DE2102793B2

DE2102793B2 - Verfahren zur Herstellung von Lbeta,3,4-Dihydroxyphenyl-alpha alanin durch Fermentation

Info

Publication number: DE2102793B2
Application number: DE2102793A
Authority: DE
Inventors: Jean Florent; Jean Lunel; Jacques Renaut
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1970-01-21
Filing date: 1971-01-21
Publication date: 1974-08-01
Also published as: DE2102793A1; GB1278558A; CA939285A; NL7100438A; DE2102793C3; US3703439A; DK125790B; ES387501A1; FR2076626A5; CH519573A; JPS4938838B1; SU452103A3; BE761828A

Description

Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378

Kultur auf Agar

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren lur Herstellung von L-/3-(3,4-Dihydroxyphenyl)- *-alanin (L-DOPA) durch mikrobiologische Umwandlung von Tyrosin entsprechend dem vorstehenden fatentanspruch 1.

Es ist bekannt, daß L-DOPA ein Produkt des Metabolismus von L-Tyrosin beim Menschen und bei den Tieren ist. Es gibt auch bei den höheren Pilzen und t>ei den Pflanzen Tyrosinasen, die L-Tyrosin über l-DOPA in Melaninpigmente überführen.

Die Mikroorganismen verwerten im allgemeinen Tyrosin in einer vollständig anderen Weise. Larway Und Evans (Biochem., Bd. 85, 1962, 22 P) haben Jedoch das Schwarzpigment analysiert, das sich in den Kulturen von in Anwesenheit von Tyrosin entwickelter Microspira tyrosinatica bildet, und gezeigt, daß dieses Pigment DOPA enthält. In der Folgezeit wurde festgeste'lt (A r ο η s ο η und V i c k e r s, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 110, 1965, 624), daß wasserlösliche Extrakte von Bacillus cereus T eine Tyrosinase enthalten, die Tyrosin und Metatyrosin in DOPA umwandeln können. Schließlich haben S i h und Mitarb. (J. Am. Chem. Soc. Bd. 91, 1969, 6204) eine Herstellung von L-DOPA durch Oxydation von L-Tyrosin Kultur im Kolben unter Bewegung

Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium kann variieren, doch sollte es im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenoioffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Ge-

5.« mischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilieibare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose, Dextrine, Stärke oder Zuckeralkohole, wie beispielsweise Glycerin, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Melassen, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können

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sehr einfache chemische Substanzen, wie beispiels- Stabilität des bereits gebildeten L-DOPA ungünstig

weise anorganische oder oiganische Ammoniumsalze, ist, bietet.

Harnstoff oder gewisse Aminosäuren, sein. Sie können Es kann vorteilhaft sein, die Umwandlung des

auch in Form von komplexen Substanzen, die den L-Tyrosins in L-DOPA in Anwesenheit von Ascorbin-

Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form ent- 5 säure vorzunehmen.

halten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form Die Ascorbinsäure wird im allgemeinen nach der

von Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydroly- Entwicklungsstufe des Mikroorganismus entweder vor

säten, Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Fleisch- oder während oder nach der Zugabe des L-Tyrosins

extrakten, Hefeextiakten, Distillers' Solubles und Mais- zugegeben. Sie ermöglicht, wertvolle Auf beuten zu

quellwasser. i° erhalten, selbst wenn der pH-Wert im Verlaufe der

Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können Umwandlungsstufe zwischen 6 und 7 beträgt. Unter

gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende diesen Bedingungen ist es im allgemeinen nicht mehr

Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder erforderlich, den pH-Wert des Kulturmediums vor

Erdalkaliphosphate oder Calcium- und Magnesium- der Durchführung der Umwandlung des L-Tyrosins

carbonat. 15 in L-DOPA einzustellen.

