DE3031334C2

DE3031334C2 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Cholansäurederivaten

Info

Publication number: DE3031334C2
Application number: DE3031334A
Authority: DE
Inventors: Yoshihiro Kurashiki Okayama Ichihara; Masao Tsuji
Original assignee: Kuraray Co Ltd
Current assignee: Kuraray Co Ltd
Priority date: 1979-08-21
Filing date: 1980-08-20
Publication date: 1985-06-13
Also published as: DE3031334A1; IT1166482B; NL185731C; NL185731B; FR2463809B1; IT8068301A0; CH646442A5; GB2057447B; GB2057447A; NL8004741A; FR2463809A1

Description

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch angegebene mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von Cholansäurederivaten der Formel:

JO 35 -40

55 60 65

COOR

(D

OH

in der X für \" OH oder = O und R für Wasserstoff, ein Alkalimetall oder Erdalkalimetall steht, mit den bei diesem Verfahren verwendeten Mikroorganismen. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Herstellung der Cholansäurederivate der Formel (I) in hoher Ausbeute in kurzer Zeit durch Kultivieren der angegebenen Mikroorganismen in einem Nährmedium, das Cholsäure oder ein Salz von Cholsäure als Substrat enthält.
Die Cholansäurederivate der Formel (I), in der X fürX" OH steht, nämlich la, 7a-Dihydroxy-12-keto-5^-cholan

säure oder ihre Salze, sind geeignete Zwischenprodukte für die Herstellung der Chenodesoxycholsäure (CDCA) als Gallensteinlöser. Das Cholansäurederivat der Formel (I), in der X für =0 steht, d.h. 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5/ö-cholansäure oder ihre Salze, sind geeignete Zwischenprodukte für die Herstellung von Deoxycholsäure, die ein geeignetes Ausgangsmaterial für die Herstellung von Progesteron und Adrenalkortikosteroidderivaten ist.

Es ist bekannt, daß Cholansäuredertvate der Formel (I) nach einem mikroblellen Verfahren unter Verwendung von Cholsäure oder eines Salzes von Cholsäure als Substrat hergestellt werden können. Beispielsweise beschreiben Hayakawa et al. ein Verfahren zur Herstellung von 3ar,7ar-Dlhydroxy-12-keto-5/J-Cholansäure durch Verwendung des Stammes Streptomyces gelatlcus 1164 [The Journal of Biochemistry (Japan), 44, Nr. 2 (1957) 109-113 und Proceedings of Japan Academy, 32 (1956) 519-522]. Hasegawa et al. beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von 3or,7ar-Dlhydroxy-12-keto-5/?-cholansäure durch Verwendung des Stammes Asperglllus clnnamomeus HUT 2026 [Hiroshima Journal of Medical Science, Band 8, Nr. 3 (1959) 277-283]. Klkuchl und Mitarbeiter beschreiben ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von 3a,7a-Dlhydroxy-12-keto-5/?-cholansäure durch Verwendung des Stammes Staphylococcus epldermldls H-I [Journal of Biochemistry, Band 72, Nr. 1 (1972) 165-172]. Ferner beschreiben Hayakawa und Mitarbeiter ein Verfahren zur Herstellung von 7cr-Hydroxy-3,12-dlketo-5/?-cholansäure unter Verwendung von Streptomyces gelatlcus, Stamm 1164 [Proceedings of Japan Academy, Band 32 (1956) 519-522].

Bei diesen Verfahren Ist jedoch die Konzentration der Cholsäure als Substrat Im Nährmedium gering, beispielsweise nicht höher als 10 g/l. Nach Untersuchungen der Anmelderin ist es bei der Herstellung von Cholansäurederivaten nach den bekannten mikrobiologischen Verfahren notwendig, die Cholsäure In niedriger Konzentration zu verwenden, da die zu verwendenden Mikroorganismen schlecht oder kaum wachsen, wenn die Konzentration der Cholsäure im Nährmedium 20 g/l oder mehr beträgt. Ferner erfordern diese bekannten Verfahren eine zu lange Zelt für die Kultivierung. Es Ist daher erwünscht, ein Verfahren zur Herstellung von Cholansäurederivaten in hoher Ausbeute Innerhalb kurzer Zeit zu entwickeln. Es wurde nun gefunden, daß gewisse Mikroorganismen, die zu den Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium und Cornynebacterlum gehören,

in einem Medium, das Cholsäure oder ihr Salz als Substrat in einer Konzentration innerhalb eines weiten Bereichs enthält, zu wachsen und die Cholansäurederivate Jn hoher Ausbeute Innerhalb kurzer Zeit zu bilden vermögen.

Die Mikroorganismen, die die Cholansäurederivate der Formel (I) in einem Nährmedium, das Cholsäure oder ihre Salze enthält, zu bilden vermögen, und von der Anmelderin gewonnen worden sind, wurden bei der American Type Culture Collection, U.S.A. (nachstehend als ATCC bezeichnet) hinterlegt. Es handelt sich um Arth_robacter, Stamm CA-35 (=ATCC 31651), Arthrobacter, Stamm CA-35-A589-29-32 (=ATCC 31652) Arthrobacter., Stamm CA-35-A589-47 (=ATCC 31653), Brevlbacterium, Stamm CA-6 (=ATCC 31661) und Corynebacterium, Stamm CA-53 (=ATCC 31662). Die Stämme Arthrobacter CA-35, Brevlbacterium CA-6 und Cerynebacterium CA-53 sind Wildstämme, und die anderen Stämme von Arthrobacter sind Mutanten des Stammes Arthrobacter CA-35, die durch Behandlung des Wildstamms mit N-Methyl-N'-nitro-N-nltrosoguanSdäa erhallen wurden.

Die morphologischen Eigenschaften, Kulturmerkmale und physiologischen Eigenschaften dieser Stämme sind in Tabelle 1 genannt. Zum Vergleich sind auch die Merkmale des Stamms Arthrobactersimplex IAM 1660, der mit dem Stamm Arthrobacter CA-35 verwandt ist, in Tabelle 1 genannt.

