DE1914527C - N hoch I-(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-O-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-D-glucopyranosyl)-5-O-D-xylofuranosyl-2-deoxystreptamin, N hochl -(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-O-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-Dglucopyranosyl)5-OD-ribofuranosyl-2deoxystreptamin, deren Gemische und Säureadditionssalze - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf N'-(4-Amino-2-hydroxybutyryI)-4-O-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-D-gJucopyranosyl) - 5 - O - τ» - xylof uranosyl - 2-deoxystreptamin, N'-(4-amino-2-hydroxYbutyr>l)-4-O-(.2,6-diamino^o-dideoxy-D-glucopyranosyl^S-O-n-ribofuranosyl-2-deoxystreptamin, deren Gemische und Säureadditionssalze, besonders die Sulfate. Die bisher nicht besehtiebenen Verbindungen werden als Ambutyrosin A und Ambutyrosin B bezeichnet, deren .emische einfach als Ambutyrosin.

Ambutyrosin wild normalerweise in Form der freien Base hergestellt. Ambutyrosin kann als solches isoliert, identifiziert, charakterisiert und verwendet werden, es kam jedoch auch in einzelne Bestandteile, das Ambutyrosin A und das Ambutyrosin B, aufgeteilt werden, und jeder diesel Bestandteile kann isoliert, identifiziert, chanl "erisiert und für sich allein verwendet werden. Außerdem können Ambutyrosin, Ambutyrosin A und Ambutyrosin B entweder in Form der freien Basen oder in Fotm ihrei Säureadditionssalze isoliert, identifiziert, charakterisiert und verwendet werden. Wenn nicht andeis angegeben, bezieht sich nachstehend der Ausdruck »Ambutyrosin« auf ein Gemisch aus Ambutyrosin A und Ambutyrosin B oder auch auf einen von diesen beiden Stoffen, falls eine Unterscheidung zwischen ihnen bedeutungslos ist. Das Ambutyrosin, wie es normalerweise erfindungsgemäß aus Fermentationsbriihen gewonnen wird, enthält einen Hauptanteil an Ambutyrosin A und einen getingeren Anteil (bis zu 10 bis 15°/₀) an Ambutyrosin B.

Ambutyiosin A, Ambutyrosin B und Gemische daraus sind stabile, weiße, feste Basen, die in Wasser sehr leicht, in Methanol mäßig und in Äthanol wenig löslich sind. Die freien Basen bilden Säuresalze mit einer Vielzahl von organischen und anorganischen Säuren, wie Essig- und Propionsäure, Malein- und Äpfelsäure, Zitronensäure, Glukonsäuie, Chlorwasserstoff- und Bromwassetstoffsäure, Phosphorsäuie und Schwefelsäure. Jede der freien Basen hat vier primäre Aminogruppen, die sämtliche Säureadditionssatze bilden können. Ist die Säure in geringerer Menge vorhanden, so bleiben einige der Aminogruppen in freier basischer Form.

Ambutyrosin A schmilzt unter Zersetzung innerhalb eines weiten Bereiches, der bei etwa 149⁰C beginnt, in einem zugeschmolzenen Kapillarröhrchen. Es hat pK'a-Werte von 5,6,7,3,8,7 und 9,8. Es hat ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum in Kaliumbromid mit Absorptionsmaxima bei 700, 1028, 1090, 1340,1390,1457,1498,1550 bis 1610,1652, 2938, 3040 und 3410 cm"¹. Zwischen 220 und 3t0 Millimikron zeigt es keine Ultraviolett-Absorptionsmaxima. Die spezifische Rotation ist [«]£ = +26° (1,46% in Wasser).

Ambutyrosin B kann erhalten werden in Form einer Substanz, welche die Analysenwerte eines Dihydrates zeigt und im zugeschmolzenen Kapillarröhrchen innerhalb eines weiten Bereiches schmilzt, der bei etwa 146° beginnt. Es hat pK'a-Werte von 5,3, 7,1, 8,6 und 9,8. Es hat im Kaliumbromid ein Infrarot-Absorptionsspektrum mit Absoiptionsmaxima bei 700,1026,1100, 1345, 1390, 1458, 1497, 1549, 1580, 1650, 2938, 3040, 3315 und 3370 cm¹. Zwischen 220 und 360 Millimikron

ίο zeigt es keine Ultraviolett-Absorptionsrnaxima. Die spezifische Rotation ist [«]? = +33^C (1,5% in Wasser).

Dank ihrer funktionellen Gruppen bilden sowohl Ambutyrosin A wie Ambutyrosin B eine große Anzahl

wichtiger und charakteristischer chemischer Derivate, wie die Tetra-N-acetylderivate und die T<".ia-N-me~ thansulfonatderivate. Tetra-N-acetylambutyrosin A hai eine spezifische Rotation [*]? = +25" (2,11% in Wasser). Tetra-N-acetylambutyrosin B hat eine spezifi sehe Rotation [x]? = +33° (1,34% in Wasser).

Säurehydrolyse von Ambutyrosin A unter relativ milden Bedingungen, z. B. mit 0,4 n-Chlorwasserstoff·· säure bei 65° C, ergibt D-Xylose. Säurehydrolyse von Ambutyrosin B unter den gleichen milden Bedingungen

»5 führt nicht zu D-Xylose, sondern zu D-Ribose.

Ambutyrosin A ist N»-(4-Amino-2-hydroxybutyryl>· 4-0-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-D-glucopyranosyl)-5-0· D-xyIofuranosyl-2-deoxystreptamin und besitzt folgende Strukturformel:

CH₁NH,

HO

CH.NHj ι	O
i Q 1
I H	H
OH ι	ι/
I c	I NH,
I H

:ch—o

Eine heftigere Säurehydrolyse von sowohl Ambutyrosin A wie Ambutyrosin B, z. B. mit 6 n-Chlorwasser- :toffsäure bei Rückflußlemperatur innerhalb 6 Stunden, führt zu Neamin, Deoxystreptamin, Neosamin C und t-Hydroxy-y-aminobuttersäure. Dieoi-Hydroxy-y-aminobuttersäure ist eine kristalline Substanz vom Fp. 212,5 bis 214,5°C; spezifische Rotation f x]$ = —28,2° (l,22^e/o in Wasser).

An Ambutyrosin A und Ambutyrosin B wurden weitere umfangreiche Strukturbestimmungen durchgeführt. In Form der freien Base, wasserfrei, haben beide die empirische Formel C_nH₄₁NsO₁₂.

Ambutyrosin B ist N*-(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-D-gIucopyranosyl)-5-0-D-ribofuranosyl-2-deoxystreptamin und weist folgende Strukturformel auf:

35

H-C

CH₂OH

Ambutyrosin A und Ambutyrosin B sind demnach Isomeie, die sich in der Konfiguration an einem einzigen Kohlenstoffatom in der Pentosehälfte unterscheiden.

Ambutyrosin und seine Bestandteile, Ambutyrosin A und Ambutyrosin B, haben gleiche antibakterielle ,60 Wirkungsspektren, wie dies in der folgenden Tabelle I an dem antibakteriellen Spektrum von Ambutyrosinsulfat gezeigt werden kann. In der Tabelle ist das antibakterielle Spektrum von Ambutyrosinsulfat ausgedrückt in Werten der Mindesthemmkonzentration, gemessen als Mikrogramm an freiem Basenäquivalent je Milliliter Medium, gegen die verschiedensten für Menschen pathogenen Bakterienarten. Die Werte wurden gewonnen mit Hilfe der üblicherweise anzutreffenden Stämme der betreffenden Organismen. Wenn für einen Organismus mehr als ein Stamm angegeben ist, ist der Bereich der Mindesthemmkonzentrationen zu dem Zweck wiedergegeben, die beobachteten Unterschiede bei verschiedenen Stämmen der gleichen Species zu zeigen.

Tabelle I

Antibakterielles Spektrum von Ambutyrosinsulfat in vitro

Mikroorganismus

Aerobacter aerogenes

Diplococcus pneumoniae

Escherichia coli

Klebsieila pneumoniae ..

Mycobacterium tuberculosis

Proteus vulgaris

Pseudomonas aeruginosa
*⁵ Salmonella enteritidis ...

Salmonealla typhimurium

Shigella flexneri

Shigella sonnei

Staphylococcus a ureus ..
Streptococcus faecalis ..

Streptococcus pyogenes..