Andere führen zudem zur Entwicklung des Vibrio Die einmal oder mehrere Male zugesetzte Ascorbin-

tyrosinaticus ATCC 19 378 erforderlichen Ionengleich- säure wird in Konzentrationen zwischen 1 und 5 g/l

gewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkali- verwendet.

chloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in Schließlich wird die Umwandlung durch die fol-

speziellerer Wei>e als Aktivatoren der Stoffwechsel- 20 genden Zusätze günstig beeinflußt:

reaktionen des Vibrio tyrosinaticus. Es sind dies die Kupfersalze (1 bis 10 mg/1), Antioxydantien, wie

Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze. beispielsweise Sorbinsäure, N,N'-Diphenyl-p-pheny-

Der pH-Wert des Fermentationsmediums sollte zu lendiamin, 2- (lind 3-)tert.-Butyl-4-methoxyphenol,

Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7,S. Vorzugs- 2,6-Di-tert.-butyl-p-cresol und insbesondere 2,2,4-Tri-

weise zwischen 6,5 und 7,5, liegen. 25 methyl-o-äthoxy-l^-dihydrochinolin in einer Menge

Das so hergestellte Züchtun^smedium wird mit von 0,1 bis 1 g/l.

einer Impfkultur des Stammes Vibrio tyrosinaticus Die Extraktion des L-DOPA aus der Fermen-ATCC 19 378 in flüssigem Medium beimpft, und die tationsmaische kann in an sich bekannter Weise vorKultur wird bei einer Temperatur zwischen 22 und genommen werden. Die Maische wird beispielsweise 37^C C und vorzugsweise bei 25 bis 26^;C unter Bewegen 30 nach Ansäuern auf pH 2 durch Filtrieren oder Zentri- und Belüftung inkubiert. Die Belüftung der Fermen- fugieren geklärt. Das L-DOPA kann dann aufeinandertation kann zwischen ziemlich wt'.en Werten variieren, folgend an einem Kationenaustauscherharz vom Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 Sulfonsäure-Typ nach der von L. E. Martin und bis 3 Liter Luft je Liter Bouillon und je Minute be- C. H a r i s s ο η (Anal. Biochem., Bd. 23, 1968, 529) sonders gut geeignet sind. 35 beschriebenen Technik und an Aluminiumoxyd in

In der zweiten Stufe, in deren Verlauf die Synthese Anwesenheit von Äthylendiaminotetraessigsäure und des L-DOPA stattfindet, setzt man zu der Kultur Natriummetabisulfit nach der Methode von A. H. L-Tyrosin handelsüblicher Qualität in Mengen, die Anton und D.E. Sayre (J. Pharmacol. Exp. von 0,1 bis 15 g/l betragen und vorzugsweise zwischen Therap., Bd. 145, 1964, 326) zurückgehalten werden. 3 und 10 g/l liegen, zu. Diese Zugabe in fester Form 40 Das an dem Aluminiumoxyd fixierte L-DOPA kann oder in Form einer Lösung kann zu verschiedenen mit einer Oxalsäurelösung eluiert und durch UmZeitpunkten im Verlaufe der Züchtung vorgenommen kristallisation nach Entfernung der Oxalsäure gewerden, erfolgt jedoch vorzugsweise nach einer eisten reinigt werden.

Phase (Inkubation) von 16 bis 24 Stunden. Die Ver- Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläute-

wendung von Säuren oder Basen zur Auflösung des 45 rung der Erfindung.

Tyrosins ermöglicht, verhältnismäßig konzentrierte . I₁

Lösungen desselben zu erhalten. Es ist vorteilhaft, Beispiel 1

gleichzeitig eine Lösung von Tyrosin in Salzsäure und In einen 30 1-Fermenter bringt man die folgenden

eine Lösung von Tyrosin in Natronlauge zu verwen- Bestandteile ein:

den, um diese Zugabe vorzunehmen, da ein geeignetes 50 Hefeextrakt 40 s

Verhältnis der beiden Lösungen ermöglicht, gleich- Pepton 80 ε

zeitig die gewünschte Tyrosinmenge in der Kultur und Fleischextrakt 80 g

die Korrektion des pH-Werts ohne merkliche Erhö- Glucose-monohydrät' [Y.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 160 g

hung der Menge des Mediums an Mineralsalzen zu Natriumchlorid 80s

^er^^lte.ⁿ·. , . · ,u-,- ,, ⁵⁵ und füllt mit Leitungswasser bis Ϊ7 i auf.
Nach dieser Zugabe ist es, gleichgültig zu welchem

