DE3044773C2

DE3044773C2 -

Info

Publication number: DE3044773C2
Application number: DE3044773A
Authority: DE
Inventors: Kenji Koyama; Syotaro Tokuyama Yamaguchi Jp Ohno; Mitsutoshi Shin-Nanyo Yamaguchi Jp Fukuda
Original assignee: Toyo Soda Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1980-01-10
Filing date: 1980-11-27
Publication date: 1987-12-17
Also published as: FR2473341B1; GB2067200B; US4522725A; FR2473341A1; DE3044773A1; GB2067200A; JPS5753328B2; JPS5699422A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung eines im wesentlichen reinen Plasmaalbumins aus Blutplasma gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1.

Blut wird nicht nur für Bluttransfusionen im Rahmen der ersten Hilfe oder ähnlicher Sofortmaßnahmen zur Lebensrettung verwendet, sondern auch in Blutbänken gelagert und zur Herstellung von Blutmedikamenten verwendet. Dabei werden lediglich die wichtigen Blutkomponenten abgetrennt und für die Transfusion verwendet. Man kann auf diese Weise eine angestrebte Dosis verabreichen und die durch nutzlose Komponenten verursachten Nebenwirkungen verhindern. Gleichzeitig kann so menschliches Blut, das nur in beschränktem Maße zur Verfügung steht, in effektiver Weise genutzt werden. Bekanntermaßen kann Blut in Erythrocyten, Leukocyten, Blutplättchen und flüssiges Blutplasma aufgetrennt werden. Das Blutplasma enthält verschiedene Proteine mit unterschiedlichen Funktionen. Es wird angestrebt, die Proteine des Blutplasmas zu separieren, zu reinigen und lediglich die Fraktion mit der je nach Anwendungszweck gewünschten Komponente zu verwenden. Unter den Proteinen des Blutplasmas kommt dem Plasmaalbumin die Funktion zu, den osmotischen Druck des Bluts aufrechtzuerhalten und biologisch unverzichtbare Materialien, wie Nahrung, den verschiedenen Organen zuzuführen.

Die medizinischen Anwendungen von Plasmaalbumin umfassen die Therapie von Hypoalbuminämie und von durch Hypoalbuminämie verursachten Ödemen; die Notfalltherapie von hämorrhagischen Schockzuständen oder Verbrennungen sowie die Entfernung von Plasmabilirubin bei der Austauschertransfusion von Neugeborenen oder dergleichen. Bei diesen Anwendungen sind ausgezeichnete Ergebnisse erzielt worden.

Als Verfahren zur Abtrennung von Plasmaalbumin von Blutplasma sind folgende Methoden bekannt, die sich die Unterschiede der Löslichkeiten der Moleküle, Unterschiede der Ladungen und Unterschiede hinsichtlich der Größe der Moleküle zunutze machen:

(1) Die fraktionierte Präzipitation durch Zugabe eines neutralen Salzes, wie Ammoniumsulfat, oder eines organischen Lösungsmittels, wie kaltes Äthanol, oder eines wasserlöslichen Makromoleküls, wie Polyäthylenglykol;
(2) die Chromatographie unter Verwendung eines Ionenaustauschers oder eines Adsorptionsmittels oder eines Molekularsiebs;
(3) elektrophoretische Verfahren, die auf den Unterschieden der Ladungen basieren;
(4) die Immunoadsorption.

Zur Trennung wurde bisher eines der oben erwähnten Verfahren oder eine Kombination derselben angewendet. Diese Verfahren weisen jedoch Nachteile auf. Entweder wird bei Durchführung des Verfahrens bei Zimmertemperatur eine Schädigung der Struktur des Plasmaproteinmoleküls verursacht oder es tritt nachteiligerweise eine Aggregatbildung ein oder es ist für die Abtrennung eine lange Zeit oder ein präzises Einhalten der Verfahrensbedingungen erforderlich.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Abtrennung von Plasmaalbumin zu schaffen, bei dem dieses bei einfacher Verfahrensweise während einer kurzen Zeit ohne Aufbrechen der Struktur des Plasmaproteins oder Bildung von Aggregaten erhalten wird.