Anzahl

der Stämme

1
1

25
3
2
5
5

14
1
3

Mindesthemm-

konzentration

Mikrogramm Base je Milliliter

0,8 bi* 6,3 3,t bis > 100 1,6 bis 50,0 1.6

1,6 6,3

4.5 bis 35,5 12.5 bis 50,0 12,5 bis 50,0 12,5

3.1 bis 12,5

1.6 bis 100

> 100 6,3 bis 12,5

Die antibakterielle Wirksamkeit von Ambutyrosinsulfat wurde außerdem demonstriert an experimentellen akuten Infektionen bei Mäusen. Subkutane Einzeldosen von etwa 2 bis 10 mg Basenäquivalent/kg Körpergewicht sind wirksam ge^en Infektionen mit Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris und Staphylococcus aureus.

Die mittlere Einzeldosis von Ambutyrosin, subkutan verabreicht als Sulfat, die für die Hälfte der Mäuse in einer Gruppe letal ist (LD₅₀-WeH), wurde zu 3050 mg Base/kg Körpergewicht bestimmt; bei intraperiionealer Applikation beträgt sie 281 mg/kg, bei intravenöser 487 mg/kg.

Gegenüber bekannten bakterizid wirksamen Substanzen zeichnet sich das erfindungsgemäße Ambutyrosin durch eine besonders geringe Toxizität und eine sehr hohe Wirksamkeit aus.

Die Mindesthemmkonzentration der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in ln-vitro-Versuchen gegenüber fünfzig frischen klinischen lsolaten von Pseudomonas aeruginosa bestimmt und mit derjenigen von o-i-x-Carboxy-phenacetyO-penicillansäure (»Carbenicillin«), einem halbsynthetischen Penicillin und derjenigen von Tetracyclin verglichen. Man erhielt dabei die folgenden Ergebnisse.

Ambutyrosin .
«Carbenicillin«
Tetracyclin ...

Mindesthemmkonzentration

1 geometrisches Grenzwerte Mittel

(mg/kg) (mg/kg)

2,20 bis 35,5 j

4,89 bis 310 ,

> 125 I

8,89 46,6

Für die LD_&0 wurden bei Mäusen die folgenden Werte gefunden:

Ambutyrosin*)

Neomycin

Circulin

Intravenös (mg/kg)

460

15 bis 53
10 bis 23

Subkutan (mg/kg)

2890

265 bis 353
77 bis 82

*) Ein Gemisch aus einem Hauptanteil Ambutyrosin A und einem kleineren Anteil Ambutyrosin B.

Das Fradiomycin ist dem Neomycin verwandt und besitzt eine ähnliche Toxizität.

Aus den oben angegebenen Werten geht r.irvor, daß das erfindungsgemäße Ambutyrosin etwa fünfmal so wirksam ist wie 6-(\-Carboxy-phenacetyI)-penicillansäure und mehr als zehnmal so wirk· 3m wie Tetracyclin. Die Toxizität der erfindungsgemäßen Verbin- ao düngen ist dagegen um mehr als den Faktor 10 geringer als diejenige der bekannten bakteriziden Mittel.

Ambutyrosin und seine Säureadditionssalze können erfindungsgemäß dadurch hergestellt werden, daß man einen Ambutyrosin produzierenden Stamm des Orga- as nismus Barillus circulans unter künstlichen Bedingungen züchtet.

Wenn hier von einem »Ambutyrosin produzierenden Stamm von Bacillus circulans« gesprochen wird, »o ist damit ein Stamm von Bacillus circulans gemeint, det, wenn er, wie beschrieben, unter künstlichen Bedingungen gezüchtet wird, eine Fermentationsbrühe ergibt, aus welcher Ambutyiosin oder eines seiner Säureadditionssalze durch die beschriebenen Arbeitsgänge erhalten werden kann.

Ein für Zwecke der Erfindung geeigneter Stamm von Bacillus circulans vurde erhalten aus einer Bodenprobe, die in der Nähe von Melspruit, Ost-Transvaal, Südafrika, gesammelt wurde. Subkulturen dieses Stammes wurden bei dem United States Department of Agriculture, Northern Utilization Reseatch and Development Division, Peoria, Illinois, hinterlegt und werden in ib-er permanenten Kulturkollektion unter den Identifikationsnummern NRRL B-3312 und NRRL B-3313 gehalten. Die Nummer NRR.- B-3312 entspricht dem u^r .prünglichen Isolat; die Nummer NRRL B-3313 entspricht einer Einzelkolonie-Auswahl Die beiden deponierten Subkulturen sind in ihren morphologischen und physiologischen Eigenschaften im wesentlichen äquivalent. Die Ausdrücke »Bacillu^r 5c circulans NRRL B-3312« und »Bacillus circulans NRRL B-33J3« beziehen sich auf einen Stamm von Bacillus circulans mit den oben beschriebenen Eigenschaften.

Die Identifikation wurde an NRRL B-3313 gemäß »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Ausgabe (1957), durchgeführt. Die zur Identifikation des Organismus benutzten Medien und Methoden sind beschrieben in Smith, Gordon und Clark, »Aerobic Sporeforming Bacteria«, Agricultural Monograph 16, US. Department of Agriculture (1952), und Society of American Bacteriologists, Manual of Microbiological Methods (1957).

Der Oiganismus ist ein aerobes, gramvariables, frei bewegliches Stäbchen (0,3- bis 0,9mal 1,1 bis4,7 μ); er gedeiht auf Fleischextrakt oder anderen komplexen organischen Medien und bildet Endosporen. Er gehört daher zur Gattung Bacillus. Seine Sporangien sind deutlich angeschwollen. Seir Sporen sind elliptisch, selten zylindrisch, zentral bis terr inal, und die Sporenwand ist dick und leicht gefleckt. Er ist gramvariabel. Gemäß der Aufschlüsselung der Species des Genus Bacillus (Bergey's Manual, S. 613 bis 615) gehört daher der Organismus unter die Arten in Ziffer II (S. 615). Er produziert aus Kohlehydraten kein Gas, ist saprophytisch, wächst auf gewöhnlichen Medien, hydrolysiert Stärke, produziert kein Indol oder Acetylmethylcarbinol und vermehrt sich nicnt bei 65"C. Er gehört daher unter B., 1., a., bb., cc. Lediglich eine Species, B. circulans, besitzt diese Eigenschaften. Bei den unten in Tabelle!! aufgeführten Versuchen unterscheidet sich der Organismus nicht wesentlich von B. circulans, Jordan, 1890, emend. Ford, 1916, wie beschrieben in Bergey's Manual, S. 628 und 629. Der Organismus ist daher als ein Stamm der Species B. circulans anzusehen.

Gemäß Vergleichsstudien unterscheidet sich B. circulans NRRL B-3313 in verschiedener Hinsicht von dem American Type Culture Collection^ATCC-) Stamm 4513 (vorgeschlagener Neotyp, N. R. S m i t h u. a., »Type cultures and proposed neotype cultures of some species in the genus Bacillus«, J. Gen. Microbiol., j4, S. 269 bis 272, 1964). Diffeienzen bestehen unter anderem in der Größe der vegetativen Zellen und Sporen, der Dicke der Sporenwand, der Vermehrungsfähigkeit bei 45"C, den Wachstumseigenschaften auf Nähragar, der Hydrolyse von Gelatine und Casein, der Verwertung von Citrat, der Reoxydation von Methylenblau und der Fermentation von i.-Arabinose, Inulin, Lactose i'nd n-Xylose.

Die Eigenschaften von NRRL B-3313 und ein Vergleich mit ATCC-4513 sind in Tabelle II dargestellt.

