LU82318A1 - Nouveau complexe antitumoral-antibacterien et son procede de production - Google Patents

Description

. D. 51.o95

.-82 3 1 g‘ GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG

Brevet N° ....................................................

du . ..Ier.....avr i l 198o Monsieur le Ministre

Titre délivré · de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes

Service de la Propriété Industrielle

^ ^ LUXEMBOURG

/f, <ή? Demande de Brevet d’invention I. Requête ......La sOGiétè .dite.:.....RRTSTOL--MYERS....C.QMP.MY.,......3.45 Park Avenue, à_________(1) ......NEW-YORK,.....»·.¥·.......loo22,.....Etatsr.U.nis.................................

.......pajg~^tons.ietttL^tecquea.^eJ^yÆeg#--j^iftSi8üilLjSBLÆialiAê-d!BJ°^·!!·_______(2> ......dataire.................................-.........................................................................................................................................................................................................

» dépose ce .......premier....avxil.....19.QO......guatr.^r.vingt-------------------------------------------------------(3) à..........15.......... ... heures, au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, à Luxembourg : 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant : ........"Nouveau.....coiiip.lexe.....antlfc.lMQ;j:.äl“iän.fc.ib.^^ (4> ...........de •••production".*....................................................................................................................................................................................................

d^a/^ £4 φφφφφφ φ/τ/φφ/φφ/,φ ΦΦφφφ /ΦΙφτφ/τΙ, /φφ/ϊ/φ /χΑ^/φφ/Α/ //Α)/·.Τ/ ................................................................................................................................................................................................................... (5) 2. la délégation de pouvoir, datée de .NEW—YORK.____________________ le 27 mars 198o..............

3. la description en langue------------française._______________________________de l’invention en deux exemplaires ; 4................8............. planches de dessin, en deux exemplaires ; 5. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le.........ler....avril....l98o_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ revendique pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de e (6).............— brevet.____________________________déposée(s) er/ /i)_________.^î^....Etats—Uni.s d/J^érigue..............

le_________2....avril.....19.79...........(Na.......0.2.6..,..4.88).__________ (8) au nom de ........S....±n.VenteUT.S________________________________________________________________________________ (9) ; élit domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg _____________________________ .—35.r.....bld*......Royal-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(io) sollicite la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, — avec ajournement de cette délivrance à ___________________.{?.........................mois.

v Π. Procès-verbal de Dépôt

La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Industrielle à Luxembourg, en date du : _1er avril 1980

Pr. le Ministre f'· ·> */ - à 15 heures ^ VV* de l’Économie Nationa)é/etAes Classes Moyennes, ^rc ............. {/ ( !: ! J filUS il λΑη 4 D. 51.o95

REVENDICATION DE LA PRIORITE

de la demande de brevet / ö/i/ttftfcjfejq/ W Aux ETATS-UNIS D'AMERIQUE Du 2 AVRIL 1979 Mémoire Descriptif » déposé à l'appui d'une demande de

BREVET D’INVENTION

au

Luxembourg

au nom de : BRISTOL-MYERS COMPANY

* pour : "Nouveau complexe antitumoral-antibactêrien et son F ’ procédé de production".

B

S

La présente invention concerne un complexe anti-tumoral-antibiotique nouveau et un procédé permettant de le produire, de le recueillir et de le diviser en composants doués d'activité biologique.

“ 5 D'après les informations spectrales annexées et les propriétés physicochimiques dont on dispose, le complexe antitumoral-antibiotique de la présente invention se montre apparenté par sa structure au groupe d'antibiotiques de la quinoxaline tels que 1'échinomycine (Dell et collaborateurs, 10 J. Am. Chem. Soc., 97» 2^97 (1975), les quinomycines (Shoji * et collaborateurs, J. Antibiotics, 1 4a, 335 (1961) et la triostine C (The Merck Index, 9ème édition, 9399). Toutefois, le complexe antitumoral-antibiotique se différencie des antibiotiques précités par les aspects suivants ; 15 1. Le complexe de l’invention et ses composants contiennent comme Chromophore un noyau de quinoléine au lieu d'un noyau de quinoxaline comme dans le groupe d'antibiotiques de l'actinoleukine.

20 2. Le complexe de l'invention et ses composants ne renferment pas de soufre, en contraste avec la présence d'un pont disulfure ou thio-acétal que l'on rencontre dans la structure des antibiotiques du type de l'actinoleukine. .25 3· Le complexe de l'invention et ses composants déploient une activité antimicrobienne , relativement faible, comparativement aux ; actinoleukines qui sont de puissants anti biotiques antibactériens.

