DE2640387A1 - Gewebespezifisches protein und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Gewebespezifisches protein und verfahren zu dessen herstellung

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Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg/Lahn
Aktenzeichen: - HOE 76/BO19 / Ma 279
Datum: 07.09.1976 - Dr.LI/sch
Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung betrifft ein gewebespezifisches Protein, d.h. einen Stoff, der Bestandteil von Organgeweben ist, und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Aus aufgeschlossenen Organen von Säugern lassen sich mehrere, bereits beschriebene Stoffe in relativ reiner Form isolieren. Bekannt ist z.B. das eisenhaltige Protein Ferritin, welches aus Placentengewebe hergestellt werden kann, aber auch in Magen, Milz, Leber, Niere, Uterus und Lunge nachgewiesen worden ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Gewebeprotein. Es ist gekennzeichnet durch
einen Proteinanteil, im wesentlichen bestehend aus d-Aminosäuren, von 94 - 3 %;
einen Kohlenhydratanteil von 5,4 - 2,2 %, davon Hexosen 3,0 - 1 %, Hexosamin 1,2 - 0,5 %, Fucose 0,2 - 0,2 %, Neuraminsäure 1,0 - 0,5%,
einen Sedimentationskoeffizienten S-I ' von 3,5 S - 0,5 S,
einen isoelektrischen Punkt von 4,9 - 0,3
eine elektrophoretisch^ Beweglichkeit im Bereich zwischen den
einen Extinktionskoeffizienten E1 (278 nm) von 11,9 - 1,0 und
eine spezifische immunologische Reaktion mit einem spezifisch gegen das Protein gerichteten Antikörper.
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Als besonderes Kennzeichen des neuen Gewebeproteins kann festgehalten werden, daß es sich sowohl in fetalen Organen als auch in adulten Organen von Säugern nachweisen läßt. Bei Primaten, insbesondere dem Menschen, ist das Protein in folgenden fetalen Organen nachgewiesen: Herz, Leber, Niere, Lunge, Magen, Gehirn, ferner in folgenden adulten Organen: Herz, Lunge, Haut, Magen, Niere, Uterus, Leber, Milz, Nebenniere, Colon, Rektum, Blase. Mit quantitativen immunologischen Methoden lassen sich dabei in der Regel mindestens 10 mg des Proteins in 100 g Gewebe nachweisen. Auch in der Placenta ist das Produkt in der Größenordnung von 10 mg/100 g Gewebe vorhanden. Die Placenta bietet sich jedoch für die Isolierung des Proteins besonders an. In Erythrozyten kann ein Gehalt von 1 mg des Proteins/100 ml Erythrozyten nachgewiesen werden, wohingegen im Plasma oder Serum von Gesunden das Protein nicht nachzuweisen ist.
Zur Erläuterung der kennzeichnenden Merkmale des Proteins sei folgendes ausgeführt.
Die Bestimmung des Sedimentationskoeffizienten erfolgte in einer analytischen Ultrazentrifuge bei 60 000 Umdrehungen/Minute in Doppelsektorzellen mit Hilfe der im Ultravioletten bei der Wellenlänge von 280 nm wandernden Banden der Substanz unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel und einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml in einer überschichtungszelle einer analytischen Ultrazentrifuge in -Anlehnung an Vinograd, Proc. Acad. Sei. USA, 4_9_, (1963).
Das Molekulargewicht wurde einerseits in der Ultrazentrifuge über die Ermittlung des Sedimentationsgleichgewichtes nach Yphantis errechnet. Es ergab sich ein Wert von 37.100 - 1.400.
Andererseits wurde bei der Untersuchung des Proteins in einem 0,1 % Natriumdodezylsulfat-haltigen Trägergel, bestehend aus Polyacrylamid, der größte Teil des Proteins in 2 Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 22 000 - 2 000 zerlegt. Daraus läßt sich für das native Protein ein Molekulargewicht von 44 000 - ' 4 000 ableiten. θ09811/0164
Zur Bestimmung des Isoelektrischen-Punktes wurde das Verfahren der isoelektrischen Focussierung angewandt unter Einsatz der hierfür von der Firma LKB, Stockholm, vertriebenen Geräte und Reagenzien.
Die elektrophoretische Beweglichkeit wurde unter Verwendung von Zelluloseacetat als Trägerfolie ermittelt.
Kohlenhydrate wurden bestimmt nach Schultze, H.E.; Schmidtberger, R.; Haupt, H.,: Untersuchungen über die gebundenen Kohlenhydrate in isolierten Plasmaproteinen. Biochem. Z., 329, 490, (1958).
Eine Aminosäureanalyse wurde nach Moore, S.; Spackman, D.H.; Stein, W.H.: Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins. Anal. Chem. , 3J), 1185, (1958) durchgeführt unter Verwendung eines Flüssigkeitschromatographen. Dabei zeigte sich, daß die am häufigsten in der Peptidkette vertretenen Aminosäuren Leucin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und Glycin sind.
Die immunologische Charakterisierung der Substanz erfolgt am einfachsten nach einem bekannten Diffusionsverfahren, bei welchem Antigen, d.h. das Protein, und ein gegen das Protein gerichteter Antikörper, bzw. das hinsichtlich der Antikörper nicht angereicherte Antiserum, gegeneinander in einem Trägermedium, wie z.B. Agar, diffundieren. Treffen die beiden Reaktionskomponenten in einem günstigen Verhältnis aufeinander, bildet sich ein sichtbares Präzipitat aus. Nach dieser Kenntnis ist es für den Fachmann einleuchtend, daß alle immunologischen Techniken zum Nachweis und zur Bestimmung sowohl des neuen Gewebeproteins als auch der gegen das Gewebeprotein gerichteten Antikörper möglich sind.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zur Herstellung des oben charakterisierten Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß Organextrakte, in der Regel wässrige Extrakte von Organen, die dieses Protein enthalten unter Zugrundelegung folgender erfindungsgemäß gefundener Kriterien fraktioniert werden:
Das Protein ist mit Neutralsalzen fällbar. Mit dem üblicherweise für derartige Fällungen verwendeten Ammoniumsülfat wird das
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Protein bei einer Sättigungskonzentration des Salzes von 30 bis 60% in einem pH-Bereich in der Nähe des Neutralpunktes gefällt.
Entsprechend seinem Molekulargewicht kann das Protein durch Maßnahmen, die zur Abtrennung von Substanzen mit Molekulargewichten zwischen 35 und 50 000 geeignet sind, gewonnen werden. Vorteilhaft werden hierfür die Methoden der Gelfiltration oder der Ultrafiltration eingesetzt.
Das Gewebeprotein wird bei neutralem oder schwach alkalischem pH-Wert an schwach-basische Ionenaustauscher adsorbiert, vorteilhaft wird dabei eine vergleichsweise wenig konzentrierte Pufferlösung verwendet, denn durch Erhöhung der Salzkonzentration oder auch durch Erniedrigung des pH-Wertes kann die Adsorption verhindert werden. Andererseits bietet sich bei Kenntnis dieses Verhaltens die Möglichkeit an, das Gewebeprotein zu adsorbieren und unter Verwendung von höher konzentrierten Salzlösungen bzw. von Pufferlösungen mit erniedrigtem pH-Werten, wieder zu eluieren.
Es hat sich gezeigt, daß das Gewebeprotein mit den wasserlöslichen organischen Basen der Acridin- und Chinolinreihe, die für Proteinfällungsverfahren üblicherweise Verwendung finden, nicht präzipitiert wird. Es bleibt in der bei diesen Verfahren üblichen Konzentration im wässrigen Überstand. Danach kann beispielsweise eine Acridinbase, wie das 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridin-lactat oder eine Chinolinbase wie Bis-(2methyl-4-aminochinolyl-6)-carbamid-hydrochlorid, zur Fällung von begleitenden Proteinen verwendet werden, wobei das erfindungsgemäße Gewebeprotein im Überstand verbleibt.
Ähnliche Überlegungen können gelten bei Verwendung von Hydroxylapatit als Adsorbens für Proteine. Das Gewebeprotein zeigt keine besondere Affinität zum Hydroxylapatit, wohingegen eine Reihe von Begleitproteinen von Hydroxylapatit festgehalten wird.
Aufgrund der Kenntnis der elektrophoretischen Beweglichkeit kann für die Anreicherung, bzw. Isolierung, des Gewebeproteins die präparative Zonen-Elektrophorese eingesetzt werden.
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Die Affinität des Gewebeproteins aufgrund seines immunologischen Verhaltens kann dafür eingesetzt werden, das Protein mit Hilfe von sog. Imitiun-Adsorptionsverfahren anzureichern. Hierfür kann in an sich bekannter Weise ein Immunadsorbens, d.h. ein trägergebundener Antikörper, gegen das Gewebeprotein hergestellt v/erden, welcher das Gewebeprotein spezifisch zu binden vermag. Das Protein kann danach durch Änderung der Milieubedingungen wieder eluiert werden.
Durch eine ausgewählte Kombination der genannten Methoden, die einerseits zur Anreicherung des Gewebeproteins andererseits zu seiner Abtrennung von den übrigen begleitenden Proteinen führen, kann die Isolierung der erfindungsgemäßen Substanz erfolgen. Demzufolge ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in den einzelnen Anreicherungsschritten für das Gewebeprotein und in den durch Kombination der Maßnahmen zur Anreicherung sich ergebenden Verfahren zu dessen Reinigung zu sehen.
Das Verfahren zur Anreicherung ist gekennzeichnet durch die Anwendung mindestens einer der folgenden Maßnahmen auf Organextrakte oder daraus gewonnenen Lösungen, die das Gewebeprotein enthalten und die anschließende Gewinnung der bezüglich des Gewebeproteins angereicherten Fraktion:
a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridin- oder Chinolinbase, vorzugsweise des 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridinlactat, im Bereich vom pH-Wert von 5 - 10, vorzugsweise bei etwa pH 8, bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,8 % · (Gewicht zu Volumen), wobei das Gewebeprotein im wesentlichen im Überstand verbleibt.
b) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Gewebeproteins, vorzugsweise vom Ammoniumsulfat bei etwa neutralem pH-Wert bis zu 30 - 60 % der Sättigungskonzentration des Ammoniumsulfats.
c) Adsorption des Gewebeproteins an einen schwachbasischen Ionenaustauscher, wie Diäthylaminoäthylcellulose, bei einer Leit-
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fähigkeit der Lösung von 0 - 2 mS und neutralem oder schwachalkalischem pH-Wert, beispielsweise unter Verwendung eines etwa 0,01 M Puffers vom pH-Wert von etwa 8. Ein bevorzugt zu verwendender Puffer ist Tris-Hydroxymethylaminomethan- HCl. Die Elution des Gewebeproteins kann durch Verschiebung des pH-Wertes auf <£ pH 7,0 oder durch Erhöhung der Leitfähigkeit auf 75 ms erreicht werden.
d) Trennung aufgrund der Molekulargröße (Molekularsiebfraktionierung). Besonders geeignet ist die Gelfiltration in einer Säule, gefüllt mit einem Polymeren entsprechender Porengröße, beispielsweise mit Epichlorhydrin-vernetztem Dextran, das als
(R)
SEPHADEX ' von der Firma Pharmacia, Uppsala, hergestellt wird, mit dem Ziel der Anreicherung von Proteinen mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000. Aber auch Produkte wie ULTRO-GEL von LKB, Bromma oder BIO-GEL P von Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif, können eingesetzt werden.
e) Durchführung einer Adsorption mit Hydroxylapatit. Da das Gewebeprotein bei Bedingungen, die üblicherweise in der präpativen Biochemie eingehalten werden, von Hydroxylapatit nicht gebunden wird, ist Hydroxylapatit ein geeignetes Agens, um
Begleitproteine des Gewebeproteins aus der Lösung zu entfernen. Die Gewebeproteinlösung wird hierfür zweckmäßig auf einen pH-Wert um den Neutralpunkt eingestellt und die -Leitfähigkeit der Lösung auf etwa 1 mS gehalten.
f) Präparat!ve Zonenelektrophorese.
Die das Protein enthaltende Lösung, die für die Durchführung einer Elektrophorese von Proteinen geeignet ist, vorzugsweise eine alkalische Pufferlösung, beispielsweise ein Natriumdiäthylbarbituratpuffer vom pH 8,6, Ionenstärke = 0,1, wird hierzu in eine Apparatur zur präparativen Elektrophorese, wie sie beispielsweise von N. Heimburger und R. Schmidtberger in Behringwerke-Mitteilungen, Heft 43, Seite 83 ff., insbesondere auf Seite 119 - 120, beschrieben wird, eingetragen. Bei dem Gerät handelt es sich um die horizontale Anordnung einer
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Trägerelektrophorese in einem offenen Trog, in welchem das Trägermaterial zur Abführung der bei der Elektrophorese auftretenden Joule'sehen Wärme auf unter 100C gekühlt wird. Als Trägermaterial dienen gegenüber Proteinen indifferente Substanzen, vorteilhaft Polyvinylchlorid, oder dessen Copolymerisate in Form eines feinen Granulats.
Es ist empfehlenswert, die Elektrophorese im alkalichen pH-Bereich, vorteilhaft bei etwa pH 8,6, bei einer Ionenstärke von 0,08 - 0,12 und bei einer Feldstärke von 4-6 Volt/cm vorzunehmen. Bei Verwendung von 0,1 M Natriumdiäthylbarbituratpuffer vom pH-Wert 8,6 wandert das Gewebeprotein im elektrischen Feld in dem als OC^- und B1-Zone klassifizierbaren Bereich der Plasmaproteine.
Für die Gewinnung des hochmolekularen £6-Globulins wird diese Zone herausgeschnitten und vom inerten Trägermaterial mit Hilfe von Wasser oder wässrigen Salzlösungen, beispielsweise einer 0,5 bis 1%igen Kochsalzlösung, eluiert. In einem letzten Reinigungsschritt kann das Eluat vorteilhaft nach einer vorherigen Konzentrierung, beispielsweise auf einem Ultrafilter, einer Gelfiltration unterworfen werden.
Zur Herstellung des neuen Gewebeproteins werden mehrere der angeführten Maßnahmen miteinander kombiniert und dabei jeweils diejenige Fraktion weiter verarbeitet, die das Gewebeprotein enthält, während die übrigen Fraktionen verworfen werden.
Ohne, daß daraus eine Einschränkung herzuleiten wäre, soll im folgenden eine Möglichkeit beispielhaft aufgezeigt werden, wie das Gewebeprotein aus einem Organgewebe gewonnen werden kann.
Dazu werden beispielsweise menschliche Placenten zerkleinert und mit Wasser oder einer verdünnten, zweckmäßig einer weniger als 10%igen Salzlösung, vorteilhaft mit einer 0,5%igen Neutralsalzlösung, wie beispielsweise Natriumchlorid, extrahiert. Zweckmäßig verwendet man auf 1 kg Placenten etwa 1-5 Liter der Extraktionslösungen. Die nicht gelösten Anteile werden durch
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Zentrifugation oder Filtration von dem Extrakt abgetrennt.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Arbeiten bei der Herstellung des Gewebeproteins unterhalb der Zimmertemperatur, beispielsweise bei 100C, durchzuführen. Der neutrale bis schwach alkalische, vorzugsweise auf etwa pH 8 eingestellte Placentenextrakt wird sodann mit einem wasserlöslichen Derivat einer Acridinbase, beispielsweise dem 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridin-lactat, bis zu einer Konzentration von 0,8 - 0,4% versetzt oder mit einem wasserlöslichen Derivat einer Chinolinbase, vorteilhaft mit Bis-(2methyl-4-aminochinolyl-6)-carbamid-hydrochlorid bis zu einer Konzentration von 0,3 - 0,15%. Die dabei entstehende Fällung wird verworfen. Der Überstand enthält den Hauptanteil des anzureichernden Gewebeproteins. Danach ist es zweckmäßig, überschüssiges Fällungsmittel durch Zusatz von Verbindungen abzuscheiden, welche mit dem Fällungsmittel einen Niederschlag zu bilden vermögen. Die Acridinbasen bilden beispielsweise mit Halogeniden schwer lösliche Verbindungen, so daß es sich anbietet, zur Abscheidung der Acridinbase Natriumchlorid zu verwenden. Eine befriedigende Abscheidung wird erreicht bei einer Konzentration von etwa 3-7% (G : V) Natriumchlorid. Der überstehenden Proteinlösung wird im folgenden soviel eines für die Fällung von Eiweißkörpern verwendbaren Salzes zugesetzt, daß das Gewebeprotein aus der Lösung verdrängt wird. Vorteilhaft wird als Salz Ammoniumsulfat verwendet: zweckmäßig wird hierfür eine Sättigungskonzentration des Ammoniumsulfats von 30 - 60%, vorzugsweise 40 - 50%, eingehalten. Der sich nach Zugabe des Arcmoniumsulfats bildende Niederschlag wird durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen und in Wasser wieder aufgelöst. Da derartige durch Salzfällung erhaltene Niederschläge in der Regel noch Fällungsmittel selbst einschließen, empfiehlt es sich, danach eine Dialyse anzuschließen. Die Lösung gegen die die Proteinlösung dialysiert wird ist zweckmäßig eine wenig konzentrierte Pufferlösung. Sinnvoll ist hier der Einsatz von Pufferlösungen, die bei der Ionenaustauschchromatographie üblich sind und die eine Adsorption des Gewebeproteins an einen schwachbasischen Ionenaustauscher ermöglichen.
Die dialysierte Lösung des Gewebeproteins wird danach in einem wenig konzentrierten Puffermilieu mit dem schwachbasischen
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Ionenaustauscher, z.B. Diäthylaminoäthylzellulose gemischt und nach erfolgter Adsorption des Gewebeproteins an den Ionenaustauscher dieser von der restlichen Lösung abgetrennt, z.B. abfiltriert. Wurde die Adsorption beispielsweise in einem schwach alkalischen Milieu (etwa pH 8,0) und einem Puffer der Konzentration von etwa 0,01 Mol/Liter durchgeführt, läßt sich ein Waschen des Ionenaustauschers mit einem 0,02 molaren Puffer bei etwas erniedrigtem pH-Wert (etwa 6-7) vornehmen. Die Salzkonzentration des Elutionspuffers kann bei insgesamt etwa 0,2 Mol/Liter liegen.
Es ist vorteilhaft, das Eluat ähnlich wie oben beschrieben mit soviel Neutralsalz zu versetzen, daß das Protein aus der verdünnten Lösung als Niederschlag und danach wieder aufgelöst in konzentrierter Form erhalten werden kann. Zur weiteren Reinigung kann das wieder aufgelöste Protein einer Gelfiltration unterworfen werden. Besonders gut angereicherte Fraktionen hinsichtlich des gesuchten Gewebeproteins werden erhalten, wenn hierfür das quervernetzte Dextran der Firma Pharmacia, SEPHADEX1 ' vom Typ G 150, verwendet wird, zweckmäßig in Form von Maßnahmen einer Säulenchromatographie. Zur Elution können in der Biochemie gebräuchliche Pufferlösungen, denen zur Erhöhung des Fraktionierungseffektes Neutralsalze zugesetzt werden können, beispielsweise 0,01 - 0,1 m Tris-hydroxymethyl-aminomethan Salzsäurepuffer mit Zusatz von 0 - 5 m NaCl von annähernd neutralem bis basischem pH-Wert dienen. Bei diesem Elutionsverfahren wird das Gewebeprotein in den eluticrten Fraktionen, zweckmäßig mit immunologischen Verfahren, gesucht, wonach diejenigen Fraktionen ausgesondert und gesammelt werden, die das erfindungsgemäße Protein enthalten.
Da auch die GeIfiltrationseluate das Gewebeprotein.in verdünnter Form enthalten, ist auch hier eine Anreicherung durch Fällung mit Neutralsalzen, wie beschrieben, angezeigt.
Die durch Wiederauflösung des SalzniederSchlages gewonnene Lösung des Gewebeproteins Wird durch Dialyse gegen eine sehr stark verdünnte Pufferlösung auf die Bedingungen eingestellt, die geeignet sind, möglichst viele der noch vorhandenen Verunreini-
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gungen an Hydroxydapatit zu adsorbieren. Geeignet sind hier insbesondere schwach-konzentrierte Phosphatpuffer, beispielsweise ein etwa 0,005 molarer Natriumphosphatpuffer, dessen pH-Wert etwa zwischen 6,5 und 7,0 liegt. Beim Kontakt des Hydroxylapatits mit der vorliegenden Proteinlösung wird das erfindungsgemäße Gewebeprotein weitgehend in Lösung belassen, so daß das Hydroxylapatit, das zweckmäßig in eine Säule eingefüllt ist, für das folgende Verfahren nicht mehr berücksichtigt werden muß. Der Durchlauf durch die Hydroxylpatitsäule enthält das gesuchte Gewebeprotein in abermals angereicherter und gereinigter Form.
Eine Wiederholung der Ionenaustauschchromatographie, wobei abweichend zum vorher beschriebenen Schritt - der Ionenaustauscher in eine Säule gefüllt, die das Gewebeprotein enthaltende Lösung auf die Säule aufgetragen und mit einer Salzlösung steigender Konzentration (gradient) eluiert wird führt zu weiteren Anreicherungen des Gewebeproteins. Das nach diesen beispielhaft aufgezeigten Schritten durchgeführte Reinigungsverfahren führt zu dem Gewebeprotein in einer Reinheit von ·ρ"99%.
Das Gewebeprotein läßt sich selbstverständlich nach dem vorher gesagten in der gleichen Reinheit auch durch Kombination anderer Schritte, beispielsweise auch unter Einfügung eines Schrittes der präparativen Elektrophorese oder der Immunadsorption, erhalten.
Das erfindungsgemäß hergestellte Gewebeprotein hat antigene Eigenschaften. Eine damit durchgeführte Immunisierung von Tieren nach bekannten Methoden führte zur Bildung von spezifischen Antikörpern im Blut der immunisierten Tiere. Deren Seren können nach üblichen Verfahren gewonnen und die darin enthaltenen Antikörper angereichert werden.
Die nachgewiesene Gewebespezifität des erfindungsgemäßen Stoffes legt eine diagnostische Bedeutung nahe. Gewebeerkrankungen lassen sich durch den Austritt des Proteins aus dem Gewebe in die Blutbahn im Blut nachweisen. Hierfür kommen im wesentlichen die bekannten immunologischen Nachweisverfahren unter Verwendung der spezifischen gegen das Gewebeprotein gerichteten Antikörper infrage.
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Die Erfindung wird in dem nachstehenden Beispiel näher erläutert:
Beispiel
150 kg tiefgefrorene Placenten werden zerkleinert und mit 150 1 einer 0,5%igen wässrigen Natriumchloridlösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2n-Natriumhydroxyd auf pH 8 eingestellt und mit 50 1 einer 3%igen wässrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridin-lactat versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird der überstand, der das Gewebsprotein enthält, abgehebert, mit 5 % festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Diaminoäthoxyacridin-lactats versetzt, filtriert und mit 30% bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit - festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert.
500 g des auf dem Filter gesaiatuelten Niederschlages werden in ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 0,05% Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der überstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0,1 η Natriumhydroxydlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 500 g feuchter Diäthylaminoäthylcellulose (Firma Serva, Heidelberg) 1 Stunde verrührt.
Dann wird die Diäthylaminoäthylcellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je 1 1 0,01 molarem Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salzsäurepuffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02 molarem Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salzsäurepuffer, pH 6,5, der 0,85% Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid enthält, eluiert.
Den vereinigten Eluaten werden 30% Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das ganze wird verrührt. Der Niederschlag, der das Gewebeprotein enthält, wird in 300 ml destilliertem Wasser gelöst und der Gelfiltration mittels
f R)
SEPHADEX* 'G-150 unter Verwendung von 0,1 molarem Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salζsäurepuffer vom pH 8,0, der 1,0 Mol Natriumchlorid/Liter enthält, #QtߣZP96Pn LΛ>°0 : 20 cm-Säule) . Hierbei
dient der Tris-Puffer zunächst als Suspensionsmedium, in dem der Träger für die Gelfiltration - nämlich das SEPHADEX(R)G 150 vorliegt. Das in destilliertem Wasser gelöste Gewebeprotein wird auf
(R)
die mit SEPFIADEX gefüllte Säule aufgetragen und mit dem besagten Tris-Puffer eluiert.
Anschließend werden die Eluate mit spezifischem Gewebeprotein-Antiserum getester, die Gewebeprotein-haltigen Fraktionen gesammelt und daraus die Proteine nochmals, wie oben beschrieben. mit 30% festem Ammonsulfat ausgefällt.
Die Weiterreinigung erfolgt an Hydroxylapatit (Säule 3 χ 23 cm) unter Verwendung eines 0,005m Phosphatpuffers, pH 6,8, und an-
(R) schließend durch Chromatographie an Diäthylaminoäthyl-SEPHADEXv ' (Pharmacia) (Säule 3 χ 23 cm) unter Verwendung eines Tris-HCl-Puffers, pH 7,0. Zur Elution wird ein Salzgradient mit 0-2% NaCl angelegt. Es werden 40 mg des neuen Gewebeproteins in einer Reinheit von 99,5% erhalten.
Die Aminosäureanalyse ergab folgende Werte (Mol-Prozent):
Lysin 5,64 Histidin 1,05 Arginin 3,83 Asparaginsäure 9,84 Threonin 4,33 Serin 4,78 Glutaminsäure 11,29 Prolin 6,41 Glycin 8,65
Alanin 1 7,51
Cystin/2 2,11
Valin 6,68
Methionin 0,98
Isoleucin 3,32
Leucin 4,43
Tyrosin 5,10
Phenylalanin 3,08
Tryptophan 1,14
809811/0164

Claims (4)

  1. HOE 76/B OI9 PATENTANSPRÜCHE:
    (T) Gewebeprotein gekennzeichnet durch
    a) einen Proteinanteil von 94 - 3%
    einen Gehalt an Kohlenhydraten von 5,4 - 2,2% und davon Hexosen 3,0-- 1%, Hexosamin 1,2 - 0,5%, Fucose 0,2 - 0,2%, Neuraminsäure 1,0 - 0,5 %;
    b) einen Sedimentationskoeffizienten S ~ ' von 3,5 S - 0,5 S;
    c) einen isoelektrischen Punkt von 4,9 - 0,3
    d) eine elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich zwischen den OC0- und ß1-Globulinen;
    Λ O, +
    e) einen Extinktionskoeffizienten E" (278 nm) von 11,9 - 1,0.
  2. 2. Verfahren zur Anreicherung des Gewebeproteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Organextrakte oder daraus gewonnene Lösungen, die dieses Protein enthalten, mindestens einer der folgenden Maßnahmen unterworfen werden und die bezüglich des Gewebeproteins angereicherte Fraktion gewonnen wird:
    a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridin- oder Chinolinbase im Bereich vom pH-Wert von 5-10 bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,8%;
    b) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Gewebeproteins;
    c) Adsorption des Gewebeproteins an einen schwachbasischen Ionenaustauscher und Elution davon;
    d) Molekularsiebfraktionierung und Gewinnung der Fraktionen die einem Molekulargewicht von etwa 50.000 entsprechen;
    e) Adsorption an Hydroxylapatit unter Vermeidung der Bindung des Gewebeproteins;
    f) präparative Zonenelektrophorese und Gewinnung der 0L2~ B1-Zwischenzone.
    809811/0164
    HOE 76/B 019
  3. 3- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Organextrakt ein Extrakt aus menschlichen Placenten verwendet wird.
  4. 4. Verwendung des Gewebeproteins nach Anspruch 1 zur Gewinnung von Antiseren nach ansich bekannten Verfahren.
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