachtet werden, dass die Menge an Lysierungsagens und/oder das zugesetzte Lysevolumen differieren können, abhängig von dem verwendeten spezifischen Gerät (d. h. dem Typ des Zellzählers/Zellsortierers). Beispielsweise verwenden einige Hämatologie-Analysierer einen Lysezusatz von 0,7 ml, während ein anderer Typ einen Zusatz von 2,0 ml verwendet.
Demgemäß kann auch die Konzentration der quaternären Ammoniumverbindung(en) in dem obigen Lysierungsagens der Erfindung variieren, d. h. abhängig von dem verwendeten spezifischen Gerät. Höchst vorzugsweise wird die Konzentration der quaternären Ammoniumverbindung zur Verwendung mit einem spezifischen Gerät angepasst, d. h. so, dass in der endgültigen WBC/Hb-Lösung, wie sie von dem verwendeten Gerät bereitgestellt wird, (d. h. der Verdünnung bei welcher die WBCs und der Hb gemessen/gezählt werden, welche im Wesentlichen dieselbe für alle zur Zeit verwendeten Geräte ist), die Gesamtkonzentration von quaternären Ammonium zwischen 1,5 und 4,5 g/l ist. Üblicherweise wird für diesen Zweck die Konzentration der quaternären Ammoniumverbindung(en) in dem anfänglichen Lysierungsagens allgemein zwischen 2,0 und 30,0 g/L liegen, abhängig von dem verwendeten Gerät.
Als ein Beispiel ist eine Liste von Geräteherstellern angegeben mit der Konzentration quaternärer Ammoniumverbindung(en) bei der Lyse:

– Medonic (Modell CA530): 3,0–6,0 g/L (endgültige WBC Verdünnung 1:400)
– Diatron (Modell Abacus): 26,0–29,0 g/L (endgültige WBC Verdünnung 1:186)
– ABX (Modell ABC VET Micros): 17,0–20,0 g/L (endgültige WBC Verdünnung 1:300)

Der Fachmann wird so im Allgemeinen in der Lage sein, das Lysierungsagens geeignet auszuwählen/anzupassen, d. h. den pH/die Menge an Säure(n), die Konzentration an Ammoniumverbindung(en) und die Konzentration(en) der optionalen weiteren Bestandteile, d. h. basierend auf der Offenbarung hierin und auf verfügbarer Information über den verwendeten spezifischen Apparat (z. B. aus dem Handbuch, welches dem Apparat beiliegt).
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines solchen Lysierungsagens beim Analysieren des Bluts oder einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung eines solchen Lysierungsagens bei der Lyse von (Erythrozyten, welche vorhanden sind in) einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers, und/oder beim "Strippen" von (den Leukozyten, welche vorhanden sind in) einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers, d. h. als Teil der Analyse dieser Blutprobe. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung eines solchen Lysierungsagens bei der Lyse und/oder dem Strippen einer solchen Blutprobe, welche mit einem Verdünnungsmittel, wie oben beschrieben, verdünnt worden ist, d. h. als Teil der Analyse dieser Blutprobe.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von einem Verdünnungsmittel bei der Analyse des Bluts und/oder einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers, wobei das Verdünnungsmittel eine wässrige Lösung umfasst:

– welche eine Osmolalität von zwischen 290 und 400 aufweist,
– welche einen pH von zwischen 6,0 und 8,0 aufweist,
– optional zumindest ein Koagulans, ausgewählt aus EDTA, Citrat/Zitronensäure und/oder Salicylsäure, oder eine Kombination davon,

Wenn EDTA in dem Verdünnungsmittel der Erfindung vorhanden ist, kann es in jeder Form verwendet werden, welche für Hämocytometrie-Zwecke geeignet ist, einschließlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, seiner Di- und Trikaliumsalze und/oder seiner Di-, Tri- und Tetranatriumsalze, oder jeder Kombination davon.
Wenn Citrat in dem Verdünnungsmittel der Erfindung vorhanden ist, optional in Kombination mit Zitronensäure, kann das Citrat in jeder für Cytohämometrie-Zwecke geeigneten (Salz-)Form vorliegen, einschließlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Trinatriumcitrat.
Wenn Salicylsäure in dem Verdünnungsmittel der Erfindung vorhanden ist, kann es in jeder Form, – einschließlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, äquivalenten Formen – welche für Cytohämometrie-Zwecke geeignet ist, einschließlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Sulfosalicylsäure und/oder eine geeignete Salzform, wie Natriumsalycilat, verwendet werden.
Vorzugsweise umfasst das Verdünnungsmittel der Erfindung zusätzlich zu dem mindestens einen Anti-Koagulans, ausgewählt aus EDTA, Citrat/Zitronensäure und/oder Salicylsäure (oder Kombinationen davon), zumindest ein zusätzliches Anti-Koagulans (d. h. verschieden von/zusätzlich zu EDTA, Citrat/Zitronensäure und/oder Salicylsäure oder Kombinationen davon). Dieses "zusätzliche Anti-Koagulans" kann jedes für Hämocytrometrie-Zwecke geeignete per se bekannte Anti-Koagulans sein (oder jede geeignete Kombination von zwei oder mehreren solcher Anti-Koagulanzien) und kann insbesondere so ausgewählt werden, dass es das Verdünnungsmittel (sogar) besser geeignet macht zur Verwendung mit dem (d. h. das Verdünnungsmittel sogar besser anpasst an das) Lysierungsagens. Beispielsweise kann das "zusätzliche Anti-Koagulans" ausgewählt sein aus:

– Oxalat, z. B. in der Form eines für Cytohämometrie-Zwecke geeigneten Salzes, wie Kaliumoxalat,
– Fluorid, z. B. in einer für Cytohämometrie-Zwecke geeigneten Form, wie Natriumfluorid,

Vorzugsweise sollte die Verwendung von Heparin jedoch vermieden werden, da es für Hämocytometrie-Zwecke weniger geeignet sein kann.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines solchen Verdünnungsmittels beim Analysieren des Bluts oder einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung eines solchen Verdünnungsmittels beim Verdünnen einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers, d. h. als Teil der Analyse dieser Blutprobe.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse des Bluts und/oder einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Bereitstellen einer Blutprobe von diesem nicht-menschlichen Säuger,
b) Verdünnen dieser Blutprobe mit einem Verdünnungsmittel, wie vorstehend beschrieben,
c) Lysieren/Strippen der verdünnten Blutprobe von Schritt b) mit einem Lysierungsagens, wie vorstehend beschrieben,
d) optional Zählen der Leukozyten oder zumindest einer Subpopulation davon in der lysierten/gestrippten in Schritt c) erhaltenen Blutprobe und/oder Bestimmen des Hämoglobingehalts (z. B. als ein Hämatin-Komplex wie nachstehend be schrieben) in der lysierten/gestrippten in Schritt c) erhaltenen Blutprobe.

Bei diesen Verfahren weist die Probe, in/von welcher in Schritt d) die Leukozyten und/oder der Hämoglobingehalt gezählt/bestimmt worden ist vorzugsweise:

– einen pH von zwischen 4,0 und 7,5 und für die endgültige WBC/Hb-Verdünnung auf, und
– enthält mindestens eine quaternäre Ammoniumverbindung in einer Gesamtkonzentration von zwischen 1,5 und 4,5 Gramm pro Liter;

Die Erfindung wird nun nachstehend mit Bezug auf die Schritte a) bis d) dieses Verfahrens genauer erörtert. Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese Schritte üblicherweise automatisch durch den verwendeten Zählsortierer ausgeführt werden.
Das Blut oder die Blutprobe, welches/welche in Schritt a) verwendet wird, kann von jedem Tier und insbesondere von jedem nicht-menschlichen Säuger und insbesondere von einem Säugetier-Haustier (einschließlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Katzen, Hunde und Pferde) und/oder von einem agronomisch wichtigen Säuger (einschließlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Schaf, Kuh/Rind, Ziege, Lamm, Schwein, etc.) erhalten worden sein.
Die Erfindung ist besonders für die Analyse von Blut oder einer Blutprobe einer Katze, eines Hunds oder eines Pferds geeignet.
Vorzugsweise ist die Osmolalität dieser Tierblutprobe zwischen etwa 290 und 325 mOsmol/kg. Insbesondere kann das Blut oder die Blutprobe von einer Katze (Osmolalität zwischen 310–320 mOsmol/kg), einem Hund (Osmolalität zwischen 295–320 mOsmol/kg) oder einem Pferd (Osmolalität von etwa 320 mOsmol/kg) erhalten worden sein.
Im Vergleich dazu ist die Osmolalität von menschlichem Blut etwa 275–300 mOsmol/kg. Obwohl die Erfindung nicht auf irgendeinen spezifischen Mechanismus oder irgendeine spezifische Erklärung beschränkt ist, kann es sein, dass dieser Unterschied in der Osmolalität zwischen menschlichem Blut und tierischem Blut – was beispielsweise bedeutet, dass die Erythrozyten in tierischem Blut viel kleiner sind als die Erythrozyten in menschlichem Blut – einer der Gründe sein kann, warum Verdünnungsmittel, welche für die Analyse von menschlichem Blut bekannt sind, weniger für die Analyse von Blut von Tieren geeignet sind.
Die Blutprobe kann in jeder geeigneten per se bekannten Weise gewonnen werden, wie durch venöses Blut. Blut von Katzen und Hunden kann z. B. entweder von der Nacken- oder Pfotenvene entnommen werden. Von Pferden wird beinahe immer die Nackenvene verwendet werden, um Blut zu entnehmen. Die Blutprobe kann auch als eine EDTA oder ein anderes geeignetes Anti-Koagulans enthaltende Probe erhalten werden, z. B. unter Verwendung eines ein solches Anti-Koagulans enthaltenden Sammelröhrchens.
Vorzugsweise wird die Blutprobe nicht später als 24 Stunden nach dem Sammeln und vorzugsweise etwa 20 bis 30 Minuten nach dem Sammeln analysiert. Üblicherweise wird die zu analysierende Probe ein Volumen von zwischen 0,5 ml und 5 ml aufweisen, abhängig von der Konzentration des Anti-Koagulans und dem verwendeten Zählsortierer.
In Schritt b) wird die Blutprobe mit dem Verdünnungsmittel der Erfindung verdünnt. Dieses Verdünnungsmittel umfasst im Allgemeinen eine wässrige Lösung mit einer Osmolalität von zwischen 290 und 400 mOsmol/kg, vorzugsweise zwischen 340 und 400 mOsmol/kg, insbesondere zwischen 350 und 390 mOsmol/kg und insbesondere zwischen 365 und 375 mOsmol/kg. Im Vergleich dazu weisen Verdünnungsmittel für die Analyse menschlichen Bluts üblicherweise eine Osmolalität von zwischen 240 und 350 auf.
Die Osmolalität des in der Erfindung verwendeten Verdünnungsmittels ist spezifisch an die Analyse von nicht-menschlichem Säugetierblut angepasst und sogar noch spezifischer an die Analyse des Bluts von Katzen, Hunden und/oder Pferden. Allgemeiner kann die Osmolalität so gewählt werden, dass sich der wie mit den hierin beschriebenen Techniken unter Verwendung des Verdünnungsmittels der Erfindung bestimmte Hämatokritwert (z. B. das Verhältnis von Zellen zum Gesamtblutvolumen) um nicht mehr als 2% von dem wie für die im Wesentlichen selbe Probe (z. B. vom selben Tier oder von derselben Tierart) durch Mikrozentrifugation (eine Referenztechnik) bestimmten Hämatokritwert unterscheidet.
Das in der Erfindung verwendete Verdünnungsmittel ist auch leicht sauer, mit einem pH, welcher vorzugsweise zwischen 6,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,0 und 7,0 und insbesondere zwischen 6,4 und 6,6 liegt. Im Vergleich dazu weisen Verdünnungsmittel für die Analyse von menschlichem Blut üblicherweisen einen pH von zwischen 6,5 und 7,5 auf.
Wenn man das obige in Betracht zieht, kann ein besonders bevorzugtest Verdünnungsmittel der Erfindung beispielsweise eine Osmolalität von zwischen 365 und 375 mOsmol/kg und einen pH von zwischen 6,4 und 6,6 aufweisen.
Das in der Erfindung verwendete Verdünnungsmittel ist weiterhin so, dass es das Vorhandensein von mindestens einem (zusätzlichen) Anti-Koagulans vorsieht, d. h. zusätzlich zu EDTA, welches (auch) in dem Verdünnungsmittel vorhanden sein kann oder welches bereits in der gesammelten Blutprobe vorhanden sein kann, z. B. wenn eine EDTA-anti-koagulierte Blutprobe verwendet wird.
Das Vorhandensein dieses "zusätzlichen" Anti-Koagulans kann helfen, die Bildung von Thromozytenaggregaten zu reduzieren/verhindern, welche zusammenhängen können mit dem/verursacht sein können durch das Vorhandensein von erhöhten Pegeln von Adrenalin in der Blutprobe, z. B. bedingt durch den Stress, unter dem das Tier stehen kann, wenn die Blutprobe gesammelt wird. Solche erhöhten Pegel von Adrenalin in der Probe können umgekehrt zu der Aktivierung von Gerinnungsfaktoren führen, wie Faktor VIII, welcher die Blutgerinnungskaskade starten oder auslösen und somit zu der Bildung von Plättchenaggregaten führen kann. Da solche Aggregate schwer abzusondern sind, können sie zu Ungenauigkeiten in der Bestimmung der Blutplättchenzahl führen. Sie können auch die Differenzierung/Zählung der Leukozyten und insbesondere der Differenzierung/Zählung der Lymphozyten stören. Das Vorgenannte ist insbesondere ein Problem wenn Blutproben verwendet werden, welche von Tieren erhalten worden sind, welche leicht gestresst sind, wie Katzen.
Geeignete Anti-Koagulanzien schließen EDTA, Citrat/Zitronensäure und Salicylsäure oder eine Kombination davon ein. Diese können in per se bekannten konventionellen Mengen verwendet werden, beispielsweise:

– EDTA: zwischen 0,001 und 0,4%, insbesondere etwa 0,04%,
– Citrat/Zitronensäure: zwischen 0,01 und 1%, insbesondere etwa 0,25%,
– Salicylsäure: zwischen 0,0001 und 0,1%, insbesondere weniger als 0,01%

Das Verdünnungsmittel kann weiterhin eine oder mehrere per se bekannte weitere Bestandteile für Verdünnungsmittel enthalten, welche wiederum in per se bekannten Mengen vorhanden sein können. Diese können die folgenden Bestandteile einschließen, ohne aber darauf beschränkt zu sein:

– für die Pufferungen des pHs verwendete anorganische Salze, wie Phosphate (Na₂HPO₄, NaH₂PO₄ oder KH₂PO₄), Borate (Na₂B₄O₇) und Tris(hydroxymethyl)aminomethan,
– Harnstoffverbindung, wie Dimethylolharnstoff,
– Aminoverbindungen, wie Prokainhydrochlorid,
– anorganische Sulfatsalze, wie Na₂SO₄,
– anorganische Chloridsalze, wie NaCl,
– Konservierungsmittel, wie Natriumazid, Monophenylglykol, Natriumbenzoat, Thimerosal oder Natrium-1-Hydroxypyrinin-2-Thion,

Ein besonders bevorzugtes in der Erfindung verwendetes Verdünnungsmittel ist eine wässrige Lösung mit einer Osmolalität von zwischen 340 und 400 und insbesondere etwa 370 mOsmol/ml und einem pH von zwischen 6,0 und 7,0 und insbesondere etwa 6,5, welches pro 1 Liter Wasser die folgenden Bestandteile (z. B. ausgewählt aus den spezifischen hierin offenbarten Verbindungen) enthält:

– mindestens ein anorganisches Salz:	13–21 g
davon:
– zur Pufferung verwendetes anorganisches Salz:	2–8 g
– anorganisches Sulfatsalz:	9–10 g
– anorganisches Chloridsalz:	2–3 g
– eine oder mehrere Harnstoffverbindungen:	1–3 g
– eine oder mehrere Amminoverbindungen:	0,05–0,15 g
– Anti-Koagulanzien (insgesamt):	< 3,0 g
– Konservierungsmittel (insgesamt):	< 1,0 g.