Tabellen Eigenschaften vom Bacillus circulans NRRL B-3313 im Vergleich mit ATCC 4513

Eigenschaften auf dem
betreffenden Medium

NRRL B-3313 ATCC-4513

Aussehen

Bacto-Nähragar, 24 Stunden
Wachstum bei 28°C; Huckers
Modifikation von Gramfärbung
Bacto-Peptor Eisen-Agar und
0,1% Bacto-Hefccxtrakt,
Wachstum bei 28' C; Conklins

gramvariabel, gewöhnlich einzelne Stäbchen mit gerundeten oder sp'tzen Enden, 0,3-bis0,9mal 1,1 bis4,7 μ gute Sporulation bei 2 Tagen; Sporangien ausgebeult und keulenförmig; Sporen ellipsoid, gelegentlich nierenförmig, terminal und subterminal; Sporenwand dick; Sporen 0,6- bis l,3mal 1,1 bis 2,3 μ

gramvariabel, gewöhnlich einzelne
Stäbchen mit abgerundeten Enden, 0,3- bis l.Omal 2,0 bis 6,5 μ
gute Sporulation bei 5 Tagen; Sporangien ausgebeult und keulenförmig; Sporen ellipsoid, gelegentlich
sphärisch, gewöhnlich terminal;
Sporenwand dünn; Sporen 0,4- bis 1,1 mal 0,8 bis 1,5 μ

Eigenschaften auf dem betreffenden Medium	NRRLB-3313	Gas	ATCC-4S1J	Gas
Beweglichkeit
Bacto-Nährbrühe, 24 Stunden	frei beweglich		frei beweglich
Wachstum bei 28°C
Wachstumstemperatur auf Bacto-		—		—
Nähragar		—		—
28CC	positiv	—	positiv	—
37°C	positiv	—	positiv	—
45" C	negativ	—	positiv	—
65PC	negativ	—	negativ	—
Wachstumseigenschaften in Brühe		—		—
Oberfläche	keine	—	keine	—
unter der Oberfläche	trübe	—	trübe	—
. Menge	mäßig	—	mäßig	—
Sediment	weiß-flockig	—	weiß-flockig	—
Kolonie-Eigenschaften auf Bacto- KlSUnnnni·		—		—
Nähragar Form	kreisförmig, wenige punktförmig	—	unregelmäßig, wenige kreisförmig	—
Erhebung	konvex	—	flach	—
Rand	ganz	—	wellenförmig bis zackig	—
Oberfläche	glatt	glatt
Dichte	durchsichtig	durchsichtig
Konsistenz	zäh bis butterförmig	butterförmig
Faibe	farblos bis weißlich	farblos bis weißlich, leicht schillernd
Gelatine-Hydrolyse auf Bacto-	35- bis 37-mm-Zone in 7 Tagen	1- bis 2-mm-2one in 7 Tagen
Nähragar + 0,4% Bacto-Gelatine
Bacto-Gelatine Stich	Verflüssigung in 5 Tagen	keine Verflüssigung in 5 und 13 Tagen
Casein-Hydrolyse	negativ in 7 Tagen, positiv in 13 Tagen	negativ in 6 und 13 Tagen
Indolproduktion	negativ in 5 und 13 Tagen	negativ in 5 und 13 Tagen
Reduktion von Nitrat zu Nitrit	negativ in 5 und 13 Tagen	negativ in 5 und 13 Tagen
Acetylmethylcarbinolproduktion	negativ in 2, 6 und 13 Tagen;	negativ in 2, 6 und 13 Tagen;
	pH-Wert der Brühe in 6 Tagen 5,8	pH-Wert der Brühe in 6 Tagen 5,8
Stärkehydrolyse	positiv in 6 Tagen, 1- bis 2-mm-	positiv in 6 Tagen, 4- bis 5-mm-
	Zone	Zone
Citratverwertung	negativ in 6 Tagen, positiv in 13 Tagen	negativ in 6 und 13 Tagen
Methylenblaureduktion	positiv in 2, 5 und 13 Tagen	positiv in 2 Tagen, reoxydiert in 5 Tagen
	Säure	Säure
Fermentation (28°C)
Ammoniumsalze
Agar
t-Arabinose	—	+
Dextrin	+	+
D-Fructose	+	+
D-Galactose	+	+
D-Glucose	+	+
Glycenn	+	+
Inulin	—	+
Lactose	—	+
Maltose	+	+
D-Mannit	+	+
D-Mannose	+	+
Raffinose	+	+
Salicin	±	+
Sucrose	+	+
D-Xylose	—	+

Eigenschaften auf dem betreffenden Medium

NRRL B-3313 Säure I Gas

ATCC-4513 Säure I Gas

Bacto-Phenolrolbrühe

i.-Arabinose

n-Glucose**)

*>-Mannit

Sucrose

♦*) pH nach 6 Tagen

5,3

Gewisse in Tabelle U erwähnte Medien haben die unten angegebene Zusammensetzung. Es ist auch zweckmäßig, Medien von gleicher Zusammensetzung tu verwenden.

Bacto-Nähragar enthält 3 g Rindfleischextrakt, 5 g Pepton und 15 g Agar, gelöst in 1000 ml destilliertem Wasser.

Bacto-Pepton-Hisen-Agar enthält 15 g Pepton, 5 g Proteosepepton, 0,5 g Ferriammoniumcitrat, 1 g Dikaliumphosphat, 0,08 g Natriumthiosulfat und 15 g Agar, gelöst in 1000 ml destilliertem Wasser.

Bacto-Hefeextrakt ist der wasserlösliche Teil von autolysierter Hefe und enthält die natürlich vorkommenden Vitamine des Vitamin-B-Komplexes.

Bacto-Nährbrühe enthält 3 g Rindfleischextrakt und 5 g Pepton, gelöst in 1000 ml destilliertem Wasser.

Bacto-Gelatine ist eine erstklassige Gelatine in granu'ierter Form.

Bacto-Phenolrot-Brühe, Base, enthält 1 g RindfleisihcÄiiäki, 10 g Piotccscpcpicn, 5 g Natriumchlorid und 0,018 g Phenolrot, gelöst in 1000 ml destilliertem Wasser.

Ambutyrosin und seine Säureadditionssalze werden durch Beimpfen eines wäßrigen Nährmediums, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, mit einem Ambutyrosin produzierenden Stamm des Organismus Bacillus circulans und Bebrüten des Impf mediums bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 40" C unter aeroben Bedingungen hergestellt. Gemäß der üblichen Arbeitsmethode wird das wäßrige Nährmedium vor dem Beimpfen sterilisiert, und das Bebrüten des beimpften Mediums erfolgt unter aseptischen, aeroben Bedingungen, bis sich im Fermentationsgemisch eine wesentlich antibakterielle Wirksamkeit entwickelt hat, worauf das Ambutyrosin in Form der freien Base oder des Säuresalzes durch weitere Behandlung des Fermentationsgemisches isoliert wird. Die bevorzugten Bedingungen zur Durchführung der Fermentation sind eine Temperatur zwischen 28 und 32° C und ein pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0, insbesondere von etwa 7,5.

Impfmaterial zur Herstellung von Ambutyrosin durch Kultivierung eines geeigneten Stammes von Bacillus circulans kann «halten werden, indem man das Oberflächenwachstum von Schrägkulturen eines Nähragarmediums anwendet. Beim Bebrüten zwischen etwa 25 und 32° C vermehrt sich der Organismus und produziert in 1 bis 2 Tagen ein zusammenhängendes Wachstum. Ein Bebrüten über 2 Tage oder 'anger ist notwendig, um eine Kultur mit voll ausgebildeten Sporen zu erhalten, was für Zwecke der Erfindung wünschenswert, wenn auch nicht notwendig ist. Im allgemeinen werden Kulturen mit Sporen verwendet, um ein belüftetes und gerührtes flüssiges Nährmedium zu beimpfen, das in einem geeigneten Gefäß, z. B. einem geschüttelten Kolben oder einem gerührten und belüfteten Fermenter, enthalten ist. Man läßt den Mikroorganismus keimen und sich 24 bis 48 Stunden bei 20 bis 40" C, vorzugsweise 26 bis 32°C, vermehren.

Diese Vorkultur wird dann zum Beimpfen der Produk-

tionsfermenter oder anderer Vor- oder Zwischenfermenter verwendet.

Wie bereits bemerkt, sind geeignete wäßrige Nähr-

ao medien diejenigen, die assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zur Verfügung stellen. Kohlenstoffquellen, die assimilierbar und für die Verwendung geeignet sind, sind unter anderem reine Kohlehydrate und mehrwertige Alkohole, die durch den Organismus verwertet

werden können, ebenso wie handelsübliche Kohlehydratgemische. Einige Beispiele für Stoffe, die für diesen Zweck geeignet sind, sind Stärken, Maisschrot, Zucker und Glycerin. Die im Nährmedium anwesende Menge von Kohlehydrat bzw. mehrwertigem Alkohol

ist nicht ausschlaggebend und liegt gewöhnlich /wischen etwa 0,5 und 5% des Gewichtes des Mediums. Etwas außerhalb dieses Bereiches liegende Menge:; können ebenfalls verwendet werden.