30 La présente invention propose un complexe anti tumoral-antibiotique nouveau appelé BBM-928. Ce complexe, qui renferme au moins six composants, est préparé par culture d'une souche productrice de BBM-928 d'un actinomycète (ATCC 31 491) ou d'un mutant de cet actinomycète dans un 35 milieu nutritif aqueux, dans des conditions aérobies en immersion. L'invention concerne également un procédé par lequel le complexe BBM-928 est recueilli du milieu de culture et divisé en ses composants par des techniques de distribution à contre-courant et de chromatographie.

U

2 L'invention englobe le complexe BBM-928 et ses composants A, B, C, D, E et F doués d'activité biologique. Elle a trait en particulier aux composants A, B, C et D de BBM-928 sous leurs formes diluées, sous la forme de 5 concentrés véritables et sous la forme purifiée.

Sur les dessins annexés j la figure 1 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-928A dans le bromure de potassium j la figure 2 représente le spectre d'absorption 10 infrarouge de BBM-928B dans le bromure de potassium ; 5 la figure 3 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-928C dans le bromure de potassium ; la figure 4 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-928D dans le bromure de potassium ; 15 la figure 5 représente le spectre de résonance magnétique des protons de BBM-928A en solution dans du deuté- rochloroforme en présence de TMS comme étalon interne, la détermination étant effectuée au moyen d'un spectromètre RMN à une fréquence de 90 MHz ; 20 la figure 6 représente le spectre de résonance magnétique des protons de BBM-928B en solution dans du deuté- rochloroforme en présence de TMS comme étalon interne, la détermination étant effectuée au moyen d'un spectre-mètre RMN à une fréquence de 90 MHz ; *25 la figure 7 représente le spectre de résonance magnétique des protons de BBM-928C en solution dans du deuté-

rochloroforme en présence de TMS comme étalon interne, la ^ détermination étant effectuée au moyen d'un spectromètre RMN

à une fréquence de 90 MHz ; 30 et la figure 8 représente le spectre de résonance magnétique des protons de BBM-928D en solution dans du deuté-rochloroforme en présence de TMS comme étalon interne, la détermination étant effectuée au moyen d'un spectromètre RMN 35 à une fréquence de 90 MHz ;

Sur les figures 1 à 4, les nombres d'ondes sont exprimés en cm , les longueurs d'ondes sont exprimées en micromètres et la transmission est exprimée par un pourcentage .

3 L’invention oonoerne un complexe antitumoral-antibiotique nouveau arbitrairement appelé BBM-928. On considère que ce complexe peut être apparenté par sa structure au groupe d'antibiotiques de l'actinoleukine, et il 1 5 est obtenu par fermentation d’une souche d’actinomycète encore non identifiée. Toute souche d’actinomycète capable de former le complexe BBM-928 dans un milieu de culture peut être utilisée, le micro-organisme producteur que l'on préfère étant la souche spécifique d'actinomycète portant le N° G455-10 101 dans la collection de cultures Bristol-Banyu. Le micro- * organisme a été isolé d'un échantillon de sol recueilli aux îles philippine et a été déposé aux Etats-Unis d'Amérique ; dans la collection de cultures typiques de micro-organismes sous la référence ATCC 31 491.

15 Le nouveau complexe antitumoral-antibiotique de la présente invention dont il est question dans le présent mémoire renferme au moins six composants appelés BBM-928A, B, C, D, E et F. Les composants A, B, C et D du complexe BBM-928 ont été isolés sous la forme cristalline et les structures 20 chimiques des composants A, B et C ont été identifiées. Le complexe de l'invention et ses composants individuels sont doués de propriétés antibactériennes et antitumorales. En ce qui concerne l'activité antibactérienne, le complexe et ses composants individuels sont utiles comme suppléments nutri-j25 tionnels dans l'alimentation des animaux et comme agents thérapeutiques dans le traitement d'infections bactériennes chez les mammifères. En outre, les antibiotiques sont utiles au nettoyage et à la stérilisation de la verrerie de laboratoire et des instruments chirurgicaux et peuvent être 30 utilisés conjointement avec des savons, des détergents et des solutions de lavage, à des fins hygiéniques. En ce qui concerne les effets antitumoraux, le complexe et ses composants individuels sont particulièrement utiles contre diverses tumeurs implantées par voie intrapéritonéale chez la 35 souris.