Ein erfindungsgemäßes Verdünnungsmittel kann beispielsweise pro 1 Liter Wasser enthalten:

– Na₂HPO₄	3–4 g
– NaH₂PO₄·1H₂O	2–3 g
– Dimethylolharnstoff	1–3 g
– Prokainhydrochlorid	0,05–0,15 g
– Na₂SO₄	9–10 g
– NaCl	2–3 g
– Zitronensäure	0,5–1,0 g
– NatriumCitrat	1–2 g
– Sulfosalicylsäure	0,004–0,008 g
– Natrium EDTA	0,3–0,4 g
– Konservierungsmittel	0,05–0,10 g

Unter Verwendung dieses Verdünnungsmittels wird die Blutprobe auf eine Verdünnung von zwischen 1:100 und 1:200 verdünnt.
Daraufhin wird die verdünnte Blutprobe von Schritt b) in Schritt c) unter Verwendung des erfindungsgemäßen Lysierungsagens lysiert/gestrippt, wie nachfolgend weiter beschrieben.
Zusätzlich zu diesem Lysierungsschritt c) kann ein Teil der verdünnten Blutprobe von Schritt b) gesammelt und in einem getrennten Schritt für die Bestimmung, unter anderem, der Zahl roter Blutzellen, der Blutplättchenzahl und/oder des mittleren Korpuskularvolumens (MCV) verwendet werden. Für diese Zweck wird üblicherweise ein Teil der verdünnten Blutprobe von Schritt b) weiter verdünnt, z. B. auf eine endgültige Verdünnung von zwischen 1:10000 und 1:60000, z. B. (vorzugsweise) unter Verwendung desselben Verdünnungsmittels, welches in Schritt b) verwendet wurde oder eines anderen geeigneten Verdünnungsmittels. Daraufhin kann einer oder mehrere der zuvor genannten Parameter der Blutprobe bestimmt werden, z. B. in einer für die Analyse menschlichen Bluts per se bekannten Weise. Beispielsweise kann die Zahl roter Blutzellen und die Plättchenzahl unter Verwendung einer Öffnung-Impedanz-Technik, beispielsweise bei Öffnungsgrößen von zwischen 60 und 100 μm (Mikrometer), bestimmt werden.
Das in der Erfindung verwendete Lysierungsagens ist im Allgemeinen eine wässrige Lösung, welche mindestens eine (vorzugsweise wasserlösliche) quaternäre Ammoniumverbindung enthält, so dass nach Zusatz des Lysierungsreagens die Gesamtkonzentration quaternärer Ammoniumverbindungen in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung zwischen 1,5 und 4,5 Gramm pro Liter liegt.
Die quaternäre Ammoniumverbindung kann jede quaternäre Ammoniumverbindung oder Kombination von für Lysierungsagenzien per se bekannten quaternären Ammoniumverbindungen sein, wie ein Dodecyltrimethylammoniumhalogenid, ein Tetradecyltrimethylammoniumhalogenid, ein Hexadecyltrimethylammoniumhalogenid und/oder ein Ethylhexadecyldimethylammoniumhalogenid (worin sich die Bezeichnung "Halogenid" auf das Vorhandensein eines Halogenanions, wie Fluorid, Chlorid, Bromid oder Iodid als das Gegenion bezieht) und/oder die in US-A-4346018 und/oder US-A-4485175 genannten quaternären Ammoniumverbindungen oder jede Kombination davon.
Besonders bevorzugt sind quaternäre Ammoniumverbindungen der allgemeinen Formel: [(R₁)₃N⁺-(CH₂)_nCH₃]X^–1 in welcher:

– jede Gruppe R₁ unabhängig eine C₁-C₃-Alkylgruppe, bevorzugt eine Methyl- oder Ethylgruppe und höchst bevorzugt eine Methylgruppe ist,
– n eine ganze Zahl zwischen 5 und 21, bevorzugt zwischen 7 und 15 und bevorzugter zwischen 9 und 13 und insbesondere 11, ist und
– X^– ein geeignetes Anion, wie Chlorid, Bromid oder Fluorid ist,

Die quaternären Ammoniumverbindungen, optional zusammen mit einem oder mehreren der anderen Bestandteile des Lysierungsagens, wie nachfolgend erwähnt, sorgen für die (Stromato-)Lyse der Erythrozyten und das Strippen der Leukozyten, um eine Unterscheidung der Leukozyten-Subpopulationen zu erlauben. Somit sollte die Konzentration der quaternären Ammoniumverbindung(en) in dem Lysierungsagens der Erfindung allgemeiner so sein, dass sie die Lyse der Erythrozyten und das Strippen der Leukozyten erlaubt, bevorzugter so, dass sie die Differenzierung der Leukozyten in zumindest beliebige zwei und bevorzugt alle drei der oben genannten Leukozyten-Subpopulationen erlaubt.
In dieser Hinsicht sollte beachtet werden, dass die Konzentration der quaternären Ammoniumverbindungen in dem in der Erfindung verwendeten Lysierungsagens allgemein niedriger ist als die Konzentrationen solcher quaternärer Ammoniumverbindungen in Lysierungsagenzien für die Analyse von menschlichen Blutproben. Üblicherweise werden die Konzentrationen solcher quaternärer Ammoniumverbindungen so sein, dass sie in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung, wie oben beschrieben, eine Konzentration quaternärer Ammoniumverbindungen zwischen 4,5–7,5 Gramm pro Liter bereitstellen. Im Vergleich dazu ist in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung für die Analyse von menschlichem Blut die Konzentration dieser quaternären Ammoniumverbindungen üblicherweise zwischen 4,5 und 7,5 g/l.
Die in der Erfindung verwendeten Lysierungsagenzien werden auch so sein, dass sie die endgültige WBC/Hb-Verdünnung mit einem pH von zwischen 4,0 und 7,5, vorzugsweise zwischen 5,0 und 7,0, bereitstellen können, was niedriger ist als der übliche pH von Lysierungsagenzien für die Analyse von menschlichem Blut, welche üblicherweise einen pH von zwischen 6,0 und 8,0 aufweisen (und insbesondere von > 7,0 bedingt durch das Vorhandensein von Zyanid in den meisten konventionellen Lysierungsagenzien für 2- oder 3-teilige Differenzialanalyse). Die Verwendung eines solch niedrig(er)en pHs in den Lysierungsagenzien der Erfindung reduziert/verhindert (weiter) die Bildung von Plättchenaggregaten und erleichtert die Stromatolyse der Erythrozyten. Der niedrigere pH der Lysierungsagenzien der Erfindung hilft auch die Leukozyten zu stabilisieren.
Das in der Erfindung verwendete Lysierungsagens ist vorzugsweise im Wesentlichen Zyanid-frei, indem keine Zyanid-enthaltenden Salze oder andere Bestandteile für die Analyse von Hämoglobin (z. B. wie ein Zyanid-enthaltender Komplex) zugesetzt worden sind. Stattdessen wird das Hämoglobin bei Ver wendung des Lysierungsagens der Erfindung vorzugsweise durch das Vorhandensein eines geeigneten (An-)Ions, wie ein Chlorid- und/oder Bromidion, in dem Lysierungsagens in einen Zyanid-freien Hämatin-Komplex umgewandelt. Dieser Zyanid-freie Hämatin-Komplex kann dann (spektro-)fotometrisch gemessen werden, wie nachstehend weiter beschrieben.
Das in der Erfindung verwendete Lysierungsagens kann weiter einen oder mehrere per se bekannte Bestandteile für Lysierungsagenzien in per se bekannten Mengen enthalten. Diese können Komponenten einschließen wie:

– eine geeignete organische oder eine anorganische Säure, beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Buttersäure, Zitronensäure, Salicylsäure, Phathalsäure oder Salzsäure oder jede geeignete Kombination davon. Das Vorhandensein dieser Säuren kann (weiter) zu der Stromatolyse der Erythrozyten beitragen;
– ein wasserlösliches Sulfatsalz, wie Natriumsulfat, Kaliumsulfat und/oder Ammoniumsulfat oder jede geeignete Kombination davon. Diese Sulfate helfen die Leukozyten zu stabilisieren und/oder die Differenzierung der Leukozyten-Subpopulationen zu verbessern;
– ein Glykol, wie Monoethylenglykol, Diethylenglykol, Propylenglykol und/oder Glycerol oder jede geeignete Kombination davon, was auch helfen kann, die Leukozyten zu stabilisieren und/oder die Differenzierung der Leukozyten-Subpopulationen zu verbessern;
– ein Alkohol oder Alkoxyalkohol, wie Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, Phenoxyethanol und/oder 2-Butoxyethanol oder jede geeignete Kombination davon;
– eine tertiäre Ammoniumverbindung und insbesondere ein tertiäres Ammoniumoxyd, wie N,N-Dimethyldodecylamin-N-Oxyd, welches (weiter) zu der Stromatolyse der Erythrozyten bei tragen kann und/oder helfen kann, die Leukozyten und/oder den Hämatin-Komplex zu stabilisieren.

Solche Verbindungen können beispielsweise die Formel
aufweisen, in welcher jede Gruppe R₁ unabhängig eine C₁-C₃-Alkylgruppe, bevorzugt eine Methyl- oder Ethylgruppe und höchst bevorzugt eine Methylgruppe ist und in welcher n eine ganze Zahl von zwischen 5 und 21, bevorzugt zwischen 7 und 15, bevorzugter zwischen 9 und 13 und insbesondere 11, ist;

– einen Polyoxyethylen-Alkyl-Phenylether, wie Triton X-100, Nodidet P-40 oder Tergitol, was (weiter) zu der Stromatolyse der Erythrozyten beitragen kann und/oder helfen kann, die Leukozyten und/oder den Hämatin-Komplex zu stabilisieren.

Beispielsweise kann eine solche Verbindung beispielsweise einen aromatischen Ring umfassen, welcher (zumindest) substituiert ist (vorzugsweise in einer Para-Konfiguration) mit zumindest einer (und vorzugsweise nur einer) linearen oder (bevorzugt) verzweigten Alkylgruppe mit zwischen 2 und 16, bevorzugt zwischen 4 und 12, bevorzugter zwischen 6 und 10, Kohlenstoffatomen, und insbesondere 8 Kohlenstoffatomen, wie ein 1,1,3,3-Tetramethylbutyl-Rest und mindestens einen (und bevorzugt nur einen) substituierten oder (bevorzugt) unsubstituierten Polyether-Rest der Formel -O-(CH2-(CH2)_p-O)_q-H, in welcher p 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 (und bevorzugt 1) ist und q eine ganze Zahl zwischen 2 und 14 (und bevorzugt 9) ist, oder jede geeignete Kombination von zwei oder mehreren dieser Bestandteile.
Ein in der Erfindung verwendetes besonders bevorzugtes Lysierungsagens ist eine wässrige Lösung, welche einen pH in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung von zwischen 4,0 und 7,5 ergibt.