Zeitpunkt und in welcher Menge das Tyrosin züge- Der pH-Wert wird durch Zugabe von 22 cm³

geben wird, zweckmäßig, die Kultur noch 1 bis 2 Tage 10n-Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Man sterilisiert

unter den gleichen Bedingungen bezüglich des Be- das Medium während 40 Minuten bei 122° C. Nach

wegens und der Temperatur fortzusetzen, um die maxi- 60 Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 16 Liter

male Produktion an L-DOPA zu erhalten. und der pH-Wert 6,95. Man be:impft dann mit 200 cm³

Es kann vorteilhaft sein, den Kulturen zu Beginn einer gerühiten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur

der Umwandlungsstufe, d. h. gleich nach der Zugabe von Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378. Die Kultur

des Tyrosins, Glucose (2 bis 20 g/l) zuzusetzen, deren wird bei 26⁰C während 16 Stunden unter Bewegen

Metabolismus gleichzeitig dem Mikroorganismus Ener- 65 und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie

gie liefert und ein Mittel zur Steuerung des pH-Werts ist dann zur Durchführung der gewünschten Umwand-

der Kultur unter Vermeidung einer Entwicklung über lung geeignet. Diese wird bei pH 5,3 durchgeführt.

6,0, die für die Umwandlung des Tyrosins und für die Man stellt daher den pH-Wert der Kultur durch

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Zugabe einer sterilen 2,4 n-Salzsäurelösung auf diesen indem man mittels eines Paraffinbads erhitzt, um

Wert ein und setzt 64 g Tyrosin in Form von zwei 70cm^a einer Lösung zu erhalten, aus der man nach

sterilen Lösungen des gleichen Volumens zu, von 10-stündigem Stehenlassen bei 4°C 2,54 g rohes

denen die eine eine 20 %ige Lösung in 2,4n-Salzsäure L-DOPA isoliert. Durch Einengen der Kristalli-

und die andere eine 20%ige Lösung in 2,4n-Natron- s sationsrautterlaugen erhält man noch 0,65 g Kristalle,

laugeist. Man setzt noch 350 cm³ einer sterilen Lösung Das gesamte Rohprodukt wird durch Umkristalli-

mit einem Gehalt von 160 g Glucose-monohydrat zu sation aus Wasser nach Entfärbung der wäßrigen Lö-

und setzt die Züchtung 27 Stunden fort, wobei man sung mit einer Aktivkohle gereinigt, Man erhält so

erforderlichenfalls den ρH-Wert korrigiert, um ihn bei 2,65 g kristallisiertes L-DOPA in einer Ausbeute von

5,3 zu halten. Das Endvolumen beträgt 14 Liter und io 49%, bezogen auf das in der Fermentationsmaische

der Gehalt an L-DOPA 3,0 g/l. bestimmte Produkt; [«] i? = -16,4 ± 0,8° (c = 1 %

Die Bestimmung des L-DOPA wird mit dem Filtrat in 0,In-HCI).

der Fermentationsmaische bei pH 2 nach der von Das an Cellulose in Dünnschicht mit dem System

L.E. /-.mow (J. Biol. Chem., Bd. 118, 1937, 531) Propanol-3n-HC! (70:30 Volumina) chromatogra-

beschriebenen Methode durchgeführt. Die Bestim- 15 phierte und mit Λ-Nitroso-jS-naphthol entwickelte

mung der erhaltenen Färbung erfolgt mit einem Produkt [vgl. R.Acher und C.Crocker, Biochim.