Diese Aufgabe wird durch das in den Patentansprüchen gekennzeichnete Verfahren gelöst.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 die Beziehung der prozentualen Permeation von Albumin und dem pH von Lösungen in den Fällen, in denen die gleiche Membran und die gleiche Probe wie bei Beispiel 1 verwendet werden, und

Fig. 2 und 3 Flüssigkeitschromatogramme, die als Ergebnis der erfindungsgemäßen Beispiele erhalten werden.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch eine Fraktionierung von Blutplasma mit einem Präzipitationsmittel, wie einer wasserlöslichen makromolekularen Verbindung, neutralen Salzen und kaltem Äthanol, eine rohe Albuminfraktion abgetrennt. Die rohe Albuminfraktion wird unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran einer Ultrafiltration unterworfen, und zwar unter Bedingungen, bei denen lediglich reines Plasmaalbumin durch die Membran hindurchgeht. Auf diese Weise wird Plasmaalbumin während kurzer Zeit mittels eines einfachen Verfahrens abgetrennt.

Unter der rohen Albuminfraktion ist im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Fraktion von Plasmaalbumin zu verstehen, die im wesentlichen kein γ-Globulin (Molekulargewicht von 16×10⁴) enthält. Dabei kann es sich um eine rohe Albuminfraktion handeln, welche durch Fraktionierung mit Polyäthylenglykol erhalten wurde, oder um eine S_II+III-Fraktion, die durch eine Cohn-Fraktionierung mit kaltem Äthanol erhalten wurde (Cohn, E. et al., J. Am. Chem. Soc., 72; 465, 1950). Falls die Fraktion γ-Globulin enthält, geht das γ-Globulin ebenfalls zusammen mit Plasmaalbumin durch die Ultrafiltrationsmembran hindurch, und es kann auf diese Weise kein reines Plasmaalbumin erhalten werden. Das für die Fraktionierung zur Herstellung der rohen Albuminfraktion angewendete Verfahren ist nicht kritisch und nicht auf die oben erwähnten Verfahren beschränkt.

Falls man Blutplasma direkt einer Ultrafiltration unterwirft, wird das im Blutplasma vorhandene Fibrinogen auf der Ultrafiltrationsmembran adsorbiert, wodurch die Ultrafiltration des Plasmaalbumins nachteiligerweise langsam verläuft. Um diesen Nachteil zu überwinden, wird Fibrinogen vorher durch eine Fraktionierung mit Polyäthylenglykol oder einem neutralen Salz abgetrennt. Anschließend wird die resultierende, rohe Albuminfraktion mit der Ultrafiltrationsmembran behandelt, um ein reines Plasmaalbumin zu erhalten. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf diesen Beobachtungen.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ultrafiltrationsmembran besteht aus einem Polysulfonharz mit den folgenden Struktureinheiten:

oder

(n = 50 bis 250)

Die Membran kan dadurch hergestellt werden, daß man das Polysulfon in einem Lösungsmittel auflöst und anschließend die Lösung in Form eines Films ausbreitet und in ein Nicht- Lösungsmittel eintaucht. Der Porendurchmesser der Membran kann mittels eines Elektronenmikroskops nicht beobachtet werden. Bei der Ultrafiltrationsmembran wird daher gewöhnlich die Eigenschaft der Membran durch ein "cut-off" Molekulargewicht definiert (Molekulargewicht der Teilchen, die gerade noch zurückgehalten werden).

Das cut-off Molekulargewicht wird gewöhnlich definiert, indem man die prozentuale Retention der Membran mit einem sphärischen Protein bestimmt, das ein bekanntes Molekulargewicht aufweist (1-Konzentration der durchgelaufenen Lösung/Konzentration der ursprünglichen Lösung)×100. Die Molekulargewichte der gelösten Bestandteile und die prozentualen Retentionen werden gegeneinander aufgetragen, und das Molekulargewicht bei einer prozentualen Retention von 100% wird berechnet. Das cut-off Molekulargewicht kann je nach dem Meßverfahren variieren. Beispielsweise wird für eine handelsübliche PM-10-Membran, hergestellt von Amicon Co., ein cut-off Molekulargewicht von 10 000 angegeben. Myoglobin mit einem Molekulargewicht von 18 000 läuft jedoch durch die Membran hindurch. Das cut-off Molekulargewicht variiert also je nach dem Meßverfahren. Es zeigt sich z. B., daß sich das cut-off Molekulargewicht in Abhängigkeit von der Veränderung des pH-Wertes der Lösung verändert, und zwar selbst dann, wenn die Probe und die Membran die gleiche sind. Es wird angenommen, daß die Variation von Ladungen des Proteins und von der Verteilung des Proteins in der Lösung abhängt.

Im vorliegenden Fall wird das cut-off Molekulargewicht dadurch bestimmt, daß man Proteine mit bekanntem Molekulargewicht (Myoglobin, β-Lactoglobulin, Albumin, γ-Globulin etc.) in einer Phosphatpufferlösung (pH 6,8) verwendet, die als Eluat einer wäßrigen Gelpermeationschromatographie (GPC) vorliegen. Es werden die Absorptionsverhältnisse der Proben bei 280 nm unter Verwendung einer handelsüblichen G3000SW-Säule, hergestellt von Toyo Soda Mfg. Co., gemessen und die prozentualen Retentionen der Menbran aufgetragen. Bei der vorliegenden Erfindung ist das cut-off Molekulargewicht bei einem pH von 6,8 angegeben.

Das cut-off Molekulargewicht der Ultrafiltrationsmembran, die bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, liegt gewöhnlich in einem Bereich von 2×50⁵ bis 3,5×10⁵ und vorzugsweise in einem Bereich von 2,5×10 5 bis 3×10⁵. Das Bestimmungsverfahren der prozentualen Retention ist nicht auf das erfindungsgemäße Verfahren beschränkt. Es hat sich gezeigt, daß unter den Ultrafiltrationsmembranen mit gleichem cut-off Molekulargewicht solche Membranen, die aus einem Polyamid, einem Polyäthylenterephthalat, einem Polycarbonat, Cellulose oder Celluloseacetat bestehen, manchmal für makromolekulare Proteine genauso gut wie für Albumin permeabel sind oder bei diesen Membranen die prozentuale Permeeation von Plasmaalbumin bemerkenswet gering ist, was zu einer schlechteren Trennfähigkeit führt. Beispielsweise werden bei Verwendung eine Cellulosemembran die Proteine an der Membran adsorbiert, und man erhält eine bemerkenswert niedrige Ultrafiltrationsrate. Andererseits kann bei Verwendung einer Polysulfonharzmembran eine Ultrafiltrationsmembran mit bemerkenswert enger Verteilung der Porendurchmesser erhalten werden. Man erhält eine konstante Ultrafiltrationsrate, ohne daß irgendeine Adsorption der Proteine auf der Membran eintritt. Diese Membran ist zur Abtrennung von Plasmaalbumin optimal geeignet. Aufgrund der Merkmale der Ultrafiltrationsmembran ist es daher möglich, die Komponenten in Abhängigkeit von den Größenunterschieden voneinander zu trennen. Es kann also unter Verwendung dieser Membran die Ultrafiltration mittels eines einfachen und schnellen Verfahrens durchgeführt werden, wobei die Größenuntershiede von Plasmaalbumin und den anderen Proteinen ausgenutzt werden.

Bei der mit dieser Membran erfolgenden Trennung liegt der pH-Wert der wäßrigen Lösung vorzugsweise in einem Bereich von 5 bis 8 und speziell 6 bis 7,5. Die prozentuale Permeation des Plasmaalbumins (Konzentration der durchgelaufenen Lösung/Konzentration der ursprünglichen Lösung×100) verändert sich, abhängig vom pH-Wert, in bemerkenswerter Weise.