Insbesondere kann das Lysierungsagens so sein, dass es in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung die folgenden Bestandteile (z. B. ausgewählt aus den spezifischen hierin genannten Verbindungen) in den nachfolgenden Konzentrationen, basierend auf 1 Liter endgültiger WBC/Hb-Verdünnung, bereitstellt:

– ein oder mehrere anorganische Sulfatsalze:	6–10 g
– eine oder mehrere Ammoniumverbindungen:	6,5–13,5 g
davon:
– tertiäre Ammoniumverbindungen:	5–9 g
– quaternäre Ammoniumverbindungen:	1,5–4,5 g
– eine oder mehrere organische oder anorganische Säuren:	0,2–1,0 ml
– ein oder mehrere Glykole:	6–10 ml
– einen oder mehrere Polyoxyalkylen-Phenyl-Alkylether:	< 1,0 ml

Das Lysierungsagens kann beispielsweise so sein, dass es in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung die folgenden Verbindungen in den nachfolgenden Konzentrationen, basierend auf 1 Liter endgültiger WBC/Hb-Verdünnung, bereitstellt:

– Na₂SO₄ 6–10 g

– N,N-Dimethyldodecylamin-N-Oxyd 5–9 g

– Dodecyltrimethylammoniumbromid 1,5–4,5 g

– Ameisensäure 0,2–1,0 ml

– Ethylenglykol 6–10 ml

oder alternativ:

– Na₂SO₄ 6–10 g

– Dodecyltrimethylammoniumbromid 1,5–4,5 g

– Ethyldimethylhexadecylammoniumbromid < 0,5 g

– Triton X-100 < 0,5 g
Das Lysierungsagens wird zu der verdünnten Blutprobe von Schritt b) bevorzugt in einem Verhältnis von zwischen 0,25 und 2,50 ml, basierend auf dem Volumen der in Schritt b) erhaltenen verdünnten Blutprobe, zugesetzt. Allgemein wird dies eine endgültige Verdünnung, verglichen mit der originalen Blutprobe, von zwischen 1:200 und 1:500 ergeben.
Nachdem das Lysierungsagens zugesetzt worden ist, wird der Lyse/dem Strippen für eine geeignete Zeitdauer, z. B. von zwischen 2 und 15 Sekunden, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. etwa 18 und 30°C, erlaubt stattzufinden.
Nach dem Lyseschritt c) werden die Leukozyten oder zumindest eine Subpopulation davon unter Verwendung einer Zellsortierungs-/Zellzählungstechnik gezählt, bevorzugt unter Verwendung eines per se für die Analyse von menschlichen Blutproben bekannten automatisierten Zellsortierers oder Zellzählers.
Wie oben erwähnt ist die Erfindung insbesondere vorgesehen zur Verwendung mit Zellsortierern oder Zellzählern, welche nach dem Öffnung-Impedanz-Prinzip arbeiten, wie die Öffnung-Impedanz-basierten Zellsortierer, welche durch Coulter, Abbott, Sysmex, Nihon Kohden, Erma, ABX, Medonic, Swelab, BioChem ImmunoSystems, Danam, Diatron, Melet, Medonic und Hycel vermarktet werden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Erfindung in ihrem breitesten Sinne die Verwendung jeden Typs von Zellsortierer oder Zellzähler umfasst, unab hängig von dessen Arbeitsprinzip, und somit auch die Verwendung von Zellsortierern umfasst, welche (beispielsweise) nach dem Lichtstreuungsprinzip arbeiten.
Die spezifischen Einstellungen des verwendeten Zellsortierers werden von dem Typ des verwendeten Zellsortierers, der spezifischen Verdünnung und dem verwendeten erfindungsgemäßen Lysierungsagens und von der zu analysierenden Blutprobe abhängen. Geeignete Einstellungen können leicht durch den Fachmann bestimmt werden, optional nach einigen einfachen Anfangsexperimenten und/oder einem beschränkten Grad von Versuch und Irrtum. Es ist auch beabsichtigt, dass die erfindungsgemäßen Verdünnungsmittel, Lysierungsagenzien und/oder Kits mit einer Anleitung vermarktet werden können, in welcher geeignete Einstellungen für einen gegebenen Zellsortierer und eine gegebene Tierart genannt sind.
Bevorzugt werden in Schritt d) mindestens eine, bevorzugt mindestens zwei und höchst bevorzugt alle 3 Subpopulationen der Leukozyten – d. h. die Lymphozyten, die "gemischte Zellpopulation" und die Granulozyten – getrennt gemessen/bestimmt. Demgemäß sind das Verdünnungsmittel und das Lysierungsagens, welche in der Erfindung verwendet werden, höchst bevorzugt so, dass sie die Differenzierung von mindestens beliebigen zwei, bevorzugt allen drei, dieser Leukozyten-Subpopulationen erlauben. Eine geeignete Öffnungsgröße für den Zellzähler kann zwischen 70 und 120 μm sein.
Zusätzlich zu der Messung der Leukozyten oder Leukozyten-Subpopulationen in Schritt d) kann auch der Hämoglobingehalt der Probe bestimmt werden. Zu diesem Zweck wird das von den lysierten roten Blutzellen während des Lyseschritts freigesetzte Hämoglobin durch die Chlorid- und/oder Bromidionen in dem Lysierungsagens bevorzugt in einen Zyanid-freien hämatinartigen Komplex umgewandelt, welcher spektrofotometrisch bei einer Wellenlänge von zwischen 500 nm und 600 nm, bevorzugt etwa 535–545 nm, gemessen/detektiert werden kann. Das kann weiterhin in einer für menschliche Blutproben per se bekannten Art ausgeführt werden.
Die Erfindung wird nun mittels des folgenden nicht limitierenden experimentellen Teils sowie der Figuren veranschaulicht, in welchen:
1A und 1B Ausdrucke sind, welche die Ergebnisse der Analyse von Blut einer Katze unter Verwendung eines Medtronic CA 530-Analysierers zeigen. 1A: Ergebnisse, welche unter Verwendung bekannter Reagenzien für die Analyse von menschlichem Blut erhalten wurden (vergleichend); 1B: Ergebnisse, welche unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reagenzien erhalten wurden.
2A und 2B Ausdrucke sind, welche die Ergebnisse der Analyse von Blut eines Hundes unter Verwendung eines Medtronic CA 530-Analysierers zeigen. 2A: Ergebnisse, welche unter Verwendung bekannter Reagenzien für die Analyse von menschlichem Blut erhalten wurden (vergleichend); 2B: Ergebnisse, welche unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reagenzien erhalten wurden.
3A und 3B Ausdrucke sind, welche die Ergebnisse der Analyse von Blut eines Pferds unter Verwendung eines Medtronic CA 530-Analysierers zeigen. 3A: Ergebnisse, welche unter Verwendung bekannter Reagenzien für die Analyse von menschlichem Blut erhalten wurden (vergleichend); 3B: Ergebnisse, welche unter Verwendung erfindungsgemäßer Reagenzien erhalten wurden.
Experimenteller Teil:

In den untenstehenden Beispielen wurden ein isotonisches Verdünnungsmittel und Lysierungsagens, welche für die Analyse von menschlichem Blut per se bekannt sind (kollektiv: "Humanreagenzien") und ein isotonisches Verdünnungsmittel und Lysierungsagens (kollektiv: "Veterinärreagenzien") gemäß der Erfindung verwendet. Diese hatten die folgende Zusammensetzung: Zusammensetzung "Humanreagenzien": a. isotonisches Verdünnungsmittel

	Pro Liter
Na₂HPO₄	3,60 g
NaH₂PO₄·2H₂O	2,18 g
Na₂SO₄	8,33 g
NaCl	1,28 g
NaN₃	0,50 g
Tween 20	0,05 mL
NaF	0,64 g
Na₂EDTA·2H₂O	0,36 g

b. Lysierungsagens

	Pro Liter
Na₂HPO₄	5,68 g
Na₂SO₄	8,33 g
NaCl	4,75 g
Dodecyltrimethylammoniumbromid	4,00 g
Natriumdodecylsulfat	0,10 g
Ethylhexadecyldimethyl-ammoniumbromid	0,35 g

Zusammensetzung "Veterinärreagenzien": a. isotonisches Verdünnungsmittel

	Pro Liter
Na₂HPO₄	3,46 g
NaH₂PO₄·H₂O	2,45 g
Dimethylolharnstoff	2,00 g
Prokainhydrochlorid	0,11 g
Na₂SO₄	9,72 g
NaCl	2,38 g
Zitronensäure·1H₂O	0,75 g
Natrium(III)citrat·2 H₂O	1,6 g
Sulfosalicylsäure	0,05 g
NaN₃	0,10 g
Na₂EDTA·2H₂O	0,36 g

b. Lysierungsagens

	Pro Liter
Na₂SO₄	8,33 g
Dodecyltrimethyl-ammoniumbromid	4,00 g
N,N-Dimethyldodecylamin-N-Oxyd	0,65 g
Ameisensäure	0,50 mL
Ethylenglykol	8,00 mL

Beispiel I: Analyse des Bluts einer Katze.
Zwei identische Proben von Blut von einer Katze wurden auf einem Medonic CA530-Analysierer analysiert.
Eine der Proben wurde mit den unten genannten "Veterinärreagenzien" analysiert; die andere wurde als ein Vergleich mit den oben genannten "Humanreagenzien" analysiert.
Die Ergebnisse sind in 1A ("Humanreagenzien", Vergleich) bzw. 1B ("Veterinärreagenzien", Erfindung) angegeben.
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, sind die unter Verwendung der Veterinärreagenzien erhaltenen Ergebnisse deutlich informativer, erlauben unter anderem eine Unterscheidung von drei unterschiedlichen Subpopulationen (sichtbar als drei separate Peaks) in der WBC-Zählung.
Beispiel II: Analyse des Bluts eines Hundes.
Zwei identische Proben von Blut von einem Hund wurden auf einem Medonic CA530-Analysierer analysiert.
Eine der Proben wurde mit den unten genannten "Veterinärreagenzien" analysiert; die andere wurde als ein Vergleich mit den oben genannten "Humanreagenzien" analysiert.
Die Ergebnisse sind in 2A ("Humanreagenzien", Vergleich) bzw. 2B ("Veterinärreagenzien") angegeben.
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, sind die unter Verwendung der Veterinärreagenzien der Erfindung erhaltenen Ergebnisse deutlich informativer, erlauben unter anderem eine Unterscheidung von drei unterschiedlichen Subpopulationen (sichtbar als drei separate Peaks) in der WBC-Zählung.
Beispiel III: Analyse des Bluts eines Pferds.
Zwei identische Proben von Blut von einem Pferd wurden auf einem Medonic CA530-Analysierer analysiert.
Eine der Proben wurde mit den unten genannten "Veterinärreagenzien" analysiert; die andere wurde als ein Vergleich mit den oben genannten "Humanreagenzien" analysiert.
Die Ergebnisse sind in 3A ("Humanreagenzien", Vergleich) bzw. 3B ("Veterinärreagenzien", Erfindung) angegeben.
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, sind die unter Verwendung der Veterinärreagenzien erhaltenen Ergebnisse deutlich informativer, erlauben unter anderem eine Unterscheidung von unterschiedlichen Subpopulationen in der WBC-Zählung.