Spektrophotometer gegenüber einer reinen Probe von Biophys, Acta, Bd., 9 1952, 704) enveist sich als frei

L-DOPA. Man prüft die Richtigkeit dieser Bestim- von Tyrosin,

mung (nicht spezifisch für L-DOPA) durch Dünn- R ' s 13

schichtchromatographie des Filtrats an Cellulose in 20 ^'

den Lösungsmittelsystemen Propanol-Wasser (7 : 3 Vo- In einen 75 l-Fermenter bringt man die folgenden

lumina) oder Isopropanol-OJn-HCl (5:1 Volumina) Bestandteile ein:

und spektrophotometrischer Bewertung des L-DOPA Hefeextrakt 100 s

nach Entwicklung mit Kaliumferrkyanid und Äthylen- Pe t ⁷OO 2

diamin. Die nach diesen beiden Methoden erhaltenen 25 Fleischextrakt ^OO a

Gehalte stimmen gut überein. _v, , · , , . ■ Z_nri

⁰ Natriumchlorid 200 g

Beispiel 2 und füllt mit Leitungswasser auf 33 I auf.

Eine Fraktion (1,8 1) der im Beispiel 1 beschriebenen Der pH-Wert wird durch Zugabe von 40 cm³

Umwandlungskultur mit einem Gehalt von 5,4 g 30 10n-Natronlauge auf 7 eingestellt. Man sterilisiert das

L-DOPA wird mit 50 cm³ 12n-Salzsäure auf pH 2 an- Medium durch" 40minütiges Durchleiten von Dampf

gesäuert und zentrifugiert. Die gewonnene über- von 122⁼C. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der

stehende Flüssigkeit wird so, wie sie ist, durch eine Bouillon 38,5 I. Sie wird durch Zugabe von 1,5 1 einer

Säule, (Durchmesser: 7,5 cm, Höhe: 63 cm) von Harz sterilen wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von

Dowex 50 W-X 2 in saurer Form (Harz auf der Basis 35 600 g Glucose-monohydrat auf 40 1 eingestellt,

von Polystyrolsulfonsäure mit 2% Divinylbenzol mit Der pH-Wert beträgt 6,90. Man beimpft mit 200 cm³

einem Gehalt von 0,9 Milliäquivalent/ml und 5,3 Milli- einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur

äquivalent/g, bezogen auf Trockenharz) geleitet. Das des Stammes Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378. Die

fixierte L-DOPA wird mit 2n-Salzsäure eluiert. Das Kultur wird 10 Stunden bei 30"C unter Bewegen und

Eluat (5,2 1), das noch kleine Mengen nichtumge- 40 unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt, bevor sie

wandeltes Tyrosin enthält, wird gereinigt, indem sein zur Beimpfung der Produktionskultur verwendet wird.

pH-Wert durch Zugabe von 800 cm³ Natronlauge Die Produktionskultur wird in einem 800-1-Fermen-

(d — 1,33) auf 4,0 eingestellt w^;rd und 250 g Alu- ter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen

miniumoxyd, 5 g Natriummetabisulfit und 5 g Äthylen- beschickt ist:

diaminotetraessigsäure in Form des pinatriumsalzes 45 Maisquellwasser (50 % Trockenextrakt) 2,2 ks

zugegeber, werden Das Gem.sch w,rd gerührt, durch Magnesiumsulfat mit 7 H₂O 0,220kg

Zugabe von 200 cm» konzentnerter Natronlauge _uncf _{fQ|k mjt Le}jtun_eswasser auf 390 1 auf.
(d = 1,33) auf einen pH-Wert von 8,6 gebracht und

dann 15 Minuten stehengelassen. Man trennt das Nach Einstellen des pH-Werts auf 6,6 mit 12C cm³

Aluminiumoxyd durch Filtrieren ab und wäscht es 50 10n-Natronlauge setzt man 1,1 kg Calciumcarbonat

mehrere Male mit insgesamt 3 1 destilliertem Wasser. zu und sterilisiert dann das Medium durch 40-minütiges

Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten, die das Durchleiten von Dampf von 122°C. Naoh Abkühlen

Tyrosin enthalten, werden verworfen, während da" beträgt das Volumen der Bouillon 425 Liter. Sie wird

L-DOPA durch Behandlung des Aluminiumoxyds mit durch Zugabe von 10 1 einer sterilen wäßrigen Lösung

