DE2943423C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur direkten Bestimmung von Eisen in einer Blutserumprobe mit Ferrozin in Gegenwart eines Reduktionsmittels durch kolorimetrische Bestimmung des gebildeten Komplexes. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Ferrozin, Thiosemicarbazid und Ascorbinsäure enthaltendes Reagenz zur Bestimmung von Eisen im Blutserum.

Es sind bereits mehrere Methoden zur Direktbestimmung von Eisen im Blutserum bekannt. Einige dieser Methoden bauen sich auf der Möglichkeit auf, daß gefärbte Komplexe zwischen zwei­ wertigen Eisenionen und Komplexbildnern, wie z. B. BP (4,7- Diphenyl-1,10-phenantrolin), TPTZ (2,4,6-Tris-(2-pyridyl)- s-triazin) und Ferrozin [Dinatriumsalz von 3-(2-Pyridyl)- 5,6-bis-(4-sulfophenyl)-s-triazin; vgl. L. L. Stookey "Analytical Chemistry" 42, Nr. 7, 779, 1970] gebildet werden und daß der gebildete Komplex spektrophotometrisch bestimmt wird. In speziellen Literaturstellen wird festgestellt, daß Ferrozin besonders gut geeignet ist, da es mit zweiwertigem Eisen einen gefärbten Komplex mit sehr hoher Absorption (ε = 27, 100), der in Wasser löslich und bei einem pH-Wert zwischen 3,5 und 11 und vorzugsweise zwischen 4 und 9 stabil ist, bildet.

Die meisten Bestimmungsmethoden für Eisen im Serum, die bereits bekannt sind, erfordern folgendes: (1) Die Dissoziation von Eisen vom Serumtransferrin durch Behandlung mit einer starken Mineralsäure in Gegenwart eines Reduktionsmittels, (2) die Deproteinisierung von Serum durch Ausfällung der Proteine, z. B. mit Trichloressigsäure, (3) die Bestimmung der zweiwertigen Eisenionen, die in der Lösung zurückbleiben, durch Farbreaktion mit Ferrozin, nachdem der pH-Wert der Lösung mit Puffer auf einen Wert zwischen 3 und 6 eingestellt worden ist (vgl. P. Carter "Anal. Biochem.", 40, 450, 1971).

Andere Methoden sind als Direktmethoden bekannt, und sie erfordern keine Ausfällung der Proteine (vgl. z. B. J. P. Persÿn et al. "Clin. Chim. Acta" 35, 91, 1971; J. M. White et al. "Clin. Chem.", Band 19, Nr. 5, 526, 1973; R. Ruutu "Chlin. Chim. Acta" 61, 229, 1975).

Bei diesen Methoden werden im allgemeinen Puffer in einem pH-Bereich verwendet, der dem isoelektrischen Punkt der meisten der Serumproteine und daher dem Instabilitätsmaximum entspricht. Die Ausfällung von Proteinen, die die Analysen­ ergebnisse stark stören würde, wird durch Zugabe von ober­ flächenaktiven Mitteln verhindert. Diese sollten auch die Ablösung des Eisens von dem Transferrin bewirken, ohne daß der pH-Wert erniedrigt wird. Jedoch gestattet die variable Protein­ zusammensetzung der verschiedenen Seren nicht in jedem Fall einen gleichförmigen und stabilen Schutz gegenüber der Ausbildung einer Trübung. Tatsächlich werden individuelle Unterschiede nicht dadurch behoben, daß man die Anfangsabsorption oder diejenige der Blindprobe abliest, weil in manchen Fällen eine unvorhersehbare Trübung des gefärbten Komplexes auftreten kann. Dazu kommt noch, daß die Freisetzung des Eisens von dem Transferrin nicht vollständig sein kann, wodurch fehlerhaft niedrige Werte erhalten werden. Aus den obigen Gründen hat das Expertengremium für Eisen des Internationalen Komitees zur Standardisierung der Hämatologie als Referenzserumeisenmethode alle derzeit bekannten zahlreichen Direktmethoden ohne Proteinausfällung zurückgewiesen (vgl. E. W. Rice et al. "Clin. Chim. Acta" 53, 391, 1974).

Andererseits verlängert die Serumdeproteinisierung die Verfahrens­ weise empfindlich, und sie stellt eine kritische Stufe dar, da die Serumfiltrate nach der Ausfällung der Proteine nicht vollständig klar sein können. Weiterhin ist ein konzentrierter Puffer notwendig, um den pH-Wert in einem Bereich einzustellen, der für die chromogene Reaktion geeignet ist, was eine Quelle für Eisenverunreinigung sein kann. Die Anwesenheit von Kupfer, die bei bestimmten pathologischen Umständen sehr hohe Werte erreichen kann, kann spektrophoto­ metrische Methoden, insbesondere diejenigen, die sich auf der Verwendung von Ferrozin aufbauen, stark stören (vgl. Hugh et al. "Chlin. Chem." Band 17, Nr. 9, 950, 1971; J. R. Duffy et al. "Chlin. Biochem." 10, 122, 1977)

Durch die Erfindung wird nun ein Verfahren und ein Reagenz das in Form eines diagnostischen Bestecks verwendet werden kann, zur Bestimmung von Eisen in Serum zur Verfügung gestellt, ohne daß eine Deproteinisierung und Abtrennung von Eisen erforderlich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Reagentien haben auch den Vorteil, daß die Freisetzung des Eisens von dem Transferrin vollständig ist und bei einem niederen pH-Wert ohne Zugabe von Puffern in Gegenwart eines Reduktionsmittels und bei Versuchs­ bedingungen erhalten wird, die eine vollständige und rasche Entwicklung des gefärbten Komplexes ohne Bildung einer Trübung gestatten, wodurch die Verwendung von tensio­ aktiven bzw. oberflächenaktiven Mitteln vermieden wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr einfach und kann leicht automatisiert werden.

Der Erfindung liegen folgende überraschende Feststellungen zugrunde: 1) Bei Zugabe von Salzsäure zu Serum, um einen pH-Wert von 2,1 oder niedriger zu erreichen, bildet sich keine Trübung; und 2) die Reaktion zwischen Ferrozin und Eisen ist selbst bei diesem pH-Wert vollständig, wodurch sehr genaue Messungen des Eisengehalts im Serum durch kolo­ rimetrische Bestimmungen gestattet werden.

Es wurde weiterhin gefunden, daß die Anwesenheit von Thiose­ micarbazid bei diesen Bedingungen alle Störungen durch Kupfer eliminiert, ohne daß die Eisenbestimmung negativ beeinflußt oder in ungeeigneter Weise kompliziert wird.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur direkten Bestimmung von Eisen in einer Blutserumprobe mit Ferrozin in Gegenwart eines Reduktionsmittels durch kolo­ rimetrische Bestimmung des gebildeten Komplexes, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zu der Probe auch Thiosemicarbazid und Salzsäure hinzugefügt werden und daß man die Umsetzung bei einem pH-Wert zwischen 1,7 und 2,1 unter Vermeidung einer Zugabe von Puffern und oberflächenaktiven Mitteln durchführt.

Im einzelnen geht man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren so vor, daß eine Probe, die das zu bestimmende Eisen enthält, mit Salzsäure versetzt wird, um den pH-Wert auf einen Wert zwischen 1,7 und 2,1 zu bringen. Ein Reduktionsmittel, damit die Eisenionen in zweiwertige Form gebracht werden, Ferrozin und Thiosemicarbazid werden gleichfalls zu der zu testenden Serumprobe gegeben. Nach beendigter Zugabe dieser Reagenzien wird die Probe sorgfältig vermischt, und hierauf wird nach 5- bis 20minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur der Eisengehalt der Probe kolorimetrisch mittels des gefärbten Komplexes bestimmt.

Demgemäß wird die Absorption bei 562 nm gegen eine Reagenz­ blindprobe, d. h. eine Probe, die das gleiche Gemisch wie oben, jedoch ohne Ferrozin enthält gemessen. Die Bestimmung des Eisengehalts erfolgt anhand einer Standardkurve, die aus wäßrigen Lösungen erhalten worden ist welche auf den gleichen pH-Wert wie die Testprobe gepuffert worden sind und die die obigen Reagentien und eine abgewogene Menge von Eisen enthalten. Die Salzsäure, die der Serumprobe zur Loslösung Loslösung des Eisens von dem Transferrin zugesetzt wird, damit der gewünschte pH-Wert erhalten wird, wird im allgemeinen in einer solchen Menge zugesetzt, daß ihre Konzentrationen in der Testprobe 0,04 bis 0,15 Mol/l, vorzugsweise 0,05 bis 0,12 Mol/l betragen. Als Reduktionsmittel wird vorzugsweise Ascorbinsäure verwendet. Konzentrationen in der Testprobe, die so niedrig sind wie 1,5 mg/ml sind ausreichend, um eine vollständige Farbentwicklung zu bewirken. Bei der üblichen Praxis werden vorteilhafterweise Konzentrationen von 5 bis 10 mg/ml verwendet. Die Farbe nimmt zu, wenn die Ferrozinkonzentration bis 0,4 mg/ml in der Testprobe erhöht wird. Jedoch kann eine vollständige Farbentwicklung auch schon bei niedrigeren Konzentrationen beobachtet werden, wenn die Ablesung mindestens 20 min nach Durchführung der Reaktion erfolgt.

Für praktische Zwecke wird die Konzentration von Ferrozin in der Testprobe im allgemeinen von etwa 0,4 bis etwa 1 mg/ml gehalten.

Thiosemicarbazid verhindert selbst bei sehr niedrigen Konzen­ trationen in der Testprobe volllständig eine Störung durch Kupfer im pH-Bereich zwischen 1,7 und 2,1. Bei dem obigen pH-Bereich ist Thiosemicarbazid wirksamer als andere Mittel, wie Thioharnstoff, und es setzt sich nicht mit dem Eisen um. Die Konzentrationen an Thiosemicarbazid, die gewöhnlich gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung verwendet werden, liegen im allgemeinen zwischen 0,5 und 1 mg/ml.

Die Umsetzung der Reagentien mit dem Serum erfolgt im allgemeinen in der Weise, daß man zu einem Volumen von Serum zwei Volumina einer salzsauren Lösung, die Ascorbinsäure, Ferrozin und Thiosemicarbazid in geeigneter Konzentration enthält, zusetzt. Diese letztgenannte Lösung wird hergestellt, bevor man den Test durchführt, und sie ist bis zu 2 h stabil.

Die Ablesung gegen die Blindprobe kann auch in der gleichen Küvette, in der die Reaktion zwischen den Reagentien und dem Serum durchgeführt wird, erfolgen. In diesem Falle wird das Serum zuerst mit der Lösung der Reagentien mit Ausnahme von Ferrozin versetzt und es wird eine erste Ablesung bei 562 nm für die Blindprobe durchgeführt.

Sodann wird Ferrozin in genügender Menge zugesetzt, und es erfolgt eine zweite Ablesung bei der gleichen Wellenlänge zur Bestimmung des Eisengehaltes. Diese Möglichkeit, daß Ablesungen von Konzentrationsdifferenzen in einer einzigen Küvette durchgeführt werden können, vermindert sowohl die Menge des Serums als auch die Anzahl der erforderlichen Verfahrensstufen. Bei einer alternativen Verfahrensweise können die festen Reagentien auch in Form von kleinen Tabletten zu dem Gemisch aus Serum und Salzsäure gegeben werden. Diese Tabletten können die erforderliche Menge an Ascorbinsäure und Ferrozin oder die erforderliche Menge von Thiosemicarbazid mit üblichen Bindemitteln bzw. Trägern, wie Kohlenhydratderivaten und hochmolekularen Polyäthylenglycolen, enthalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert sehr zufriedenstellende Ergebnisse, wenn Tests zur Bestätigung der Reproduzier­ barkeit mit Seren von unterschiedlichen Konzentrationen durchgeführt werden.

Wenn weiterhin zu Proben von gepoolten Seren Standardeisen­ lösungen zugesetzt werden, um die Probenkonzentrationen zu erhöhen, dann läuft die Kurve der Absorptionswerte für die zugefügten Eisenkonzentrationen durch den Punkt der Nullzugabe. Somit kann die ursprüngliche Eisenkonzentration der Probe bestimmt werden, indem man auf die Abszisse extrapoliert, was die Genauigkeit des Verfahrens beweist. Die Absorption, die aus den Zugabeversuchen errechnet wird, steht mit derjenigen im Einklang, die mit Standardeisenlösungen festgestellt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit anderen bekannten Methoden, die sowohl eine Deproteinisierung als auch eine Direktbestimmung einschließen verglichen. Die Atomabsorption (AA) wurde (nachdem ihre Verläßlichkeit durch Reproduzierbarkeits- und Wiedergewinnungsversuche bestätigt worden war) als Vergleichsmethode ausgewählt, da sie von einer Störung durch Kupfer frei ist. Eisen wurde in 26 Seren bestimmt, die einen weiten Konzentrationsbereich umfaßten. Dies geschah 1) durch eine automatisierte Fließ­ methode (AT) (B. Zak et al. "Clin.", Band 11, Nr. 6, 641, 1965), bei der eine Ablösung des Eisens von dem Transferrin, eine Dialyse und die Komplexbildung mit Ferrozin erfolgten; 2) durch das erfindungsgemäße Verfahren (DRC), die Atomabsorptions­ methode (AA) mit einer Deproteinisierung, ein handels­ übliches Direktverfahren, das als DM1 bezeichnet wird, und ein handelsübliches Direktverfahren, das als DM2 bezeichnet wird.

Die zwei letztgenannten Methoden bauen sich im wesentlichen auf der Methode auf, die von K. Lauber ("Zeit. Klin. Chem.", 3, 96, 1965) beschrieben wird.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammen­ gestellt.

Tabelle I

Die Ergebnisse der Tabelle I zeigen, daß eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Atomabsorptions(AA)methode über den gesamten Konzentrations­ bereich besteht. Für Konzentrationen von weniger als 60 µg/dl und über 160 µg/dl steht AT in einer weniger zufriedenstellenden Korrelation mit AA als das erfindungsgemäße Verfahren. Bei dem Testbesteck DM1 wird häufig eine Trübung beobachtet, die in manchen Fällen für fehlerhaft hohe Werte verantwortlich ist. Bei dem Testbesteck DM2 entwickelt sich bei gelegentlichen Proben eine sehr rasch zunehmende Trübung, die jede Ablesemöglichkeit verhindert. Es hat sich gezeigt, daß bereits eine geringfügige Hämolyse zu Störungen Anlaß gibt. Dazu kommt noch, daß die gefundenen Werte gewöhnlich niedriger sind als diejenigen, die mit anderen Methoden erhalten werden.

Nachstehend wird die Durchführung der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode näher erläutert.

Lösungen

• 1) 100 mg Thiosemicarbazid, 1 g Ascorbinsäure und 100 mg Ferrozin werden in einem 100-ml-Kolben eingegeben und sodann mit 0,1-molarer HCl aufgelöst. Die Lösung wird mit 0,1-molarer HCl auf das Volumen gebracht.
• 2) Die gleiche Lösung mit Ausnahme des Ferrozins wird für die Blindprobe hergestellt.
• Die Lösungen werden innerhalb von 2 h verwendet.
• 3) Für Arbeitsstandardlösungen werden 100 mg Thiosemicarbazid, 1 g Ascorbinsäure und 100 mg Ferrozin in einem 0,1- molaren Glycinpuffer mit einem pH-Wert von 2,1 aufgelöst und mit dem gleichen Puffer auf ein Volumen von 100 ml gebracht.
• 4) Eisenarbeitsstandards werden durch geeignete Auflösungen einer Vorratsstandardlösung, die 100 µg/ml von 99,9% Eisen enthält hergestellt. Lösungen mit der gewünschten Konzentration von 25 bis 400 µg/dl werden täglich hergestellt.

Verfahrensweise

Zu 2 ml Lösung (1) wird 1 ml Serum in einer Küvette gegeben. Die Küvette wird mit einem inerten Kunststoffilm (z. B. Parafilm) bedeckt, und die Lösung wird durch Umkehren gemischt. Nach 5-minütigem Stehenlassen wird die Lösung wiederum gemischt, und nach weiteren 5 min wird die Absorption bei 562 nm gegen eine Blindprobe abgelesen, welche dadurch hergestellt worden ist, daß 1 ml Serum zu 2 ml der Lösung (2) gegeben worden sind.

Für die Standardkurve wird zu 2 ml der Lösung (3) 1 ml der verschiedenen Eisenlösungen (4) gegeben. Nach dem Vermischen werden die relativen Absorptionen gegen die Blindprobe abgelesen, wobei zu 2 ml der Lösung (1) 1 ml Glycinpuffer gegeben wird, weil selbst in dem reinsten Glycin Eisenspuren vorhanden sein können. Die Absorptionen werden gegen die Standardeisenkonzentrationen aufgetragen.

Wenn die Reaktion in einer einzigen Küvette durchgeführt wird, dann wird 1 ml Serum zu 2 ml Lösung (2) gegeben und es wird eine erste Ablesung bei 562 nm durchgeführt. Hierauf werden 100 µl einer 2-g/dl-Lösung von Ferrozin zugesetzt, und nach dem Vermischen durch wiederholtes Umkehren und 10-minütigen Stehenlassen wird eine zweite Ablesung bei 562 nm durchgeführt.

Claims (12)

1. Verfahren zur direkten Bestimmung von Eisen in einer Blutserumprobe mit Ferrozin in Gegenwart eines Reduktionsmittels durch kolorimetrische Bestimmung des gebildeten Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß zu der Probe auch Thiosemicarbazid und Salzsäure hinzugefügt werden und daß man die Umsetzung bei einem pH-Wert zwischen 1,7 und 2,1 unter Vermeidung einer Zugabe von Puffern und oberflächenaktiven Mitteln durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reduktionsmittel Ascorbin­ säure verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Salzsäure in der Testprobe, die der kolorimetrischen Messung unter­ worfen wird, zwischen 0,05 und 0,12 Mol/l liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Ferrozin in der Testprobe, die der kolorimetrischen Bestimmung unterworfen wird, 0,4 bis 1 mg/ml beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Thiosemi­ carbazid in der Testprobe, die der kolorimetrischen Bestimmung unterworfen wird, 0,5 bis 1 mg/ml beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Ascorbinsäure in der Testprobe mindestens 1,5 mg/ml beträgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien Ferrozin und Ascorbinsäure und das Thiosemicarbazid zu dem Gemisch aus Serum und Salzsäure in Form von Tabletten zugefügt werden.

8. Tablette zur Verwendung beim Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie Ferrozin und Ascorbinsäure zusammen mit einem inerten Träger enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz Ferrozin als konzentrierte Lösung zu dem Gemisch der Probe mit den übrigen Reagenzien zugesetzt wird und daß zwei photometrische Ablesungen der Probe durchgeführt werden, wobei die eine vor und die andere nach der Zugabe von Ferrozin erfolgt.

10. Reagenz zur Bestimmung von Eisen im Blutserum, dadurch gekennzeichnet, daß es Ferrozin, Thiosemicarbazid und Ascorbinsäure enthält.

11. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es in Salzsäure gelöst ist.

12. Reagenz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenzgemisch in einer solchen Konzentration vorliegt, daß in der der kolorimetrischen Messung unterworfenen Testprobe die Konzentration an Salz­ säure zwischen 0,05 und 0,12 Mol/l liegt, die Konzentration von Ascorbinsäure zwischen 5 und 10 mg/ml liegt, die Konzentration von Ferrozin zwischen 0,4 und 1 mg/ml liegt und die Konzentration von Thiosemicarbazid zwischen 0,5 und 1 mg/ ml liegt.