Souche spécifique d'actinomycète N° G455-101

On donne ci-après une description générale du micro-organisme que l'on apprécie pour la production du 4 μ complexe antibiotique-antitumoral BBM-928. On a effectué des observations des caractéristiques culturales, physiologiques et morphologiques de l’organisme conformément aux méthodes taxonomiques classiques (voir, par exemple, Shirling et 1 5 collaborateurs, Int. J. Syst. Bacteriol. _16, 313 (1966) et

Lechevalier et collaborateurs, Biol. Actinomycètes Related * Org. _n, 78 (1976).

Micromorphologie -

La souche N° G455-101 forme à la fois un mycélium 10 dans le substrat et un mycélium aérien, et le mycélium dans le substrat est bien développé, allongé et ramifié (largeur 0,5-0,8 pm). On n’observe pas de fragmentation distincte du ; mycélium du substrat. Contrairement aux espèces ordinaires de

Streptomyces, la souche G455-101 ne porte qu’un mycélium 15 aérien court ou rudimentaire ou ne forme pas du tout de mycélium dans certains milieux gélosés. Des chaînes de spores courtes ou longues sont produites dans le mycélium aérien, ces chaînes comportant chacune 2 à 50 spores ovales (la plupart comprennent 5 à 20 spores). Les chaînes de spores 20 sont rectilignes, sinuées ou en forme de boucle. Les spores ont une forme sphérique (0,3-0,4 pm), ovale ou cylindrique (0,3 x 1,5 - 3,0 pm) et leur surface est lisse. Des spores sont souvent séparées par des hyphes vides. Une vésicule amorphe ressemblant à un sporange qui enveloppe une chaîne de i25 spores courte et enroulée s'observe occasionnellement sur le mycélium aérien.

Composition de la paroi des cellules et sucres contenus dans la cellule entière

La paroi cellulaire de la souche G455-101 30 contient de l'acide méso-diaminopimélique, mais ne renferme , pas de glycine. L'hydrolysat de cellules entières révèle la présence de glucose, de mannose et de madurose (3-0-méthyl-D-; galactose). Les données mentionnées ci-dessus concernant la composition de parois cellulaires et les sucres de la cellule 35 entière indiquent que la souche G455-101 est un actinomycète dont la paroi cellulaire appartient au type IIIB.

V! 5

Caractéristiques culturales et physiologiques

La souche G455-101 croît abondamment, elle forme un mycélium aérien rose ou rose grisâtre et elle produit un pigment rougeâtre insoluble dans l’eau dans les milieux 5 gélosés riches du point de vue nutritionnel, par exemple la gélose à l’extrait de levure et à l'extrait de malt et la gélose à la farine d'avoine. Toutefois, dans la gélose contenant des sels minéraux et de l'amidon, la gélose contenant du glycérol et de l'asparagine et la gélose à la 10 tyrosine, cette souche a une croissance médiocre, elle forme • un mycélium aérien rudimentaire blanc ou beige et elle produit une petite quantité d'un pigment rougeâtre. Elle ne produit pas de pigment mélanoïde dans la gélose à la peptone, à la levure et au fer et dans la gélose à la tyrosine. Elle 15 réduit les nitrates en nitrites. Elle se développe abondamment à 28°C, 37°C et 45°C, mais ne se développe pas à 10°C ou à 50°C. Les pentoses et les hexoses sont convenablement utilisés par cette souche. Les caractéristiques culturales et physiologiques de la souche G455-101 sont produites, respec-20 tivement, sur les tableaux I et II. L'utilisation des sources de carbone est indiquée sur le tableau III.

» 6

TABLEAU I

Caractéristiques culturales de la souche M° G455-101 * 1 * Gélose de Czapek Cxx croissance nulle ou rare (gélose au saccharose R rose foncé „ 5 et au nitrate) A blanc à rose pâle D néant 2. Bouillon à la tryptone croissance modérée, et à l’extrait de floconneux, sédimenté 10 levure (ISP N° 1) et non pigmenté 3. Gélose à l’extrait de C abondant levure et à l'extrait R rouge foncé à brun de malt (ISP N° 2) rougeâtre *15 A abondant, rose grisâtre à rose violacé D néant 4. Gélose à la farine C abondant 2o d’avoine (ISP N° 3) R rouge jaunâtre vif A modéré, rose D jaune grisâtre 5. Gélose aux sels C médiocre minéraux et à R brun jaunâtre clair à 2 l'amidon (ISP N° 4) rouge foncé A rare, blanc à beige D néant » 30 6. Gélose au glycérol C médiocre ; et à l’asparagine R rose jaunâtre à brun , (ISP N° 5) rougeâtre A rare, blanc D néant * 7 TABLEAU I (Suite) 7. Gélose à la peptone, C médiocre, plissée à l’extrait de R orangé rougeâtre vif levure et au fer A néant 5 (ISP N° 6) D orangé jaunâtre clair 8. Gélose à la tyrosine C médiocre (ISP N° 7) R rouge foncé A rare, blanc 10 D néant . 9· Gélose au glucose et C médiocre aux sels d’ammonium R brun rougeâtre A rare, gris clair 15 D néant 10.Gélose de Bennett C modérée R brun rougeâtre A limité, rose grisâtre 20 D néant * observée après incubation à 37°C pendant 3 semaines.