Die Stickstoffquellen im Nährmedium können von organischer oder gemischt organischer-anorganischcr Natur sein. Einige Beispiele aus der großen Reihe von stickstoffhaltigen Substanzen, die verwendet werden können, sind Casein, Sojabohnenmehl, Erdnußmeh!, Baumwollsamenmehl, Weizenkleber, Gersten- oder

Haferabfälle, Lactalbumin, enzymatische Aufberci tungsprodukte von Casein, Trypton, Fleischpeptor., Ammoniumchlorid und Ammoniumsulfat. Da viele der leicht verfügbaren Stick stoffquellen Rohstoffe sinO, schwankt die Menge, die dem Medium zugefügt wer-

den muß, mit der Reinheit, so daß man nicht ohm. weiteres die genaue Menge an stickstoffhaltigen Stoffen festlegen kann, die dem Medium zugesetzt werden sollen. Es läßt sich höchstens sagen, daß die Stoffe, die den Stickstoff bereitstellen, im allgemeinen

nicht 5 bis 6 Gewichtsprozent des gesamten Ferment«- tionsmediums überschreiten und in den meisten Fällen in geringerer Menge anwesend sind.

Die Anwesenheit von wachstumsfördernden Faktoren im Fermentationsmedium ist ebenfalls wünschens-

SS wert. Einige diese Faktoren sind bereits in den üblichen Rohstoffen, die den Stickstoff liefern, vorhanden und müssen nicht eigens zugesetzt werden. Man kann dem Fermentationsgemisch jedoch auch geringe Mengen derartiger Stoffe zusetzen, wie z. B. Rückstände aus

der Branntweinbereitung, Hefe, Hefeautolysat, Hefeextrakt und Rückstände aus der Melassefermentation: oder man setzt anorganische Salze tu, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat, oder auch Salze von Spurenmetallen, wie Zink, Kupfer,

Mangan, Eisen oder Kobalt.

Das wie oben bereitete Nährmedium wird gegebenenfalls auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 8,0, vorzugsweise auf einen pH-Wert von etwa 7,5, einge-

11 12

stellt. Ein Puffer, wie Calciumcarbonat, kann ebenfalls arbeitet mit der Adsorption an einem starken Anzugegeben werden, um den pH-Wert innerhalb der ionenaustauscherharz in Boratform und selektiver

gewünschten Grenzen zu halten, wenn die Fermenta- Eluierung der Komponenten. Vermutlich tritt die

tion fortschreitet. Falls nötig, kann auch ein Anti- Trennung durch selektive Eluierung auf, da Ambutyro-

schaummittel zugesetzt werden. 5 sin B im Riboseteil benachbarte cis-ständige Hydroxyl-

Die Züchtung des Ambutyrosin produzierenden gruppen aufweist und einen Boratkomplex bildet, Stammes von Bacillus circulans im wäßrigen Nähr- während Ambutyrosin A im Xyloseteil keine benachmedium kann auf verschiedenste Weise durchgeführt barte cis-ständige Hydroxylgruppe aufweist und keinen werden. So kann z. B. der Organismus unter aeroben ßoratkomplex bildet. Wenn das Ambutyrosin an dem Bedingungen an der Oberfläche des Mediums gezüch- io starken Aniorfenaustauscherharz in Boratform adsortet werden, oder er kann unterhalb der Mediumsober- biert ist, wird zuerst die Ambutyrosinkomponente A fläche, d. h. als Submerskultur, gezüchtet werden, vor- durch Eluieren mit Wasser entfernt, worauf die Ambuausgesetzt, daß für eine adäquate Sauerstoffzufuhr ge- tyrosinkomponente B durch Eluieren mit 5°/_oiger Borsorgt wird. säurelösung ausgezogen wird. Beide Komponenten

Die bevorzugte Methode zur Erzeugung von Am- 15 können durch Adsorption an einem Carbonsäureharz

butyrosin und dessen Säureadditionssalzen gemäß der in Ammoniumform und Eluieren mit 1 molarem Am-

vorliegenden Erfindung besteht in der Fermentation moniumhydroxid weitergereinigt werden. Bo.tück-

eines Ambutyrosin produzierenden Stammes von stände in dem Produkt können mit Hilfe eines bor-

Bacillus circulans in einer Submers- oder Tiefkultur, spezifischen Anionenaustauscherharzes entfernt wer-

wobei man als Impfmaterial eine vermehrungsfähige, ao den.

24 bis 48 Stunden alte, belüftete und gerührte Brühen- Gemäß einem anderen Verfahren zum Auftrennen kultur des Organismus verwendet. Nach diesem Vet- von Ambutyrosin in seine Komponenten wird das fahren wird ein steriles wäßriges Nährmedium mit dem Ambutyrosingemisch in die Tetra-N-acetylderivate Organismus beimpft und unter Rühren und Luftzufuhr übergeführt und diese dann der Trennchromatographie bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 40⁰C, as auf Diatomeenerde unterworfen, wobei ein System, vorzugsweise in der Nachbarschaft von 28 bis 32" C, wie 1-Butanol, Wasser, Pyridin (10:10:3) oder so lange bebrütet, bis das Ambutyrosin in hoher Kon- 1-Butanol, 5%ige Borsäure, Pyridin (10: 10: 3), verzentralion in der Kulturflüssigkeit anwesend ist. Die wendet wird. Gemische aus den beiden Komponenten Länge der für maximale Ausbeuten benötigten Zeit können getrennt und die Komponenten leicht voneinhängt von der Größe und dem Typ dei verwendeten 3° ander unterschieden werden durch Anwendung von Einrichtung, von der Rühr- und Belühungsgcschsvir.- Papierrhormatographie auf die Tetta-N-acetylderivate digkeit und anderen Faktoren ab. Bei großtechnischen unter Verwendung von 1-Butanol, Pyridin, 5°/_oiger Fermentationen, die in Fermentern vom Tanktyp Borsäure (6: 4: 3); R( Tetra-N-acetylambutyrosin A, durchgeführt werden, wird eine maximale Produktion 0,30 bis 0,38; Rf Tetra-N-acetylambutyrosin B, 0,16 gewöhnlich in etwa 3 bis 6 Tagen erreicht. 35 bis 0,20. Die Tetra-N-acetylderivate können auf Papier

Die in der Brühe nach der Fermentationsperiode festgestellt werden durch Anwendung einer Modinkaoder zu irgendeiner Zeit während dieser Periode an- tion der allgemeinen Methode von Pan und Dutwesende Menge an Ambutyrosin kann durch Bio- eher, Analytical Chemistry, 28, S. 836 (1956), bei versuch bestimmt werden. Die antibakterielle Wirk- welcher an Stelle von Natriumhypochlorit Chlorgas samkeit (die von Ambutyrosingehalt abhängt) der 40 verwendet wird. Zwecks Herstellung der für das obige Buhe wird bestimmt durch Messen der Hemmwirkung Verfahren nötigen Tetra-N-acetylderivate werden 7,7 g auf die Vermehrung des Mikroorganismus Escherichia Ambutyrosin in 150 ml Essigsäureanhydrid und 430 ml cnli (bzw. eines anderen geeigneten Organismus) auf Methanol gelöst. Die Lösung wird 48 Stunden bei einer Testplatte und Vergleichen des Resultates mit der 25°C gehalten und das Reaktionsgemisch dann in 3 1 Hemmung, die durch eine entnrechende Verdünnung 45 Diäthyläther eingegossen. Es scheiden sich die Tetrader betreffenden Probe von gereinigtem Ambutyrosin, N-acetylderivate ab, die abfiltriert und getrocknet werdie auf eine noch zu beschreibende Art erhalten wurde, den. Die Tetra-N-acetylderivate der beiden Kompobewirkt wird. nenten können in einem einzigen Arbeitsgang herge-

Nach Abschluß der Fermentationsperiode kann stellt werden.

Ambutyrosin bzw. eines seiner Säureadditionssalzc aus 5° Ambutyrosin und seine Komponenten können durch

der Brfihe aiii noch zu beschreibende Art erhalten wer- Umsetzen mit einer gioßen Anzahl Säuren, wie Essig-

den und kann dann einer weiteren Reinigung im ge- säure, Propionsäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Zitro-

wünschten Umfang unterworfen werden, einschließlich nensäure, Gluconsäure, Chlor- oder Bromwasserstoff-

der Trennung in die Komponenten Ambutyrosin A säure, Phosphorsäure, Schwefelsäure usw., in pharma-

und Ambutyrosin B. ⁵⁵ zeutisch brauchbare Säureadditionssalze übergeführt

Die Gewinnung des Ambutyrosins kann auf ver- werden.

schiedene Weise erfolgen. So kann beispielsweise die Ambutyrosin, seine einzelnen Komponenten und die

Brühe mit einem Carbonsäureharz in Ammoniumform entsprechenden Säuresalze sind antibakterielle Mittel,

behandelt werden, um das Ambutyrosin an das Harz die ein weites Spektrum an an»^:bakterieller Wirksam-

zu adsorbieren. Aus dem Harz kann das Ambutyrosin 60 keit aufweisen. Eine besonders überraschende Eigen-

durch Eluieren mit einer Base, wie 1 molares schaft dieser Substanzen ist ihre relativ hohe Aktivität

Ammoniumhydroxid, gewonnen werden. Zwecks gegen Pseudomonas aeruginosa, sowohl in vitro als

Reinigung kann die Adsorption am Harz und das auch in vivo. Die Verbindungen können oral, paren-

Eluieren mit einer Base ein oder mehrmals wiederholt teral oder lokal angewandt werden. Bei Menschen sind

weiden. ⁶S intramuskuläre Einzeldosen Ambut-yrosinsulfat, die

Ambutyrosin kann in seine Komponenten Ambu- 4 mg Ambutyrosinbase je Kilogramm Körpergewicht

tyrosin A and Ambutyrosin B mit Hilfe verschiedener entsprechen, gut verträglich und ergeben therapeutisch

Verfahren getrennt werden. Ein bevorzugtes Verfahren wirksame Konzentrationen im Blutplasma und im Urin.

13 ^V 14

Auf Grund ihres breiten antibakteriellen Spektrums den bei 25 bis 27°C unter Belüftung mit einer Ge-

und ihrer bakteriziden, sowohl wie ihrer bakterio- schwindigkeit von 0,27 m³/Minute _und gegebenenfalls

statischen Wirksamkeit sind die erfindungsgemäßen Zugabe eines Antischaummittels laufen. Verbindungen als antibakterielle Mittel auch wirksam

bei Applikation in vitro, z. B. zum Sterilisieren von 5 stufe IV Laboratoriumsinstrumenten und -oberflächen, zum

Sterilisieren von pharmazeutischen Produkten und zur Es wird ein Nährmedium bereitet, dessen Zusammen- Aufrechtcrhaltung von sterilen Bedingungen bei der Setzung demjenigen aus Stufe 11 entspricht, das jedoch Herstellung von Arzneimitteln. Zur Sterilisierung von außerdem noch 4,O°/o (Gewicht/Volumer.) Glycerin Laboraloriumsinslrumenteh, -geräten und-oberflächen io enthält. 568 1 dieses Nährmediums werden in je einen

und ähnlichen In-vitro-Anwendungen können die Ver- von zwei 750-l-Fermentern eingebracht und in der

bindungcn in Form von 0,1· bis l,0°/„igen wäßrigen Hitze sleiilisiert und abgekühlt. Jeder Fermenter wird

Lösungen verwendet werden. nun mit 57 1 der wachsenden, 32 Stunden alten Kultur Die Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der aus Stufe IM beimpft und unter Rühren und Belüf- Erfindung. 15 ten mil einer Geschwindigkeit von 0,48 m³/Minutc B e i s ρ i e I 1 122 Stunden bei 29,5 bis 3O,5"C bebrüttt. In jeden der

_f beiden Fermenter werden, gegebenenfalls in Portionen,

^Mule ' 151 Antischaummittel eingerührt. Vier Schrägkulturen von Bacillus circulans NRRL ... . . , B-3313 werden auf einem sterilen Agarmedium bereitet, ao Isolierung und Rem.gung des Produktes

das die folgende Zusammensetzung hat: Die Brühen aus Stufe IV werden vereinigt und 1155 1

Pepton, erhalten aus Casein durch ^avon bei einem pH-Wert von 6,8 1 Stunde mit 48 1 Pancre'e rd-aune is_E Carbonsaurehatz in der Ammoniumform verrührt. PoduktTes^naufschlussesvon- " ^{5 AIs H}.^{atz kan}" ^?" ^ ""<" der Hande.s-

5 ε *^{s bezeichnu}ng »Amberlite IRC-50« erhältliche Kunstharz

f veiwendet werden. Man läßt dann das Harz mit den

15 S ^dar'" ^{adsorbierten Stoffen} absitzen und wäscht es mit

n«tilliprt« Wawr 11 Wasser frei von suspendierten Feststoffen. Das ge-

uesuiuenes wasser waschene Harz wird in einen Glaszylinder von 15 cm

Die Kult ren werden 2 Tage bei 28"C bebrütet und 30 Durchmesser eingefüllt, der bereits 10,51 frisches

das gebildete Bakterienwachstum jeweils in 10 ml Carbonsäureharz in Ammoniumform als Bodenschicht

0.1%iger steriler Natriumheptadecylsulfatlösung sus- enthält. Die so hergerichtete Kolonne wird mit 3710 !

pendlest. lmolarem Ammoniumhydroxid gewaschen, um Verun-

_Stuf_e H ieinigungen zu entfernen, und das Ambutyrosinpro-

35 dukt wird der Säule durch Eluieren mit 3801 lmolarem

Es wird ein Nährmedium der folgenden Zusammen- Ammoniumhydroxid entzogen. Das Ammoniumsetzung (Gewicht/Volumen) bereitet: >-*■" hydroxideluat wird auf 221 eingeengt, mit verdünnter

Sojabohnenmehl. 44% Protein ST'⁶'⁵**⁶ ?"' ^" ^Tl™ 1 ^ein8^es^^nt _u ^Und

(mit Lösungsmittel extrahiert) ... 1,0·/, durch e,_ne Kolonne von 275 ml des gleichen Carbon-

Tioricrhpc Ppntnn 175°/ ⁴° saureharzes in Ammoniumform mit einer Geschwindig-

iTnÄSSrid \ \ \ [ ] \ \ \ ['. \'. \ 0AV° ** ™ T ¹J""' "5™ S ^MinU£ "^^ ^D"

Wasser auf 100°/ ^{em daran} adsorbierten Material wird aus

dieser Kolonne von oben über 8^ ml frisches Harz,

Der pH-Wert des Mediums wird mit 10 η-Natron- das sich in einem Glaszylinder von 5 cm Durchmesser

lauge auf 7,5 eingestellt, worauf 0,5% (Gewicht/ 45 befindet, beschichtet. Die Kolonne wird mit 49 1

Volumen) Calciumcarbonat zugegeben werden. O.lmolarem Ammoniumhydroxid gewaschen, um die

Nun bringt man 12 I dieses Mediums in einen 30-1- Verunreinigungen zu entfernen, worauf das Ambuty-Fermenter ein. Das Medium wird durch Erhitzen auf rosinprodukt mit 41 lmolarem Ammoniumhydroxid 12ΓC innerhalb 90 Minuten sterilisiert, worauf man eluiert wird. Dann wird das Ambutyrosincijat im es abkühlen läßt und mit 40 ml der Sporensuspension 50 Vakuum auf eine kleines Volumen eingeengt, nitriert von Bacillus circulans NRRL B-3313 in Natrium- und Iyophilisiert. Der Rückstand besteht aus Ambuheptadecylsulfat, hergestellt gemäß Stufe I, beimpft. tyrosin; spezifüsche Drehung t«]£ = +26° (1,1% '" Das beimpfte Medium wird 32 Stunden bei 26 bis 27" C Wasser). Durch Mikroanalyse läßt sich feststellen, daß bebrütet, wobei man es mit 200 Umdrehungen je Mi- das Produkt 45,41% Kohlenstoff, 7,26% Wasserstoff nute rührt und mit steriler Luft, die mit einer Geschwin- 55 und 12,83% Stickstoff hat. Ausbeute 21 g. digkeit von 6 l/Minute zugeführt wird, belüftet. Durch Zugabe von überschüssiger Chlorwasser-Während des Bebrütens werden etwa 36 g eines stoffsäure oder Salzsäure zu einer wäßrigen Lösung der Gemisches aus Schweinefett und Mineralölen mit freien Base kann man die entsprechenden Salze her-Mono- und Diglyceriden in Einzelant^len zugegeben, stellen, die durch Zugabe von Acöton ausgefällt werum ein allzu starkes Schäumen zu verhindern. 60 den. Das auf diese Weise erhaltene Sulfat hat eine βρες.,. .„ zifische Drehung [«]? = +29° (2% in Wasser). Die ^btmem Mikroanalyse ergibt 32,32% Kohlenstoff, 6,20%

1141 eir.es Nährmediums mit der gleichen Zusam- Wassei stoff, 8,64% Stickstoff. In Wasser hat die

mensetzung wie in Stufe II werden in einen 200-I-Fer- Substanz pK'a-Werte von 6,5, 8,1 und 9,5. menter eingebracht. Das Medium wird 60 Minuten bei 65 Äquivalente Resultate werden erhalten, wenn man

12rc sterilisiert, worauf man es abkühlen läßt und die Kulturen von Bacillus circulans NRRL B-3313

mit 40Om! der wachsenden 32-Stunden-Kultur aus gegen Kulturen von Bacillus circulans NRRL B-3312

Stufe H beimpft. Man läßt die Fermentation 32 Stun- austauscht.

I 914 527

15 i 16

Beispiel 2 fernen, und dann mit insgesamt 1701 !molarem Ammo-

_ - niumhydroxid in drei gleichen Portionen eluiert. Die

^btuIe ' erste Fraktion von 571 enthält den größten Teil des

Es wird eine Sporensuspension von Bacillus circulans Ambutyrosins und wird im Vakuum auf ein Volumen

NRRLB-3313 in 0,l%iger steriler Natriumhepta- 5 von 41 eingeengt, mit verdünnter Schwefelsäure auf

decylsulfatlösung hergestellt wie im Beispiel 1, Stufe I. einen pH-Wert von 6,2 eingestellt und 1 Stunde mit

_ , 813 g mit Wasser gewaschener Aktivkohle und 400 g

mit Wasser gewaschener Diatomeenerde verrührt- Das

Analog Beispiel 1, Stufe II, wird cine-Fermentation Gemisch wird filtriert und der Filterkuchen mit 801

durchgeführt, wobei jedoch die 12 Γ Nährmedium nur χσ Wasser ausgewaschen. Das Filtrat wird mit den Waschmit 10 ml der Natriumheptadecylsulfatsuspensior von wässern vereinigt, im Vakuum auf 41 eingeengt, filtriert

Bacillus circulans NRRL B-3313 beimpft werden. und lyophilisiert. Das Produkt ist Ambutyrosmsulfat-

_c , salz, spezifische Drehung [&]f = +29° (2% in

^Mutem Wasser). Laut Mikroanalyse enthält es 31,85%

Es wird ein iHährmedium hergesteßt, dessen Zusam- 15 Kohlenstoff, 6,28% Wasserstoff, 8,83% Stickstoff,

mensetzung derjenigen des im Beispiel 1, Stufe II, ver- 8,01 % Schwefel und 24,01 % Sulfat. Im Wasser hat es wendeten entspricht. Der pH-Wert des Mediums wird pK'a-Werte von 6,5, 8,1 und 9,5. Ausbeute 333,9 g.

mit 10 η-Natronlauge auf 7,5 eingestellt, worauf 0,5%

(Gewicht/Vohmen) Calciumcarbonal und 0,1 % (Ge- B e i s ρ i e I 3

wicht/Volumen) eines Polypropylenglykols als Anti- ao .

schaummittel zugegeben werden. Zwei Anteile von je Mute

114 1 dieses Gemisches werden in einen 190-l-Ferrhenter Eine Sporensuspension von Bacillus circulans

eingebracht, bei 121°C 60 Minuten sterilisiert, abge- NRRLB-3313 in 0,l%iger steriler Natriumhepta-•kühlt und mit 200 ml der wachsenden, 32 Stunden alten decylsulfatlösung wird wie im Beispiel 1, Stufe I, beKultur aus Stufe II beimpft. Die Feimentations- 35 schrieben hergestellt,
gemistie werden 32 Stunden bei 29 bis 31° C unter Be- _ , ..

lüftung mit einer Geschwindigkeit von 0,27 m³/Minute ^{u e}

bebrütet. Es wird ein Nährmedium der folgenden Zusammen-

ς . j_V stellung (Gewicht/Volumen) bereitet:

Es wird ein Nährmedium hergestellt, dessen Zusam- Sojabohnenmehl, 44% Protein

mensetzung dem in Stufe III verwendeten entspricht, (mit Lösungsmittel extrahiert) ... 1,0%

das jedoch zusätzlich 4,0 % (Gewicht/ Volumen) Glyce- Tierisches Pepton 1.75%

rin enthält. Als Antischaummittel wird ein Polypropy- Ammoniumsulfat 0,4%

lenglykol zugegeben. In jeden von vier 757-1-Fermen- 35 Wasser auf 100%

tern werden 56S1 dieses Gemisches aufgegeben, in der

Wärme sterilisiert, gekühlt und mit 57 1 der 32 Stunden Der pH-Wert des Mediums wird mit 10 n-Natron-

alten Kultur aus Stufe III beimpft. Die Fermentations- lauge auf 7,5 eingestellt, worauf 0,5% (Gewicht/

gemische werden dann 128 Stunden bei 29 bis 31°C Volumen) Calciumcaibonat zugefügt werden.

unter Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 0,5 bis 40 121 dieses Mediums weiden in einen 30-1-Fermenter

1 m^s/Minute bebrütet. Gegebenenfalls wird als Anti- eingebracht. Um das Medium zu sterilisieren, erhitzt

schaummittel ein Polypropylenglykol in Portionen man es 90 Minuten auf 121°C, läßt es dann abkühlen

zugefügt. und beimpft mit 10 ml einer Suspension von Bacillus

... , _ . . ' „ . , · circulans NRRL B-3313 aus Stufe 1 in Natriumhepta-

Isolation und Reinigung des Produktes _{45 decy}i_su|_fat. _Das Gemisch wird 33 Stunden unter

Die Brühen aus den vier Fermentein werden vereinigt Rühren und Belüftung mit 61 Luft je Minute bei 28 bis

und das Ganze (23101; pH-Wert 6,9) 1 Stunde mit 30° C bebrütet. Während dieser Periode fügt man in

127 1 Carbonsäureharz in Ammoniu.nfotm verrührt. Portionen 400 ml eines Antischaummittel in Form

Man läßt dann das Harz mit dem adsorbierten Material von Polypropylenglykol zu, um das Schäumen einzu-

absitzen und entfernt die suspendierten festen Verun- 50 schränken,

ieinigungen durch Waschen des Harzes mit Wasser. Stufe III
Das gewaschene Harz wird dann in eine Säule von

30 cm Durchmesser eingefüllt, die bereits 1131 frisches 571 eines Nährmediums mit der gleichen Zusammen-Carbonsäureharz, Ammoniumform, als Bodenschicht Setzung wie dasjenige in Stufe II (pH-Wert 7,5) werden enthält. Die gefüllte Säule wird mit 16 4701 O.lmola- 55 in einem Feimenter von 1141 Inhalt sterilisiert, gerem Ammoniumhydroxid gewaschen, um die Verun- kühlt und mit 40OmI der wachsenden, 3 Stunden alten reinigungen zu c...fernen, worauf das Ambutyrosin Kultur aus Stufe II beimpft. Das beimpfte Medium durch Eluieren der Säule mit 1900 1 lmolarem Ammo- wird 32 Stunden bei 28 bis 3O⁰C unter Luftzufuhr mit niumhydroxid gewonnen wird. Das Eluat wird im einer Geschwindigkeit von 0,18 m³/Minute bebrütet. Vakuum auf 1801 eingeengt, mit verdünnter Schwefel- 60 Gegebenenfalls wird ein Polypropylenglykol zur Versäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und durch hinderung des Schäumens zugegeben,
eine Säule von 3,5 1 Carbonsäureharz, Ammoniumform, mit einer Geschwindigkeit von 0,03 ml/ml Harz Stufe IV
je Minute geschickt. Das Harz wird dann mit 21

Wasser gewaschen und über 10,5 1 frisches Harz in 65 11361 Nährmedium der gleichen Zusammensetzung

einer gläsernen Säule von 10 cm Durchmesser gepackt. wie in Stufe II (pH-Wert 7,5) wird in der Wärme sterili-

Die Säule wird mit 1035 1 O.lmolarem Ammonium- siert, gekühlt und mit 57 I der 32 Stunden alten Kultur

hydroxid gewaschen, um die Verunreinigungen zu ent- aus Stufe III beimpft. Das Gemisch wird 24 Stunden

bei 29 bis 31,5⁰C unter Zufuhr von 1,27 m³ Luft je Minute bebrütet. Gegebenenfalls wird PoJypropylenglykol als Antischaummittel zugegeben.