Tabelle 1

Merkmale

Arthrobacter simplex, Stamm IAM 1660

Arthrobacter,
Stamm CA-35

mikroskopische Beobachtungen Form

Teilung

Größe (μπι) Flagellata Sporen

Gramfarbung Säurefeste Färbung

Kulturmerkmale Bouillon-Agarplatte

Gelatine-Stichkultur Lackmusmilch

BCP-Milch

Physiologische Merkmale ') Nitratreduktion Denitrifi cation Methylrottest Voges-Proskauer-Test Indolebiidung H₂S-B ildung Hydrolyse von Stärke Verwertung von Citrat Assimilierung anorganischer Stickstoffquellen Urease
Oxidase
Katalase
Sauerstoffbedarf Oxidations-/Fermentationstest Bildung von Säuren und Gasen aus Kohlenhydraten ²) 1. L-Arabinose

Stäbchen (zuweilen gequollen oder gekrümmt)

0,4-0,5 X 1-3 nicht vorhanden nicht vorhanden positiv-veränderlich nein

kreisrund, leicht erhaben, farblos, glatt, glänzend, durchsichtig

schlagartige (saccate) Verflüssigung Lackmus reduziert, Milch geklärt

Klärung, wird alkalisch

Stäbchen (zuweilen abgebrochen oder gekrümmt)

abbrechen
0,8-0,9 X 1,7-2,2
nicht vorhanden
nicht vorhanden
positiv
nein

kreisrund, leicht erhaben, gelb bis cremefarben, glatt, glänzend, undurchsichtig keine Verflüssigung
Lackmus reduziert,
Milch unverändert

alkalisch, nicht geronnen und nicht peptonisiert

± bis -

aerob	Säuren	Gase	Assimi	aerob	Säuren	Gase	Assimi- 65
-			lierung	oxidativ			lierung
Wachs			Wachs
tum			tum

Fortsetzung

Merkmale

Arthrobacter simplex, Stamm IAM 1660

Arthrobacter, Stamm CA-35

Bildung von Säuren und Gasen aus Kohlenhydraten²)

* 2. D-Xylose

3. D-Glucose

4. D-Mannose

5. D-Fructose

6. D-Galactose

7. Maltose

8. Saccharose

9. Lactose

10. Trehalose

11. D-Sorbit

12. D-Mannit

13. Inosit

14. Glycerin

15. Stärke

Wachstum

Säuren Gase

Assimilierung

Wachstum

Säuren Gase

Assimilierung

±to-

Merkmale

Arthrobacter CA-35-A589-29-32

Arthrobacter, Stamm CA-35-A589^t7

mikroskopische Beobachtungen Form
Teilung
Größe (μιη) Flagellata Sporen
Gramfarbung Säurefeste Färbung

Kulturmerkmale Bouillon-Agarplatte

Bouillon-Agarplatte, enthaltend Cholsäure (10 g/l)

Gelatine-Stichkultur Lackmusmilch

BCP-Milch

Physiologische Merkmale') Nitratreduktion Denitrifi cation Methylrottest Voges-Proskauer-Test Indolbildung H₂S-Bildung Hydrolyse von Stärke Citratverwertung

kurze Stäbchen

0,8-1,0 X 1,3-2,0

polare Flagellata

keine

positiv

nein

kreisrund, flach, gelb, glatt, glänzend, undurchsichtig

Verflüssigung

Lackmus reduziert, Milch nicht geronnen und nicht peptonisiert

alkalisch, nicht geronnen und nicht peptonisiert

kurze Stäbchen

0,8-1,0 X 1,3-2,3 Flagellata keine

positiv

nein

kreisrund, flach, gelb, glatt, glänzend, undurchsichtig kreisrund, flach, weiß bis blaß cremefarben, glatt, glänzend, undurchsichtig Verflüssigung Lackmus reduziert, Milch nicht geronnen und nicht peptonisiert alkalisch, nicht geronnen und nicht peptonisiert

Fortsetzung

Merkmale

Arlhrobiicter CA-35-A589-29-32 Arthrobacier,

Assimilierung von anorganischen Stickstoffquellen

Ammonium +

Nitrat +

Urease

Oxidase -

Katalase +

Sauerstoffbedarf aerob

Oxidations'/Ferrnsntationstest oxidat^;

Bildung von Säuren und Gasen aus Kohlenhydraten ²)

1. L-Arabinose

2. D-Xylose

3. D-Glucose

4. D-Mannose

5. D-Fructose

6. D-Galactose

7. Maltose

8. Saccharose

9. Lactose

10. Trehalose

11. D-Sorbit

12. D-Mannit

13. Inosit

14. Glycerin

15. Stärke

Säuren

Gase aerob
Säuren

	10 S
-Λ589-47	•5

	20 ι
Gase	25 I
-	30 B j
I I I I	I 35 β i
:	i [
-
-

Merkmale

Brevibacterium Stamm CA-6 Corynebacterium,
Stamm CA-53

mikroskopische Beobachtungen Form
Teilung
Größe (μπι) Flagellata
Sporen
Gramiarbung Säurefeste Färbung

Kulturmerkmale Bouillon-Agarplatte

Bouillon-Agarplatte, enthaltend Cholsäure (10 g/1) Nähragarplatte

Gelatine-Stichkultur Lackmusmilch

BCP-Milch

Stäbchen

1,0 X 2,5-4,0 polare Flagellata nicht vorhanden positiv nein Stäbchenform, Coryneform

abbrechen (snapping)
1,3-2,4 x 1,0-1,2
nicht vorhanden
nicht vorhanden
positiv
nein

gewellt, leicht erhaben, farblos, glatt, glänzend, durchscheinend

Verflüssigung peptonisiert, wird alkalisch

peptonisiert, wird alkalisch kreisrund, flach gelb, glatt, glänzend, undurchsichtig

keine Verflüssigung

Lackmus mit braunem Sediment reduziert

alkalisch

40

45

50

55

60

65

Fortsetzung

Merkmale

Brevibacterium Stamm CA-6

Corynebacterium, Stamm CA-53

10

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Säuren Gase

Assimilierung

aerob Säuren

Gase

Physiologische Merkmale ') Nitratreduktion Denitrifi cation Methylrottest Voges-Proskauer-Test Indolbildung H₂S-B ildung Hydrolyse von Stärke Citratverwertung Assimilierung von anorganischen Stickstoffquellen Ammonium Nitrat

Urease Oxidase Katalase Sauerstoffbedarf Oxidations-/Fermentationstest

Bildung von Säuren und Gasen aus Kohlenhydraten²)

1. L-Arabinose

2. D-Xylose

3. D-Glucose

4. D-Mannose

5. D-Fructose

6. D-Galactose

7. Maltose

8. Saccharose

9. Lactose

10. Trehalose

11. D-Sorbit

12. D-Mannit

13. Inosit

14. Glycerin

15. Stärke

Bemerkungen:

1. Die zur Kennzeichnung der physiologischen Merkmale verwendeten Zeichen haben die folgenden Bedeutungen:
+ : Der Stamm hat das entsprechende Merkmal oder bildet das entsprechende Produkt.

±: Es ist schwierig, zu bestimmen, ob der Stamm das entsprechende Merkmal hat oder das entsprechende Produkt bildet oder nicht. -: Der Stamm hat nicht das entsprechende Merkmal oder bildet nicht das entsprechende Produkt.

2. Die hinsichtlich der Bildung von Säuren und Gasen aus Kohlenhydraten verwendeten Zeichen haben die folgenden Bedeutungen:

I) Wachstum, Säuren und Gase:

Der Stamm wurde in Hugh-und-Leifson-Medium gezüchtet mit dem Unterschied, daß jeweils die Kohlenhydrate 1-15 anstelle der KohlenstoPTquelle verwendet wurden und das Wachstum des Stamms und die Bildung von Säuren und Gasen beobachtet wurden.