2,21 2n-Oxalsäure gewonnen wird. Die Oxalsäure- 55 mit einem Gehalt von 4,4 kg Glucose-monohydrat

lösung wird unter vermindertem Druck (30 mm Hg) und 5 1 einer sterilen wäfirigeii Lösung mit einem

durch Erhitzen auf einem siedenden Wasserbad auf Gehalt von 0,880 kg Ammoniumsulfat auf 400 1 auf-

0,7 1 eingeengt. Man entfernt riurch Filtrieren die aus- gefüllt. Der pH-Wert beträgt 7.

kristallisierte Oxalsäure. Das Filtrat wird anschließend Man beimpft mit 6 Liter der oben beschriebenen mit 3,71 Äthylalkohol behandelt. Der pH-Wert wird öo Impfkultur aus dem 75 !-Fermentcr. Die Kultur wird mit 150 cm³ Natronlauge (r/=l,33) auf 5,5 einge- 20 Stunden bei 30⁼ C unter Bewegen mit einer Turbine, stellt, um die Mineralsalze auszufällen. Man vervoll- die mit 180 U/Min, betrieben wird, und unter Beständigt die Ausfällung, indem man noch 3,7 I Aceton lüftung mit steriler Luft mit einem Durchsatz von zusetzt. Der gebildete Niederschlag wird sogleich ab- 20 m³/Su:. entwickelt. Der pH-Wert der Kultur wird filtriert, und das neue Filtrat wird unter vermindertem 65 automatisch durch Zugabe von 6n-Ammoniak oder Druck (30 mm Hg) durch Erhitzen auf einem siedenden 4n-Salzsäure bei 6,6 -*: 0,05 gehalten.
Wasserbad auf 0,8 1 eingeengt. Man beendet das Ein- Nach 20 Stunden ist die Kultur zur Durchführung engen bei normalem Druck unter Stickstoffatmosphäre, der gewünschten Umwandlung geeignet. Das Volumen

der Maische wird auf 400 1 und der pH-Wert auf 5,5 mit 6n-Salzsäure eingestellt.

Dann bringt man 1,11 einer wäßrigen Lösung von pH 5,5, die 215 g L-Ascorbinsäure enthält, ein und hält die Maische 2 Stunden bei 30⁰C unter Rühren mittels einer :nit 180 U/Min, betriebenen Turbine und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 20 m³/Std. 2 Stunden bei 3O⁰C.

Man bringt in die Maische erneut 1,11 einer wäßrigen Lösung von pH 5,5, die 215 g L-Ascorbinsäure enthält, und dann 1,720 kg L-Tyrosin in Form von zwei wäßrigen Lösungen ein, von denen die eine eine 6,15 %ige Lösung in ln-Natronlauge und die andere eine 6,15 %ige Lösung in ln-Salzsäure ist. Man nimmt noch drei aufeinanderfolgende Zugaben von 1,11 einer wäßrigen Lösung von pH 5,5 mit einem Gehalt von 215 g L-Ascorbinsäure in Abständen von 1 Stunde vor. Die Kultur wird nach Beendigung dieser Zugaben 7 Stunden fortgesetzt, wobei der pH-Wert bei 5,5 gehalten wird. Das Endvolumen der Maische beträgt 4301. Die Menge an L-DOPA macht dann 3,55 g/l aus.

Beispiel 4

Eine Kultur von Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378 wird unter den Bedingungen von Beispiel 3 hergestellt. Nach 20 Stunden ist die Kultur zur Durchführung der Umwandlung geeignet. Das Volumen der Maische wird auf 400 1 eingestellt und der pH-Wert bei 6,6 gehalten.

Man bringt dann 2,2 1 einer wäßrigen Lösung von pH 6,5 mit einem Gehalt von 400 g L-Ascorbinsäure ein und hält die Maische unter Rühren mittels einet mit 180 U/Min, betriebenen Turbine und unter Belüftung mit steriler Luft mit einem Durchsatz von

ίο 20 m³/Std. während 2 Stunden bei 30⁰C.