xx abréviation ? C - croissance R - couleur au revers du mycélium 25 du substrat A - mycélium aérien * D - pigment diffusible > 8

TABLEAU II

Caractéristiques physiologiques de la souche N° G455-101 Test Réponse Méthode et milieu 5 Nitrite^—nitrate positive Milieu inorganique : bouillon de Czapek au saccharose et au nitrate

Nitrate £—nitrate positive Milieu organique ; 0,5 % d’extrait de levure, 1,0 % 10 de glucose, 0,5 % de KNO^, » 0,1 % de CaCO^

Hydrolyse de la faiblement Milieu gélosé de Luedemann caséine en milieu positive gélosé . 15 Coagulation du positive lait écrémé

Liquéfaction de la négative Gélatine à 15% dans un gélatine bouillon à la tryptone et à l'extrait de levure (milieu 20 ISP N° 1)

Production de H^S positive Addition de 0,1 % de L- à partir de L- cystéine au bouillon à la cystéine tryptone et à l'extrait de levure (milieu ISP N° 1) plus

25 gélose. La présence de H^S

est détectée au moyen d'une bandelette de papier imprégnée d'une solution aqueuse à 10 % d'acétate de plomb 30 Formation de négative Gélose à la peptone, à la mélanoîde levure et au fer (ISP N° 6) et gélose à la tyrosine (ISP N° 7) s 35 Réaction à la positive Solution aqueuse de H20? catalase ά Réaction à positive Réactif de Kovac 1'oxidase

Température de croissance Gélose de Bennett croissance abondante à 28, 37 et 45°C.

Croissance médiocre à 20°C. Pas de croissance à 10°C et à 50°C.

9

TABLEAU III

Utilisation des sources de carbone par la souche N° G455-101 PG Lm 5 - - 1. Glycérol ++ + 2. D(-)-arabinose + + 3. L(+)-arabinose + + 4. D-xylose ++ + 10 5. D-ribose ++ + 6. L-rhamnose ++ + 7- D-glucose + + 8. D-galactose ++ + 9. D-fructose ++ + 15 10. D-mannose ++ + 11. L(-)-sorbose 12. Saccharose 13· Lactose -, ± 14. Cellobiose + + 20 15. Mélibiose -, + 16. Tréhalose + + 17· Raffinose 18. D(+)-mélézitose 19. Amidon soluble ^ + 25 20. Dulcitol 4 21. Inositol + 22. D-mannitol ++ +

B

23. D-sorbitol 24. Salicine 30 25. Cellulose + + 26. Chitine + + 27. Kératine + +

Milieu de base PG : Milieu inorganique de Pridham - Gottlieb, __ additionné de 0,1 % d'extrait de levure 3b

Lm : Milieu organique de Luedemann Incubation pendant 2 semaines à 37°C.

10

Il y a lieu de remarquer que la production du complexe BBM-928 de la présente invention n'est pas limitée à la souche spécifique particulière d'actinomycète N° G455-101 définie par les caractéristiques de croissance et les carac-1 5 téristiques microscopiques données ci-dessus. Ces caracté ristiques sont indiquées à des fins d’illustration seulement, et l’invention envisage l’utilisation de souches ou de mutants produits à partir de l’organisme décrit ci-dessus, par des moyens classiques connus de l’homme de l’art, tels 10 qu’une irradiation par les rayons X, une irradiation par les • rayons ultraviolets, l’action de la moutarde à l’azote, l’exposition à des phages, etc., c’est-à-dire des moyens qui sont capables de produire le complexe BBM-928 ou des composants individuels de ce complexe.