+ : Der Stamm wächst oder eine Säure oder ein Gas wird gebildet

±. Es ist schwierig, zu bestimmen, ob der Stamm wächst oder eine Säure oder ein Gas gebildet wird oder nicht

-: Der Stamm wächst nicht oder eine Säure oder ein Gas wird nicht gebildet

II) Assimilierung:

Das Nährmedium, das pro Liter 2 g NH₄NO:,. 2 g KH₃PO₄. 5 g K_:HPO₄. 0.2 g MgSO₄ · 7H₂O, 0.1 g Hefeextrakt und 5 g eines der Kohlenhydrate 1-15 enthielt, wurde in ein Reagenzglas (Durchmesser 21 mm) gegeben, und der Stamm wurde darin unter Schütteln gezüchtet, wobei seine Assimilierung (Wachstum) beobachtet wurde.

aerob oxidativ

Wachstum

- : Der Stamm wächst nicht.

± : Der Stamm wächst geringfügig.

+ : Der Stamm wächst.

++ : Der Stamm wächst gut.

+++: Der Stamm wächst sehr gut.

Auf der Grundlage dieser morphologischen Merkmale, Kulturmerkmale und physiologischen Merkmale wurde die Klassifizierung der Stämme gemäß Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology, 7. und 8. Auflage, bestimmt.

Es wurde festgestellt, daß Arthrobacter Stamm CA-35 hinsichtlich seiner mikroskopischen Beobachtungen, beispielsweise In der Form, der Gramfärbung und dergleichen sowie In seinen physiologischen Merkmalen eine Beziehung zu Arthrobacter simplex hat. Der Stamm Arthrobacter CA-35 unterscheidet sich jedoch von Arthrobacter Simplex Stamm IAM 1660 In seiner Pigmentbildung, Verwertung von Kohlenhydraten und im Wachstum In einem Cholsäure enthaltenoen Medium. Arthrobacter, Stamm CA-3S, vermag in einem Medium zu wachsen, das Natriumcholat als einzige Kohlenstoffquelle In hoher Konzentration, z. B. 20 bis 500 g/l, enthält, und bildet »ls hauptsächliche Stoffwechselprodukte Ta-HydroxyO.n-diketo-S/J-Cholansäure, 3or,7a-Dihydroxy-12-keto-5/3-choiansäure, 7cr,i2cr-Dihydroxy-3-keio-5/j-choiansäure und/oder die Natriumsaize dieser Säuren, während Arthrobacter simplex Stamm IAM 1660 in einem Medium, das Natriumcholat als einzige Kohlenstoff quelle In einer Konzentration von 10 g/l enthält, kaum zu wachsen vermag.

Der Stamm CA-35 von Arthrobacter bildet gelbe bis cremefarbene Pigmente. Andererseits existieren als Mikroorganismen, die zur Gattung Arthrobacter gehören und Pigmente bilden, Arthrobacter oxydans, Arthrobacter aurescens und Arthrobacter ureafaclens. Der Stamm CA-35 von Arthrobacter unterscheidet sich jedoch auch von diesen Mikroorganismen, da Arthrobacter oxydans und Arthrobacter aurescens gewöhnlich gramnegativ sind und Stärke hydrolysleren und Arthrobacter ureafaclens gewöhnlich gramnegativ ist und Nitrate nicht r.duzlert. Es ist daher anzunehmen, daß der Stamm Arthrobacter CA-35 eine neue Spezies darstellt, die zur Gattung Arthrobacter gehört, da der Stamm sich von den Stämmen der Standardspezies, die zur Gattung Arthrobacter gehören, unterscheidet.

Obwohl einige der Mutanten des Stamms Arthrobacter CA-35 vom Ursprungsstamm hinsichtlich der Geiseln sehr verschieden sind, wurde festgestellt, daß diese Mutanten zu Arthrobacter gehören, da Im allgemeinen ein Mutant In die gleiche Spezies seines Ursprungsstamms eingestuft wird.

Im Hinblick auf seine mikroskopischen Beobachtungen wie Gramfärbung und dgl. und seine physiologischen Merkmale wurde festgestellt, daß der Stamm Brevlbacterlum CA-6 zur Gattung Brevlbacterium gehört. Der Stamm Brevlbacterium CA-6 unterscheidet sich jedoch etwas von anderen zur Gattung Brevlbacterium gehörenden Mikroorganismen, da die anderen Mikroorganismen zahlreiche, den Zelleib umgebende Geiseln aufweisen (Perltrlcha), während der Stamm Brevibacterlum CA-6 polare Geisein usw. aufweist.

Ferner wurde gefunden, daß der Stamm Corynebacterlum CA-53 mit Corynebacterlum equi eng verwandt ist.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durchgeführt. Indem ein Mikroorganismus, der aus den Gattungen Arthrobacter, Brevlbacterlum und Corynebacterium, wie sie im Patentanspruch genannt wurden, ausgewählt ist und In einem Cholsäure oder ihr Salz als Substrat enthaltenden Medium zu wachsen vermag, in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das Cholsäure oder ihr Salz als Substrat enthält.

Für die Zwecke der Erfindung kann Cholsäure als solche als Substrat verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich, Alkalisalze von Cholsäure, z. B. Natriumcholat und Kallumcholat. oder Erdalkallsalze von Cholsäure, z. B. Calziumcholat und Magneslumcholat, zu verwenden, wobei die Alkalisalze bevorzugt werden. Bei Verwendung eines Cholats wird es in Wasser In einer solchen Menge gelöst, daß eine wäßrige Lösung, die das Cholat In bestimmter Konzentration enthält, erhalten wird. Als Alternative kann eine bestimmte Menge einer Alkaliverbindung oder Erdalkallverbindung, die ein Salz mit Cholsäure bildet, vorher in Wasser gelöst und die Lösung mit Cholsäure versetzt werden, wobei eine wäßrige Lösung, die ein Cholat in bestimmter Konzentration enthält, erhalten wird. Die Konzentration der Cholsäure oder ihres Salzes kann In einem weiten Bereich von etwa 1 bis 500 g/l, gerechnet als Cholsäure, variiert werden. Im Hinblick auf die Ausbeute an gewünschten Cholansäurederivaten der Formel (I), die Bedingungen der Kultivierung und die Wirtschaftlichkeit, z. B. Verfahrensführung, Verarbeltbarkelt und dergleichen, wird empfohlen, die Cholsäure oder ihr Salz in einer Konzentration von etwa 5 bis 300 g/l, vorzugsweise etwa 10 bis 200 g/l, gerechnet als Cholsäure, zu verwenden.

Die Kultivierung kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden, im allgemeinen erfolgt die Züchtung In Schüttelkultur oder Submerskultur unter Verwendung eines flüssigen Mediums.

Für die Züchtung können mehr Medien verwendet werden, die die Nährstoffe enthalten, die von dem zu verwendenden Mikroorganismus verwertet werden. Das Medium kann Cholsäure oder ihr Salz als einzige Kohlenstoffquelie oder eine zusätzliche Kohlenstoffquelle, z. B. eine Pentose (z. B. Arablnose), eine Hexose (2. B. Glucose, Mannose, Fructose und Galactose), ein Disaccharld (z. B. Maltose), ein Stärkezersetzungsprodukt (z. B. Dextrin), einen Zuckeralkohol (z. B. Sorbit), einen mehrwertigen Alkohol (z. B. Glycerin), ein Gemisch dieser Kohlenstoffquellen oder dgl. und/oder andere Nährstoffe, z. B. ein Polypepton, ein Pepton, Flelschextrakt. Malzextrakt, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Aminosäuren oder ein Gemisch dieser Nährstoffe enthalten. Im allgemeinen kann eine zusätzliche Kohlenstoffquelle und/oder ein anderer Nährstoff dem Nährmedlum in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 g/l zugesetzt werden.

Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Ammonlumsuifat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat und Gemische dieser Verbindungen. Im allgemeinen kann die Stickstoffquelle dem Nährmedium in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 5 g/l zugesetzt werden. Ferner können Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat u. dgl. als anorganische Salze dem Nährmedlum gewöhnlich in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 g/l zugesetzt werden. Die Kultivie-

rung kann als Schüttelkultur oder Submerskultur 6 Stunden bis 5 Tage bei 25 bis 35° C durchgefühlt werden.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird Cholsäure oder ihr Salz als Substrat in die Cholansäurederivate der

Formel (I) und eine geringe Menge 7 a, na-Dihydroxy-S-keto-Sjö-cholansäure oder ihr Salz umgewandelt, wenn der Stamm Arthroba ier CA-35 verwendet wird. Es wurde gefunden, daß das Cholansäurederivat der Formel (I), in der X für'S" OH steht, nämlich 3a, 7a-Dihydroxy-12-keto-5/?-cholansäure oder ihr Salz, überwiegend gebildet

wird, wenn die vorstehend genannten Mutanten von Arthrobacter CA-35 verwendet werden. Wenn 3a, 7a, Dihydroxy-n-keto-SyS-cholansäure oder ihr Salz gewünscht wird, ist es daher zweckmäßig, die Mutanten Arthrobacter CA-35-A-589-29-32 (=ATCC 31652) und Arthrobacter CA-35-A589-47 (=ATCC 31653) zu ver-

it wenden. Bei Verwendung des Stamms Brevibacterium CA-6 wird die Cholsäure oder ihr Salz in die Cholansäurederivate der Formel (I) und eine geringe Menge 7a-Hydroxy-3,12-diketo-4⁴-cholensäure oder ihr Salz umgewandelt. Bei Verwendung des Stamms Corynebacterium CA-53 wird die Cholsäure oder ihr Salz in die Cholansäurederivate der Formel (I) und 7<z-Hydroxy-3,12-diketo-.d⁴-cholensäure oder ihre Salze umgewandelt. Nach Beendigung der Kultivierung werden die im Kulturmedium angehäuften Produkte vom Medium abgetrennt und gereinigt. Zuerst werden Materialien, die Im Medium unlöslich sind, z. B. Zellen des Mikroorganismus u. dgl., nach bekannten Verfahren wie Filtration, Zentrifugleren u. dgl. vom Kulturmedium abgetrennt. Dann wird das Filtrat oder der Übersianii durch Zusatz elnsr Säure, z. B. Salzsäure, angesäuert, wodurch die Produkte darin ausgefällt werden. Gleichzeitig wird auch die als Substrat verwendete Cholsäure oder Ihr Salz, die nicht umgewandelt worden sind, als Cholsäure ausgefällt. Nach der Abtrennung der gebildeten Fällung wird das Filtrat oder der Überstand mit einem Inerten organischen Lösungsmittel, z. B. Äthylaceta, weiter extrahiert, und das Lösungsmittel wird vom Extrakt abdestlUiert, wobei ein Rückstand erhalten wird. Hierdurch werden die verbleibenden Produkte und das Substrat fast vollständig zurückgewonnen Der erhaltene Rückstand wird mit der vorstehend genannten Fällung vereinigt.

Das In dieser Welse erhaltene Gemisch der Produkte und der Cholsäure wird der Chromatographie unterworfen, um das gewünschte Produkt zu isolieren. Beispielswelse können Poduicte, die unter Verwendung des Stamms Arthrobacter CA-35 oder dessen genannten Mutanten erhalten werden sind, wie folgt isoliert werden: de Produkte und die Cholsäure werden In Ihre Methylester umgewandelt, und die erhaltenen Methylester werden der Chromatographie an Kieselgel unterworfen, wobei nacheinander mit Chloroform, Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 99: 1) und dann mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 97: 3) eluiert wird. Der

3u gewünschte 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5/?-cholansäuremethylester wird mit Chloroform eluiert. Durch Elution zuerst mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 99:1) werden zuerst eines der Nebenprodukte, 7ct,12ct-Dlhydroxy-S-keto-S/J-cholansäuremethylester. und dann der gewünschte 3a,7a-D!hydroxy-12-keto-5/?-cholansäuremethylester eluiert. Methyitholat wird mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 97:3) eluiert. Diese Methylester können durch Hydrolyse nach einem üblichen Verfahren In die entsprechenden Säuren umgewandelt werden. Als Alternative können bei Verwendung des Stamms Brevibacterium CA-6 oder Corynebacterium CA-53 die Produkte beispielsweise wie folgt Isoliert werde,-.: i^as Gemisch der Produkte und die Cholsäure werden unmittelbar ciev Chromatographie an Kieselgel unterworfen, wobei nacheinander mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 98 : 2) und dann mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhäiinfs 97 : 3) eluiert wird. Die gewünschte 7ar-Hydroxy-3,12-dlketo-5/J-chol3nsäure wird mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 98:2) eluiert. Durch Elution mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 97 : 3) wird zuerst als Nebenprodukt Ia-Hydroxy-S.n-dtketo-^-cholensaure und dann die gewünschte 3a,7ar-Dihydroxy-12-keto-5/?-cholansäure eluiert.

Die räch dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene SaJct-Dihydroxy-n-keto-S/J-cholansäure oder Ihr Salz kann nach der Huang Mlnlon-Reduktionsmethode leicht reduziert werden, wobei Chenodesoxycholsäure (CDCA) als wertvoller Gallenstelnlöser erhalten wird.

7.z-Hydroxy-3,12-dlketo-5/)-cholansäure oder Ihr Salz kann durch Dehydratisierung und anschließende Hydrierung nach einem bekannten Verfahren leicht In Desoxycholsäure, ein wertvolles Ausgangsmaterial für die Herstellung von Progesteron und Adrenalkortlkosteroldderivaten umgewandelt werden. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Bezugsbelsplele welter ausführlich erläutert

Gewinnung von Mutanten

Eine Schleifenmenge des Stamms Arthrobacter CA-35 (FERM-P 5145; ATCC 31651), de? Im Schrägröhrchen {Nährmedium A : 0,5% NaOH, 5,0% Cholsäure, 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt 0,5% NaCl und 1,5% Agar) gezüchtet worden war, wurde In ein In einem Reagenzglas (200 mm χ 21 mm Durchmesser) enthaltenes Nährmedium (10 ml, Medium B: 1% NaOH, 10% Cholsäure, 0,2% NH₄NO,. C,2<*. KH₂POa, 0,5% K₂HPO₄, 0,02% MgSO₄ ■ 7H₂O und 0,01% Hefeextrakt) geimpft und unter Schütteln 24 Stunden bc; 30° C bebrütet. Die erhaltene Kultur (0,3 ml) wurde zu einem In einem Reagenzglas (200 mm χ 21 mm Durchmesser) enthaltenen Nährmedium (10 ml, Nährmedium C: 0.05% NaOH, 0,5% Cholsäure. 0,5% Glucose. 0,2% NH₄NO,, 0,2% KH₂PO₄, 0,5% K₂HPO₄, 0.02% MgSO₄ 7H₂O und 0.01% Hefeextrakt) gegeben und unter Schütteln 15 bis 16 Stunden bei 30° C bebrütet. Die Zellen des Mikroorganismus In einer Log-Phase wurden mit einem Membranfilter (Porengröße 0,45 μηι) unter aseptischen Bedingungen Isoliert, mit 0,'molaren Phosphat.juffern (pH 7,0, 20ml) gewaschen und im eic chen Puffer (25 ml) suspendiert.

