DE3112538A1 - Verfahren zur auftrennung von waessrigen proteingemischen - Google Patents

Verfahren zur auftrennung von waessrigen proteingemischen

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DE3112538A1 DE19813112538 DE3112538A DE3112538A1 DE 3112538 A1 DE3112538 A1 DE 3112538A1 DE 19813112538 DE19813112538 DE 19813112538 DE 3112538 A DE3112538 A DE 3112538A DE 3112538 A1 DE3112538 A1 DE 3112538A1
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Description

1A-54 473
IONICS, Incorporated
Beschreibung
Verfahren zur Auftrennung von wäßrigen Proteingemischen
Biologische Flüssigkeiten wie Blutplasma oder-serum, Molke, Urin usw. enthalten ein Gemisch von verschiedenen Proteinen. Z. B. enthält Blutplasma Albumin (3,5 - 4,5.g/100 ml, MG 66 000), Fibrinogen (0,20 - 0,45 g/100 ml, MG 340 000), oL -Globuline ( o,4 - 1,0 g/100 ml), /3 -Globuline (0,8 - 1,8 g/100 ml, MG 160 00), IgM (0,06 - 0,25 g/100 ml, MG 950 000) usw. (Frank W. Putnam, The Trace Components of Plasma, An Overview). Die Immunoglobuline (lg*s) sind sehr wichtig, da sie an den Schutz- und Abwehrmechanismen gegenüber Infektionskrankheiten (infektiöse Organismen), beteiligt sind. Klinische Erkrankungen,
sind/
die gekennzeichnet durch ein Ungleichgewicht dieser Systeme von Proteinen, z. B. entweder in der Fähigkeit eindringende Organismen zu erkennen oder körpereigene (indigenous) Proteine oder Nucleinsäuren zu erkennen, haben das grundlegende Verständnis der klinischen Aspekte der Wissenschaft von der Immunität gefördert. Es ist bekannt, daß abnorme immunologische Reaktionen ein weites Spektrum von Erkrankungen hervorrufen. Beispiele für Erkrankungen, von denen bekannt ist, daß sie mit Immunkomplexreaktionen verbunden sind, sind z. B. Serumkrankheit, Glomerulonephritis und Myasthenie gravis. Die Plasmapherese (Wiederzuführung von Blut nach Waschung in physiologischer Kochsalzlösung unter Ausscheiden des Blutplasmas) ist ein Verfahren, das angewandt wird, um den immuno-
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pathologischen Prozeß, der mit zirkulierenden humoralen Antikörpern und/oder Immunkonplexen des Plasmas verbunden 1st, zu beschränken, günstig zu beeinflussen oder zu unterbrechen (Glassman, Rationale for Plasmapheresis, "Plasma Therapy" Bd. 1 Nr. 1, S. 13 (1979)).
Ein bekanntes Verfahren besteht darin, ungefähr 4 Liter Blut innerhalb eines Zeitraums von 2-4 Stunden der Plasmapherese zu unterwerfen durch Zentrifugieren oder Kreuzfiltration (cross-flow Filtration). Das auf diese Weise von dem Patienten entfernte Blutplasma wird üblicher Weise verworfen und durch Albumin und entweder physiologische Kochsalzlösung oder Ringer*s Lösung versetzt, um das Gleichgewicht zwischen Proteinen, Elektrolyten und Wasser wiederherzustellen. Das ist ein aufwendiges Verfahren. Bei einem anderen Verfahren wird der Ersatz des entfernten Plasmas erreicht, indem frisches oder gefrorenes (und aufgetautes ) Plasma (pool plasma) zugeführt wird, und obwohl diese Methode weniger aufwendig ist, besteht hier die Gefahr der übertragung von Hepatitisviren auf den Patienten. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens (das als Immunopherese bezeichnet wird) werden diese Probleme überwunden, indem Immunglobuline, Euglobuline oder Euglobulin-Antigen-Komplexe, die die Erkrankung verursachen oder durch sie entstanden sind, selektiv entfernt.und gleichzeitig der Hauptanteil von Albumin, Elektrolyt (Salz) und Wasser ersetzt und so dem Patienten sein eigenes Plasma (im wesentlichen befreit von Ig oder Ig-Antigen-Komplex), das das entsprechende Protein enthält, wieder zuführt, ohne daß die Gefahr von Hepatitisübertragung besteht, da kein zusätzliches Albumin oder Spenderplasma erforderlich ist.
Der antihämophile Faktor oder antihämophiles Globulin (Faktor VIII, AHF oder AHG) ist einer der Bestandteile, die bei der Koagulation des Blutes eine Rolle spielen. Eine angeborene (erbliche) Störung der Blutkoagulation, nämlich Hämophilie,
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führt zu profusen Blutungen der Gelenke, Muskeln oder inneren Organe aufgrund einer geringen Verletzung. Diese Krankheit scheint auf einem Mangel an spezifischen Plasmaproteinen AHF zu beruhen. Von dieser Krankheit betroffene Patienten müssen bereits nach kleinen Verletzungen häufig ärztlich behandelt v/erden. Wenn eine Operation erforderlich ist, wird die Gerinnungsanomalie ausgeglichen durch die Transfusion von frischem Plasma oder durch Injektion eines Faktor-VIII-Konzentrats, wobei das letztere Vorgehen bevorzugt ist, da hierdurch eine Hyperproteinämie und mögliche Nierendysfunktion, die bei hohen TransfusionsVolumina auftreten kann, vermieden wird.
Bekannte Verfahren zur Bildung bzw. Gewinnung von AHF bestehen z. B. darin, daß man von Plasma (pool-plasma) ausgeht, in der Kälte einen Niederschlag (Kryopräzipitat) bildet, den Niederschlag, der hauptsächlich aus einem Gemisch aus AHF und Fibrinogen besteht, abzentrifugiert, das Fibrinogen entfernt und durch Lyc^hilisieren ein AHF-Konzentrat bildet. Diese Verfahren besitzen den Nachteil, daß sie lang und mühsam sind und die Gefahr der Übertragung von Hepatitis besteht, da Spenderplasma verwendet werden muß. Auch durch das Vorhandensein von Fibrinogen als Verunreinigung wird es schwierig, die AHF-Konzentrate in Lösung zu bringen. Außerdem tritt aufgrund der Tatsache, daß zwischen der Blutspende und der Anwendung des Plasmas einige Tage vergehen, ein beträchtlicher Verlust an AHF-Aktivität auf. Eine AHF-Einheit ist definiert als die in 1 ml eines durchschnittlichen, normalen, menschlichen Serums, das weniger als 1 Stunde alt ist, vorhandene Aktivität (100 % AHF-Gehalt). So kann der Verlust an Aktivität in flüssigem Plasma außerhalb des Körpers nach 6 Stunden bis zu 80 % betragen. Ein schnelles Verfahren zur Verarbeitung von AHF würde diesen Aktivitätsverlust verhindern. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung werden diese Probleme überwunden, da hier ein geeignetes (on-line real-time) Verfahren vor-
ir *
liegt. Daher kann die Gewinnung an AHF bis zu 4 bis 5 Mal so hoch sein, wie es mit den zur Zeit angewandten Verfahren, bei denen lange Zeiten vergehen, möglich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar auf kleinere Mengen von gesammelten Blut. Z. B. können 2-3 hepatitisfreie Familienmitglieder des an Hämophilie Erkrankten Plasma spenden und das AHF kann sofort innerhalb kurzer Zeit gewonnen werden," wobei man ein hepatitisfreies AHF mit sehr hoher Aktivität erhält. Die erfindungsgemäßen on-line Verfahren können auch angewandt werden zur Gewinnung von Faktor VIII von Spendern während der Plasmapherese.
Die erfindungsgemäß angewandten grundlegenden Techniken, d. h. die Plasmapherese und Elektrodialyse sind bekannt. Die neue Kombination dieser Techniken wie sie hier angegeben ist, führt zu einem Synergismus, d. h. einer verbesserten Wirksamkeit jeder Stufe, sowie der Kombination in unerwarteter Weise und macht diese Verfahrensstufen besonders geeignet für zeitgerechte in situ therapeutische Anwendungen für Patienten, bei denen die Entfernung Ig*s oder deren Komplexen erforderlich ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird für die Verwendung von Plasma und Molkenproteinen als bevorzugte Beispiele beschrieben, es kann jedoch auch auf andere biologische Flüssigkeiten und andere Proteine angewandt werden. Die Anwendung der Elektrodialyse zum Aussalzen oder alternativ Entsalzen, um eine Proteintrennung herbeizuführen, kann als sehr wirksames Mittel in der Hand des Proteinchemikers dienen.
Die Erfindung betrifft die Anwendung der Elektrodialyse zur Trennung von wässrigen Proteingemischen in Fraktionen mit deutlich unterscheidbaren Zusammensetzungen, wie durch bekannte physikalische oder chemische Verfahren bestimmt werden kann. Die Erfindung umfaßt die Fraktionierung oder teilweise Auftrennung von Proteingemischen und anschließende Wiederherstellung ihres Salz- und Wassergleichgewichtes. Sie be-
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trifft nicht nur die Fraktionierung durch Salzentfernung (Entsalzung), sondern auch durch Salzzusatz (Aussalzen). Die Proteingemische sind in erster Linie (Jedoch nicht ausschließlich) Plasma, Serum oder davon abgeleitete Fraktionen. Bei dem zum Entsalzen angewandten Elektrodialyse-Verfahren ■werden gelöste Salze (Ionen) entfernt und folglich werden Euglobuline oder ihre Komplexe im wesentlichen durch Verringerung der lonenkonzentration ausgefällt, gegebenenfrails kombiniert mit Temperatur und /oder pH-Wert-Änderungen. Nach Entfernung der Salze ist die Wechselwirkung zwischen Salz-Ionen und ionisierbaren Gruppen der Proteine offentsichtlich vermindert, wodurch eine Wechselwirkung zwischen den Euglobulin-Molekülen und dadurch eine Ausfällung dieser Globuline auftritt. Albumin und andere Proteine, die keine Euglobuline sind, fallen bei den (niederen) Salzkonzentrationen, die für die
und/ Euglobuline geeignet sind, nicht aus bleiben daher für die Zurückführung an den Patienten oder zur Gewinnung in Lösung. Nach Entfernung der durch die Euglobuline auftretenden Trübung (oder des Niederschlags) kann die lonenkonzentration des Plasmas gegebenenfalls wieder im wesentlichen auf ihren Anfangswert gebracht werden, in/dem das von Salz befreite Plasma als salzaufnehmender Strom in einer Elektrodialyseanordnung angewandt wird. Das von Salz befreite Plasma wird so im wesentlichen wieder rekonstituiert, bezüglich der Elektrolyte (und Wasser) und kann direkt dem Spender oder dem Patienten wieder zurückgegeben werden, ohne daß weitere Modifikationen des Salz- oder Wassergehaltes erforderlich sind.
Bei der Ausführungsform, bei 3er ausgesalzen wird, wird Salz in das Proteingemisch gegeben, um verschiedene Proteine, eines nach dem anderen, mit zunehmender Ionenstärke auszufällen. Die Aussalzungsmittel dieser Gruppe wirken offensichtlich so, daß sie die Aktivität des Wassers in dem Losungsgemisch herabsetzen und dadurch die hydrophilen Gruppen der Protein-
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moleküle dehydratisieren und dadurch zu einer Ausfällung der Proteine führen.
Bei einer dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden bestimmte Mittel zugesetzt, z. B. Metallionen, kleine Anionen und Polyanionen (Polyphosphate usw.)» die zu einer Ausfällung bzw. Trübung führen, offensichtlich aufgrund unterschiedlicher Mechanismen, wodurch die elektrostatischen Ladungen einiger kritischer Gruppen an dem Protein offenbar angegriffen werden. Da eine Ionisierung dieser kritischen Gruppen erforderlich ist, um einen normalen Hydratisierungszustand des Proteinmoleküls aufrechtzuerhalten, wird die Ausfällung häufig eingeleitet durch eine bloße Kompensierung der elektrischen Ladungen der Proteinmoleküle. Derartige Mittel brauchen nur in niedrigen und genau bestimmten Konzentrationen angewandt zu werden, da der Mechanismus nicht von der Menge abhängt (not bulk effect). Mit Hilfe der Elektrodialyse ist dies in ausgezeichnet geregelter Weise möglich.
Bei bekannten Verfahren werden diese Mittel direkt zugegeben, was zu starken lokalen Wirkungen "führt. Bei der Elektrodialyse können alle die oben angegebenen Ausführungsformen · nach der Erfindung leicht durchgeführt werden und die Fraktionierung kann leicht gesteuert oder in einigen Fällen sogar verstärkt werden.
Einige Ausführungsformen nach der Erfindung umfassen Verfahren zur Fraktionierung von flüssigen Proteingemischen, die gelöstes Salz oder Salze enthaltendurch Anwendung von Elektrodialyse-(ED)-Vorrichtungen mit einem oder mehreren Paaren an salzaufnehmenden und salzverdünnenden Kammern, die voneinander durch ionenselektive, neutrale (nicht selektive) oder Kombinationen von neutralen und ionenselektiven Membranen getrennt sind. Bei einer Ausführungsform wird elek-
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7 -14
trischer Strom zwischen Endelektroden erzeugt, um den Salzgehalt eines in den Salzverdünnungskammern enthaltenen Proteingemisches zu verringern, indem die Salze aus diesen Kammern in angrenzende salzaufnehmende Kammern übergehen. Dieses Entsalzen wird fortgesetzt bis eine Trübung auftritt. Die Bildung der Trübung kann gegebenenfalls erleichtert werden durch vorherige, gleichzeitige oder anschließende Änderung des pH-Wertes und/oder der Temperatur. Das im wesentlichen entsalzte Proteingemi.c;cn aus der Verdünnungskammer wird gerammelt und so aufgearbeitet, daß r-\no oder mehrere der die Trübung verursachenden Proteinkomponeriten abgetrennt oder entfernt wird. Gegebenenfalls wird anschließend das von Salz befreite Proteingemisch in die salzaufnehmendoii Kammern geleitet, wobei die in diese Kammern aus den Verdünnungskammern eintretenden Salze dazutühren, daß das von. Salz befreite Proteingemisch im wesentlichen wieder seinen ursprünglichen Salz- und Wassergehalt enthält. Eine derartige Renormalisierung ist erwünscht, wenn das Proteingemisch Blutplasma ist, das dem Spender wieder zurückgegeben werden soll.
Das oben beschriebene Verfahren ist besonders wirksam, wenn das flüssige Proteingemisch Blutplasma oder -serum ist, wenn die entfernten Proteinkomponenten Globuline und/oder ihre Komplexe sind und wenn zumindest eine der Membranen in jedem Paar ionenselektiv ist.
Ein alternatives Verfahren zur Durchführung der oben beschriebenen Ausführungsform, bei der zumindest eine der Membranen in jedem Paar ionenselektiv ist, besteht darin, das entsalzte Proteingemisch aus der Verdünnungskammer der ED-Anordnung zu gewinnen, eines oder mehrere der ausgefällten Proteine aus dem entsalzten Proteingemisch zu entfernen und anschließend das an Salz und Protein verarmte Gemisch wieder in die ursprüngliche Verdünnungskammer zu führen. Es wird ein Gleichstrom einer solchen Polarität angelegt, daß die früheren Verdünnungskammern, die jetzt ein an Salz verarmtes Gemisch enthalten, die salzkonzentrierenden oder auf-
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·■· * Cfc
nehmenden Kammern werden und die vorherigen aufnehmenden Kammern Salze enthalten, die "bei dem ersten Teil des Verfahrens entfernt worden sind( und nun Verdünnungs- oder Ent- ' fernungskammern werden, wodurch der ursprüngliche Salz- und Wassergehalt des entsalzten Proteingemisches wiederhergestellt wird.
Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Ausfällung oder Trübung erreicht werden durch Aussalzen, d. h. Zugabe eines Aussalzungsmittels zu dem Proteingemisch. Derartige Mittel sind z« B. Sulfate (Na2SCv, K2SO^, (NH^^SO^, MgSO^ usw.), Acetate (Natrium- oder Kaliumacetat usw.), Citrate (Natrium- oder Kaliumeitrat usw.)> Chloride (NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, LaCl^) und andere im wesentlichen nicht toxische, lösliche Salze. Die angewandte Elektro-.dialysevorrichtung ist ähnlich der im ersten Falle beschriebenen. Das an Salz angereicherte Proteingemisch, in dem die Trübung aufgrund des Aussalzens durch ein entsprechendes Mittel, z. B. Na2SO., aufgetreten ist, wird gesammelt und behandelt, um die eine oder mehrere Prpteinkomponenten, die die Trübung verursachen, zu entfernen. Der salzliefernde (zur Verarmung führende) Strom enthält das Aussalzmittel oder alternativ das mit Salz angereicherte Plasma, das nach Entfernung des Niederschlags erhalten worden ist. So können im wesentlichen gleichzeitig beide Verfahrensstufen durchgeführt werden, d. h. Entfernung des Ausfall- oder Aussalzmittels und Zu-. . gäbe dieses Mittels zum Aussalzen. Der an Salz verarmte Proteinstrom kann dann wieder zu der ursprünglichen Quelle (Spender) zurückgeführt werden, gegebenfalls nach Wiederherstellung des Elektrolytgleichgewichtes auf im wesentlichen den ursprünglichen Salz- und Wassergehalt.
Das oben beschriebene Aussalzverfahren ist besonders dann anwendbar, wenn das flüssige Proteingemisch Blutplasma oder -serum ist und wenn die entfernten Proteinkomponenten ■^-Globulineund/oder ihre Komplexe sind. Durch die Elek-
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trodialyse kann das Ausfällmittel in gesteuerter Geschwindigkeit zugegeben werden, was einen sehr wichtigen Faktor darstellt. Eine langsame Zugabegeschwindigkeit des Ausfällmittels führt zur Bildung von kristallinen Proteinniederschlägen mit größerer Reinheit des Proteins,die wesentlich weniger adsorbierte Verunreinigungen enthalten, verglichen mit den feineren. Proteinflocken, die bei schneller. Zugabe des Aunfällraittels ausfallen und die Proteine enthalten können, die bei langsamer Zugabe nicht ausfallen -würden.
Bei einer weiteren Ausführungsform nach der Erfindung kann die Ausfällung hervorgerufen werden durch Veränderung des pH-Wertes durch ED, um den pH-Wert im wesentlichen auf den iso-elektrischen Punkt (pi) einer bestimmten Proteingruppe, z. B. der ^-Globuline im Falle von Blutplasma zu bringen. Das Aussalzen kann bei einer niedrigeren Salzkonzentration erreicht werden, wenn nahe dem iso-elektrischen Punkt des . Proteins gearbeitet wird. Die Ausfällung durch Entsalzen kann bei einer höheren Salzkonzentration erreicht werden, wenn nahe dem iso-elektrischen Punkt gearbeitet wird.
Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die Proteinfraktionierung auch durchgeführt werden durch Zugabe von z. B. Zinkglycinat (Endkonzentration ungefähr 20 mM) bei einem pH-Wert von ungefähr 7,2 mit Hilfe der Elektrodialyse. Das Zinkion (Zn++) führt zur Ausfällung verschiedener Proteine (X-Globuline, Fibrinogen, usw.) im Plasma, ohne daß Albumin entfernt wird. Dieses Verfahren ist ähnlich dem oben erwähnten Aussalzverfahren, in^dem in der Verdünnungskammer Zinksalz entfernt wird und in der Konzentrierungskammer, die das Proteingemisch enthält, angereichert wird, wodurch Ausfällung eintritt. Die erforderliche Menge an Zn++ ist sehr klfein, verglichen mit vielen anderen Aussalzmitteln, da der Mechanismus der Ausfällung offensichtlich nur darin besteht, daß die negativen elektrischen Ladungen des MoIe-
/10
1H
kills kompensiert werden. Der Ladungsausgleich der verbleibenden ionischen Gruppen ist 0 und das im wesentlichen neutrale ProteinmolekUl ist offensichtlich nicht in der Lage, ausreichende Mengen Wasser anzuziehen, um in Lösung zu bleiben.
Es ist für den Fachmann klar, daß einige der oben beschriebenen Techniken und Ausführungsformen miteinander kombiniert werden können. Z. B. kann bei der Abtrennung bestimmter .y~-Globuline von Plasma eine direkte Zugabe von Aussalzmittel kombiniert v/erden mit einer Elektrodialyse zur Entfernung des zugesetzten Salzes, um eine Lösung zu erhalten, die verhältnismäßig reich ist an Albumin (nach Entfernung des Globulinniederschlags).
In den Beispielen wird NapSCL als bevorzugtes Aussalzmittel angewandt. Es können jedoch auch andere derartige Mittel verwendet werden. Es können auch andere Salze und deren Gemische angewandt werden, um das Fraktionierungsverfahren zu verfeinern.
Die Elektrodialyse (ED) wird verbreitet angewandt zum Entsalzen von wässrigen Lösungen wie z. B. Abwasser, Molke, usw. (US-PS 3 433 726; 3 447 939; 3 595 766; 3 757 005; 3 754 usw.). Diese Patentschriften beziehen sich nur auf die Verringerung'des Salzgehaltes einer Flüssigkeit und nicht auf die Anwendung des ED-Verfahrens in einem komplexen Schema bei der Fraktionierung und anschließende Wiedereinstellung des Salzgleichgewichtes und Wassergehalts bei einem Gemisch von Proteinen wie es z. B. für therapeutische Zwecke in Fällen der Plasmapherese vorgesehen ist.
Ein Entsalzen durch Verwendung von Ionenaustauschersäulen, wurde angewandt, um eine Ausfällung und damit Fraktionierung von Plasmaproteinen zu erreichen (US-PS 3 234 199; 3 073 744). Dieses Verfahren besitzt jedoch nur eine geringe Flexibilität
/11
-Vf-
und die Säulen sind schwierig zu handhaben, zu reinigen und zu sterilisieren, wenn sie unter Bedingungen angewandt werden sollen, wie sie für die Proteinfraktionierung erforderlich sind.
Es hat sich nun gezeigt, daß die Elektrodialyse nicht nur zur Fraktionierung von Proteinen aufgrund eines Entsalzens angewandt werden kann, sondern auch beim Aussalzen, sowie zur Wiederherstellung des Elektrolyt-(Salz) und Wassergleichgewichtes der entstehenden Proteingemische. Das entstehende Protein (Gemisch) kann somit direkt wieder an den Spender oder an einen Patienten verabreicht werden und enthält im wesentlichen seine ursprünglichen Salze. Die Kombination dieser oben angegebenen Verfahren umfaßt als wesentliche Stufen die .Elekiradiärjse des Proteingemisches (gegebenenfalls kombiniert mit einer Änderung von Temperatur und pH-Wert) und die Abtrennung bestimmter ausgefällter Proteine und anschließend gegebenenfalls im wesentlichen die Wiederherstellung des Wasser- und Salzgleichgewichtes des ursprünglichen Gemisches. Durch dieses neue Verfahren wird die Wirksamkeit jeder Stufe auf unerwartete Weise erhöht und das Verfahren wird außerordentlich geeignet, besonders zur zeitgerechten in si tu-Anwendung^ für Plasmapherese-Patienten, wenn eine Entfernung von Globulinen oder ihren Komplexen erforderlich ist, zusammen mit einer WiederherStellung im wesentlichen des ursprünglichen Plasmas. Durch dieses Verfahren werden nicht nur die Kosten für den Ersatz von Albumin und Salz vermieden, sondern auch die bei der Verabreichung von frischem oder gefrorenem pool-Plasma auftretenen Gefahren der Hepatitisübertragung vermieden.
Das Verfahren und die Vorrichtung für eine erste Ausführungsform der Fraktionierung durch Entsalzung werden im folgenden in Bezug auf die Fig. 1 und 2 beschrieben, bei denen gleiche Teile mit gleichen Ziffern bezeichnet sind. Im Zusammenhang mit den Figuren wird als zu behandelnde Flüssigkeit von Blutplasma ausgegangen; es kann jedoch auch irgend-
*) (in situ real-time therapeutic use) /^2
ein anderes Proteingemisch angewandt werden. Wie in Fig. 1 gezeigt, wird citratisiertes oder heparinisiertes Blut (1) ultrafiltriert und/oder zentrifugiert (2), um die Zellbestandteile (3) abzutrennen oder irgendeine andere Suspension (als geformte Elemente (FE) bezeichnet) und das verbleibende Plasma (15) wird in eine Elektrodialyse (ED) Anlage (4) geleitet (z. B. eine handelsübliche von Ionics, ■ Inc. Watertown, Ma.). Elektrodialyse Vorrichtungen und ihre Arbeitsweisen sind näher beschrieben in den US-PS 2 848 403; 2 863 813; 3 003 940; 3 341 441; 4 115 225 u.a.. Eine solche Dialysevorrichtung bzw. ein Stapel umfaßt üblicher Weise ein oder mehrere Paare von Konzentrations- und Verdünnungskammern, die abwechselnd durch Anionen- und Kationenaustauschermembranen getrennt sind. Ionenselektive Membranen können unter bestimmten Umständen auch ersetzt werden durch im wesentlichen elektrisch neutrale Membranen. So kann die Anionmembran ersetzt werden durch eine neutrale Membran, wenn eine verringerte Stromausbeute für den Ionenübergang .toleriert werden kann. Die Kammern sind zwischen einer Anode (+) und einer Kathode (-) lokalisiert. Eine Elektrolyt - Lösung wird vorzugsweise durch die Kathoden- und Anodenkammern geleitet, um den *) durch die Konzentrations- und Verdünnungskammer zu ermöglichen. Der elektrische Strom wird solange durchgeleitet, bis zumindest eine beginnende Trübung auftritt oder bis eine derartige Trübung entsteht, wenn die Temperatur verringert und/oder der pH-Wert im wesentlichen auf den iso-elektrischen Punkt des am wenigsten löslichen Proteins eingestellt wird. Üblicherweise isoliert eine Konzentrationskammer die Elektrodenlösungen von den Produkt- oder Verdünnungskammern. Die Membranen werden im allgemeinen aber nicht notwendigerweise, so gewählt, daß der Übergang von niedermolekularen Verbindungen wie Blutzuckern minimalisiert wird. Die Durchflußgeschwindigkeiten durch den Stapel und der angelegte elektrische Strom (Spannung) werden so gesteuert, daß zu starke Veränderungen des pH-Wertes vermieden werden. Plasma · wird in und durch die Verdünnungskammern hindurchgeleitet
*) Stromdurchgang ,
Λ « * « »-Ί #· «MAU Ψ m *
durch Anlegen eines Gleichstroms über die Elektroden, der Salz- oder Ionengehalt des Plasmas wird verringert aufgrund des Übergangs des Salzes in die angrenzenden Konzentrationskammern, (beachte die vertikalen Pfeile in dem Stapel) in die zuvor, wenn dies erwünscht ist, eine kleine Menge Plasma oder Albumin gegeben werden kann. Das entstehende, im wesentlichen entsalzte Plasma (5) wird von den Verdünnung kammern (nicht gezeigt) gesammelt und in Vorrichtungen zur Abtrennung und Entfernung von einem oder mehreren die Trül/ai;" verursachenden Proteinen (Globuline oder ihre Komplexe in diesem Fall) geleitet. Die Trennvorrichtuncen können z. B. aus einem Wärmeaustauscher (6) zur Verringerung der Temperaturen und/oder Vorrichtungen zur Einstellung des pH-Wertes, zum Zentrifugieren und/oder Ultrazentrifugieren (7) bestehen. Nach Entfernung der, die Trübung verursachenden oder ausgefällten Globuline (17) oder anderer Proteine wird das von Salz bereite Gemisch (8) in und durch die Konzentrationskammern (nicht gezeigt) des ED-Stapels (4) geleitet, wo es die Salze aus den benachbarten Verdünrungskammern aufnehmen kann (vertikale Pfeile) und dadurch der ursprüngliche Salzgehalt des Gemisches im wesentlichen wiederhergestellt. Das Gemisch, das wieder die Salze enthält (9) wird anschließend gegebenenfalls durch einen Wärmeaustauscher (10) geleitet, um das Gemisch ungefähr auf Körpertemperatur zu bringen, soweit dies erforderlich ist und dann durch die geformten Bestandteile (z. B. rote und weiße Blutkörperchen und Plättchen) ergänzt, die vorher von dem Plasma entfernt worden waren. Dieses wiederhergestellte Proteingemisch (12) kann dem Patienten (14) im wesentlichen ohne Zugabe von Albumin oder Elektrolyt von außen wieder verabreicht werden. Daher handelt es sich im wesentlichen um einen geschlossenen Kreislauf, der angewandt werden kann für zeitgerechte in situ-Verfahren für einen therapeutischen Plasmaaustausch.
Wenn die Temperatur des Plasmas während der Elektrolyse im Bereich von ungefähr 0 - 40 C gehalten wird, wenn die
/14
Geschwindigkeit des Proteingemisches in den Verbindungskammern im Bereich von 3-40 cm/s liegt und das Verhältnis von Stromdichte (CD)in mA/cm zu Leitfähigkeit der Proteinlösung (K) in mS/cm (^) im Bereich von 0,1" 10 gehalten wird, treten keine nennenswerten pH-Änderungen in dem Protein auf und der so entstandene Niederschlag (selbst bei verhältnismäß vollständigem Aussalzen) ist so beschaffen, daß ein Verstopfen der Kammern des ED-Stapels im v/es ent lichen vermieden wird (mS = m-TV" ).
In Fig. 2 ist eine andere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des Verfahrens angegeben. Die · Flüssigkeit ist wieder Plasma .(1), kann jedoch auch ein anderes flüssiges Proteingemisch sein. (Citrat oder Heparin können zugesetzt sein oder nicht, um die Koagulation des Plasmas während des Verarbeitens möglichst gering zu halten). Das Plasma - ob heparinisiert oder citratisiert oder nicht wird ultrafiltriert oder zentrifugiert (2), um die Trübung. zu entfernen und dann in den ED-Stapel (4) geleitet, ähnlich wie bei Figur 1 beschrieben. Plasma wird in die (nicht gezeigten) Verdünnungskammern geleitet und beim Durchleiten eines Gleichsstroms durch den Stapel werden Salze aus dem Plasma (vertikale Pfeile) in die Konzentrationskammern transportiert. Das von Salz befreite Gemisch (5) aus den Verdünnungskammern wird durch den Wärmeaustauscher (6) geleitet, um·das Plasma zu kühlen, und der entstandene Niederschlag
(17) wird, mit Hilfe eines Ultrafilters oder einer Zentrifuge (7) oder einer ähnlichen Vorrichtung abgetrennt. Die von Salz befreite, überstehende Flüssigkeit (8) wird dann in die Salzkonzentrationskammern (nicht gezeigt) eines Elektrodialyse-Stapels (18) geleitet. Für diese zweite ED-Operation ist ein zweiter ED-Stapel (18) angegeben. In der Praxis kann jedoch auch der ED-Stapel (4) angewandt werden, wo der ursprüngliche Konzentrationsstrom (19) des ED-Stapels (4) den Verdünnungsstrom bildet. Die Polarität des ED-Stapels
(18) kann entgegengesetzt sein, wie in dem ED-Stapel (4).
*) (Lösung)
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Diese zweite Elektrodialyse (18) führt dazu, daß die Salze aus dem ursprünglichen Konzentrationsstrom (19) wieder dem entsalzten Plasma zugeführt werden, wodurch das Salzgleichgewicht wiederhergestellt wird. Dieses normalisierte Plasma (9) wird dann durch einen Wärmeaustauscher (10) geleitet und die Blutkörperchen oder FE (3) werden zugesetzt. Das so bearbeitete Blut kann wieder dem Spender oder einem anderen Patienten (14) verabreicht werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert .
Beispiel 1
Dieses Beispiel erläutert die Wiederherstellung des Elektrolyt- und Wassergleichgewichts eines entsalzten Plasmas unter Verwendung von frischem Plasma in dem Verdünnungsstrom .
Die angewandte Vorrichtung war ein Labor-Elektrodialyse-Stapel, wobei nur ein Zellpaar (d. h. eine Verdünnungsund Konzentrationskammer, die durch ionen-selektive Membranen voneinander getrennt waren) angewandt wurde, das sich zwischen terminalen Elektrodenkammern befand. Eine 0,2 η Na2SOr-Lösung wurde für den Elektrodenstrom angewandt, um den Gleichstrom zu leiten. Ein Volumen von 360 ml citratisiertem, aber sonöt frischem.Plasma wurde als Verdünnungsstrom angewandt und 3^0 ml entsalztes Plasma wurden in dem Konzentrationsstrom angewandt. Die lineare Geschwindigkeit des VerdünnungsStroms betrug ungefähr 25 cm/s, die Temperatur wurde auf 15 - 20°C gehalten und die Pließgeschwindigkeiten auf 90 ml /min je Zellpaar. Die wirksame Zellfläche betrug 220 cm . Das Fortschreiten des Verfahrens ist zusammengefaßt in der folgenden Tabelle angegeben.
/16
CD/K Zeit
(min.) 		A Verdünnungsstrom
(citratisiertes.
frisches Plasma)
(spez.) ,
Leitwert PH Vo1·
(K) 		8,2 360 Konzentrationsstrom
(entsalztes Plasma)
(spez.)
Leitwert PH %1-
GO 		5,2 340
4,7 0 17 16,500 7,4 352 Ό,030 7,2 347
4,7 6 8,8 8,600 6,9 347 8,500 7,7 350
4,7 12 4,4 4,300 6,1 344 12,400 8,0 353
5,0 25 0,9 0,825 5,2 342 15,600 8,3 355
27,5 35 0,2 0,033 16,400
So wurde das entsalzte Plasma in dem Konzentrationsstrom wieder auf einen Leitfähigkeitswert ( spezifischen Leitwert) gebracht, der mit demjenigen des ursprünglichen citratisierten Plasmas vergleichbar war, und das Wassergleichgewicht wurde wiederhergestellt.
Beispiel 2
Während der in Beispiel 1 angewandte ED-Stapel ionenselektive Membranen (Anionen-und Kathionenmembranen) enthielt, kann auch die Kombination von ionen-selektiven Membranen mit neutralen (nicht selektiven) Membranen angewandt werden. In diesem Beispiel war bei dem Stapel des Beispiels 1 die anionen-selektive Membran ersetzt durch eine neutrale Membran aus regenerierter Cellulose. Andere bekannte neutrale Membranen wie Membranen zur umgekehrten Osmose oder Dialyse können, wenn dies erwünscht ist, ebenfalls angewandt werden. Neutrale Membranen besitzen den Nachteil, daß sie nicht so wirksam sind wie ionen-selektive Membranen. Bei Verfahren, bei denen der Energieaufwand nicht von wesentlicher Bedeutung ist, können derartige
/17
3Ί
- Vt -
► · * m
Membranen jedoch ebenfalls vorteilhaft angewandt werden.
In diesem Beispiel wurde der Stapel, der die Membran aus regenerierter Cellulose enthielt, angewandt unter Verwendung im wesentlichen der gleichen Lösungen und Bedingungen wie in Beispiel 1 angegeben. Im folgenden ist summarisch der Verlauf dieses Verfahrens angegeben.
Zeit
(min.)		 A 0 Verdünnungsstrom
(citratisiertes.
frisches Plasma)		 Leit-
PH		 ■\jb1. Konzentration^strom
(untnalztoc Plnr.rnn )		 PH Vol.
CD/K 0 12, 2 (spez.)
wert (K)		 8,2 360 (spez.) Leit
wert (K)		 5,3 340
3,3 14 6, 1 16,500 7,4 350 0,050 7,4 350
3,3 27 3, 6 8,, 700 6,9 342 8,480 7,7. 355
3,3 57 0, 2 4,300 6,1 337 l?,390 8,0 360
3,3 80 0, 0,830 5,2 334 15,450 8,2 363
23,3 0,039 16,420
Auch hier wurde das entsalzte Plasma wieder auf eine Leitfähigkeit gebracht, die mit derjenigen des ursprünglichen frischen Plasmas vergleichbar war und auch das Wassergleichgewicht wurde wieder hergestellt. Es ist festzustellen, daß die längere Arbeitszeit (80 Minuten) darauf zurückzuführen ist, daß die Wirksamkeit des Stroms wesentlich geringer ist bei einer Kombination von neutralen und Kationenaustauschermembranen.
Beispiel 3
Dieses Beispiel ist ähnlich wie das Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß entsalztes Plasma in dem ursprünglichen Verdünnungsstrom des Beispiels 1 angewandt wurde und eine Wasserlösung, die die bei einer vorhergehenden Entsalzungsstufe entfernten Salze enthielt, als ursprünglicher Konzentrationsstrom angewandt wurde. Die Polarität des Stromes
» ·♦···· V If „
wurde umgekehrt (wodurch die ursprünglichen Konzentrationskammem zu Verdünnungskammern und die ursprünglichen Verdünnungskammern zu Konzentrationskammern wurden) und die Salze aus dem Salz-Wasser-Strom wurden in das entsalzte Plasma (jetzt der Konzentrationsstrom) übergeführt, um die Salze aus dem Plasma wieder auf die ursprüngliche Konzentration zu bringen.
Beispiel h-
Dieses Beispiel zeigt die Entfernung von Immunglobulinen (Ig) als Funktion des Entsalzungsgrades.
Es wurde die in Beispiel 1 beschriebene Vorrichtung angewandt mit 200 ml heparinisiertes menschliches Plasma in der Verdünnungskammer. Die Temperatur lag im Bereich von
10 - 260C und der CD/K-Wert betrug ungefähr 4 . Es
mS/cm wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 25 cm/s gearbeitet. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse zusammengefaßt. Daraus geht hervor, daß ungefähr 50% der Gesamt-Ig's, während die Entfernung von (der Gehalt an) Albumin nach 99,79oigem Entsalzen im wesentlichen unverändert blieb.
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pH Leit % Ent In der überstehenden Flüssig IgA (mg/100 Proteine
7,55 fähigkeit salzung keit enthaltene 115 ml)
7,55 15,280 0 85 IgM
Zeit,
(imn.)		 7,35 13,720 0 80 72 Albumin
O 7,10 7,020 48,80 IgG 75 50 4 410
O 6,55 3r710 72,96 820 75 46 3 900
5 5,40 1,310 90,60 750 55 36 3 900
8 5,20 0,447 96,70 780 50 24 3 900
10 4,90 O5.190 98,60 700 40 12 4 100
13 5,00 0,047 *99,70 630 45 10 4 000
15 5,10 0,028 99,80 570 45 16 4 000
17 0,022 99,84 450 12 3 900
19 410 10 3 800
20 410 1 800
410
* Summe der % an Ig's, die nach 99,7%igem Entsalzen entfernt worden waren
% entfernt
IgG 45«3
IgA 52,9
IgM 68,0
gesamt Ig's* 47,3
Beispiel 5
% entfernt (korrigiert für Wasser-Übergang
46,7 55,9 71,4 49,7
Dieses Beispiel erläutert eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform, bei der durch eine Änderung des pH-Wertes im wesentlichen auf den iso-elektrischen Punkt eines Proteins, das entfernt werden soll, die Ausfällung erleichtert wird. Durch Fortsetzung des Entsalzens des in Beispiel 4 entstehenden Plasmas sinkt der pH-Wert auf den iso-elektrischen Punkt (pi) von Albumin (ungefähr 4,9), wodurch dieses ausfällt. Der Albuminniederschlag wird abfiltriert und dann durch Zusatz von Salz wieder suspendiert. Diese Zugabe wird mit Hilfe der ED erreicht, indem das albumin-
/20
ν ι ·
* ♦
atf -
reiche Material als Salzkonzentrat ions strom angewandt wird, wodurch eine 3 - 5%ige isotonische Albuminlösung entsteht. Dieses Albumin ist im wesentlichen frei von Immunoglobulinen und ihren Komplexen und kann als Plasma-Ersatz (Plasma-Expander) verwendet werden. Das ist ein bevorzugtes Verfahren für Fälle, in denen mehr als 40 - 50 % der Immunglobuline entfernt werden sollen, mit Hilfe der "Immunpherese" (Entfernung von Immunoglobulinen) bei Autoimmun-Erkrankungen. ■ ·
Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Fraktionierung durch "Aussalzen" erreicht, d. h..die Anwendung von Salzen wie (NH^)2SO,, Na2SO, usw., die durch Elektrodialyse in das Proteingemisch eingebracht werden. Die verschiedenen Proteine fallen bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen aus und. es tritt dadurch eine Fraktionierung ein. Ein deutlicher Vorteil des Zusatzes der Salze durch Elektrodialyse anstelle der direkten Zugabe besteht darin, daß mit Hilfe der ED eine besser gesteuerte Zugabe der Salze möglich ist, wodurch lokale Konzentrationsgradienten vermieden werden. Das "Aussalzen" durch Elektrodialyse ist auch wesentlich schneller im Vergleich zur Dialyse allein, wo nur die Diffusion (und nicht ein elektrisches Potential) der treibende Mechanismus ist. Vergleichbare Fraktionierungen werden durch ED bei einem wesentlich geringeren Salzgehalt erreicht, sowohl verglichen mit der direkten Zugabe als auch mit der Zugabe des Salzes durch Dialyse.
Die Vorrichtung und das Verfahren, die zum Aussalzen angewandt werden, werden in folgenden für die Fraktionierung von Blutplasma-Proteinen näher erläutert, sind jedoch nicht auf Plasma beschränkt. Zwei Ausführungsformen für das "Aussalzen" sind in den Figuren 3 und 4 angegeben. Wie aus Fig. 3 hervorgeht, wird frisches Plasma (15) als Konzentrationsstrom (salzaufnehmender Strom) durch die beiden Elektro-
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dialyse-Stapel (4) und (11) geleitet. Das entstandene ausgesalzene Plasma (22) wird in Trennvorrichtungen (7) wie eine Zentrifuge geleitet, wo etwaiges ausgefälltes Protein (17) abgetrennt wird. Die entstandene überstehende Flüssigkeit (8), die der Verdünnungsstrom für den ED-Stapel (11) wird, ist im wesentlichen ein Albuminfiltrat, das das Aussalzmittel (wie Na2SOi), enthält, von dem eine ausgefällte Proteinfraktion (17) entfernt worden ist (z. B,. Immunoglobuline und Fibrinogen) . Dieser Strom gibt seine Salze ab (senkrechte Pfeile), wenn ein Strom durch den ED-Stapel geleitet wird, d. h. das Aussalzmittel wird in einen Strom aus frischem Plasma (15) übertragen, wodurch die Ausfällung bestimmter Proteine (Globuline) von dem frischen Plasma verursacht wird. Dieser Ver dünnungsstrom (8) wird umgekehrt arm an Salzen und es entsteht im weseilichen eine Albuminlösung. Der letzte oder Äufarbeitungs-ED-Stapel (4) ist in der Figur getrennt angegeben, kann jedoch auch Teil eines einzigen ED-Stapels sein. Diese Aufarbeitungsstufe ist nicht unbedingt erforderlich, wenn das Produkt (9) Salze enthalten darf, die für eine Infusion nicht schädlich sind. Ein Ergänzungselektrolyt (20) kann erforderlich sein, wenn die Aufarbeitungsstufe angewandt werden muß. Ein derartiges Verfahren ist verträglich mit einer in situ-Arbeitsweise für einen therapeutischen Plasmaaustausch und kann nicht nur ansatzweise bzw. diskontinuierlich sondern auch kontinuierlich durchgeführt werden.
Eine andere Variante des Aussalzens nach der Erfindung ist in Fig. 4 gezeigt. Hier wird das Aussalzmittel (Salzlösung) direkt zu dem Plasma (15) zugesetzt, wodurch die Immunoglobuline ausfallen und abgetrennt (7) und z. B. durch Filtration entfernt (17) werden. Das entstehende Plasma (16), das als Verdünnungsstrom angewandt wird, wird durch den ED-Stapel (4) entsalzt, wobei der Konzentrationsstrom (18) im wesentlichen eine Lösung des Aussalzmittels
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wird. Diese konzentrierte Lösung (19) kann direkt zu frischem Plasma (15) in einem geschlossenen Kreislauf zugegeben werden. Elektrolyse (20) und geformte Teilchen (3) können zu der entsalzten Albuminlösung (9) zugegeben werden, bevor die Lösung (12) wieder an den Spender oder an Patienten (14) verabreicht wird. Obwohl Na2SO, als Aussalzmittel bevorzugt ist, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt. Andere Salze und ihre Gemische wie KpSO^, (NH^)2SO^j4, Natriumeitrat, Phosphate, NaCl, KCl, Acetate, usw. und ihre Gemische können ebenfalls angewandt werden. Die Menge an zugesetztem Salz hängt natürlich von der gewünschten Fraktionierung ab. . .
Im folgenden Beispiel ist die Abtrennung von IgG von Albumin beschrieben.
Beispiel 6
300 ml Plasma wurden auf 28bis37°C erwärmt und eine gesättigte Lösung von Na SO^ (ungefähr 6n) von 28bis 37°C wurden mit einer Geschwindigkeit von 10bis15 ml/min zugegeben, während.das Plasmagemisch konstant und schnell gerührt wurde. Die in der überstehenden Flüssigkeit verbleibende Menge an Albumin und Globulinen (IgG) wurde während der Salzzugabe als Funktion der Salz- (Elektrolyt-) Konzentration in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt.
In Fig. 5 sind die Ergebnisse angegeben, die bei Anwendung verschiedener Methoden der Zugabe des Ν3230^-Ε.1β^Γθ1γΐβη erzielt wurden. Die Figur zeigt auch die ungefähre Proteinfraktionierung (Albumin und IgG1s), die bei unterschiedlichen Elektrolytstärken auftritt. Ebenfalls angegeben ist die Fraktionierungskurve, die man erhält, wenn ein Salzgemisch (6n NaCl und 6n Na2SO^) angewandt wird. Ein Vergleich des Aussalzens mit Hilfe der Elektrodialyse, Dialyse und direkter Zugabe des Salzes geht aus der Figur
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hervor.
Die Ergebnisse zeigen, daß um eine 8O96ige Entfernung von Globulinen (IgG's) von dem frischen Plasma zu erzielen, eine Konzentration von 1,8 η Salz (Na2SUA) in dem Plasma (überstehende Flüssigkeit) erforderlich ist, wenn ein direktes Zugabeverfahren angewandt wird* Unter diesen Bedingungen tritt jedoch auch eine gleichzeitige Entfernung (Verlust) von ungefähr 15 % Albumin ein. Wenn ein Salzgomisch (Na2S0» + NaCl) direkt zugegeben wird, kann eine 80%ige Entfernung von Globulinen bei ungefähr 2,05 η Salz, erreicht werden, wobei nur eine 5%ige Entfernung von Albumin auftritt. Wenn das Salz (Na2SO^) durch Dialyse zugegeben wird,wird eine 80%ige Entfernung bei ungefähr 2,3 η Salz beobachtet, aber auch ein Verlust von ungefähr 10 % Albumin. Im Vergleich dazu wird beobachtet, daß bei Zugabe des Salzes durch Elektrodialyse (ED) eine 95%ige Entfernung von Globulinen bei einer sehr viel geringeren Normalität (1,2 n) mit einem Verlust von weniger als 15 % Albumin erreicht werden kann. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß eine vollständige Entfernung von Globulinen mit geringeren Verlusten an Albumin bei geringeren Salz-Normalitäten erreicht werden kann, wenn die Salzzugabe durch Elektrodialyse erfolgt. Ein Alternatiwerfahren kann, wenn dies erwünscht ist, angewandt werden in Form einer Kombination der direkten Zugabe oder Zugabe durch Dialyse des Aussalzmittels und anschließende ED-Behandlung, um die zugesetzten Salze zu entfernen.
Beispiel 7
Dieses Beispiel zeigt die Abtrennung von Antihämophilem Faktor (AHF) und Fibrinogen von Plasma. Da die Aktivität von AHF zeit- und temperaturempfindlich ist (mit zunehmender Zeit und erhöhter Temperatur abnimmt), wird die Trennung
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bei niederer Temperatur (40C) durchgeführt. Ein zur Abtrennung angewandtes Verfahren besteht darin, die Ionenstärke des Plasmas herabzusetzen durch Entsalzen durch ED, um eine Ausfällung (Abtrennung) von Fibrinogen und AHF herbeizuführen und den Niederschlag anschließend z. B. in 0,15 η NaCl-Lösung wieder zu lösen und anschließend diese Lösung wieder der ED zu unterwerfen, um die Ionenstärke herabzusetzen, um eine Ausfällung (und Trennung) des AHF von Fibrinogen zu erzielen. Wahlweise kann die zuletzt genannte Trennung nach dem erneuten Lösen durch spezifische Adsorption von AHF an Anionenaustauschersäulen oder durch Gelpenetrationsverfahren durchgeführt werden.
Ein zweites Verfahren besteht im direkten Aussalzen von AHF bei einer entsprechenden Salzstärke. Diese Verfären sind auch anwendbar auf on line-sowie off line-Arbeitsweisen wie im Falle der Immunpherese.
Eine andere Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in.der Anwendung von ED auf die Fraktionierung von Plasma-Proteinen mit Hilfe von kleinen Menge Schwermetallionen mit geringer Toxizität wie Zinkdiglycinat als Ausfällmittel. Das Plasma wird zunächst teilweise elektrodialysiert zur Entfernung von Gerinnungsfaktoren, die während des Entsalzens ausgefällt werden. Diese ausgefällten Faktoren werden entfernt und die entstandene überstehende Flüssigkeit durch die Salzkonzentrationskammern des ED-Stapels, der Zinkdiglycinat in den Verdünnungskammern enthält, geleitet. Bei Anlegen einer elektrischen Spannung wird eine geregelte Menge an Zinkdiglycinat in die Konzentrationskammern übertragen und ergibt eine Ionenstärke von ungefähr 0,10 η in der überstehenden Flüssigkeit. Es wird bei ungefähr 0 bis 4° C und einem pH-Wert von ungefähr 7,0Ms7,2 gearbeitet. Das führt zur Bildung eines Niederschlags, der im wesentlichen aus Globulinen besteht^ und einer überstehenden Flüssigkeit, die reich ist an Albumin. Die überstehende Flüssigkeit kann von dem zugesetzten Zink
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befreit werden durch Entsalzen mit Hilfe der ED, nachdem der pH-Wert durch Zugabe eines geeigneten Puffers auf un- ©fähr 5,1bjs5»8 erniedrigt worden ist.
Anstelle von Zinkdiglycinat kann auch Almuniumchlorid zur fraktionierten Ausfällung aller Proteine mit Ausnahme der Jf -Globuline angewandt werden. Die direkte Zugabe eines gleichen Volumens 0,1.m AlCl7 bei O0C zu Plasma unter schnellem Rühren führt zur Ausfällung aller anderen Proteine, die dann in 0,15 η KaCl-Lösung wieder gelöst werden können.
Beispiel 8
Dieses Beispiel erläutert die Anwendung von Wechselstrom anstelle von Gleichstrom, wie er üblicherweise für Elektrodialysearbeiten angewandt wird. In dem Stapel wird eine Kombination von neutralen (N) und kationen-selektiven (C) Membranen entsprechend Fig.6 angewandt. Ein mit Wechselstrom arbeitender ED-Stapel ist im einzelnen in der US-PS 2 955 beschrieben.
Ein mit einem Edelmetall wie Platin (5) platiertes Ventilmetall wie Niob (4) wird als Anode (1) angewandt und das Ventilmetall (6) ohne die Platierung mit Edelmetall wird als Katode (3) angewandt. Die Ventilmetalle besitzen die Eigenschaft den Strom nur zu leiten, wenn sie als Kathode geschaltet sind, wodurch eine Art "Gleichrichtung" des Wechselstroms (AC) stattfindet. Bei einem derartigen ED-Stapel werden zwei Zellpaare (anstelle von einem in Beispiel 2) angewandt, die durch eine dipolare Elektrode (2) in der Mitte getrennt sind, die auf der einen Seite platinisiert (5) ist, um als Anode zu dienen. Während der positiven(+) Stromhälfte des Zyklus dient die platinisierte Seite (5) der Elektrode (1) als Anode und die nicht platinisierte Seite (4) der Elektrode (2) als Kathode und damit ist der mit den Elektroden (1) und (2) verbundene Membranstapel wirksam, während der Membranstapel zwischen den
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- 26 - IO
Elektroden (2) und (3) inaktiv ist, da die Elektrode (3) nicht platinisiert ist und nicht als Anode wirken kann.
Während der negativen (-) Hälfte des Stromzyklus arbeitet der Stapel zwischen den Elektroden (2) und (3), da die platinisierte Seite (5) der Elektrode (2) als Anode wirkt.
Ein derartiger Stapel arbeitet ähnlich wie in Beispiel 2 ' angegeben. Die Vorrichtung besitzt den Vorteil, daß sie mit Wechselstrom betrieben v/erden kann und kein Gleichrichter erforderlich ist. Die neutrale Membran kann auch durch eine Anionenmembran ersetzt werden, um eine bessere Energieausnutzung zu erzielen.
Beispiel 9
Diese Beispiel illustriert die Entfernung von Faktor VIII von menschlichen Plasma mit Hilfe der Elektrodialyse zum Entsalzen. Die Membrantrennvorrichtung ist ein Dial-A-
T M
Cell * "-Stapel, der Ionics, Inc. of Watertown, Mass., wie er im einzelnen in der US-PS 4 202 772 beschrieben ist. Der Stapel umfaßt zwei Zellenpaare mit einer wirksamen Membranfläche von 13,6 cm · Die Ionenaustauschermembranen sind Kationen selektiv (CR 61 CZL) und Anionen selektiv (AR 103 QZL), beide von Ionics, Inc..
Es wurden 30 ml frisches Plasma(enthaltend ACD (Antikoagulans-Lösung/bestehend aus einem Gemisch von Natriumcitrat, Citronensäure und Dextrose) angewandt. Das Ausgangsplasma besaß eine Aktivität von 78 % des Normalen. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse des Entsalzens angegeben. Beim Entsalzen des Plasmas wird Faktor VIII ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit verarmt daher an Faktor VIII. Bei einem ungefähr 90%igen Aussalzen enthält die überstehende Flüssigkeit noch ungefähr 5 bis 10 % Faktor VIII, da der entfernte Niederschlag ungefähr 90täs 95 %
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des in der Ausgangs-Plasmaprobe enthaltenen Paktors VIII enthält.
Leitfähig Entsalzung 0 Paktor VIII-Aktivität
Zeit keit (%) 14,7 in der überstehenden
(min.) (K) 38,2 Flüssigkeit (%)
0 13,6 52,9 78
12 11,6 47,6 70
18 8,4 79,4 63
24 6,4 83,8 42
30 3,6 86,8 30
33 2,8 92,6 9
36 2,2 12
39 1,8 5
42 1,0 11
Die Behandlung von flüssiger Molke zur Erhöhung des erwünschten Proteingehaltes und Herabsetzung des Gehaltes an Aschen (Salzen)und Lactose ist Gegenstand einer Vielzahl von Verfahren. In der US-PS 3 615 664 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem Lactose von Molke abgetrennt wird durch Einengen der rohen Molke zum Auskristallisieren von Lactose und anschließende Behandlung der überstehenden Flüssigkeit durch Elektrodialyse zur Demineralisierung. In der US-PS 3 447 930 ist ein anderes Verfahren beschrieben, bei dem zuerst die Demineralisierung durchgeführt wird und anschließend die Entfernung von Lactose. Diese und andere bekannte Verfahren sind darauf gerichtet, ein gereinigtes (refined) Molkenendprodukt mit hohem Proteingehalt zu erhalten. Einige der Hauptschwierigkeiten bei der Durchführung dieser Verfahren bestehen in der Denaturierung von Molkenprotein (Lactalbumin) während der Anwendung von Wärme, um die Konzentrierung und Kristallisierung herbeizuführen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, diese Probleme zu überwinden, indem die Molkenproteine ausgesalzt v/erden und anschließend die ausgefällten Proteine durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt und entfernt werden und anschließend die Salze aus der überstehenden
/28
Flüssigkeit entfernt werden. Die überstehende Flüssigkeit besteht hauptsächlich aus Lactose und kann daher höheren Temperaturen ausgesetzt werden, ohne daß die Gefahr der Denaturierung von Proteinen besteht. Es ist festzustellen, daß durch dieses Verfahren nicht nur die Proteine abgetrennt werden, sondern auch eine Entsalzung stattfindet, entsprechend den in den oben angegebenen Beispielen zur Behandlung von Plasma-Proteinen beschriebenen Verfahren.
Beispiel 10
Die angewandte ED-Vorrichtung ist ähnlich der in Beispiel 1 beschriebenen. Der Verdünnungsstrom besteht aus 500 ml der überstehenden Flüssigkeit einer Molkenvorbehandlung, bei der im wesentlichen die gesamten Molken-Proteine durchSektrodialyse bei ungefähr 3,5 η Natriumsulfat und einer Temperaturvon ungefähr 38°C entfernt, d. h. ausgesalzen worden sind. 300 ml konzentrierte Molke mit einem Feststoffgehalt von 22,5 % (Zusammensetzung der Feststoffe: 12 % Proteine, 80 % Lactosehydrat und ungefähr 8,0 % Asche) wurden als Konzenträtionsstrom verwendet. Es wurde Gleichstrom mit einer Dichte von ungefähr 130 ASF angewandt (CD/K = 2,0 zu Beginn) und gegen Ende des Versuchs,als der Verdünnungsstrom von einem großen Teil seiner Salze befreit war, wurde der Strom auf einen CD/K-Wert von ungefähr 4,8 eingestellt.
Der Versuch wurde durchgeführt bis der Konzentrationsstrom ungefähr 3,5 η Na2SO^ enthielt und eine Leitfähigkeit von 95 mS/cm besaß. Das Volumen des VerdünnungsStroms, das sich auf ungefähr 300 ml verringert hatte, war zu 90 % salzfrei und konnte weiter behandelt werden zur Gewinnung von Lactose. Der Konzentrationsstrom, dessen Volumen auf ungefähr 500 ml zugenommen hatte, bildete einen feinen Niederschlag (Trübung) von Protein, das abzentrifungiert werden konnte. Die entstehende stark salzhaltige überstehende Flüssigkeit wurde
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dann als Verdünnungs strom angewandt, van das Aussalzmittel auf einen neuen,Ansatz frischer Molke zu übertragen,-Dieses Verfahren der übertragung des Aussalzmittels wird ähnlich erreicht wie in den oben beschriebenen Fällen bei der Trennung menschlicher Plasma-Proteine.
3V
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Claims (21)

DH..-1NG. FRANZ -W ^^ 979 ^UESTHOFF-v.PECHMANN-BEHRENS-GOETZ Dipl,,ng.Gerhard puls (,«»-Wx) DIPL.-CHEM. DK. E. FKEIHSRR VON FECHMANN ' PROFESSIONAL XEPXESENTATIVES BEFORE THB EUKOPEAN FATENT OFFICE DK.-ING. DIETER BEHRENS MANDATAIXES AGKEBS FXES L'oFFICB EUROFEEN DES BXEVIT* DIPJL.-INC.; DlPL.-VtRTSCH.-ING. RUPERT GOETZ IONICS, Incorp. D-8000 MÜNCHEN 90 1A-54 473 SCHWEIGERSTRASSE 2 telefon: (089) 66 20 51 telegkamm: protectfatent telex: $24070 Patentansprüche.
1. Verfahren zur Trennung von wässrigen Proteingemischen in Fraktionen unterschiedlicher Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst im wesentlichen die gesamten Feststoffe abtrennt, das Gemisch anschließend durch eine Elektrodialyse-Vorrichtung leitet, umfassend mindestens 2 benachbarte Membranen, die eine Kammer bilden, bis durch Änderung der Ionenstärke des Gemisches ein oder mehrere Proteine in dem Gemisch unter Bildung einer Trübung oder eines Niederschlags zumindest teilweise destabilisiert werden und daß man im wesentlichen die gesamten, die Trübung verursachenden Stoffe abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch mit einer Geschwindigkeit zwischen 3 und 40 cm/s durch die Elektrodialyse-Vorrichtung führt,,einen Strom von ungefähr 0,1 - 10 mA/mS χ cm durchleitet und bei ungefähr 0 - 400C arbeitet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ionenstärke dadurch verändert, daß man den pH-Wert im wesentlichen auf den isoeJlfktrischen Punkt von mindestens einem dieser Proteine einstellt und/oder die Ionenkonzentration um mindestens 10 % ändert.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die Membranen der Elektrodialyse-Vorrichtung im wesentlichen nicht ionenselektiv sind.
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1A-54 473 -Z-
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine der Membranen in jedem Paar ionenselektiv ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine der Membranen in jedem Paar kationenselektiv ist.
7; Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die andere Membran in dem Paar anionenselektiv ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ionenstärke in dem Gemisch verändert, indem man die Konzentration an nicht-einwertigen und/oder einwertigen Ionen erhöht.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die als Trübung oder Niederschlag abgetrennten Feststoffe wieder löst.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß man die zumindest teilweise wieder gelösten Feststoffe durch Veränderung der Ionenstärke durch Elektrodialyse in einen (Trübung verursachenden) unlöslichen Anteil und einen löslichen Anteil auftrennt und die beiden Teile bzw. Fraktionen voneinander trennt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trübung zumindest teilweise durch einen Elektrolyt wieder in Lösung bringt, der zumindest teilweise durch Elektrodialyse von dem Prbteingemisch gewonnen worden ist,und das wiedergelöste Protein in mindestens 2 unterschiedliche Komponenten auftrennt.
/3
1A-54 473 - 3 -
12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem wässrigen Proteingemisch, das Plasmaproteine enthält, ausgeht und Fibrinogen und Antihämophilen Faktor als Trübung entfernt.
13o Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man von im wesentlichen nicht denaturiertem Plasma ausgeht, und Immunoglobuline als Trübung abtrennt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß man das Fibrinogen und den Antihämophilen Faktor wieder in Lösung bringt und durch Zusammenbringen mit Ionenaustauschkörnern und/oder Geldurchdringungskörnern in eine an Fibrino^pi iekte und eine an Antihämophilem Faktor reiche Fraktion auftrennt.
15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß man von einem wässrigen Gemisch, das Plasmaproteine enthält, ausgeht und Albumin als Trübung abirennt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß man die Trübung wieder in Lösung bringt und als Plasma-Streckmittel verwendet.
17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ionenstärke des Gemisches verändert durch Zusatz von im wesentlichen löslichen, im wesentlichen nicht toxischen Salzen aus der Gruppe der Sulfate, Citrate, Phosphate, Chloride, Acetate, Perchlorate, Nitrate, Sulfite, Thiosulfate, Bromide, Jodide und deren Gemische und die im wesentlichen nicht Albumin-Proteine enthaltende Trübung abtrennt.
18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß man/eine1 Lösung^ die dispergierte
1A-54 473 - 4 -
Euglobuline und Pseudoglobuline enthält, daß man durch Durchleiten eines Stroms die Ionenkonzentration des Gemisches soweit erhöht, daß eine Trübung entsteht, die verhältnismäßig reich ist an Euglobulinen und arm an
Pseudoglobulinen, diese Trübung abtrennt das verbleibende wässrige Gemisch wieder durch eine Elektrodialyse-Vorrichtung führt und durch erneutes Durchleiten eines Stromes die Ionenkonzentration ausreichend erhöht, daß eine Trübung entsteht, die verhältnismäßig arm ist an Euglobulinen und reich an Pseudoglobulinen, diese Trübung erneut entfernt und die verbleibende wässrige Lösung wieder durch eine Dialysevorrichtung leitet um die Ionenkonzentration der Lösung herabzusetzen.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Salze durch eine Dialyse-Membran zugibt.
20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die durch Elektrodialyse entfernten Salze zur Bildung einer Trübung einem neuen Proteingemisch wieder zusetzt.
21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von Molke als proteinhaltigem Gemisch ausgeht.
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