In Fig. 1 ist die Beziehung der prozentualen Permeation von Plasmaalbumin und des pH-Wertes der Lösung dargestellt. Die Behandlungszeit kann, abhängig von einer höheren prozentualen Permeation, entsprechend kürzer sein. Aus wirtschaftlichen Gründen liegt der optimale pH-Wert bei der Abtrennung unter Verwendung der Membran vorzugsweise in einem Bereich von5 bis 8 und insbesonde von 6 bis 7,5. Die Konzentration der Lösung ist vorzugsweise geringer als 2% (Gew./Vol.). Bei einer höheren Konzentration ist die Ultrafiltrationsrate geringer. Außerdem ist die prozentuale Permeation von Plasmaalbumin niedriger, da eine höhere Konzentrationspolarisierung er gelösten Bestandteile auf der Oberfläche der Membran eintritt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der pH-Wert der wäßrigen Lösung der rohen Albuminfraktion in einem Bereich von 5 bis 8 eingestellt. Es wird eine Ultrafiltration der Lösung durch die Membran durchgeführt, wobei die anderen Proteine auf der Membran zurückgehalten werden, während lediglich das Plasmaalbumin durch die Ultrafiltrationsmembran hindurchgeht. Anschließend kann die durchgelaufene Plasmaalbuminlösung in weiteren Verfahrensschritten mit einer Membran konzentriert und entsalzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann nicht nur auf Blutplasma angewendet werden, das vom Menschen stammt. Es kann auch auf Blutplasma angewendet werden, das von Tieren, wie Rindern, Pferden und Schafen, stammt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und Vergleichsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Ein Polykondensat von Diphenylsulfon und Bisphenol A (n = 170) wird in Dimethylacetamid aufgelöst, um eine 12%ige (Gew./Vol.) Lösung herzustellen. Die Lösung wird mittels einer Rakel auf einem 30 cm×30 cm großen Polyäthylenvliesmaterial ausgebreitet, so daß man eine Dicke von 200 µm erhält. Das Ganze wird in Wasser eingetaucht und man erhält eine Membran. Zur Bestimmung des cut-off Molekulargewichts der Membran wird die Membran in Stücke mit einem Durchmesser von 90 mm zerschnitten. Damit wird eine Ultrafiltrationsvorrichtung ausgerüstet. Es werden die prozentualen Retentionen der Proteine Myoglobin (18 000), Albumin (68 000), γ-Globulin (160 000) und Glutamatdehydrogenase (350 000) bestimmt. Das cut-off Molekulargewicht beträgt etwa 3×10⁵.

Menschliches Blut wird bei tiefer Temperatur zur Entfernung der Blutkörperchenkomponenten einer Zentrifugentrennung unterworfen. Man erhält auf diese Weise Blutplasma. Der pH- Wert des Blutplasmas wird mit einer 1N wäßrigen Lösung von NaOH auf 8,0 eingestellt. Unter Kühlen und Rühren wird eine 50%ige Lösung von Polyäthylenglykol (4000) dem Blutplasma zugesetzt, so daß man eine Konzentration des Polyäthylenglykols von 12% erhält. Die Lösung wird bei tiefer Temperatur zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt. Der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wird mit 1N HCl auf 4,6 eingestellt. Der Lösung werden unter Kühlen und Rühren Polyäthylenglykol (4000)-Flocken zugesetzt, um eine Konzentration des Polyäthylenglykols von 25% zu erhalten. Das Gemisch wird zur Abtrennung eines Präzipitas bei tiefer Temperatur zentrifugiert. Das Präzipitat wird in einer Phosphatpufferlösung mit einem pH von 6,8 aufgelöst, und zwar unter Bildung einer 1%igen Lösung. die Lösung wird bei einem Druckunterschied von 1 kg/cm² in der mit der Membran ausgerüsteten Ultrafiltrationsvorrichtung einer Ultrafiltration unterworfen. Das unter den folgenden Meßbedingungen resultierende Chromatogramm der Lösung ist in Fig. 2 dargestellt.

Meßbedingungen:
Gelpermeationschromatographie: HLC-802UR G3000 SW (eine Säule), hergestellt von Toyo Soda Mfg. Co.,
Eluationsmittel: Phosphatpufferlösung (pH 6,8),
Detektor: UV Monitor 280 nm.

Das Chromatogramm zeigt auf der linken Seite die Signale der rohen Albuminfraktion, die durch Fraktionierung mit Polyäthylenglykol erhalten wurde, und zwar vor der Ultrafiltration. Das auf der rechten Seite dargestellte Chromatogramm ist das der Lösung, die durch die Ultrafiltration erhalten wurde (Plasmaalbumin). Aus dem Chromatogramm geht klar hervor, daß lediglich Plasmaalbumin durch die Membran hindurchgeht. Die prozentuale Permeation beträgt etwa 50%. Signale (1) und (2): makromolekulare Proteine; Signal (3): Plasmaalbumin:

Beispiel 2

Das Polysulfonharz von Beispiel 1 wird in einem gemischten Lösungsmittel aus N-Methylpyrrolidon und Dimethylsulfoxid (7 : 3) aufgelöst, um eine 15%ige (Gew./Vol.) Lösung herzustellen. Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 wird eine Ultrafiltrationsmembran hergestellt und das cut-off Molekulargewicht der Membran bestimmt. Das cut-off Molekulargewicht der Membran beträgt etwa 2,5×10⁵. Menschliches Blutplasma wird zweckentsprechend behandelt, so daß man bei -3°C einen pH-Wert von 7,2, eine Ionenstärke von 0,14, eine Äthanolkonzentration von 8% und eine Proteinkonzentration von 5,1% erhält. Das Plasma wird weiterhin zur Abtrennung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird so behandelt, daß man bei -5°C eine Äthanolkonzentration von 25%, einen pH-Wert von 6,9, eine Ionenstärke von 0,09 und eine Proteinkonzentration von 3% erhält. Anschließend wird wiederum zentrifugiert, um die überstehende Lösung (S_II+III-Fraktion) abzutrennen. Die überstehende Lösung wird verdünnt, um eine Proteinkonzentration von 1% zu erhalten. Die Lösung wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 einer Ultrafiltration unterworfen.

Das unter den Bedingungen von Beispiel 1 resultierende Chromatogramm der Lösung ist in Fig. 3 dargestellt. Aus dem Chromatogramm wird deutlich, daß lediglich Plasmaalbumin durch die Membran hindurchgegangen ist. Die prozentuale Permeation beträgt etwa 30%.

Beispiel 3

Ein Polysulfonharz mit der Haupteinheit

(n = 150)
wird in Dimethylsulfoxid zu einer Konzentration von 15% (Gew./Vol.) aufgelöst. Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 wird eine Ultrafiltrationsmembran hergestellt und das cut-off Molekulargewicht der Membran bestimmt. Das cut-off Molekulargewicht der Menbran beträgt 3 × 10⁵. Rinderblut wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 mit Polyäthylenglykol behandelt, um eine grobe Plasmaalbuminfraktion zu erhalten. Die Fraktion wird einer Ultrafiltration unterworfen, indem man eine Ultrafiltrationsvorrichtung vom Rührtyp verwendet. Dabei wird das Verfahren des Beispiels 1 angewendet. Das sich für die Lösung ergebende Chromatogramm ist im wesentlichen das gleiche wie das von Fig. 3. Daraus geht eindeutig hervor, daß lediglich Albumin durch die Membran hindurchgeht. Die prozentuale Permeation beträgt etwa 30%.

Vergleichsbeispiel 1

Unter Verwendung der Membran des Beispiels 1 wird eine Ultrafiltration von menschlichem Blutplasma mit einem pH- Wert von 7 durchgeführt. Bei der Ultrafiltration tritt lediglich eine geringe Menge des Plasmaalbumins durch die Membran hindurch.

Vergleichsbeispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt. Es wird jedoch eine im Handel erhältliche Celluloseacetat-Ultrafiltrationsmembran (cut-off Molekulargewicht von 3×10⁵) eingesetzt. Es werden eine Fraktionierung und eine Ultrafiltration durchgeführt. Als Ergebnis wird beobachtet, daß zwar zu Beginn eine geringe Menge des Plasmaalbumins durchläuft, jedoch zu einem späteren Zeitpunkt keine Permeation des Plasmaalbumins stattfindet. Die Ultrafiltrationsrate ist bemerkenswert niedriger.

Claims

1. Verfahren zum Abtrennen von Plasmaalbumin, wobei man durch ein Grobfraktionierungsverfahren eine rohe Albuminfraktion vom Blutplasma abtrennt, dadurch gekennzeichnet, daß man nachfolgend Plasmaalbumin mit einer Ultrafiltrationsmembran aus einem Polysulfonharz der folgenden Formel abtrennt oder (n = 50 bis 250).

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein rohes Albumin einsetzt, das mittels des Grobfraktionierungsverfahrens unter Verwendung von Polyäthylenglykol aus dem Blutplasma abgetrennt wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Fraktion von S_II+III einsetzt, die durch eine fraktionierte Trennung unter Verwendung von kaltem Äthanol nach Cohn aus dem Blutplasma abgetrennt wurde.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert einer wäßrigen Lösung des rohen Albumins in einem Bereich von 5 bis 8 liegt.