DE69729217T3

DE69729217T3 - Methode zur chromatographischen entfernung von prionen

Info

Publication number: DE69729217T3
Application number: DE69729217T
Authority: DE
Inventors: Maria Gawryl; Robert Houtchens; William Light
Original assignee: OPK Biotech LLC
Current assignee: OPK BIOTECH LLC, US
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-26
Publication date: 2012-03-15
Anticipated expiration: 2017-06-27
Also published as: CN1283660C; DE69729217T2; ES2221957T3; CN1221425A; JP4031833B2; WO1998000441A1; ATE267212T1; US5808011A; EP0954528A1; CA2259632A1; HK1019151A1; AU3580297A; JP2000513377A; EP0954528B2; TW390887B; ES2221957T5; AU718557B2; DE69729217D1; CN1743340A; EP0954528B1

Description

Spongiforme Enzephalopathien sind Krankheiten des zentralen Nervensystems von Säugetieren, die zu präseniler Demenz führen, und typischerweise tödlich verläufen. Zu diesen gehören die menschlichen Krankheiten Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Kuru und Gerstmann-Straussler-Scheinken-Syndrom, die Schafskrankheit Scrapie (Traber-Krankheit) und bovine-spongiforme Enzephalopathie (BSE). Obwohl starke Hinweise vorliegen, dass diese Krankheiten durch gemeinsame Erreger oder einer Gruppe eng verwandter Erreger hervorgerufen werden, ist das Wesen dieser Erreger nur schlecht abgegrenzt (Prusiner, Science 252: 1515–1522 (1991)). Eine wachsende Anzahl von Beweisanzeichen deutet darauf hin, dass eine proteasenresistente posttranslational modifizierte Form eines zellulären Wirtproteins eine ursächliche Rolle spielt, allerdings ist nicht bekannt, ob dieses veränderte Protein allein der verursachende Erreger ist oder ob es ein notwendiger Teil eines verursachenden Erregers ist. Dieses Protein wurde als Prionprotein (im folgenden bezeichnet als „PrP”) bezeichnet, und die infizierenden Erreger der spongiformen Enzephalopathie werden als Prionen bezeichnet.
Es gibt Anzeichen, dass unter speziellen Bedingungen zumindest einige spongiforme Enzephalopathien von einem Tier auf ein anderes übertragen werden können, und in manchen Fällen von einer Spezies auf eine andere übertragen werden können, obwohl diese im allgemeinen nicht infektiös sind. Beispielsweise wurde in den 70er Jahren des 20. Jahrhunderts über eine Reihe von Creutzfeld-Jakob-Krankheitsfällen berichtet, bei denen die Patienten einer Behandlung mit einem menschlichen Wachstumshormon unterzogen wurden, das von Mischungen aus Hirnanhangdrüsen aufbereitet wurde (Braun et al., New England J. med., 313: 728–731 (1985)). Es wird davon ausgegangen, dass das erste Auftreten der bovinen spongiformen Enzephalopathie durch die Übertragung von der Traber-Krankheit (Scrapie) von Schafen auf Rinder durch verseuchtes Futter erfolgte. Ebenso wurde durch intracranielle Injektion von kontaminierten Schafgewebe in Mäuse eine Mausform der Traber-Krankheit entwickelt.
Die Bestimmung von Prionen in Gewebe oder anderen biologischen Produkten beruht zur Zeit auf Untersuchungen, bei denen die Infektion von Mäusen oder Hamstern mit Extrakten von in Frage kommendem, biologischen Material gemessen wird. Da die Inkubationszeit für diese Krankheiten ein Jahr oder länger sein kann, sind solche Studien langwierig und teuer in der Durchführung.
Das weit verbreiterte Auftreten von Krankheiten in Verbindung mit Prionen und die Möglichkeit der Übertragung zwischen unterschiedlichen Arten hat schwerwiegende Folgen für die Biotechnologie-Industrie, die viele ihrer Produkte aus Säugetiergewebe gewinnt (Di Martino, Biologicals 21: 61–66 (1993)). Bedenken über die Sicherheit solcher Produkte haben zu Studien über die Inaktivierung von Prionen geführt. Diese Studien zeigen an, dass Prionen gegenüber Inaktivierung resistenter sind als gewöhnlichere Pathogene, wie Viren oder Bakterien. Daher sind relativ drastische Bedingungen nötig, um Prionen enthaltendes biologisches Material zu dekontaminieren. Die einzigen zur Zeit bekannten Verfahren, um biologische Präparationen mit hohem Prionentiter zu desinfizieren, sind anhaltende Autoclavierung bei 130°C oder darüber und Behandlung mit konzentrierter Natriumhydroxydlösung. Diese Verfahren sind zur routinemäßigen Inaktivierung von Prionen empfohlen worden (Department of Health and Social Security Circular 84: 16 (1989)). Es wurde ebenfalls berichtet, dass Ultrafiltration mit einem Molekulargewichtsausschluss von 100 kD in Verbindung mit der Behandlung mit 6 molarem Harnstoff zur Dekontamination von Prionen enthaltenden Zubereitungen führt (Pocchiari et al., Arch. Virol. 98: 131–135 (1988)). Andere Verfahren, die in der Lage sind, die Prionenaktivität zu verringern, schließen Behandlungen mit organischen Lösemitteln, Detergenzien, proteindenaturierenden Agenzien, chaotrophischen Salzen und Phenol ein (Millson et al., in Prusiner and Hadlow, eds. Slow Transmissible Diseases of the Nervous System, Vol. II. New York: Academic Press 409–424 (1979); Prusiner et al., PNAS 78: 4606–4610 (1981); Kimberlin et al., J. Neurol. Sci. 59: 390–392 (1983); Walker et al., Am. J. Public. Health 73: 661–665 (1983); Brown et al., J. Infect. Dis. 153: 1145–1148 (1986)).
Die extremen Bedingungen, die benötigt werden, um die Infektiosität von Prionen auszuschalten, sind typischerweise unverträglich mit den Verfahren, bei denen versucht wird, Biomoleküle mit einer nützlichen Aktivität zu erhalten, und führen zur Denaturierung von vielen Biomolekülen und dadurch in wesentlich zur Zerstörung ihrer Aktivität. Daher besteht ein Bedarf an einem Verfahren zur Entfernung von Prionen aus biologischem Material oder zum Inaktivieren von Prionen unter Bedingungen, bei denen die Aktivität von gewünschten Biomolekülen nicht gefährdet wird.
EP-A-0313343 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von Proteinen. Eine Ionentauscherchromatographietechnik zur Reinigung roher Proteine die eng verwandte Verunreinigungen enthalten, wobei die isoelektrischen Punkte der gewünschten Proteine und der Verunreinigung bestimmt werden. Die Anwendung der Technik auf die Reinigung von GM-CSF unter Verwendung von Kationentauscherharzen ist offenbart.
Protein Science (1992) 1, 1343–1352 (PAN et al) offenbart die Reinigung von Proteinen und zellulärer Prionenproteine von Gehirnen syrischer Hamster. Die Proteine wurden ausgehend von einer mikrosomalen Fraktion durch Extraktion mit Detergenzien gereinigt und durch immobiliserte CO²⁺-Ionenaffinitätschromatographie und die angereicherte PrP^c-II-Kationentauscherchromatographie und SDS-PAGE getrennt.
J. Chromatographie B, 680 (1996) 91–96 (Walker et al) offenbart wässrige Zweiphasentrennung von komplexen Ausgangsmaterialien erhalten von Gehirngewebe-Homogenisaten.
WO-A-9605846 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von infektionsfreien, pharmazeutischen Präparationen und/oder Nahrungsmitteln aus infektiösem Material, und im besonderen Material, das Prionen enthält, unter Verwendung einer Reihe von Ultrafiltrationsmembranen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Entfernung von Prionen aus einer Lösung, welche die Prionen und Hämoglobin enthält.
Das Verfahren schließt einen Schritt ein, bei dem man die Lösung unter Bedingungen, die zu einer Gradientenelution führen, durch eine Anionentauscherchromatographiesäule leitet, wobei man das Prion von Hämoglobin dadurch trennt, dass das Hämoglobin in einer Eluatfraktion gesammelt wird, die von der Eluatfraktion, die das Prion enthält, verschieden ist.
In einer Ausführungsform wird das Hämoglobin von einem Säugetier, wie einem Menschen oder einem zu den Rindern, Schafen, Schweinen oder Mäusen gehörenden Tier erhalten.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Entfernung von Prionen aus einer Lösung, die die Prionen und Hämoglobin beinhaltet. Das Verfahren weist einen Schritt auf, bei dem man die Lösung durch eine Anionentauschersäule unter Bedingungen leitet, die zu einer Gradientenelution führen. Dadurch wird das Prion von Hämoglobin getrennt, wobei das Prion in einer Fraktion eluiert wird, die von der Fraktion, die das Hämoglobin enthält, verschieden ist.
Das Verfahren der Erfindung kann unter milden Bedingungen durchgeführt werden, ohne Anwenden von Hitze, starken Alkali- oder oxidierenden Agenzien. Daher ermöglicht die vorliegende Erfindung die Dekontamination von Lösungen, die Prionen in Gegenwart von Hämoglobin beinhalten, ohne wesentliche die Aktivität des Hämoglobins zu beeinflussen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Eigenschaften und andere Details des Verfahrens der Erfindung werden jetzt genauer beschrieben und in den Ansprüchen hervorgehoben.
Die gegenwärtige Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass durch Chromatographie einer Prionen-gespickten Rinderhämoglobinlösung mit einer Anionentauschersäule ein überraschend hoher Anteil an Prioneninfektiosität aus der eluierten Hämoglobinfraktion entfernt wird. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Entfernung eines Prions aus einer Lösung, die ein Prion und Hämoglobin aufweist, weist das Hindurchleiten der Lösung durch eine Anionentauscherchromatographiesäule unter Bedingungen, die zu einer pH-Gradientenelution führen, auf. Dadurch wird das Prion von dem Hämoglobin getrennt, d. h. das Hämoglobin eluiert aus der Säule in einer Fraktion, die von der Fraktion, die das Prion enthält, unterschiedlich ist.
Zum Zweck der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Prion” auf ein Protein, das ein Erreger für eine Krankheit des zentralen Nervensystems darstellt. Der Ausdruck „verursachender Erreger” soll sich auf einen Erreger beziehen, der entweder die in Frage kommende Krankheit verursacht oder ein notwendiger Teil eines krankheitserregenden Systems ist. Mit Prionen verknüpfte Krankheiten schließen verschiedene spongiforme Enzephalopathien, wie die menschlichen Krankheiten Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Kuru und Gerstmann-Straussler-Scheinken-Syndrom, die Schafskrankheit Traber-Krankheit, bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) und übertragbare Maus-Enzephalopathie, ein. Das Prion kann, bspw. ein Protein sein, wie ein posttranslationsmodifiziertes PrP-Protein, oder es kann ein Protein sein, dass mit einem Informationsmolekül, sowie ein Polynukleotid, komplexiert ist, bspw. ein Polydesoxyribonukleotid komplexiert mit einem posttranslationsmodifizierten PrP-Protein.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Biomolekül” auf Hämoglobin.
Geeignete pH-Gradienten, die zur Elution bei der Anionentauscherchromatographiesäule verwendet werden können, schließen bspw. einen kontinuierlichen pH-Gradienten, bei dem der pH des Eluenten kontinuierlich als Funktion der Zeit verändert wird, ein. Ein Beispiel eines kontinuierlichen pH-Gradienten ist ein linearer pH-Gradient, wobei die Änderung des pH eine lineare Funktion der Zeit ist. Ein kontinuierlicher pH-Gradient kann durch Verwendung von zwei oder mehr Puffer mit unterschiedlichem pH, die zusammengemischt werden, um den Eluenten zu bilden, gebildet werden. Das Verhältnis der Puffer im Eluenten, und daher der pH-Wert des Eluenten kann folglich kontinuierlich als Funktion der Zeit variiert werden. Die Mischung der Puffer wird typischerweise mit einem Durchflussmengenregler, der so programmiert ist, dass der gewünschte pH-Gradient erhalten wird, geregelt.
In einer weiteren Ausführungsform kann der pH-Gradient ein Stufen-pH-Gradient sein, wobei die Änderung des pH's in Bezug auf die Zeit diskontinuierlich ist, und eine oder mehr Stufen gebildet werden, oder Zeitpunkte vorhanden sind, bei denen der pH sich abrupt ändert. Dies kann durch einfaches Ersetzen des Eluenten, wobei ein erster Puffer durch einen zweiten Puffer mit unterschiedlichem pH ersetzt wird, erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der verwendete Gradient ein Stufen-pH-Gradient.
In einem Verfahren zur Durchführung einer Stufen-pH-Gradientenelution wird nacheinander jeweils einer Reihe von Puffer mit unterschiedlichen pH-Werten in die Chromatographiesäule gegeben. Es ist bevorzugt, dass die Puffer gefiltert sind, bspw. durch eine 10.000 Dalton Entpyrogenisierungsmembran. Die verwendeten Puffer sollen monovalente Puffer mit geringer Ionenstärke sein, so dass die Elution der Lösungsbestandteile im allgemeinen abhängig vom pH ist, und nicht im wesentlichen abhängig von der Ionenstärke ist. Typischerweise besitzen Puffer mit einer Ionenstärke von etwa 50 mM oder weniger geeignet niedrige Ionenstärken.
Beispiele von Anionentauschermedien, die für das vorliegende Verfahren geeignet sind, schließen Siliziumdioxid, Aluminiumoxid, Titandioxid, vernetztes Dextran, Agarose oder ein derivatisiertes Polymer oder Copolymer, wie ein Polyacrylamid, ein Polyhydroxyethylmethacrylat oder ein Styroldivinylbenzol, das mit einer kationischen Funktionalität derivatisiert ist, wie einer Diethylaminoethyl- oder einer quaternären Aminoethylgruppe, ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Anionentauschermedium auf Silikagel (Siliziumdioxid) basiert. Das Medium wird durch hydroxythermische Behandlung von Silikagel, um die Porengröße zu vergrößern, und anschließendem (γ-Glycidoxy-Propyl)trimethoxysilan Aussetzen des Gels, um aktive Epoxidgruppen an der Oberfläche zu bilden, gebildet. Das derivatisierte Silikagel wird dann mit einem tertiären Amin, wie HOCH₂CH₂N(CH₃)₂, behandelt, um an der Oberfläche quaternäre Amoniumgruppen zu bilden.
Die Anionentauscherchromatographiesäule kann bspw. eine Gravitationssäule sein, d. h. eine Säule, durch die die mobile Phase unter dem Einfluss der Gravitationskraft fließt. Die mobile Phase kann auch einer Druckdifferenz zwischen dem Säuleneinlass und Auslass ausgesetzt werden, wie durch Aufgabe einer unter Druck stehenden Flüssigkeit auf die Säule, nachdem die Probe auf die Säule geladen wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anionentauscherchromatographiesäule eine Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (High Performance Liquid Chromatographie-Säule (HPLC)).
Die Lösung weist ein Prion und ein Hämoglobin, wie Rinderhämoglobin, auf. In dieser Ausführungsform transportiert der erste Puffer die Lösung in das Medium in der Chromatographiesäule und erleichtert die Bindung des Hämoglobins an das Medium. Der zweite Puffer stellt dann den pH im Medium so ein, dass die Nichthämoglobinkomponenten, wie das Prion, eluiert werden. Der dritte Puffer eluiert dann Hämoglobin, das im wesentlichen frei von Prionen ist. Die erste und die letzte Fraktion des das Hämoglobin enthaltenden Eluenten, beispielsweise die ersten drei bis vier Prozent und die letzten drei bis vier Prozent, können verworfen werden, um die Reinheit des Hämoglobins zu sichern.
Vorzugsweise ist der erste Puffer eine Tris-hydroxymethylaminomethanlösung (Tris) (Konzentration etwa 20 mMol, mit einem pH-Wert im Bereich von zwischen ungefähr 8,4 und ungefähr 9,4). Der zweite Puffer ist eine Mischung des ersten Puffers und des dritten Puffers, wobei der zweite Puffer einen pH-Wert im Bereich von etwa 8,2 bis etwa 8,6 aufweist. Der dritte Puffer ist eine Tris-Lösung (Konzentration etwa 50 mMol, mit einem pH im Bereich von zwischen etwa 6,5 und etwa 7,5). Der vierte Puffer ist eine NaCl/Tris-Lösung (Konzentration etwa 1,0 M NaCl und etwa 20 mMol Tris mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 8,4 und etwa 9,4, vorzugsweise von etwa 8,9 bis etwa 9,1). Es ist speziell bevorzugt, dass der pH des zweiten Puffers zwischen etwa 8,2 und 8,4 ist.
Die Puffer werden typischerweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 0°C bis etwa 50°C angewandt. Vorzugsweise beträgt die Puffertemperatur während der Verwendung etwa 12,4 ± 1,0°C. Zusätzlich werden die Puffer typischerweise bei einer Temperatur von etwa 9°C bis etwa 11°C gelagert.
In einer weiteren Ausführungsform weist das Verfahren des weiteren das Leiten der Lösung durch eine Ultrafiltrationsmembran auf. Dieser Schritt kann vor oder nach dem Anionentauscherchromatographieschritt durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Lösung unter Druck vor der Anionentauscherchromatographie durch eine Ultrafiltrationsmembran, wie eine 100.000 Dalton Membran, geleitet. Beispiele von Ultrafiltrationsmembranen, die für dieses Verfahren geeignet sind, schließen 100.000 Dalton Membranen, erhältlich von Millipore Corporation (Bedford, MA, catalog no. CDUF 050 H1) und A/G Technology (Needham, MA, Model No. UFP100E55).
In einer weiteren Ausführungsform weist die Lösung ein Prion, das der verursachende Erreger für bovine spongiforme Enzephalopathie ist, und Rinderhämoglobin auf.
In einer weiteren Ausführungsform weist die Lösung ein Prion auf, das der verursachende Erreger für eine spongiforme Enzephalopathie, wie die Traber-Krankheit, Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Kuru, Gerstmann-Straussler-Scheinken-Krankheit, ist, und Hämoglobin auf.
Die Erfindung wird nun des weiteren und speziell durch die folgenden Beispiele beschrieben.
ERLÄUTERUNGEN DURCH BEISPIELE
Beispiel 1: Reinigung von einer Rinderhämoglobinlösung durch Anionentauscherchromatographie
Herstellung der Rinderhämoglobinlösungen
Eine Rinderhämoglobinlösung wurde nach einem Verfahren, wie in U. S. Patent Anmeldung Nr. 08/473,497 beschrieben, hergestellt. Proben von Rindervollblut wurden gesammelt, mit Natriumcitratantikoagulant gemischt, um eine citratisierte Blutlösung zu bilden, und dann auf den Endotoxingehalt analysiert. Die Blutlösungsproben wurden nach der Entnahme bei einer Temperatur von etwa 2°C gehalten und anschließend durch ein Sieb mit ungefähr 24.000 Öffnungen/Meter (600 Maschen Sieb) gesiebt, um große Aggregate und Teilchen zu entfernen.
Die citratisierte Blutlösung wurde dann nacheinander durch 800 μm und 50 μm Polypropylenfilter gegeben, um große Fremdkörper in der Blutlösung zu entfernen.
Die roten Blutzellen wurden dann gewaschen, um extrazellulare Plasmaproteine, wie BSA oder IgG von den roten Blutzellen zu entfernen. Um die roten Blutzellen zu waschen, wurde die Blutlösung in einen Diafiltrationstank gegeben und dann mit dem gleichen Volumen einer isotonischen Lösung, die durch eine 10 kDalton Ultrafiltrationsmembran (kommerziell erhältlich von Millipore Corporation, Cat.-Nr. CDUF 050 G1) gefiltert wurde. Die isotonische Lösung bestand aus 6,0 g/l Natriumcitratdihydrat und 8,0 g/l Natriumchlorid in Wasser für Injektionszwecke (WFI).
Die verdünnte Blutlösung wurde dann auf das Ausgangsvolumen aufkonzentriert, in dem durch eine 0,2 μm Hohlfaser (Microgon Krosflo II Microfiltration cartridge, Spectrum/Microgon, Laguna Hills, CA) diafiltriert wurde. Gleichzeitig wurde gefilterte isotonische Lösung kontinuierlich als Make-up mit einer Rate zugegeben, die gleich der Rate des Filtrationsverlust durch die Diafiltration ist, zugegeben. Während der Diafiltration traten Blutbestandteile, die wesentlich kleiner als rote Blutzellen sind, wie in Plasma gelöste Stoffe, mit dem Filtrat durch die Wände des Diafilters. Die roten Blutzellen, Blutplättchen und größere Teile der verdünnten Blutlösung, wie weiße Blutzellen, wurden bei kontinuierlicher Zugabe von isotonischer Lösung zurückgehalten, um eine dialysierte Blutlösung zu bilden.
Während des Waschens der roten Blutzellen wurde die Blutlösung bei Temperaturen von zwischen ungefähr 10°C bis 25°C gehalten, wobei der Druck am Einlass des Diafilters zwischen 172369 Pa und 206873 Pa (etwa 25 psi und etwa 30 psi) gehalten wurde, um die Effizienz zu verbessern.
Das Waschen der roten Blutzellen war beendet als das Volumen des Diafiltrats etwa 600% des Volumens der Blutlösung vor dem Verdünnen mit der isotonischen Lösung betrug.
Die dialysierte Blutlösung wurde dann kontinuierlich mit einer Rate von ungefähr 4 Liter pro Min. in eine Sharples Super-Zentrifuge (Modell Nr. AS-16, Sharples Division of Alfa-Laval Separation, Inc.), ausgestattet mit einem Nr. 28 Ringdam, gepumpt. Die Zentrifuge wurde betrieben, während gleichzeitig dialysierte Blutlösung eingespeist wurde, um rote Blutzellen von weißen Blutzellen und Plättchen zu trennen. Während des Betriebs wurde die Zentrifuge bei einer Rotationsgeschwindigkeit betrieben, die ausreichend war, um das Blut in eine schwere rote Blutzellenphase und eine leichte weiße Blutzellenphase zu trennen, typischerweise etwa 15.000 Umdrehungen/Min.. Fraktionen der roten Blutzellenphase und der weißen Blutzellenphase wurden im folgenden kontinuierlich während des Betriebs aus der Zentrifuge entladen.
Nach der Trennung wurden die roten Blutzellen lysiert, um eine Hämoglobin-enthaltende Lösung zu bilden. Ein wesentlicher Teil der roten Blutzellen wurden nach dem Entladen aus der Zentrifuge auf Grund des Einschlags der Zellen auf die Wand der Leitung zum Entladen der roten Blutzellphase in einen Winkel zum Fluss der roten Blutzellphase aus der Zentrifuge mechanisch lysiert, wodurch Hämoglobin aus den roten Blutzellen in die rote Blutzellenphase gelangte.
Die lysierte rote Blutzellenphase floss dann durch die rote Blutzellphaseentladungsleitung in einen statischen Mischer (Kenics 0,0127 Meter (1/2 Inch) mit 6 Elementen, Chemineer, Inc.).
Gleichzeitig mit der Entladung der roten Blutzellenphasen in den statischen Mischer wurde ein gleiches Volumen Wasser für Injektionszwecke ebenfalls in den statischen Mischer injiziert, worin das Wasser für Injektionszwecke mit der roten Blutzellenphase gemischt wurde. Die Flussraten der roten Blutzellenphase und des Wassers für Injektionszwecke in den statischen Mischer betrugen jeweils etwa 0,25 Liter/min..
Durch das Mischen der roten Blutzellenphase mit dem Wasser für Injektionszwecke in dem statischen Mischer wurde ein lysiertes rotes Blutzellenkolloid hergestellt. Dieses wurde dann in eine Sharples Super Zentrifuge (Modell Nr. AS-16), die geeignet ist das Hämoglobin Zellbestandteilen der roten Blutzellen, die nicht Hämoglobin sind, zu trennen, überführt. Anschließend wurde die Zentrifuge bei einer ausreichenden Rotationsgeschwindigkeit rotiert, um das lysierte rote Blutzellenkolloid in eine leichtere Hämoglobinphase und eine schwerere Phase zu trennen. Die leichtere Phase bestand aus Hämoglobin und enthielt Nichthämoglobinbestandteile mit einer Dichte, die etwa gleich oder weniger als die Dichte des Hämoglobins ist.
Die Hämoglobinphase wurde kontinuierlich aus der Zentrifuge durch eine 0,45 μm Pellicon Filterkassette (Millipore Corporation, Kat.-Nr. HVLP 000 C5) in einen Behälter als Vorbereitung zu einer Hämoglobinreinigung entladen. Zellenstroma wurde dann mit dem Retentat aus dem Mikrofilter in den Behälter gegeben. Während der Mikrofiltration wurde die Temperatur des Behälters auf 10°C oder weniger gehalten. Um die Effizienz zu erhöhen, wurde die Mikrofiltration beendet, wenn der Eingangsdruck von 68.948 Pa auf 172.369 Pa (von etwa 10 psi auf etwa 25 psi) stieg. Die Hämoglobinmikrofiltrate wurden vom Mikrofilter in den Mikrofiltrationsbehälter gegeben. Das Mikrofiltrat wurde in diesem Stadium in zwei Proben, Probe A und Probe B geteilt. Probe A wurde zu diesem Zeitpunkt nicht weiter gereinigt.
Probe B wurde anschließend durch einen 100 kD Ultrafilter (Millipore Corporation, Kat.-Nr, CDUF 050 H1) gepumpt. Ein wesentlicher Anteil des Hämoglobins und Wassers, der im Mikrofiltrat enthalten war, sind durch den Ultrafilter hindurchgetreten, während größere Mikrofiltratkomponenten, wie Proteine mit Molekulargewichten größer als etwa 100 kD, zurückgehalten wurden und zurück in den Mikrofiltrationstank gegeben wurden. Gleichzeitig wurde Wasser für Injektionszwecke kontinuierlich in den Mikrofiltrationstank als Make-up für im Ultrafiltrat verlorenes Wasser gegeben. Die Ultrafiltration wurde fortgeführt, bis die Konzentration an Hämoglobin im Mikrofiltrattank geringer als 8 g/l betrug. Während des Ultrafiltrationsschritts wurde die Innentemperatur des Mikrofiltrationstanks auf etwa 10°C gehalten.
Das Hämoglobinultrafiltrat wurde dann in einen Ultrafiltrationstank gegeben, wieder durch einen 30 kD Ultrafilter (Millipore Corporation Kat.-Nr. CDUF 050 T1) gegeben, um kleinere Zellkomponenten, wie Elektrolyten, metabolische Intermediate, Wasser und Proteine von einem Gewicht geringer als 30 kD zu entfernen. Dies führt zu einer konzentrierten Hämoglobinlösung, die etwa 100 g Hämoglobin pro Liter enthält. Die anfängliche Reinigung von Probe B wurde an diesem Punkt beendet.
Herstellung von Anionentauscherchromatographiemedium
Silikagel wurde mit (γ-Glycidoxypropyl)trimethoxysilan in Wasser bei 70°C behandelt, wodurch ein an der Oberfläche mit Epoxidgruppen derivatisiertes Silikagel erhalten wurde. Dieses derivatisierte Silikagel wurde dann mit N,N-dimethylethanolamin (OHCH₂CH₂)N(CH₃)₂ behandelt, wodurch ein an der Oberfläche mit quaternären Ammoniumgruppen derivatisiertes Silikagel erhalten wurde.
Versehen der Probe mit Erregern der Traber-Krankheit
Bei dem Erregern der Traber-Krankheit, das in der hierin beschriebenen Studie verwendet wurde, handelt es sich um einen Maus adaptierten ME-7-Strang, lizenziert vom Institut of Animal Health, Edinburgh, Schottland. Die Originalquelle des Erregers war eine natürliche Traber-Krankheits-Infektion von Suffolk-Schafen. Gehirnextrakt dieser Schafe unterlief zwei Durchläufe durch Moredun zufällig gezüchtete Mäuse, neun Durchläufe durch C57BL/6N, ein Durchlauf durch C₃H-Mäuse und ein weiterer Durchlauf durch C57BL/6N-Mäuse. Das versehene Material, das in dieser Studie verwendet wurde, befand sich auf Durchlaufstufe 13.
Probe A (180 ml) wurde mit 20 ml des Erregers der Traber-Krankheit versehen, um Probe A' zu erhalten. Eine Teilmenge von Probe A' wurde zur Verwendung in Zusatzbeweisversuchen zurückbehalten und der Rest wurde einer Ultrafiltration durch einen 100 kD Ultrafilter, wie oben für Probe B beschrieben, unterzogen. Das erhaltene Ultrafiltrat, das jetzt als Probe A'' bezeichnet wurde, wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf Traber-Krankheits-Infektiosität getestet.
Eine 20 ml Teilmenge von Probe B wurde mit 2 ml des Erregers der Traber-Krankheit versetzt, um Probe B' zu erhalten. Eine Teilmenge der Probe B' wurde zurückbehalten, um diese in Zusatzbeweisversuchen zu verwenden. Der Rest der versetzten Proben wurde dann einer Anionentauscherchromatographie unterzogen. Die versetzte Probe B' wurde auf das Medium, das in der Chromatographiesäule enthalten war, gegeben, um das Hämoglobin durch Anionentauschhochleistungsflüssigchromatographie zu reinigen. Die Säule wies einen inneren Durchmesser von 0,2 Meter (8 Inch) und eine Länge von 0,6 Meter (24 Inches) auf. Das Anionentauschermedium in der Säule war das Silika-basierte Medium, das oben beschrieben wurde.
Die Säule war zuvor mit einem Puffer vorbehandelt worden, wodurch die Bindung des Hämoglobins an das Medium erleichtert wurde. Dann wurde Probe B' bei einer Flussrate von 1,78 Litern/min. in die Säule gespritzt. Die Säule wurde dann durch aufeinanderfolgendes Aufgeben von drei verschiedenen Puffern gewaschen, um ein Hämoglobineluat herzustellen, wobei ein pH-Gradient in der Säule erzeugt wurde. Die Temperatur jeder Pufferlösung betrug etwa 12,4°C. Die Pufferlösungen wurden zuvor gereinigt, indem sie durch eine 10 kD Ultrafiltrationsmembran (Millipore Corporation Kat.-Nr. CDUF 050 G1) gegeben worden sind, bevor diese in die Säule eingespritzt wurden. Die Flussrate von jedem Puffer durch die Säule betrug 3,56 Liter/Min..
Der erste Puffer, 20 mM Tris-hydroxymethylaminomethan (Tris, pH im Bereich von etwa 8,4 bis etwa 9,4), transportierte die konzentrierte Hämoglobinlösung in das Ionentauschermedium im Innern der Säule. Der zweite Puffer, eine Mischung aus dem ersten Puffer mit einem dritten Puffer, der einen pH von etwa 8,3 aufwies, passte dann den pH im Innern der Säule an, so dass verunreinigende Substanzen eluiert wurden, während das Hämoglobin zurückbehalten wurde. Die Gleichgewichtseinstellung mit dem zweiten Puffer dauerte etwa 30 Minuten. Der Eluent des zweiten Puffers wurde als Abfall entsorgt. Der dritte Puffer, 50 mM Tris (pH im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 7,5), eluierte dann das Hämoglobin von der Säule. Die ersten und letzten drei bis vier Prozent des Hämoglobineluenten wurde verworfen. Der verbleibende Hämoglobineluent, im folgenden bezeichnet als Probe B'', wurde in Hinblick auf eine Infektion mit der Traber-Krankheit, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht.
Beispiel 2: Bewertung des Prionenentfernungsverfahrens bei Rinderhämoglobinaufbereitungen
Die Überprüfung des Verfahrens wurde bei einer registrierten Einrichtung durchgeführt, wobei beim Ablauf die Bestimmungen des U. S. Food und Drug Administration Good Laboratory (21 CFR 58), des United Kingdom GLP Compliance Pogramme, des Japanese GLP Standard und der OECD Principles of Good Laboratory Practice eingehalten wurden.
Die Lösungen, die mit Hilfe der in vivo-Untersuchung in bezug auf die Infektiosität der Traber-Krankheit untersucht wurden, waren

1. Die Lösung der Erreger der Traber-Krankheit, die als Zusatz zu den Hämoglobinlösungen verwendet wurde,
2. Probe A'
3. Probe A''
4. Probe B'
5. Probe B''

In vivo Untersuchung
Die in vivo Untersuchung in bezug auf die Infektiosität der Traber-Krankheit wurde von Microbiological Associates, Rockville, MD, nach einem veröffentlichten Verfahren durchgeführt (Chesebro, Spongiform Enzphalopathie: the Transmissible Agents, in Virology, Fields, Knipe, et al., eds. Raven Press Ltd.: New York, Kapitel 81, Seiten 2325–2336 (1990)). Das Verfahren schließt eine intracranielle Inkubation von Mäusen mit einem Teil der zu untersuchenden Lösung, Überwachung der Mäuse auf klinische Anzeichen von Traber-Krankheits-Infektionen und Bestimmung von Überlebensraten während einer Dauer von einem Jahr, ein.
Infektiosität der Traber-Krankheit wurde für die folgenden Lösungen untersucht: das Zusatzmaterial, Probe A' (geklärt und ungeklärt), Probe A'', Probe B' und Probe B''. Eine Reihe von Verdünnungen von jeder dieser Lösungen wurde hergestellt, wie im folgenden aufgeführt: Zusatzmaterial: Faktoren 1 (unverdünnt), 10^–3, 10^–4, 10^–5, 10^–6, 10^–7 und 10^–8; Probe A', ungeklärt: Verdünnungsfaktor 1, geklärt: Verdünnungsfaktoren 1, 10^–1; Probe A'', Verdünnungsfaktoren 1, 10^–1, 10^–2, 10^–3, 10^–4 und 10^–5; Probe B' Verdünnungsfaktor 1 und 10^–1; Probe B'', Verdünnungsfaktoren 1, 10^–1, 10^–2, 10^–3, 10^–4 und 10^–5.
Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden in zwei Gruppen von jeweils 10 oder 15 Mäusen unterteilt. Eine Gruppe von 15 Kontrollmäusen wurde nicht geimpft, wobei eine weitere Gruppe von 15 Vehikelkontrollmäusen jeweils mit 0,020 ml Vehikellösung geimpft wurden. Die Mäuse in jeder der verbleibenden Gruppen wurden jeweils mit einem Anteil von 0,02 ml einer einzelnen Verdünnung der zu untersuchenden Lösungen geimpft.
Die Mäuse wurden auf klinische Anzeichen von Infektionen mit der Traber-Krankheit über einen Zeitraum von 365 Tagen überwacht. Anzeichen von der Endstufe der Traber-Krankheit schließen Empfindlichkeit gegenüber lauten Geräuschen, Urininkontinenz, raue Behaarung, abnormer Gang und träge Augen ein. Infektion mit der Traber-Krankheit wurde durch histopathologische Untersuchungen des Gehirngewebes der Toten oder geopferten Mäuse bestätigt, wobei die Gegenwart von kleinen Vakuen im Gehirngewebe die Diagnose der Traber-Krankheit erhärteten.
Ergebnis
Das Gesamtreinigungsverfahren von Rinderhämoglobin ist in U. S. Patentanmeldung Nr. 08/473,479 offenbart. Zwei Rinderhämoglobinlösungen wurden nach einem Teil dieses Verfahrens, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, wobei in jedem dieser Fälle die Reinigung an unterschiedlichen Punkten des Gesamtverfahrens gestoppt wurde. Probe A wurde durch einen Mikrofiltrationsschritt (Porengröße 0,45 μm) gereinigt, während Probe B durch ein Diafiltrationsschritt (100 kD nominaler Molekulargewichtsausschluss) gereinigt wurde.
Dieses Überprüfungsverfahren untersuchte den Einfluss des 100 kD Ultrafiltrationsschritts und des Anionentauscherchromatographieschritts auf die Infektiosität der Probe, zu der der Maus-adaptierte ME-7 Erreger der Traber-Krankheit zugesetzt wurde, auf die Gehirnhomogenisate von infizierten Mäusen. Der Erreger der Traber-Krankheit wurde als Modell für den verursachenden Erreger von boviner spongiformer Enzephalopathie verwendet. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um eine in vivo Untersuchung von Mäusen, die zur Zeit die einzige Art von Untersuchung ist, die zur Verfügung steht, um Prioneninfektiosität zu untersuchen. Die Infektiosität der beiden zugesetzten Proben vor dem zu untersuchenden Reinigungsschritt wurde in einem Vergleichsversuch untersucht und führte in beiden Fällen zu 100% Mortalität der Mäuse während 365 Tagen, wobei eine wesentliche Mehrheit der Mäuse Veränderungen der Gehirnmorphologie aufwiesen, die mit einer Infektion mit der Traber-Krankheit übereinstimmen. Im Gegensatz dazu zeigten Proben, die anschließend einem Reinigungsschritt durch eine 100 kD Ultrafiltration oder Anionentauscherchromatographie gereinigt wurden, keine Anzeichen von einer Infektiosität mit der Traber-Krankheit bei den in vivo Untersuchungen.
Die Ergebnisse der in vivo Untersuchungen sind in der Tabelle zusammengefasst und zeigen für jede Gruppe der Testmäuse die Anzahl der Mäuse, welche die 365 Tage dauernde Untersuchung überlebten, die Anzahl der Mäuse, welche während der Untersuchung klinische Anzeichen von der Traber-Krankheit aufwiesen, die Anzahl der Mäuse welche während der Studie gestorbenen oder geopferten wurden und die Anzahl der toten Mäuse, bei welchen die Traber-Krankheit histopathologisch bestätigt wurde, an.
Die Daten zeigen, dass 19 von 20 Mäusen, die mit dem Zusatzmaterial bei einer Verdünnung vom Faktor 10^–4 oder großer geimpft wurden, klinische Anzeichen von Traber-Krankheit anzeigten, wobei die Traber-Krankheit durch Histopathologie bestätigt wurde. Bei der einzigen überlebenden Maus in dieser Gruppe handelt es sich möglicherweise um einen Injektionsfehler.
Alle Mäuse, die mit der nicht geklärten, nicht verdünnten Probe A' behandelt wurden starben, wobei diese keine Anzeichen von Traber-Krankheit zeigten. Die Tode werden auf die toxischen Einflüsse von festem Material in dieser heterogenen Mischung zurückgeführt. Jede der zehn Mäuse, die mit der geklärten Probe A' behandelt wurden, starben, nachdem diese klinische Anzeichen von Traber-Krankheit anzeigten, bei 9 von diesen wurde die Traber-Krankheit durch Histopathologie bestätigt. Bei einer Maus aus dieser Gruppe verhinderte wesentliche Autolyse die histopathologische Bestätigung von der Traber-Krankheit. Im Gegensatz dazu überlebten von 90 Mäusen, die mit einer Verdünnung der Probe A'' geimpft wurden 86 die Studie, wobei keine klinische Anzeichen von der Traber-Krankheit zeigte und die Gehirne der vier Mäuse, die starben, zeigten normale Histopathologie.
Von 5 Mäusen, die mit der Probe B' geimpft wurden, überlebte keine die Studie und vier davon zeigten sowohl klinische als auch histopathologische Anzeichen von der Traber-Krankheit. Eine Verdünnung von Probe B'' wurde 90 Mäusen verabreicht. Von diesen überlebten 84 die Studie, wobei keine der toten Mäuse klinische oder histopathologische Anzeichen der Traber-Krankheit zeigten.

Diese Ergebnisse zeigen klar, dass Hämoglobinlösungen, denen Erreger der Traber-Krankheit zugegeben wurden, unter milden Bedingungen dekontaminiert werden können. Reinigung über eine 100 kD Ultrafiltration oder Anionentauscherchromatographie mit einer pH-Gradientenelution reduzierte die Infektiosität mit der Traber-Krankheit bei den erhaltenen Lösungen unter die Detektionsgrenze der in vivo Untersuchung. Tabelle: Ergebnisse der Studie zur Bewertung der Entfernung der Erreger der Traber-Krankheit

Beispiel	Verdünnung	überlebend/geimpft	Anzahl mit klinischen Anzeichen/Anzahl tot oder geopfert	Anzahl mit einer Pathologie von Scrapie/Anzahl untersucht
Zusatzmaterial	10^–8	9/10	0/1	0/1
Zusatzmaterial	10^–7	9/10	0/1	0/1
Zusatzmaterial	10^–6	9/10	1/1	1/1
Zusatzmaterial	10^–5	8/10	2/2	2/2
Zusatzmaterial	10^–4	0/10	10/10	10/10
Zusatzmaterial	10^–3	1/10	9/9	9/9
Kontrolle	keine	12/15	0/3	0/3
Kontrolle Vehikel	keine	15/15	0/0	0/0
A'	unverdünnt	0/5	1/5	1/1
A'	geklärt unverdünnt	0/5	5/5	5/5
A'	geklärt 1:10	0/5	5/5	4/5
A''	10^–5	14/15	0/1	0/1
A''	10^–4	14/15	0/1	0/1
A''	10^–3	14/15	0/1	0/1
A''	10^–2	14/15	0/1	0/1
A''	10^–1	15/15	0/0	0/0
A''	unverdünnt	15/15	0/0	0/0
B'	unverdünnt	0/5	4/5	4/5
B''	10^–5	13/15	0/2	0/2
B''	10^–4	13/15	0/2	0/2
B''	10^–3	15/15	0/0	0/0
B''	10^–2	14/15	0/1	0/1
B''	10^–1	14/15	0/1	0/1
B''	unverdünnt	15/15	0/0	0/0

Claims

Verfahren zum Entfernen von Prionen aus einer Lösung, welche das Prion und Hämoglobin aufweist, bei dem man die Lösung unter Bedingungen, die zu einer pH-Gradientelution führen, durch eine Anionentauschchromatographiesäule leitet, wobei man das Prion von dem Hämoglobin dadurch trennt, dass das Hämoglobin in einer Eluatfraktion gesammelt wird, die von der Eluatfraktion, die das Prion enthält, verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Gradient ein kontinuierlicher Gradient oder ein Stufengradient ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Hämoglobin von einem Menschen oder einem zu den Rindern, Schweinen, oder Mäusen gehörenden Tier stammt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Anionentauscherchromatographiemedium zumindest eine Komponente, ausgewählt aus Siliziumdioxid, Aluminiumoxid, Titandioxid, vernetztem Dextran, Agarose oder ein Polymer, derivatisiert mit kationischen Gruppen, beispielsweise ein Polyacrylamid, ein Polyhydroxyethylmethacrylat oder ein Poly(Styrol-co-Divinylbenzol), aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man des Weiteren die Lösung durch eine Ulrafiltrationsmembran filtert, und wobei die Ultrafiltrationsmembran beispielsweise eine Molekulargewichtsgrenze von ungefähr 100 kD aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Prion Erreger für eine spongiforme Enzephalopathie ist, die beispielsweise Scrapie, Creutzfeldt-Jakob Krankheit, Kuru, Gerstmann-Straussler-Scheinken-Syndrom oder bovine spongiforme Enzephalopathie ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Hämoglobin Rinderhämoglobin ist, und dass das Prion beispielsweise ein Erreger für bovine spongiforme Enzephalopathie ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Anionentauscherchromatographiemedium Siliziumdioxid aufweist, beispielsweise Siliziumdioxid, welches mit kationischen Gruppen funktionalisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die kationische Gruppe eine quaternäre Ammoniumgruppe ist.