Stufe V

Es wird ein Nährmedium bereitet, dessen Zusammenstellung demjenigen aus Stufe II entspricht, außer daß es zusätzlich noch 4 Gewichtsprozent (Gewicht/Volumen) Glycerin enthält. Das Medium (pH-Wert 7,5) enthält außerdem Polypropylenglykol als Antischaummittel. 45401 dieses Mediums werden in je einen von zwei 75701 fassenden Feimentern eingefüllt, mit Hitze sterilisiert, gekühlt und mit je 5681 der 24 Stunden alten Kultur aus Stufe IV beimpft. Die Fermentation wirJ 120 Stunden bei 28 bis 31"C durchgeführt, wobei Luft mit einer Geschwindigkeit von 1,7 mV Minute hindurchgeleitet und, falls nötig, noch zusätzliches Antischaummittel zugegeben wird.

Isolation und Reinigung des Produktes

Der Inhalt der Fermenter wird vereinigt und die vereinigte Brühe (110501) l'/₂ Stunden mit 508 1 Carbonsäureharz in Ammoniumform verrührt. Das Harz mit dem daran adsorbierten Material läßt man absitzen und wäscht es dann von den suspendierten Feststoffen mit Wasser frei. Das gewaschene Harz wird in eine Kolonne aufgegeben, die schon 46 I frisches Carbonsäureharz, Ammoniumform, als BodenscMcht enthält. Die Harzkolonne wird gewaschen mit 11 360 I 0,1 molarem Ammoniumhydroxid, um die Verunreinigungen zu entfernen, und das Ambutyrosin wird durch Eluieren mit 3785 11 molarem Ammoniumhydroxid ausgezogen. Das Eluat wird im Vakuum auf ein Volumen von 121 1 eingeengt, mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und filtriert.

Die in den Stufen I₁ II, III, IV und V beschriebenen Operationen und das oben beschriebene Isolationsverfahren werden wiederholt, so daß man ein zweites konzentriertes Ambi'tyrosineluat von 2161 erhält, das ebenfalls mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und filtriert wird.

Zur Weiterverarbeitung werden die beiden Eluate zu einer Lösung vereinigt, die ein Volumen von 337 1 hat.

Die vereinigte Lösung wird mit Wasser auf 11361 verdünnt und durch eine Kolonne vcn 30 1 Carbonsäureharz, Ammoniumform, mit einer Geschwindigkeit von 900 ml/Minute geschickt. Das Harz wird mit 571 Wasser gewaschen und dann über 911 frisches Harz in einen Glaszylinder von 30,5 cm Durchmesser geschichtet. Die gefüllte Kolonne wird mit 7381 O.lmolarem Ammoniumhydroxid gewaschen, um die Verunreinigungen zu entfernen, worauf das Ambutyrosinprodukt durch Eluieren mit 15141 lmolarem Ammoniumhydroxid, das in Anteilen zugegeben wird, entfernt wird. Die ersten 6701 lmolares Ammoniumhydroxid enthalten das meiste Ambutyrosin. Die Auszüge werden im Vakuum eingeengt, um das Ammoniak abzutreiben. Zur weiterer. Reinigung wird das Produkt adsorbiert auf 35 1 frischem Carbonsäureharz, Ammoniumform, und dieses Harz wird über 105 1 frisches Harz in eine Kolonne von 30,5 cm geschichtet. Die gefüllte Kolonne wird mit 75701 O.lmolarem Ammoniumhydroxid gewaschen, um die Verunreinigungen zu entfernen, und das Ambutyrosinprodukt wird durch Eluieren mit 7571 lmolarem Ammoniumhydroxid abgetrennt Das Eluat wird im Vakuum auf ein Volumen von 90 1 eingedampft, mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, 1 Stunde mit ρ kg Aktivkohle und 12 kg Diatomeenerde verrührt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen bis das Gesamtvolumen des ursprünglichen Filtrats zusammen mit den Waschwässern 833 i beträgt Die Lösung wird im Vakuum auf ein Volumen von 301 eingeengt und dann filtriert und Iyophilisiert. ίο Das Produkt, Ambutyrosinsutfatsalz, hat eine spezifische Drehung [xtf? ~ +29,3° (2% in Wasser). Analyse: C₂₁H₄₁N₅O₁, · 2H₂SO₁ · 2H₂O .

Berechnet C 32,02, H 6,27, N 8,89, S 8,14%; gefunden ... C32,08 H 6,36 N9,Γ<ί S8,14%. Ausbeute 2017 s

Hie Si.iiiead.Jitu>nv>nl/e \on Ambutyrosin werden in die fr.-ie Hase durch milde Behandlung mit einer

Base, wie Nairiumh\droxid, Kaliumcarbonat oder Kaliumbicarbonat, oder durch Ionenaustausch in der Kälte übergeführt. Beispielsweise wird eine wäßrige Lösung des Sulfatsalzos über ein starkes Anionaustauscherharz in der Hydroxidform geleitet. Ein

»5 hoch vernetztes Harz kann verwendet werden. Das Produkt wird in Form der freien Base erhalten, wenn man die Lösung durch das Harz leitet und dieses dann mit Wasser auswäscht. Man kann auch eine wäßrige Lösung des Sulfatsalzes auf eine Kolonne, die Carbon-

säureharz ·η der Ammoniumform enthält, aufgeben. Das Harz mit dem adsorbierten Material wird mit Wasser und geringen Mengen von O.lmolarem Ammoniumhydroxid gewaschen und das Ambutyrosin als freie Base von der Kolonne mit lmolarem Ammonium hydroxid eluiert.

Eine Lösung von 6,169 g Ambutyrosin und 5,911 g Natriumformaldehyd-bisulfit in 20 ml Wasser wird 2 Tage stehengelassen. Dann werden 210 ml Methanol unter Rühren zugegeben. Das gummiartige Produkt

wird gerieben, bis es fest wird. Das feste Produkt wird auf ein Filter gebracht und mit Methanol ausgewaschen. Ausbeute 8,503 g. Es ist das Natriumsalz von Ambutyrosintetra- (N - methansulfonsäure). Zwecks Reinigung wird es wieder in Wasser gelöst und durch

Zusatz von Methanol ausgefällt. Das entsprechende Kaliumsalz der Ambutyrosintetra-(N-methansulfoncpure) wird auf ähnliche Weise aus Kaüumformaldehyd-bisulfit gebildet. Diese Alkalisalze der Ambutyrosinietra-(N-methansulfonsäure) sind pharmazeutisch brauchbare Derivate, die die gleichen antibakteriellen Eigenschaften aufweisen wie das Ambutyrosin selbst.

Beispiel 4

Das nach den obigen Methoden erhaltene Ambutyrosin kann auf folgende Weise in die beiden Komponenten Ambutyrosin A und Ambutyrosin B aufgespalten werden: Man bereitet auf folgende Weise ein Ionenaus tauscherharz in Boratform: 3 I eines starken Anion- austauscherharzes in der Chlondform werden in eine Glaskolonne von 5 cm Durchmesser eingebracht. Es kann dazu ein Harz mit einer Korngröße von 0,12 bis 0,25 mm verwendet werden. Das Hai ζ wird in die

6j Hydroxidform übergeführt, indem man 161 2molare Natronlauge durch die Kolonne schickt. Es wird dann mit etwa 9,5 I Wasser gewaschen, bis der pH-Wert der abfließenden Lösung 9,2 ist, worauf das Harz mit 17,51

1 S14527

19 20

einer 5%igen Borsäurelösung behandelt und zum _R. _β „. _s

Schluß mit Wasser gewaschen wird, bis der pH-Wert Beispiel 3

der abfließenden Lösung etwa 5,5 beträgt. Im folgenden sei ein weiteres Beispiel für die Auf-

Nun wird eine Probe von 6,01 g Ambutyrosin, das trennung von Ambutyrosin in die Komponenten A und

sich aus Ambutyrosin A und Ambutyrosin B zusam- 5 B wiedergegeben.

mensetzt, in 15 ml Wasser gelöst und in die Säule ein- Ein starkes Anionenaustauscherharz in Boratform gebracht. Die Säule wird mit 6,421 Wasser eluiert, und wird wie folgt hergestellt: 3,41 eines starken Anionenes werden Fraktionen von etwa 7 ml/Minute abge- austauschetharzes in Chloridform wird in eine Säule nommen. Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, von 5,4 cm Durchmesser eingebracht. Hierzu kann ein werden identifiziert und vereinigt. Bei einer typischen io Harz mit einer Korngröße von 0,12 bis 0,25 mm ver-Trennaktion wird beispielsweise das Produkt in dem wendet werden. Das Harz wird mit 2molarer Na:ron-Eluat gefunden, das nach dem Durchgang von 2,251 lauge in die Hydroxidform übergeführt, mit Wasser geWasser beginnt und abgezogen wird, bis die Säule mit waschen, bis der pH-Wert der abgezogenen Lösung der Gesamtmenge von 4,951 Wasser eluiert worden ist. 10,5 ist, und dann mit 1215%iger Borsäure behandelt, Das auf diese Weise durch Eluieren mit Wasser erhal- 15 worauf es zum Schluß mit Wasser gewaschen wird, bis tene Produkt enthält Ambutyrosin A und ist frei von der pH-Wert der Lösung 6,9 beträgt. Ambutyrosin B. Ausbeute etwa 3.5 g. Nun wild in die Säule eine Lösung von 4,03 g

Die Kolonne wird dann nacheinander mit 41 Ambutyrosin in 7,5 ml Wasser eingebracht. Die lVo'ger Borsäure, 2 1 2° „icer Borsäure und zum Kolonne wird mit 11 I Wasser bei einer Geschwindig-Schluß mit 5%iger Borsäurelösung eluiert. Das Eluat ao keil von 14 ml/Minute eluiert und Fraktionen des wird in Fraktionen gesammelt, und die Fraktionen, die Eluats gesammelt. Die Fraktionen, die bei einem das Produkt enthalten, weiden identifiziert und ver- Volumen der abgezogenen Lösung von 3,96 1 beginnen einigt. Bei einem typischen Trennvorgang findet man und bei einem Volumen von 6,97 I enden, enthalten ein das Produkt hauptsächlich in Fraktionen, die einem Produkt, das ein im wesentlichen von der Komno-Volumen der abgezogenen Losung von 2,64 bis 4,01 25 nente B freies Ambutyrosin A darstellt. Diese Fraktionach Anwendung von 5°/,iger Borsäure entsprechen. nen werden vereinigt und das Ambutyrosin A durch Dieses Produkt besteht aus Ambutyrosin B, das im Adsorption an einem Carbonsäureharz, Ammoniumwesentlichen frei ist von Ambutyrosin Λ. form, und nachfolgende Eluation mit lmolarem

Ambutyrosin Λ kann wie folgt weitergereinigt wer- Ammoniumhydroxid isoliert, wie dies oben beschrieben

den: Fraktionen aus der erwähnten Harzsäule, die 30 wurde. Die das starke Anionenaustauscherharz in

einem Lösungsvo'umen von 3,0 bis 3,61 (wobei Wasser Boratform enihaltene Säule wird dann mit 7,11

als Eluiermittel gedient hat) er::spre-hen, werden inner- 2,5%iger Borsäure und zum Schluß mit 51 5%iger

halb etwa 20 Stunden über eine Säule geschickt, die Borsäure eluiert. Man gewinnt ein Produkt aus der

11 ml Carbonsäureharz in Ammoniumform enthält. Säule durch Elution mit 5% Borsäure. Der Haupt-

Die Säule wird dann mit Wasser und anschließend mit 35 anteil dieses Produktes ist in den Fraktionen zu finden,

40 ml O.lmoiarem Ammoniumhydroxid ausgewaschen, die einem Volumen an abgezogener Lösung von 0,5 bis

um Verunreinigungen zu entfernen. Das Ambutyro- 3,2 1 5%iger Borsäure entsprechen. Es handelt sich um

sin A wird dann mit zwei Portionen von je 80 ml Ambutyrosin B, das im wesentlichen von der Kompo-

1 molarem Ammoniumhydroxid eluiert. Der erste Teil nente A frei ist.

ergibt nach Eindampfen im Vakuum und Lyophilisiereti 40 Zwecks weiterer Reinigung wird die Lösung von

584 mg Ambutyrosin A, das Spuren von Bor enthält. Ambutyrosin B in 5%iger Borsäure sehr langsam durch

Um das Bor zu entfernen, wird das Produkt in 5 ml eine Säule von 0,6 cm Durchmesser, die 5 ml Carbon-Wasser gelöst und die Lösung durch 4 ml eines bor- säureharz, Ammoniumform, enthält, geschickt. Die spezifischen Anionenaustauscherharzes geschickt. Hier- Säule wird mit Wasser gewaschen und dann mit 90 ml für ist ein Harz wie »Amberlite XE 243« in Form der 45 lmolarem Ammoniumhydroxid eluiert. Das Ammofreien Base geeignet. Die Säule wird dann noch zusatz- niumhydroxideluat wird im Vakuum eingeengt und lieh mit 8 ml Wasser eluiert und die abgezogene Lö- lyophilisiert und ergibt dann 624 mg Ambutyrosin B sung lyophilisiert; man erhält das Ambutyrosin A als (freie Base), das mit einer kleinen Menge Borsäure verfreie Base, das keinerlei Borsäure mehr enthält. unreinigt ist. Eine wäßrige Lösung dieses Produktes

Eine Lösung des so gewonnenen borfreien Ambu- 50 wird langsam durch 4 ml eines borspezifischen An-

tyrosins A in 8 ml Wasser wird durch 6 ml eines starken ionenaustauscherharzes in Form der freien Base ge-

Anionenaustauscherharzes in der Hydroxidform ge- schickt (Dauer 3 Stunden) und die Säule mit zusätz-

schickt. Die Säule wird zusätzlich mit 15 ml Wasser lieh 10 ml Wasser eluiert. Die abfließende Lösung wird

eluiert und die abfließende Lösung lyophilisiett; man lyophilisiert und ergibt 609 mg Ambutyrosin B, das nur

erhält gereinigtes Ambutyrosin A als freie Base, das 55 noch 0,02% Bor enthält und die folgenden Eigen-

die folgenden Eigenschaften aufweist: Die spezifischen schäften hat: Die spezifischen Potationen [λ]'} (1,5%

Rotationen [«]" (1,46% in Wasser) bei verschiedenen in Wasser) bei verschiedenen Wellenlängen sind die Wellenlängen sind die folgenden: +26,0° bei 589 ηιμ; folgenden: +33,0° bei 589 τομ.; -f-34,0" bei 578 ΐημ;

+27,2° bei 578 ηιμ; +30,4° bei 546 πιμ; +49,5° bei +38,5° bei 546 ΐημ; +64,0° bei 436 ηιμ. Nach 24stün-

436 ιημ; +74,4° bei 365 ηιμ. Nach 24stündigem 60 digem Trocknen in Vakuum bei 100⁰C ergibt die

Trocknen im Vakuum bei 100⁰C ergibt die Mikro- Mikroanalyse folgende Werte: 42,79% Kohlenstoff,

analyse 44,94% Kohlenstoff, 7,05% Wasserstoff und 7,53% Wasserstoff und 11,45% Stickstoff (entspre-

12,23% Stickstoff. In Kaliumbromid hat das Produkt chend einem Dihydrat). Im Kaliumbromid hat das

Infrarotabsorptionsmaxima bei 700,1028,1090, 1340, Produkt Infrarotabsorptionsmaxima bei 700, 1026,

1390,1457,1498,1550 bis 1610,1652, 2938, 3040 und 65 HOO, 1345, 1390, 1458,1497, 1549, 1580, 1650, 2938,

3410 cm-¹. 3040, 3345 und 3370 cm-».

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   N'-{4-Amino-2-faydroxybutyiyl)-4-O-{2,6-diamino-li.ö-dideoxy-D-glucopyranosyO-S-O-D-xylofuranosyI-2-deoxystreptamin, N*-(4-Amino-2-hydroxybutyrylH-O-{2,6-dianiino-2,6-dideoxy-D-glucopyranosyO-S-O-D-ribofuranosyl^-deoxystreptamin, deren Gemische und Säureadditionssalze, besonders die Sulfate.