Claims

Verwendung eines Lysierungsagens beim Analysieren des Bluts oder einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers und bei der Lyse von (den Erythrozyten, welche vorhanden sind in) einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers und/oder beim "Strippen" von (den Leukozyten, welche vorhanden sind in) einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers, d. h. als Teil der Analyse von dieser Blutprobe, wobei das Lysierungsagens im Wesentlichen zyanidfrei ist und nach Verdünnung auf die endgültige WBC/Hb-Verdünnung einen pH von zwischen 4,0 und 7,5 und eine Gesamtkonzentration von quaternären Ammoniumverbindungen in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung von zwischen 1,5 und 4,5 Gramm pro Liter bereitstellt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Lysierungsagens in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung die folgenden Bestandteile in den nachfolgenden Konzentrationen, basierend auf einem Liter endgültiger WBC/Hb-Verdünnung, bereitstellt: – ein oder mehrere anorganische Sulfatsalze: 6–10 g – eine oder mehrere Ammoniumverbindungen: 6,5–13,5 g davon: – tertiäre Ammoniumverbindungen: 5–9 g – quaternäre Ammoniumverbindungen: 1,5–4,5 g – eine oder mehrere organische oder anorganische Säuren: 0,2–1,0 ml – ein oder mehrere Glykole: 6–10 ml – ein oder mehrere Polyoxyalkylen-Phenyl-Alkyl-Ether: < 1,0 ml
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 bei der Lyse und/oder dem Strippen einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers, welche verdünnt worden ist mit einem Verdünnungsmittel, umfassend eine wässrige Lösung: – welche eine Osmolalität von zwischen 290 und 400 aufweist, – welche einen pH von zwischen 6,0 und 8,0 aufweist, optional zumindest ein Anti-Koagulans, ausgewählt aus EDTA, Citrat/Zitronensäure und/oder Salicylsäure, oder eine Kombination davon, und optional weiterhin einen oder mehrere per se bekannte Bestandteile für Verdünnungsmittel enthält.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Verdünnungsmittel mindestens ein weiteres Anti-Koagulans, welches nicht EDTA, Citrat/Zitronensäure und/oder Salicylsäure ist, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Vedünnungsmittel eine Osmolalität von zwischen 340 und 400 mOsmol/kg und einen pH von zwischen 6,0 und 7,0 aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Verdünnungsmittel eine Osmolalität von zwischen 365 und 375 mOsmol/kg und einen pH von zwischen 6,4 und 6,6 aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das Verdünnungsmittel die folgenden Bestandteile pro Liter Wasser umfasst: – mindestens ein anorganisches Salz: 13–21 g davon: – zur Pufferung verwendetes anorganisches Salz: 2–8 g – anorganisches Sulfatsalz: 9–10 g – anorganisches Chloridsalz: 2–3 g – eine oder mehrere Harnstoffverbindungen: 1–3 g – eine oder mehrere Amminoverbindungen: 0,05–0,15 g – Anti-Koagulans: < 3,0 g – Konservierungsmittel: < 1,0 g.
Verfahren zur Analyse des Bluts und/oder von einer Blutprobe eines nicht-menschlichen Säugers, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Blutprobe von diesem nicht-menschlichen Säuger; b) Verdünnen dieser Blutprobe mit einem Verdünnungsmittel umfassend eine wässrige Lösung: – welche eine Osmolalität von zwischen 290 und 400 aufweist, – einen pH von zwischen 6,0 und 8,0 aufweist, – optional mindestens ein Anti-Koagulans, ausgewählt aus EDTA, Citrat/Zitronensäure und/oder Salicylsäure oder einer Kombination davon, und optional weiterhin eine oder mehrere per se bekannte Bestandteile für Verdünnungsmittel enthält, c) Lysieren/Strippen der verdünnten Blutprobe von Schritt b) mit einem Lysierungsagens, welches im Wesentlichen zyanidfrei ist und welches nach Verdünnung auf die endgültige WBC/Hb-Verdünnung einen pH von zwischen 4,0 und 7,5 und eine Gesamtkonzentration von quaternären Ammoniumverbindungen in der endgültigen WBC/Hb-Verdünnung von zwischen 1,5 und 4,5 Gramm pro Liter bereitstellt, d) optional Zählen der Leukozyten oder zumindest einer Subpopulation davon in der lysierten/gestrippten in Schritt c) erhaltenen Blutprobe und/oder Bestimmen des Hämoglobingehalts in der lysierten/gestrippten in Schritt c) erhaltenen Blutprobe.
Verfahren nach Anspruch 8, bei welchem die Probe, in/von welcher in Schritt d) die Leukozyten und/oder der Hämoglobingehalt gezählt/bestimmt worden ist, – einen pH von zwischen 4,0 und 7,5 und für die endgültige WBC/Hb-Verdünnung aufweist und – mindestens eine quaternäre Ammoniumverbindung in einer Gesamtkonzentration von zwischen 1,5 und 4,5 Gramm pro Liter enthält.
Verfahren nach Anspruch 8 und/oder 9, bei welchem, bei Schritt d) zumindest zwei, und vorzugsweise alle drei der Leukozyten-Subpopulationen, umfassend die Lymphozyten, die "gemischte Zellpopulation" und/oder die Granulozyten, getrennt gezählt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei welchem ein Teil der in Schritt b) erhaltenen verdünnten Blutprobe weiter verdünnt wird, woraufhin in dieser weiter verdünnten Blutprobe die Zahl roter Blutzellen, die Blättchenzahl und/oder das mittlere Korpuskularvolumen bestimmt wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 3 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei welcher/welchem der nicht-menschliche Säuger ausgewählt ist aus Säugetier-Haustieren, einschließlich aber nicht beschränkt auf Katzen, Hunde und Pferde und/oder aus agronomisch wichtigen Säugern, einschließlich aber nicht beschränkt auf Schaf, Kühe/Rind, Ziegen, Lämmer und/oder Schweine.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 3 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei welcher/welchem der nicht-menschliche Säuger ausgewählt ist aus einer Katze, einem Hund und/oder einem Pferd.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, Verwendung nach Anspruch 12 oder 13 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei welcher/welchem die Analyse der Blutprobe durch eine Öffnung-Impedanz-Technik erfolgt.