Man bringt in die Maische noch 2,2 1 einer wäßrigen Lösung von pH 6,5 mit einem Gehalt von 400 g L-Ascorbinsäure und dann 1,720 kg L-Tyrosin in Form von zwei wäßrigen Lösungen ein, von denen die

is eine eine 6,15 %ige Lösung in ln-Natronlauge und die andere eine 6,15%ige Lösung in ln-Salzsäure ist.

Man nimmt anschließend aufeinanderfolgend ic einem Abstand von 1 Stunde zwei Zugaben von 1,11 einer wäßrigen Lösung von pH 6,5, von denen jedt

ao 200 g L-Ascorbinsäure enthält, und eine Zugabe vor 2,2 1 einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt vor 400 g L-Ascorbinsäure vor. Die Züchtung wird nact der letzten Zugabe noch 7 Stunden fortgesetzt, wöbe der pH-Wert der Bouillon bei 6,6 gehalten wird.

»5 Das Endvolumen der Maische beträgt 430 Liter Die Menge an vorhandenem L-DOPA beträgt 2,79 g/l

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-/?-(3,4-DihydroxyphenyO-Ä-alanin (L-DOPA) durch mikrobiologische Hydroxylierung von L-Tyrosin, d adurch gekennzeichnet, daß man Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378 oder einen seiner Mutanten in einem belüfteten Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur zwischen 22 und 37° C in Anwesenheit von Tyrosin züchtet und dann das gebildete L-DOPA in an sich bekannter Weise extrahiert und reinigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung des Vibrio tyrosinaticus in eine Wachstumsphase bei pH 6,0 bis 7,8 und dann eine Umwandlungsphase des Tyrosins bei pH 4,0 bis 7,0 unterteilt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Tyrosin in Form einer sauren und einer basischen Lösung zugibt.

4. Verfahren zur Herstellung von L-DOPA nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß während der Umwandlungsphase des Tyrosins Glucose zugegeben wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß während der Umwandlungsphase des Tyrosins L-Ascorbinsäure zugegeben wird.

6. Verfahren zur Herstellung von L-DOPA nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß im Verlaufe der Umwandlungsphase des Tyrosins ein Antioxydans zugegeben wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß während der Umwandlungsphase des Tyrosins Kupfersalze zugegeben werden.

(nach Blockierung det Aminfunktion mit verschiedenen Gruppen) mit Hilfe verschiedener Mikroorganismen, darunter Gliocladium deliquescens, beschrieben.

Es wurde nun gefunden, daß Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378 befähigt ist, in Submerskiiltur beträchtliche Mengen an L-Tyrosin mit erhöhter Ausbeute in L-DOPA überzuführen. Man kann so eine wirtschaftliche Produktion dieser Substanz erreichen.
Bei der Durchführung des Verfahrens ist es nicht

ίο erforderlich, die Mikroorganismen abzutrennen, um daraus die enzymatischen Systeme zu extrahieren, was im allgemeinen in großem Maßstab schwer durchführbar ist.
Die Umwandlung von L-Tyrosin in L-DOPA durch Vibrio tyrosinaticus erfolgt bei verschiedenen pH-Werten. Man erhält üblicherweise die höchsten Umwandlungsausbeuten bei pH-Werten von 4,0 bis 7,0 und vorzugsweise bei einem pH-Weit in der Nähe von 5,5. Da das pH-Optimum für die Umwandlung mit einer guten Entwicklung des Mikroorganismus nicht vereinbar ist, ist es bevorzugt, daß die Kultur in zwei Stufen erfolgt. In der ersten Stufe läßt man Vibrio tyrosinaticus" ATCC 19 378 sich in einem geeigneten Nährmedium, dessen pH-Wert über 6,0 liegt, entwickeln. In der zweiten Stufe erfolgt die Zugabe und die Umwandlung des Tyrosins, gegebenenfalls nach Korrektion des pH-Werts der Kultur, damit sich diese in dem günstigsten Gebiet befindet.

Die Züchtung von Vibrio tyrosinaticus ATCC 19 378 kann nach jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Submerszüchtungsmethode erfolgen, doch ist diese letzteie aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden.

Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen: