-
Gebiet der
Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Erhalt einer reineren
und sichereren Zubereitung von Normalserumalbumin (des Menschen),
das im wesentlichen frei von Aluminium und Weiteren toxischen Begleitstoffen
ist.
-
Die
Verwendung von menschlichem bzw. Humanalbumin als Therapeutikum
ist gut bekannt. Ein derartiges Produkt ist "PLASBUMIN" 25% und 5% (Gutter Biological, Miles
Inc., Berkeley, California). Viele haben versucht, Albumin-Zubereitungen
zu verbessern, und es ist gezeigt worden, dass einige ein gewisses
Niveau einer verbesserten Zusammensetzung erreicht haben. Aber in
gewisser Weise gibt es noch Mängel
bei jeder dieser neuartigen Zusammensetzungen. Beispielsweise ist
festzustellen, dass bei einem der Hersteller von Albumin die Gehaltsmenge
an Aluminium auf einen so niedrigen Wert wie von 96 ppb verringert
wird. Beim 40°C-Stabilitätstest dieses
Produkts stieg die Gehaltsmenge auf einen so hohen Wert wie von
380 ppb an. Das vorliegende Patent lehrt die Verfahrensweisen, die
notwendig sind, um Quellen-Plasma (des Menschen) bis hin zu einer
Albumin-Zubereitung mit überlegener
Lagerungsdauer und mit erwiesenen markierten und etikettierten Werten,
die sich während
der Datierzeitdauer nicht verändern.
-
Aluminium
in Albumin stellt eine Hauptsorge für Kliniker dar, die Albumin
in ihrer Praxis verabreichen. Koppel et al., J. Toxicol. Clin. Toxicol.
26(5–6):
337–56,
Okt-Nov 1988.
-
Die
vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von Albumin-Quellen
gerichtet, die im wesentlichen nur wenig Hämoglobin enthalten, wie das
im Federal Register beschriebene Quellen-Plasma (des Menschen). Allerdings
kann im Verfahren der vorliegenden Erfindung auch Albumin eingesetzt
werden, das aus gentechnischen Quellen wie aus mit rDNA erzeugten
Quellen und weiteren Albumin-Quellen stammt, die im wesentlichen
nur wenig Hämoglobin
enthalten. weil die Hauptquelle von Albumin in der Welt von heute
Plasma ist, bezieht sich das Verfahren zur Herstellung der vorliegenden
Zusammensetzungen hauptsächlich
auf Plasma oder Serum. Es ist beispielsweise nicht auf Hämoglobin
enthaltende Zubereitungen aus einer Plazenta-Quelle gerichtet. Viele
Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Albumin zur Infusion sind
aus Materialien bekannt, die Hämoglobin
enthalten, wie Plazenta, die als das Ausgangsmaterial eingesetzt
wird. Siehe
US 4,197,238 , die
auch eine Übersicht
entsprechender Verfahren liefert. Siehe auch
US 4,169,829 , die ebenfalls auf gereinigtes
Albumin gerichtet ist, das aus plazentarem oder weiterem hämolysierten
Blut hergestellt wird, das Hämoglobin
enthält.
Die Neuheit der vorliegenden Erfindung lehrt, dass monomeres Albumin
(von mehr als 99%), das gemäß Celluloseacetat-Elektrophorese
100% rein und frei von allen restlichen Verarbeitungschemikalien ist,
mit dem in der vorliegenden Erfindung gelehrten Verfahren bereitgestellt
wird. Die Zubereitung enthält
im wesentlichen kein Material mit einem Molekulargewicht, das größer als
das von dimerem Albumin ist. Eine Zubereitung, die frei von polymerisiertem
Protein, aus einer im wesentlichen Hämoglobin-freien Albumin-Quelle wie
aus Quellen-Plasma (des Menschen) hergestellt und im wesentlichen
frei von Aluminium ist, ist bisher unbekannt. Zu diesen Merkmalen
kommt noch hinzu, dass das mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung
hergestellte Produkt die gemäß Etikett
angegebenen und markierten Werte der Begleitstoffe über seine
Datierzeitdauer hinweg beibehält.
-
Bio-Sciences
6, 103–106,
1987, offenbart ein Verfahren zur Reinigung von HSA, das eine Albumin-Zubereitung
ergibt, die eine Reinheit von 99% und von weniger als die Nachweisgrenze
(0,5%) an Polymeren aufweist.
-
Biotechnology
of plasma proteins, Colloque INSERM, 175, 19–24, 1989, beschreibt die Reinigung
von Albumin durch Thermokoagulation.
-
J.
Trace Elem. Electrolytes Health Dis. 3, 39–42, 1989, beschreibt ein Verfahren
zur Reinigung von HSA, das eine Albumin-Zubereitung ergibt, die
zu 98% monomer ist und nicht mehr nachweisbare Polymere (von weniger
als 0,2%) aufweist.
-
In
Methods of plasma protein fractionating, Ed. Curling, J. M. Academic
Press, London, S. 77–91, 1980,
ist eine Albumin-Reinigung durch Ionenaustausch-Chromatographie
beschrieben.
-
EP-A
73 646 betrifft den Aufbau von DNA-Sequenzen und deren Verwendung
zur mikrobiellen Herstellung von Proteinen, insbesondere von Humanserumalbumin.
-
European
Pharmacopoeia beschreibt erforderliche Eigenschaften von Albumin-Lösungen.
-
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, ein wirtschaftliches und sicheres
Verfahren zur Herstellung von Humanserumalbumin zur Verwendung in
der medizinischen Behandlung aus Quellen, die im wesentlichen frei
von Hämoglobin
sind, als Ausgangsmaterial anzugeben und zur Verfügung zu
stellen.
-
Die
Befähigung
des mit den Verfahren der Erfindung hergestellten Humanserumalbumin,
im wesentlichen frei von Aluminium zu bleiben, ermöglicht es,
dass die Etikett-Gehaltsmengen über
die Datierzeitspanne des vorliegenden Therapeutikum hinweg andauern
und bestehen bleiben.
-
Das
Herstellungsverfahren kann mit einer Albumin-Quelle wie dem Cohn-Albumin-Fraktionierungsschema
an einem Punkt, der für
die Fraktion V relevant ist, oder mit der Rohalbumin-Stufe beginnen.
Die Quelle kann auch in im Verfahrensstrom aufwärts gerichteten Systemen, wie
der Cohn-Fraktion IV-1 und Cohn-Fraktion IV-4, liegen. Dünnfilm-Verdampfungsverfahrenstechniken
können
zur Verringerung mühsamer Volumenströme angewandt
werden. Siehe Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946). Der
Fraktion V-Niederschlag oder ein mehr gereinigter Cohn-Fraktionszustand
wird in Wasser suspendiert, das mehr oder weniger und annähernd 3
Volumina kaltes, Pyrogen-freies, destilliertes Wasser sein kann.
Die Temperatur des Wassers liegt unterhalb Raumtemperatur und kann
vorzugsweise 8°C ± 4° betragen.
Eine bei dieser Temperatur gehaltene Lösung wird durch gründliches
Vermischen gebildet. Ist der Niederschlag in Lösung gegangen, wird der pH-Wert
bestimmt und, nötigenfalls,
so eingestellt, dass er im Bereich von 4,5 ± 0,2 liegt. Der ideale und
am meisten bevorzugte pH-Wert für
diese Stufe beträgt
4,5 bis 4,6. Der pH-Wert muss immer unter 5,0 liegen. Das Albumin
wird durch einen Tiefenfilter wie dem von AMF Cuno Corp. filtriert.
Das Filtermedium muss von solcher Tiefe sein, dass im wesentlichen
alles lipidische proteinartige Material aus der Ausgangs-Lösung entfernt
wird. Der pH-Wert des Albumin-Filtrats wird dann auf den annähernd isoelektrischen
Bereich der α-Globuline
(mit einem pH-Wert von ca. 5,0 bis 6,0 und vorzugsweise von 5,3)
mit einer verdünnten
Base-Lösung
wie von 1,0 M Natriumcarbonat oder 1,0 M Natriumhydroxid eingestellt.
Jedes geeignete Basen-Puffersystem kann verwendet werden, um die
Erhöhung
des pH-Wertes durchzuführen.
-
Nach
der Einstellung des pH-Wertes wird das System bei der oben beschriebenen
Temperatur für
einen Wärmeschock
zubereitet. Zuerst wird eine bestimmte Menge an Natriumcaprylat
zum System, bezogen auf die Protein-Konzentration des Systems während des
Wärmeschocks,
gegeben, d. h., für
jedes Kilo im Filtrat verfügbares
Protein werden annähernd
30 g Natriumcaprylat in das System eingebracht. Ethanol wie SDA-3A-Alkohol
wird zum stabilisierten Albumin-Filtrat auf einer pro Volumen-Basis
gegeben, um annähernd 10
bis 20% Alkohol zu ergeben. Unter gründlichem Rühren erreicht die Temperatur
des Systems annähernd 20°C und wird
danach von ca. 20°C
auf annähernd
50°C angehoben.
Die bevorzugte Temperaturerhöhung
beträgt
50°C. Diese
Tem peratur wird für
eine Zeitdauer von mindestens 1 h gehalten, und der bevorzugte Bereich beträgt annähernd 1
bis 3 h. Ganz allgemein gilt, dass, je höher die erreichte Temperatur
ist, um so weniger Zeit bei dieser Temperatur benötigt wird.
Daher würde,
obgleich geringere Temperaturerhöhungen
anwendbar sind, dies eine unangemessen lange Verweilzeit bei dieser
Temperatur erforderlich machen. Ist der Wärmeschock beendet, kann die
Temperatur des Systems auf normale Plasma-Verarbeitungstemperaturen,
wie von weniger als ca. 10°C,
herabgesetzt werden. 1 g DEAE-Sephadex (Pharmacia Inc.) wird pro
Liter Lösung
zugegeben, und das System wird durch ein geeignetes Tiefenmedium
wie das von AMF Cuno Corp. filtriert. Der pH-Wert des gereinigten
Albumin-Filtrats wird dann von annähernd 6,0 auf ca. 8,5 (am meisten
bevorzugt auf 7,2) eingestellt. Das gereinigte Albumin wird dann
auf ein Ultrafilter wie das von Romicon Inc. oder von Koch Co. gebaute
gegeben. Die Albumin-Lösung
wird diafiltriert, und der Volumenaustausch wird mit einer schwachen
Salz-Lösung
wie von 3%igem Natriumchlorid- oder Natriumacetat- oder in einigen
Fällen
von Natriumcaprylat-Lösungen
und am meisten bevorzugt mit Natriumchlorid durchgeführt. Die
gereinigte Albumin-Lösung wird
diafiltriert, und als Ergebnis der Verdrängung der Salze werden das
Aluminium und weitere Begleitstoffe beseitigt. Eine Diafiltration
gegen Wasser (am meisten bevorzugt mit 4 Volumina kaltem destillierten
Wasser) wird durchgeführt.
Das gereinigte, gewaschene Albumin wird aus der Ultrafiltrationsgerätschaft
bei einer solchen Konzentration geerntet, um den gewünschten
Proteingehalt zu ergeben, bei dem die Zugabe von Exzipienten ermöglicht ist.
Die bevorzugte Zusammensetzung des im obigen Verfahren hergestellten
Endprodukts würde
eine Molarität
des Caprylats aufweisen, die auf die Albumin-Konzentration bezogen
ist. Das heißt,
eine Zubereitung mit 25% Protein würde ganz allgemein bei 0,02
M bis annähernd
0,1 M und vorzugsweise bei einer Molarität von 0,04 Caprylat stabilisiert
sein. Ursprüngliche
Zubereitungen von E. J. Cohn waren "Salz-arm". Die Zusammensetzung der Wahl der vorliegenden
Erfindung würde
annähernd
0,1 M Aminoessigsäure
enthalten, um Tonizität
im Fall geringer Verdünnungen
zu garantieren. Die vorliegend entstandene Zusammensetzung weist
die größte Lagerungsdauer
und Beibehaltung der biologischen Aktivität auf. Die in der vorliegenden
Offenbarung beschriebene Zubereitung könnte, gewünschtenfalls, mit 0,02 M Natriumcaprylat
und 0,02 M Acetyl-dl-tryptophan mit Natriumchlorid endgültig zubereitet
werden, um 130 bis 160 mEq/L Natrium zu ergeben. Das Vorliegen von
Tryptophan im Albumin lässt
das Produkt mit zunehmendem Alter dunkel werden, und es besteht
bezüglich
der Produkte des Tryptophan-Abbaus eine gewisse Sorge.
-
Beispiel 1
-
5
kg Cohn-Fraktion V-Paste, die mehr als 4 Jahre lang gelagert worden
war (BR 7209), wurde als Los-Nummer 3388-70 mit dem Verfahren verarbeitet.
Die Paste wurde in 3 Volumina destilliertem Wasser von +5°C suspendiert
und über
eine Zeitdauer von 2 h gründlich
vermischt. Der an einem Beckman pH-Messgerät direkt abgelesene pH-Wert
der Lösung
betrug 4,65. Ein AMF-Cuno-Mehrkartuschen-Filtergehäuse wurde
mit zwei verfügbaren
Cuno-Filterkartuschen mit der Cuno-Bezeichnung "90 Sp" zubereitet. Das Filter-System wurde
mit 100 L heißem
und 60 L kaltem destillierten Wasser gespült, um Herstellrückstände aus
dem Tiefenmedium zu entfernen. Die Fraktion V-Lösung, mit Filterhilfe, wurde
dann durch das Filtergehäuse
geleitet, und ein Filtrat von weniger als 10 National Turubidity
Units (Hach Nephelometer, Loveland, Colorado) wurde gesammelt. Bei
Beendigung der Filtration wurde das Filtergehäuse mit destilliertem Wasser
von +5°C
in einer Menge gespült,
um das lösliche
Protein aus dem Filtermedium zu verdrängen. Es wurden Bestimmungen
durchgeführt,
um eine Gewinnung von besser als 98% des ursprünglich suspendierten Proteins
zu bestätigen.
Der pH-Wert des Filtrats betrug 4,66. Der pH-Wert des Filtrats wurde
auf 5,15 mit 1,0 M Natriumcarbonat eingestellt. Bezogen auf die
vorhandene Menge von Albumin-Protein wurden 30 g Natriumcaprylat
pro kg Fraktion V-Paste zugegeben, worauf 181 g SDA3A-Alkohol für jeden
Liter Albumin-Filtrat, der verarbeitet wird, zugegeben wurden. Die
Temperatur des alkoholischen Albumin-Filtrats wurde dann auf 50°C angehoben
und bei dieser Temperatur 2 h lang gehalten. Das Wärmegeschockte
Material wurde dann auf 8°C
abgekühlt.
1 g DEAE-Sephadex (Pharmacia) wurde dann für jeden Liter des Materials
zugefügt.
Ein wie oben beschriebener Cuno-Filter wurde angewandt, um die denaturierten
Globuline und das unlösliche
DEAE-Sephadex (Pharmacia) zu entfernen, das eben gerade zugefügt worden
war. Das Filtrat wurde bezüglich
zurückgewonnenem
Protein analysiert, und es wurde gefunden, dass es 97% des am Anfang
verfügbaren
Proteins enthält.
Die Trübheit (turbidity)
der Lösung
betrug weniger als 10 nationale Trübheitseinheiten (National Turbidity
Units). Der pH-Wert des ultrareinen Albumin-Filtrats wurde auf 7,22
mit 1,0 M Natriumcarbonat eingestellt. Das Filtrat wurde dann auf
ein Pilotmodell-Ultrafilter mit PM 30 Romicon-Hohlfaser-Ultrafilterkartuschen
(ein Produkt von Rohm & Haas)
gegeben. Drei Volumenaustauschvorgänge wurden mit 3%iger einfacher
Salzlösung
durchgeführt.
Die Permeatflussgeschwindigkeiten waren sehr gut, und Geschwindigkeiten
von über
200 mL/Kartusche/pro Minute waren üblich. Fünf Volumenaustauschvorgänge wurden
dann mit kaltem destillierten Wasser durch geführt. Die Produkt-Temperaturen
wurden immer bei weniger als 10°C
gehalten. Das Produkt wurde aufkonzentriert und aus dem Ultrafilter
geerntet. Die Protein-Konzentration wurde mit 26,5% ermittelt, und
die Produkt-Turbidität
(Trübheit)
betrug weniger als 5 nationale Trübheitseinheiten. Es besteht
eine gewisse Sorge, dass das beim Wärmeschock eingesetzte Caprylat
an das Albumin gebunden wird und eine überschüssige Menge an Caprylat ein
Problem erzeugen würde.
Reine Proben des Produkts wurden auf 60°C erwärmt, und es wurde gefunden,
dass sie in 10 Minuten gelieren, was die Herabsetzung des Caprylats
aus dem Wärmeschock
auf ein bedenkenloses Niveau dar- und
belegt. Proben wurden auf eine wie oben beschriebene Endbehälter-Konfiguration
kompoundiert, und die Tabelle erläutert die Testergebnisse:
-
-
Die
Turbidität
an einem Hach Co. Nephelometer beträgt 1,4 N. T. U.
-
Beschreibung der Figuren
-
In I ist der Aluminium-Gehalt von Albumin
der vorliegenden Erfindung (☐) im Vergleich mit handelsüblichem
Albumin (+) in einer beschleunigten Zeitstudie bei 40°C dargestellt,
wobei beide in Aluminium enthaltenden Behältern gelagert wurden.
-
In II ist der Vergleich des Aluminium-Gehalts
von Albumin der vorliegenden Erfindung mit dem Aluminium-Gehalt
von im Handel erhältlichem
Albumin verschiedener Hersteller A bis E dargestellt.
-
In III ist der Vergleich der Komponenten
mit schwerem Molekulargewicht im Albumin der vorliegenden Erfindung
mit den Komponenten mit schweren Molekulargewicht von im Handel
erhältlichem
Albumin verschiedener Hersteller A bis E dargestellt, die alle mit
Hochdruck-Flüssigchromatographie
(HPLC) gemessen wurden.
-
In IV ist der Vergleich der Reinheit des
Albumin der vorliegenden Erfindung mit der Reinheit von im Handel
erhältlichem
Albumin verschiedener Hersteller A bis E dargestellt, die alle mit
Celluloseacetat-Elektrophorese (CAE) gemessen wurden.
-
In V ist der Vergleich des Trübheitsniveaus
des Albumin der vorliegenden Erfindung mit dem Trübheitsniveau
von im Handel erhältlichem
Albumin verschiedener Hersteller A bis E dargestellt, die alle in
nationalen Trübheitseinheiten
(NTU) an einem Hach-Nephelometer gemessen wurden.