Die Mutationsbehandlung wurde durchgeführt, Indem N-Methyl-N'-ntlro-N-nl;ro?f;giianld!n In einer Endkonzentration von 50 Mg/ml zu 4 ml der vorstehend genannten Zellsuspension In einem Peagenzglas (200 mm χ 21 mm Durchmesser) gegeben und das Gemisch 45 Minuten bei 30⁰C unter Schütteln inkubiert wurde. Unter diesen Bedingungen betrug die Letalrate de¹= Stamms Arth cb^tfir ΓΑ-35 etwa 80%.

Die In dieser Welse behandelten Ztllen wurden mit einem Membranfilier (Porengröße 0,45 μπι) unter aseptischen Bedingungen Isoliert, mit 20 ml 0,!molarem Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und In 25 ml des glel-

chen Puffers suspendiert. Die erhaltene Zellsuspension wurde mit einer sterilisierten normalen Kochsalzlösung verdünnt und auf Agarpiatten (Medium D: 0,1% NAOH, 1,0* Choisäure, 0,2% NH₄NO₃, 0,2% KHjPO₄, 0,5% K₂HPO₄, 0,02% MgSO₄ · 7H₂O, 0,01% Hefeextrakt und 1,5% Agar) so ausgebreitet, oaß 300 bis 500 Kolonien pro Platte gebildet würden. Die Platten wurden 4 Tage bel.30° C Inkubiert. Jede in dieser Weise gebildete, punktförmlge Kolonie wurde isoliert und auf einer Platte (Medium E: 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCL und 1,5%- Agar) 24 Stunden b^el 30° C Inkubiert. Jede auf der Platte des Mediums E gebildete Kolonie wurde durch Replikatlerung auf eine Platte des Mediums D übertragen und 20 Stunden bei 30° C inkubiert.

Jede Kolonie auf der genannten Platte des Mediums E, deren durch Replikatlerung übertragene Kolonie auf der Platte des Mediums D nicht wuchs, wurde auf einen Schrägnährmedium (Medium F: 0,1% NaOH, 1.0% Choisäure, 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl und 1,5% Agar) 24 Stunden bei 30° C Inkubiert. Eine Schleifenmenge dieser Schrägkultur wurde In 10 ml eines Nährmediums (Medium G: 0,5% NaOH, 5,0% Choisäure, 0,5% Glucose, 0,2% NH₄NO₃, 0,2% KH₂PO₄, 0,5% K₂HPO₄, 0,02% MgSO₄ · 7H₂O und 0,01% Hefeextrakt) in einem Reagenzglas (200 mm χ 21 mm Durchmesser) geimpft und un"^r Schütteln 3 Tage bei 30° C inkublert.

Bei der Untersuchung der in jedem Medium G angehäuften Produkte durch Dünnschlchtchromatography wurde ein Mikroorganismus, der 3a,7ar-Dlhydroxy-12-keto-5/i-cholansäure oder Ihr Salz selektiv bildet, gefunden 15 ^ und als Stamm Arthrobacter CA-35-M-965-3 bezeichnet.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wird nachstehend als »Verfahren M« bezeichnet. Nach dem Verfahren M wurde eine Mutationsbehandlung unter Verwendung des Stamms Arthrobacter CA-35-M-965-3 als | Ursprungsstamm durchgeführt. Als Folge wurden drei Stämme, die 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5/?-cholansäure oder Ihr Salz selektiv bildeten gefunden und als Stämme Arthrobacter CA-35-A589. Arthrobacter Ca-35-A849 bzw. Arthrobacter CA-35-A-1071 bezeichnet.

Aus der Kolonie des Stamms Arthrobacter CA-35-A589 wurden zwei überlegene Stämme isoliert und als Stämme Arthrobacter CA-35-A589-29-32 bzw. Arthrobacter CA-35-A589-47 bezeichnet.

Beispiel 1

Der Stamm Arthrobacter CA-35 (=ATCC 31651) wurde In einem Nährmedium der nachstehend genannten Zusammensetzung wie folgt gezüchtet:

Choisäure 100 g

Ammoniumnitrat 2,0 g

Kallumdlhydrogenphosphat 2,0 g

Dlkallumhydrogenphosphat 5,0 g

Magneslumsulfatheptahydrat 0,2 g

Hefeextrakt 0,1g

Natriumhydroxyd 10 g |

destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 11

Durch Mischen dieser Bestandteile wurde ein Nährmedium (11) erhalten. Teile von je 100 ml dieses Nährmediums wurden auf 10 Sakaguchlkolben (Volumen 500 ml) verteilt und 15 Minuten Im Autoclaven bei 12O⁰C behandelt. Den Kolben wurden je 10 ml einer Impfkultur zugesetzt, die durch vorheriges Züchten des Stamms im gleichen Medium für 2 Tage bei 30° C unter Schütteln erhalten worden war. Jeder Kolben wurde auf einer Schüttelvorrichtung 2 Tage bei 30° C Inkublert.

Nach beendeter Kultivierung wurde das Kulturmedium vereinigt und zur Entfernung der Zellen des Mikroorganismus zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde durch Zusatz von 600 ml wäßriger 1 N-Salzsäure angesäuert, wobei sich eine Fällung bildete. Die Fällung wurde abgetrennt und die zurückbleibende Lösung mit 1 1 Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wurde mit einem Rotationsverdampfer vom Extrakt abdestilliert und der Rückstand mit der vorstehend genannten Fällung vereinigt, wöbe! ein Gemisch von Cholansäurederlvaten und Choisäure (85 g) erhalten wurde.

E;n geringer Teil des Gemisches wurde In Methanol in einer Konzentration von 1% gelöst. Die Lösung (10 μΐ) wurde in eine schnell arbeitende Flüsslgkeltschromatography-Apparatur eingespritzt, die mit einer μBondapak C-18-Kolonne versehen war (Typ HLC-GPC-244). Die Säule wurde mit Wasser-Methanol (Volumenverhältnis 30: 70. pH 2.5) mit einer Rate von 1 ml/Min, eluiert. Der Brechungsindex des Eluats wurde gemessen.

Das erhaltene Chromatogramm ist in Flg. 1 dargestellt. Die Peaks A, B, C und D In Flg. 1 entsprechen denen des Bezugsstandards von 7cr-Hydroxy-3,12-dlketo-5/J-cholansäure, SaJar-Dlhydroxy-U-keto-S/J-cholansäure, 7a,12a-Dlhydroxy-3-keto-5/3-cholansäure bzw. Choisäure.

Wenn die Verbindungen in den Fraktionen, die den Peaks A, B und C entsprachen. Isoliert und Ihre chemischen Konstitutionen auf der Grundlage der Massenspektren, IR-Spektren und NMR-Spektren bestimmt wurden, zeigten diese Spektren, daß es sich bei diesen Verbindungen um 7ct-Hydoxy-3,12-dlketo-5/!-cholansäure, 3a.7a-Dlhydroxy-12-keto-5/3-choIansäure bzw. 7a,12ur-Dlhydroxy-3-keto-50-cholansäure handelte. Die Abbildungen Flg. 2, 3 und 4 zeigen die IR-Spektren (A, B und C) der Methylester der den Peaks A, B und C entsprechenden Verbindungen im Vergleich zu denen des Bezugsstandards (A', B' und C).

Die Schmelzpunkte der den Peaks A, B und C entsprechenden Verbindungen und Ihrer Methylester sind nachstehend In Tabelle 2 genannt.

3G 31 334

Tabelle 2

Verbindungen Schmelzpunkte der Methylester, (⁰C) Gefunden Literatur

Schmelzpunkte der freien Säuren (⁰C)

Gefunden Literatur

Peak A	150-152	152-154	—	—
Peak B	154-156	156-157	219-220	221-222
Peak C	168-169	169-172	185-186	186-138

Die Ausbeute der Produkte und die Menge der Cholsäure, die nicht umgesetzt worden war, wurden aus dem Flächenverhältnis des in Fig. 1 dargestellten Chromatogramms berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt

Tabelle 3

Verbindungen	Flächen	Umsatz	Ausbeute oder
	verhältnis	(%)	Menge (g)
7a-Hydroxy-3,12-diketo-	28,54	28,54	24,3
5/ß-cholansäure
(Peak A)
3α, 7a-Di-hydroxy-12-keto-	63,06	63,06	53,6
5/?-cholansäure
(Peak B)
7α-, 12a-Di-hydroxy-3-	1,54	1,54	1,30
keto-5/5-cholansäure
(Peak C)
Cholsäure	6,86	6,86	5,80
(Peak D)

Beispiel 2

t Der In Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch außerdem 5,0 g/l Glucose dem Nähr-

medium zugesetzt warden. Hierbei wurden 91,0 g eines Gemisches von Produkten und nicht umgewandelter Cholsäure erhalten. Das Gemisch (91,0 g) wurde In 270 ml Methanol gelöst und mit 9 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Die erhaltene Lösung wurde 20 Minuten am Rückfluß erhitzt, wobei die Produkte und die Cholsäure In Ihre Methylester umgewandelt wurden.

In eine Kolonne (1200 mm χ 70 mm Durchmesser) wurden 1500 g Kieselgel C-200 gefüllt. Die vorstehend genannten Methylester wurden am Kieselgel absorbiert. Die Säule wurde mit Chloroform elulert, wobei 25,1 g 7a-Hydroxy-3,12-dlketo-5^-cholansäUremethylester erhalten wurden. Die Säule wurde dann mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 99 :1) elulert, wobei zuerst 1,40 g 7a,12a-Dlhydroxy-3-keto-5/J-cholansäuremethylester und dann 56,4 g 3a;,75r-Dihydroxy-12-keto-5/3-cholansäuremethylester erhalten wurden.

Diese Methylester wurden hydrolysiert, wobei 24,8 g 7a-Hydroxy-3,12-dlketo-5/J-choiansäure, 1,38 g 7α,12α-Dlhydroxy-3-keto-5/?-cholansäure und 56,0 g 3a,7«-Dlhydroxy-12-keto-5/?-cholansäure erhalten wurden.

Beispiel 3

Der In Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch die Konzentration der Cholsäure verändert und dem Nährmedium Natriumhydroxid In einer Menge von 10 Gew.-%, bezogen auf die verwendete Cholsäure, zugesetzt wurde. Die Ausbeute an Produkten und die Menge der nicht umgewandelten Cholsäure für jede Konzentration des Substrats (Cholsäure) sind In Tabelle 4 genannt.

Tabelle 4

Verbindungen

Ausbeuten

Substratkonzentration (g/l) 50 200

300

3a, 7a-Dihydroxy-12-keto-5/?-cholansäure 27,1g 108,3 g 47,4 g

7a-Hydroxy-3,12-diketo-5/?-cholansäure 12,3 g 49,0 g 21,4 g

7a, Ha-Dihydroxy-S-keto-SyS-cholansäure 0,7 g 2,65 g 1,20 g

Cholsäure geringe 20,1 g 230 g

Menge

10

Beispiel 4

Der in Beispiel 2 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch jeder Kolben auf der Schüttelvorrichtung 24 Stunden bei 30° C Inkubiert wurde, wobei 98,0 g eines Gemisches von Produkten und nicht umgewandelter Cholsäure erhalten wurden. Das Gemisch wurde der Schnell-Flüsslgkeltschromatographle unter den In 5 Beispiel 1 genannten Bedingungen unterworfen, um seine Zusammensetzung zu ermitteln. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt.

Tabelle 5

Verbindungen Anteil ^!

3a, 7a-Dihydroxy-12-keto- 67,7

5/7-cholansäure
7a-Hydroxy-3,12-diketo- 15

5/?-cholansäure 8,3

la, 12a-Dihydroxy-3-keto-

5/?-cholansäure 4,0

Cholsäure 20,0 20

Beispiel 5

Der in Beispiel 2 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch in jeden Kolben 20 ml einer Impfkultur gegeben wurden, die durch Züchten für 24 Stunden bei 3O⁰C erhalten worden war. Hierbei wurden 117,0 g 25 eines Gemisches von Produkten und nicht umgewandelter Cholsäure erhalten. Das Gemisch wurde der Schnellchromatographle unter den In Beispiel 1 genannten Bedingungen unterworfen, um seine Zusammensetzung zu ermitteln. Die Ergebnisse sind In Tabelle 6 genannt.

Tabelle 6 _J0

Verbindungen	Beispiel 6	Anteil
3a, 7a-Dihydroxy-12-keto-
5/?-cholansäure	63,3
7a-Hydroxy-3,12-diketo-
5/?-cholansäure	23,5
7a, 12a-Dihydroxy-3-keto-
5/?-cholansäure	2,0
Cholsäure	11,2

Der Stamm Arthrobacter CA-35-A589-29-32 ₄₅

(=ATCC 31652) wurde wie folgt gezüchtet:

Zusammensetzung des Nährmediums:

Cholsäure 100 g

Ammoniumnitrat	2,0 g
Kaliumdihydrogenphosphat	2,0 g
Dikaliumhydrogenphosphat	5,0 g
Magnesiumsulfatheptahydrat	0,2 g
Hefeextrakt	0,1g
Natriumhydroxit	10 g
Glukose	5,0 g
Leitungswasser	zur Abfüllung auf 1 1

Die vorstehend genannten Bestandteile, mit Ausnahme der Glukose, wurden In Leitungswasser gemischt und damit auf 800 ml aufgefüllt und Im Autoclaven 15 Minuten bei 120⁰C behandelt. Die Glukose wurde In 200 ml Leitungswasser gelöst und im Autoclaven 30 Minuten bei 110° C behandelt. Nach dem Abkühlen wurden beide Lösungen zusammengegeben, wobei 1 1 Nährmedium erhalten wurden. Je 100 ml des Nährmediums wurden auf 10 Sakaguchlkolben (Volumen 500 ml) unter aseptischen Bedingungen aufgeteilt. In die Kolben wurden je 2 ml 65

■^if der Impfkultur gegeben, die durch vorherige Kultivierung des Stamms Im gleichen Nährmedium unter Schütteln bei 30⁰C für 14 Stunden erhalten worden war. Jeder Kolben wurde auf einer Schüttelvorrichtung 3 Tage bei 30° C inkubiert.

Nach beendeter Kultivierung wurde das Kulturmedium zusammengegeben und zur Entfernung der Zellen des Mikroorganismus zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde durch Zusatz von 600 ml wäßriger 1 N-Salzsäure angesäuert, wobei eine Fällung gebildet wurde. Die Fällung wurde abgetrennt und die als Rückstand verbleibende Lösung mit 1 1 Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wurde vom Extrakt Im Rotallonsverband abdestilliert und der Rückstand mit der vorstehend genannten Fällung zusammengegeben, wobei 99,3 g eines Gemisches von Cholansäurederlvaten und Cholsäure erhalten wurden.

Ein kleiner Teil des Gemisches wurde In Methanol In einer Konzentration von 2% gelöst. Die Lösung (10 μΐ) wurde In eine Schnell-Flüsslgkeltschromatography-Apparatur gegeben, die mit einer μBondapak C-18-Kolonne versehen war (Typ HLC-GPC-244).

Die Säule wurde mit Wasser-Methanol (Volumenverhältnis 30: 70, pH 4,0) mit einer Rate von 1 ml/Minute elulert und der Brechungsindex des Eluats gemessen. Das erhaltene Chromatogramm ist In Flg. 5 dargestellt. Die Peaks B und D In Fig. 5 entsprechen denen der Bezugstandards von 3a,7a-Dlhydroxy-12-keto-5/3-cholansäure bzw. Cholsäure.

Wenn die dem Peak B entsprechende Verbindung In der Fraktion Isoliert und Ihre chemische Konstitution auf der Grundlage des Massenspektrums, IR-Spektrums und MMR-Spektrums bestimmt wurde, ergaben diese Spektren, daß die Verbindung die 3«,7a-D!hydroxy-12-keio-5/i-cholansäure war.

Die Ausbeute an Produkten und die Menge der nicht umgewandelten Cholsäure wurden aus dem Flächenverhältnis des Chromatogramms In Fig. 5 berechnet. Die Ergebnisse sind In Tabelle 7 genannt.

Tabelle 7

Verbindungen

Umsatz, % *) Ausbeute oder Menge (g)

3<r, 7a-Dihydroxy-12- 98,85 98,16

keto-5/?-cholansäure
(Peak B)

andere aus Cholsäure 0,59 0,59

gebildete Derivate

Cholsäure (Peak D) 0,56 0,55

*) Der Umsatz wurde aus dem Flächenverhältnis berechnet.

Beispiel 7

Der In Beispie! 6 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch eine Zellsuspenslon, die durch Abtrennen der Zellen des Mikroorganismus aus der Impfkultur (10 ml) durch Zentrifugleren und Suspendieren der Zellen In 10 ml sterilisiertem Wasser erhalten worden war, anstelle von 2 ml der Impfkultur In jeden Kolben gegeben wurde. Hierbei wurden 99,5 g eines Gemisches von Produkten und nicht umgewandelter Cholsäure erhalten. Das Gemisch (99,5 g) wurde In 270 ml Methanol gelöst und mit 9 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Die erhaltene Lösung wurde 20 Minuten am Rückfluß erhitzt, um die Produkte und die Cholsäure in ihre Methylester umzuwandeln.

1500 g Kieselgel C-200 wurden in eine Kolonne (1200 mm χ 70 mm Durchmesser) gefüllt, worauf die genannten Methylester am Kieselgel adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 99 : 1) eluiert, wobei 102 g SxJ^-Dihydroxy-^-keto-SyS-cholansäuremethylester erhalten wurden, der hydrolislert wurde, wobei 98,5 g 3ar,7ar-Dlhydroxy-12-keto-5/?-cholansäure erhalten wurden.

Beispiel 8

Der in Beispiel 6 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch die Konzentration der Cholsäure verändert, Nairiuriihydröxii dem Nährrnediurn in einer Menge von 10 Gew.-%, bezogen auf verwendete Cholsäure, und wäßrige 1 N-Salzsäure In einer Menge von 60 ml/g des verwendeten Natrlumhydroxits zugesetzt wurden, wobei eine Fällung gebildet wurde. Der Umsatz oder die Ausbeute des Produkts und die Menge der zurückbleibenden Cholsäure sind für jede Konzentration des Substrats (Cholsäure) in Tabelle 8 genannt.

Tabelle 8

Verbindungen	3a, 7a-Dihydroxy- 12-keto-S/J-cholan- säure	Cholsäure
Umsatz bzw. Ausbeute
Substratkonzen tration (g/l)
1	96,7% *)	0,4%
5	98,0% *)	0,7% *}

Fortsetzung	3a, 7o-Dihydroxy- 12-keto-5/f-cholan- säure	Gholsäure
Verbindungen
Umsatz bzw. Ausbeute
Subslratkonzen- tration (g/l)	9,3 g	0,1g
10	19,5 g	0,2 g
20	49,6 g	0,1g
50	98,2 g	0,6 g
100	129,2 g	70,0 g
200

·) Umsatz

20 1

Beispiel 9 |

Der In Beispiel 6 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35-A 589-29-32 der Stamm Arthrobacter CA-35-A589-47 (=ATCC 31653) verwendet wurde, die Konzentrationen der Cholsäure und des Natrlumhydroxlts Im Nährmedium auf 50 g/l bzw. 5 g/l geändert wurden und jeder Kolben 35 Stunden bei 30⁰C lnkublert wurde, wobei 49,31g eines Gemisches von Produkten und nicht umgewandelter Cholsäure erhalten wurden. Das Gemisch wurde der gleichen Schnell-Flüssigkeltschromatography unter den In Beispiel 6 genannten Bedingungen unterworfen.

Das erhaltene Chromatogramm ist in Fig. 6 dargestellt. Die Peaks A, B, C und D in Flg. 6 entsprechen dem des Bezugsstandards von 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5/3-cholansäure, SaJct-Dlhydroxy-n-keto-S/J-cholansäure, 7a,12a:-Dlhydroxy-3-keto-5/!-cholansäure bzw. Cholsäure.

Wenn die den Peaks A, B, C und D entsprechenden Fraktionen abgetrennt und der Dünnschichtchromatography unterworfen wurden, enthielt jede dem Peak B, C bzw. D entsprechende Fraktion eine Elnzelverbindung. Die dem Peak A entsprechende Fraktion war ein Gemisch von 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5/J-cholansäure und einem anderen nicht identifizierten Material.

Die Ausbeute an Produkten und die Menge der zurückgebliebenen, nicht umgewandelten Cholsäure wurden aus dem Flächenverhältnis des in Flg. 6 dargestellten Chromatogramms berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 genannt.

Tabelle 9

Verbindungen Umsatz % Ausbeute bzw.

Menge, g

7cr-Hydroxy-3,12- 0,80 0,39

diketo-5/?-cholansäure und nicht
identifiziertes
Material
(Peak A)

3«, 7a-Dihydroxy- 98,01 48,33

I2-keto-5/?-
cholansäure
(Peak B)

7a, Ha-Dihydroxy- 0,25 0,13

3-keto-5/S-cholansäure
(Peak C)

60

andere Derivate 0,24 0,12

Cholsäure
(Peak D) 0,70 0,35

Beispiel 10 «

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle des Stamms Arthrobacter CA-35 der Stamm Brevlbacterlum CA-6 verwendet wurde. Das hierbei erhaltene Gemisch von Produkten und

unverändert gebliebener Cholsäure wurde der Schnell-Flüsslgchromatography wie In Beispiel 1 unterworfen. Das erhaltene Chromatogramm Ist In Fig. 14 dargestellt.

Die Verbindungen In den Fraktionen, die den Peaks E, A, B und D entsprachen, wurden isoliert und Ihre

chemischen Konstitutionen durch die Massenspektren, IR-Spektren und NMR-Spektren bestimmt. Diese Spek-

tren zeigten, daß es sich bei diesen Verbindungen um 7ar-Hydroxy-3,12-dlketo-4⁴-cholensäure, 7a-Hydroxy-3,12-dlketo-5/J-cholansäure, SctJa-Dlhydroxy-U-keto-S/J-cholansaure bzw. Cholsäure handelte. Die Verbindungen In den Fraktionen, die den Peaks X und Y entsprachen, wurden nicht Identifiziert.

In dem In Flg. 7 dargestellten Chromatogramm beträgt das Verhältnis der Peaks mit Ausnahme der Peaks X und Y (d. h. das Flächenverhältnis E : A : B : D 12,2 : 22,2 : 44,9 : 20,7.

Beispiel 11

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle des Stamms Arthrobacter CA-35 der Stamm Corynebacterium CA-53 (=ATCC 31662) verwendet wurde, wobei 82 g eines Gemisches von Produkten und Cholsäure erhalten wurde. Dieses Gemisch wurde der Schnell-Flüsslgkeitschromatography unter den In Beispiel 1 genannten Bedingungen unterworfen, wobei jedoch Wasser-Methanol (Vo!umenverhältn!s 30 : 70, pH 4,0) anstelle von Wasser-Methanol (Volumenverhältnis 30 : 70, pH 2,5)als Elutlonsmittel verwendet wurde.

Das erhaltene Chromatogramm Ist in Flg. 8 dargestellt. Die Peaks A, B, C und D in Flg. 15 entsprechen denen der Bezugsstandards von 7<z-Hydroxy-3,12-dlketo-5/!-cholansäure, SaJcr-Dlhydroxy-U-keto-S/J-cholansäure, 7a-Hydroxy-3,12-dlketo-J⁴-cholensäure bzw. Cholsäure.

Wenn die Verbindungen in den Fraktionen, die den Peaks A, B und C entsprachen, Isoliert und Ihre chemischen Konstitutionen aus den Massenspektren, IR-Spektren und NMR-Spektren bestimmt wurden, zeigten diese Spektren, daß es sich bei diesen Verbindungen um 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5^-Cholansäure, 3«,7ar-Dlhydroxy-12-keto-5^-cholansäure bzw. 7sr-Hydroxy-3,12-diketo-J''-cholensäure handelte.

Bezugsbeispiel 1

In einen Dreihalsrundkolben wurden 10 g der In der beschriebenen Welse hergestellten 3a,7cr-Dihydroxy-12-keto-5/?-cholansäure gegeben. Der Säure wurden langsam 100 ml Äthylenglykol und eine Lösung von 10 g KaIlumhydroxyd in 20 ml Wasser zugesetzt. Ferner wurden 10 ml 85%lges Hydrazlnhydrat zugesetzt, worauf das erhaltene Gemisch 2 Stunden am Rückfluß erhitzt wurde. Die Temperatur wurde allmählich erhöht und das Erhitzen am Rückfluß 4 Stunden bei 185 bis 190⁰C fortgesetzt, um das Hydrazlnhydrad abzudestillleren. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch mit überschüssigem Wasser verdünnt und auf pH 3 eingestellt, wobei sich eine Fällung bildete. Die Fällung wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei 8,5 g 3ar,7a-Dihydroxy-5/i-cholansäure (CDCA) erhalten wurden.

Bezugsbeispiel 2

In einem Dreihalsrundkolben wurden 3 g der in der beschriebenen Welse hergestellten 7cr-Hydroxy-3,I2-dlketo-5/i-cholansäure In 70 ml Pyridln gelöst. Der Lösung wurde 1 mol Tosylchlorld zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde der Reaktion bei 0° C überlassen und dann 5 Stunden am Rückfluß erhitzt. Anschließend wurde wäßrige 3 N-Salzsäure zugesetzt und das Reaktionsgemisch mit 100 ml Äther extrahiert. Der Äther wurde vom Extrakt unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 2,5 g d^b- und/oder 4⁷-3,12-Dlketo-cholensäure erhalten wurden. Das erhaltene Produkt (2 g) wurde In 10 ml wäßrigen 1 N-Natriumhydroxid gelöst. Der Lösung wurde 0,1 g Raney-Nickel zugesetzt. Nach Zugabe von 0,01 mol Wasserstoff wurde das Gemisch der Reaktion über Nacht überlassen, wobei 3cr,12«-Dlhydroxy-5ß-cholansäure (Desoxycholsäure) und 3a:,I2/!-Dlhydroxy-5/i-choIansäure erhalten wurden (Ausbeute 90%).

Hierzu 8 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung von Cholansäurederivaten der Formel
O

COOR

OH

in der C für \~ OH oder = O und R für Wasserstoff, ein Alkalimetall oder Erdalkalimetall steht, durch Züchten eines Mikroorganismus in einem ChoLsäure oder eines ihrerSalzeenthaltevidenNährmedium und Isolieren des gebildeten Cholanjäurederivats, dadurch gekennzeichnet, daß man Arthrobacter ATCC 31651, Arthrobacter ATCC 31652, Arthrobacter ATCC 31653, Brevibacterium ATCC 31661 oder Corynebacterium ATCC 31662 in einem Nährmedium züchtet.