DE3044773A1

DE3044773A1 - Verfahren zur abtrennung von plasmaalbumin

Info

Publication number: DE3044773A1
Application number: DE19803044773
Authority: DE
Inventors: Mitsutoshi Shin-nanyo Yamaguchi Fukuda; Kenji Koyama; Syotaro Tokuyama Yamaguchi Ohno
Original assignee: Toyo Soda Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1980-01-10
Filing date: 1980-11-27
Publication date: 1981-08-27
Also published as: DE3044773C2; GB2067200B; JPS5753328B2; FR2473341B1; JPS5699422A; FR2473341A1; GB2067200A; US4522725A

Description

30AA773

1A-3432
Ts-190

TOYO SODA MANUFACTURING CO., LTD. Shin-nanyo-shi, Yamaguchi-ken, Japan

Verfahren zur Abtrennung von Plasmaalbumin

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Plasmaalbumin-Medikament. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Abtrennung eines im wesentlichen reinen Plasmaalbumins aus Blutplasma.

In jüngster Zeit ist Blut nicht nur für Bluttransfusionen im Rahmen der ersten Hilfe oder ähnlicher Sofortmaßnahmen zur Lebensrettung verwendet worden. Das Blut wird auch in Blutbänken gelagert und zur Herstellung von Blutmedikamenten verwendet. Derartige technische Entwicklungen haben dazu geführt, daß lediglich die wichtigen Blutkomponenten abgetrennt und für die Transfusion verwendet werden. Es ist auf diese Weise möglich, eine angestrebte Dosis zu verabreichen und die durch nutzlose Komponenten verursachten Nebenwirkungen zu verhindern. Gleichzeitig kann so menschliches Blut, bei dem es sich um eine wichtige und nur in beschränktem Maße zur Verfügung stehende Quelle han-

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deIt, in effektiver Weise genutzt werden. Bekanntermaßen kann Blut in Erythrocyten, Leukocyten, Blutplättchen und flüssiges Blutplasma aufgetrennt werden. Das Blutplasma enthält verschiedene Proteine mit unterschiedlichen Funktionen. Es wird angestrebt, die Protine des Blutplasmas zu separieren, zu reinigen und lediglich die Fraktion mit der je nach Anwendungszweck gewünschten Komponente zu verwenden. Unter den Proteinen des Blutplasmas kommt dem Plasmaalbumin die Funktion zu, den osmotischen Druck des Bluts aufrechtzuerhalten und biologisch unverzichtbare Materialien, wie Nahrung, den verschiedenen Organen zuzuführen.

Die medizinischen Anwendungen von Plasmaalbumin umfassen die Therapie von Hypoalbuminämie und von durch Hypalbuminämie verursachten Ödemen; die Notfalltherapie von hämorrhagischen Schockzuständen oder Verbrennungen sowie die Entfernung von Plasmabilirubin bei der Austauschertransfusion von Neugeborenen oder dergl. Bei diesen Anwendungen sind ausgezeichnete Ergebnisse erzielt worden.

Als Verfahren zur Abtrennung von Plasmaalbumin von Blutplasma sind folgende Methoden bekannt, die sich die Unterschiede der Löslichkeiten der Moleküle, Unterschiede der Ladungen und Unterschiede hinsichtlich der Größe der Moleküle zunutze machen:

(1) Eine fraktionierte Präzipitation durch Zugabe eines neutralen Salzes, wie Ammoniumsulfat ; oder eines organischen Lösungsmittels, wie kaltes Äthanol,oder eines wasserlöslichen Makromoleküls, wie Polyäthylenglykol;

(2) eine Chromatographie unter Verwendung eines Ionenaustauschers oder eines Adsorptionsmittels oder eines Molekularsiebs oder dergl.;

(3) ein elektrophoretisches Verfahren, das auf den Unterschieden der Ladungen basiert;

(4) eine Immunoadsorption.

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Zur Trennung wurde bisher eines der oben erwähnten Verfahren oder eine Kombination derselben angewendet. Diese Verfahren weisen Jedoch Nachteile auf. Entweder wird bei Durchführung des Verfahrens bei Zimmertemperatur eine Schädigung der Struktur des Plasmaproteinmoleküls verursacht oder es tritt nachteiligerweise eine Aggregatbildung ein oder es ist für die Abtrennung eine lange Zeit oder ein präzises Einhalten der Verfahrensbedingungen erforderlich.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Abtrennung von Plasmaalbumin zu schaffen, bei dem dieses bei einfacher Verfahrensweise während einer kurzen Zeit ohne Aufbrechen der Struktur des Plasmaproteins oder Bildung von Aggregaten erhalten wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man durch eine grobe fraktionierte Trennung eine rohe Albuminfraktion vom Blutplasma abtrennt und anschließend das Plasmaalbumin mit einer Ultrafiltrationsmembran aus einem PoIysulfonharz abtrennt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Beziehung der prozentualen Permeation von Albumin und dem pH von Lösungen in den Fällen, in denen die gleiche Membran und die gleiche Probe wie bei Beispiel 1 verwendet werden; und

Fig. 2 und 3 Flüssigkeitschromatogramme, die als Ergebnis der erfindungsgemäßen Beispiele erhalten werden.

Von den Erfindern wurde die bekannte Technologie im Hinblick auf Verbesserungen untersucht, und zwar ausgehend von einer unterschiedlichen Betrachtungsweise. Dabei wurde ein neues Verfahren zur Abtrennung von Plasmaalbumin aus Blutplasma aufgefunden.

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Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch eine Fraktionierung von Blutplasma mit einem Präzipitationsmittel, wie einer wasserlöslichen makromolekularen Verbindung, neutralen Salzen und kaltem Äthanol, eine rohe Albuminfraktion abgetrennt. Die rohe Albuminfraktion wird unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmerabran einer Ultrafiltration unterworfen, und zwar unter Bedingungen, bei denen lediglich reines Plasmaalbumin durch die Membran hindurchgeht. Auf diese Weise wird Plasmaalbumin während kurzer Zeit mittels eines einfachen Verfahrens abgetrennt.

Unter der rohen Albuminfraktion ist im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Fraktion von Plasmaalbumin zu verstehen, die im wesentlichen kein γ-Globulin (Molekulargewicht von 16 χ 10 ) enthält. Dabei kann es sich um eine rohe Albuminfraktion handeln, welche durch Fraktionierung mit Polyäthylenglykol erhalten wurde, oder um eine S^j^jj-Fraktion, die durch eine Cohn-Fraktionierung mit kaltem Äthanol erhalten wurde. Falls die Fraktion γ-Globulin enthält, geht das γ-Globulin ebenfalls zusammen mit Plasmaalbumin durch die Ultrafiltrationsmembran hindurch, und es kann auf diese Weise kein reines Plasmaalbumin erhalten werden. Das für die Fraktionierung zur Herstellung der rohen Albuminfraktion angewendete Verfahren ist nicht kritisch und nicht &uf die obec erwähnten Verfahret, beschränkt.

Falls man Blutplasma direkt einer Ultrafiltration unterwirft, wird das im Blutplasma vorhandene Fibrinogen auf der Ultrafiltrationsmembran adsorbiert, wodurch die Ultrafiltration des Plasmaalbumins nachteiligerweise langsam verläuft. Um diesen Nachteil zu überwinden, wird Fibrinogen vorher durch eine Fraktionierung mit Polyäthylenglykol, einem neutralen Salz oder dergl. abgetrennt. Anschließend wird die resultierende, rohe Albuminfraktion mit der Ultrafiltrationsmembran behandelt, um ein reines Plasmaalbumin

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zu erhalten. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf die sen Beobachtungen.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ultrafiltrationsmembran ist vorzugsweise eine solche, die aus einem Polysulfonharz mit den folgenden Struktureinheiten besteht:

^oder

-O-

(η = 50 bis 250)

Die Membran kann dadurch hergestellt werden, daß man das Polysulfon in einem Lösungsmittel auflöst und anschließend die Lösung in Form eines Films ausbreitet und in ein NichtLösungsmittel eintaucht. Der Porendurchmesser der Membran kann mittels eines Elektronenmikroskops nicht beobachtet werden. Bei der Ultrafiltrationsmembran wird daher gewöhnlich die Eigenschaft der Membran durch ein "cut-off" Molekulargewicht definiert (Molekulargewicht der Teilchen, die gerade noch zurückgehalten werden).

Das cut-off Molekulargewicht wird gewöhnlich definiert, indem man die prozentuale Retention der Membran mit einem sphärischen Protein bestimmt, das ein bekanntes Molekulargewicht aufweist (1 - Konzentration der durchgelaufenen Lösung/Konzentration der ursprünglichen Lösung) χ 100. Die Molekulargewichte der gelösten Bestandteile und die prozentualen Retentionen werden gegeneinander aufgetragen und das Molekulargewicht bei einer prozentualen Retention von 100% wird berechnet. Das cut-off Molekulargewicht kann je nach dem Meßverfahren variieren. Beispielsweise wird für eine PM-10 Membran, hergestellt von Amicon Co., ein cut-off Mole-

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kulargewicht von 10 000 angegeben. Myoglobin mit einem Molekulargewicht von 18 000 läuft jedoch durch die Membran hindurch. Das cut-off Molekulargewicht variiert also je nach dem Meßverfahren. Es zeigt sich z.B., daß sich das cut-off Molekulargewicht in Abhängigkeit von der Veränderung des pH-Wertes der Lösung verändert, und zwar selbst dann, wenn die Probe und die Membran die gleiche sind. Es wird angenommen, daß die Variation von Ladungen des Proteins und von der Verteilung des Proteins in der Lösung abhängt.

Im vorliegenden Fall wird das cut-off Molekulargewicht dadurch bestimmt, daß man Proteine mit bekanntem Molekulargewicht (Myoglobin, ß-Lactoglobulin, Albumin, γ-Globulin etc.) in einer Phosphatpufferlösung (pH 6,8) verwendet, die als Eluat einer wäßrigen Gelpermeationschromatographie (GPC) vorliegen. Es werden die Absorptionsverhältnisse der Proben bei 280 nm unter Verwendung einer G3000SW-Säule, hergestellt von Toyo Soda Mfg.Co., gemessen und die prozentualen Retentionen der Membran aufgetragen. Bei der vorliegenden Erfindung ist das cut-off Molekulargewicht bei einem pH von 6,8 angegeben.

Das cut-off Molekulargewicht der Ultrafiltrationsmembran, die bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, liegt gewöhnlich in einem Bereich von 2 χ 10^ bis 3,5 x 10 und

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vorzugsweise in einem Bereich von 2,5 x 10 bis 3 x 10 . Das Bestimmungsverfahren der prozentualen Retention ist nicht auf das erfindungsgemäße Verfahren beschränkt. Es hat sich gezeigt, daß unter den Ultrafiltrationsmerabranen mit gleichem cut-off Molekulargewicht solche Membranen, die aus einem Polyamid, einem Polyäthylenterephthalat, einem Polycarbonat, Cellulose oder Celluloseacetat bestehen, manchmal für makromolekulare Proteine genau so gut wie für Albumin permeabel sind oder bei diesenMembranen die prozentuale Permeation von Plasmaalbumin bemerkenswert gering ist,

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was zu einer schlechteren Trennfähigkeit führt. Beispielsweise werden bei Verwendung einer Cellulosemembran die Proteine an der Membran adsorbiert, und man erhält eine bemerkenswert niedrige Ultrafiltrationsrate. Andererseits kann bei Verwendung einer Polysulfonharzmembran eine Ultrafiltrationsmembran mit bemerkenswert enger Verteilung der Porendurchmesser erhalten werden. Man erhält eine konstante Ultrafiltrationsrate, ohne daß irgendeine Adsorption der Proteine auf der Membran eintritt. Diese Membran ist zur Abtrennung von Plasmaalbumin optimal geeignet. Aufgrund der Merkmale der Ultrafiltrationsmembran ist es daher möglich, die Komponenten in Abhängigkeit von den Größenunterschieden voneinander zu trennen. Es kann also unter Verwendung dieser Membran die Ultrafiltration mittels eines einfachen und schnellen Verfahrens durchgeführt werden, wobei die Größenunterschiede von Plasmaalbumin und den anderen Proteinen ausgenutzt werden.

Bei der mit dieser Membran erfolgenden Trennung liegt der pH-Wert der wäßrigen Lösung vorzugsweise in einem Bereich von 5 bis 8 und speziell 6 bis 7,5. Die prozentuale Permeation des Plasmaalbumins (Konzentration der durchgelaufenen Lösung/Konzentration der ursprünglichen Lösung χ 100) verändert sich, abhängig vom pH-VTert, in bemerkenswerter Weise.

In Fig. 1 ist die Beziehung der prozentualen Permeation von Plasmaalbumin und des pH-Wertes der Lösung dargestellt. Die Behandlungszeit kann, abhängig von einer höheren prozentualen Permeation, entsprechend kurzer sein. Aus wirtschaftlichen Gründen liegt der optimale pH-Wert bei der Abtrennung unter Verwendung der Membran vorzugsweise in einem Bereich von 5 bis 8 und insbesondere von 6 bis 7,5. Die Konzentration der Lösung ist vorzugsweise geringer als 2% (Gew./Vol.). Bei einer höheren Konzentration ist die Ultra-

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filtrationsrate geringer. Außerdem ist die prozentuale Permeation von Plasmaalbumin niedriger, da eine höhere Konzentrationspolarisierung der gelösten Bestandteile auf der Oberfläche der Membran eintritt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der pH-Wert der wäßrigen Lösung der rohen Albuminfraktion in einem Bereich von 5 bis 8 eingestellt. Es wird eine Ultrafiltration der Lösung durch die Membran durchgeführt, wobei die anderen Proteine auf der Membran zurückgehalten werden, während lediglich das Plasmaalbumin durch die Ultrafiltrationsmembran hindurchgeht. Anschließend kann die durchgelaufene Plasmaalbuminlösung in weiteren Verfahrensschritten mit einer Membran konzentriert und entsalzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann nicht nur auf Blutplasma angewendet werden, das vom Menschen stammt. Bs kann auch auf Blutplasma angewendet werden, das von Tieren, wie Rindern, Pferden und Schafen, stammt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und Vergleichsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Ein Polykondensat von Diphenylsulfon und Bisphenol A (n = 170) wird in Dimethylacetamid aufgelöst, um eine 125frLge (Gew./Vol.) Lösung herzustellen. Die Lösung wird mittels einer Rakel auf einem 30 cm χ 30 cm großen Polyäthylenvliesmaterial ausgebreitet, so daß man eine Dicke von 200/um erhält. Das Ganze wird in Wasser eingetaucht und man erhält eine Membran. Zur Bestimmung des cut-off Molekulargewichts der Membran wird die Membran in Stücke mit einem Durchmesser von 90 mm zerschnitten. Damit wird eine Ultrafiltrationsvorrichtung ausgerüstet. Es werden die prozentualen Retentionen der Proteine Myoglobin (18 000), Albumin (68 000), γ-Globulin (16O 000) und Glutamatdehydrogenase

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(350 000) bestimmt. Das cut-off Molekulargewicht beträgt etwa 3 x 10 .

Menschliches Blut wird bei tiefer Temperatur zur Entfernung der Blutkörperchenkomponenten einer Zentrifugentrennung unterworfen. Man erhält auf diese Weise Blutplasma. Der pH-Wert des Blutplasmas wird mit einer 1N wäßrigen Lösung von NaOH auf 8,0 eingestellt. Unter Kühlen und Rühren wird eine 5O96ige Lösung von Polyäthylenglykol (4000) dem Blutplasma zugesetzt, so daß man eine Konzentration des PoIyäthylenglykols von 1296 erhält. Die Lösung wird bei tiefer Temperatur zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt. Der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wird mit 1N HCl auf 4,6 eingestellt. Der Lösung werden unter Kühlen und Rühren Polyäthylenglykol (4000)-Flocken zugesetzt, um eine Konzentration des Polyäthylenglykols von 259ί zu erhalten. Das Gemisch wird zur Abtrennung eines Präzipitats bei tiefer Temperatur zentrifugiert. Das Präzipitat wird in einer Phosphatpufferlösung mit einem pH von 6,8 aufgelöst, und zwar unter Bildung einer 1#igen Lösung. Die Lösung wird bei einem Druckunterschied von 1 kg/cm in der mit der Membran ausgerüsteten Ultrafiltrationsvorrichtung einer Ultrafiltration unterworfen. Das unter den folgenden Meßbedingungen resultierende Chromatogramm der Lösung ist in Fig. 2 dargestellt.

Meßbedingungen

Gelpermeationschromatographie: HLC-802UR G3000 SW (eine Säule), hergestellt von Toyo Soda Mfg. Co.

Eluationsmittel: Phosphatpufferlösüng (pH 6,8) Detektor: UV Monitor 280 nm.

Das Chromatogramm zeigt auf der linken Seite die Signale der rohen Albuminfraktion, die durch Fraktionierung mit Polyäthylenglykol erhalten wurde, und zwar vor der Ultrafiltration. Das auf der rechten Seite dargestellte Chromatogramm ist das der Lösung, die durch die Ultrafiltration

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erhalten wurde (Plasmaalbumin). Aus dem Chromatogramm geht klar hervor, daß lediglich .Plasmaalbumin'durch die Membran hindurchgeht. Die prozentuale Permeation beträgt etwa 50%. Signale (1) und (2): makromolekulare Proteine Signal (3): Plasmaalbumin.

Beispiel 2

Das Polysulfonharz von Beispiel 1 wird in einem gemischten Lösungsmittel aus N-Methylpyrrolidon und Dimethylsulfoxid (7:3) aufgelöst, um eine 1596ige (Gew./Vol.) Lösung herzustellen. Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 wird eine Ultrafiltrationsmembran hergestellt und das cut-off Molekulargewicht der Membran bestimmt. Das cut-off Molekulargewicht der Membran beträgt etwa 2,5 x 1Cr. Menschliches Blutplasma wird zweckentsprechend behandelt, so daß man bei -3°C einen pH-Wert von 7»2, eine Ionenstärke von .0,14, eine Äthanolkonzentration von Q% und eine Proteinkonzentration von 5,1% erhält. Das Plasma wird weiterhin zur Abtrennung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird so behandelt, daß man bei -5⁰C eine Äthano!konzentration von 2596, einen pH-Wert von 6,9, eine Ionenstärke von 0,09 und eine Proteinkonzentration von 396 erhält. Anschließend wird wiederum zentrifugiert, um die überstehende Lösung (Sjj^.jjj-Fraktion) abzutrennen. Die überstehende Lösung wird verdünnt, um eine Proteinkonzentration von 196 zu erhalten. Die Lösung wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 einer Ultrafiltration unterworfen.

Das unter den Bedingungen von Beispiel 1 resultierende Chromatogramm der Lösung ist in Fig. 3 dargestellt. Aus dem Chromatogramm wird deutlich, daß lediglich Plasmaalbumin durch die Membran hindurchgegangen ist. Die prozentuale Permeation beträgt etwa 3096.

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Beispiel 3

Ein Polysulfonharz mit der Haupteinheit

(n = 150)

wird in Dimethylsulfoxid zu einer Konzentration von 15% (Gew./Vol.) aufgelöst. Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 wird eine Ultrafiltrationsmembran hergestellt und das cut-off Molekulargewicht der Membran bestimmt. Das cut-off Molekulargewicht der Membran beträgt 3 x 10^. Rinderblut wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 mit Polyäthylenglykol behandelt, um eine grobe Plasmaalbuminfraktion zu erhalten. Die Fraktion wird einer Ultrafiltration unterworfen, indem man eine Ultrafiltrationsvorrichtung vom Rührtyp verwendet.. Dabei wird das Verfahren des Beispiels 1 angewendet. Das sich für die Lösung ergebende Chromatogramm ist im wesentlichen das gleiche wie das von Fig. 3. Daraus geht eindeutig hervor, daß lediglich Albumin durch die Membran hindurchgeht. Die prozentuale Permeation beträgt etwa 3096.

Vergleichsbeispiel 1

Unter Verwendung der Membran des Beispiels 1 wird eine Ultrafiltration von menschlichem Blutplasma mit einem pH-Wert von 7 durchgeführt. Bei der Ultrafiltration tritt lediglich eine geringe Menge des Plasmaalbumins durch die Membran hindurch.

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Vergleichsbeispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt. Es wird jedoch eine im Handel erhältliche Celluloseacetat-Ultrafiltrationsmembran (cut-off Molekulargewicht von 3 x 1Cr) eingesetzt. Es werden eine Fraktionierung und eine Ultrafiltration durchgeführt. Als Ergebnis wird beobachtet, daß zwar zu Beginn eine geringe Menge des Plasmaalbumins durchläuft, jedoch zu einem späteren Zeitpunkt keine Permeation des Plasmaalbumins stattfindet. Die Ultrafiltrationsrate ist bemerkenswert niedriger.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Abtrennen von Plasmaalbumin, dadurch gekennzeichnet, daß man durch ein Grobfraktionierungsverfahren eine rohe Albuminfraktion vom Blutplasma abtrennt und nachfolgend Plasmaalbumin mit einer Ultrafiltrationsmembran aus einem Polysulfonharz abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Polysulfonharz um ein Harz der folgenden Formeln handelt:

'3
(n = 50 bis 250).

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein rohes Albumin einsetzt, das mittels des Grobfraktionierungsverfahrens unter Verwendung von Polyäthylenglykol aus dem Blutplasma abgetrennt wurde.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 boder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Fraktion von ^stt₊iji einsetzt, die durch eine fraktionierte Trennung unter Vervrendung von kaltem Äthanol nach Cohn aus dem Blutplasma abgetrennt wurde.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert einer wäßrigen Lösung des rohen Albumins in einem Bereich von 5 bis 8 liegt.

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ORIGINAL INSPECTED