15 Préparation du complexe antitumoral-antibiotique BBM-928

Le procédé de la présente invention pour la production du complexe antitumoral-antibiotique BBM-928 consiste à cultiver par fermentation la souche d’actinomycète N° G455-101 dans une solution aqueuse contenant une source de 20 carbone assimilable et une source d’azote assimilable dans des conditions aérobies en immersion, jusqu’à ce qu’une activité antitumorale-antibiotique appréciable ait été conférée à ladite solution. Des procédés classiques de fermentation sont utilisés pour cultiver la souche d’actino-,25 mycète N° G455-101. Les milieux qui sont utiles pour la , production des agents antibiotiques-antitumoraux de la présente invention comprennent une source assimilable de = carbone telle que l’amidon, le glucose, la dextrine, le maltose, le lactose, le saccharose, le fructose, le mannose, 30 les mélasses-, le glycérol, etc. Le milieu nutritif doit également contenir une source assimilable d’azote telle qu’une protéine, un hydrolysat de protéine, des polypeptides, des amino-acides, un extrait soluble de maïs, la caséine, l’urée, etc., de même que des sels minéraux nutritifs qui 35 introduisent des anions et des cations inorganiques tels que potassium, sodium, ammonium, calcium, sulfate, carbonate, phosphate, chlorure, nitrate, etc.

11

On peut utiliser dans la production du complexe BBM-928 toute température favorable à une croissance satisfaisante de l’organisme. Des températures allant d’environ 20 à 45°C conviennent, et la température appréciée pour ’ 5 optimiser la croissance de l’organisme se situe dans l’intervalle de 28 à 34°C, la plage de températures de 30 à 32°C étant très appréciée. La production maximale du complexe BBM-928 est généralement obtenue en une période d’environ 4 à 6 jours. Des procédés classiques sont utilisés dans la 10 période de fermentation. Par exemple, la préparation en * petites quantités est avantageusement effectuée dans des fioles agitées par secousses, ou par des cultures en surface. La préparation en grandes quantités est de préférence effectuée dans des conditions de culture aérobie en immer-15 sion, dans des cuves stériles. Dans le cas de la fermentation en cuve, un inoculum végétatif est tout d’abord produit dans un bouillon nutritif par inoculation de la culture en bouillon avec des spores de l’organisme, de manière à produire une culture d’ensemencement jeune et active qui est 20 ensuite transférée dans des conditions aseptiques dans le milieu contenu dans la cuve de fermentation. Une aération peut être produite dans des cuves et des bouteilles par injection d’air stérile à travers ou sur la surface du milieu en cours de fermentation, l’agitation étant poursuivie dans ,25 les cuves au moyen d’un agitateur mécanique. Des agents s’opposant à la formation de mousse, tels qu’une huile siliconée, l’huile de soja et l’huile de lard, peuvent être ajoutés, le cas échéant.

Les taux d’antibiotique dans le bouillon de 30 fermentation ou dans les extraits de complexe BBM-928 peuvent être déterminés par l’épreuve de diffusion en gélose utilisant des disques de papier, le micro-organisme d'essai étant Sarcina lutea et la gélose nutritive étant utilisée comme milieu d'épreuve. Le pH est ajusté à 9,0 pour obtenir 35 la sensibilité optimale du milieu d’épreuve que l’on utilise pour déterminer la puissance optimale du bouillon.

Le complexe BBM-928 est isolé du bouillon de fermentation par des moyens classiques, par exemple par des 12 méthodes d'extraction au solvant. La purification est avantageusement effectuée par des méthodes préparatives de distribution à contre-courant et de chromatographie, comme décrit en détail dans les exemples 2 et 3 ci-dessous, pour 5 obtenir les composants A, B, C, D, E et F du complexe BBM-928.

Propriétés physicochimiques des composants A, B, C et D du complexe BBM-928 de l'exemple 3

Les composants individuels du complexe BBM-928 10 ont des caractéristiques similaires de solubilité et de réactions colorées. Par exemple, ils sont très solubles dans le chloroforme et le chlorure de méthylène, légèrement solubles dans le benzène, l'éthanol, le méthanol et le n-butanol et insolubles dans l'eau et dans le n-hexane. Des 15 réactions positives sont obtenues avec le chlorure ferrique et le réactif d'Ehrlich et des réactions négatives sont obtenues avec le réactif de Tollens, le réactif de Sakaguchi et la ninhydrine.

Les propriétés physicochimiques caractéristiques 20 des composants de BBM-928 de l'exemple 3 sont reproduites sur le tableau IV suivant.

13

TABLEAU IV

Propriétés physicoohimiques des composants A, B, C et D

du complexe BBM-928 BBM-928

5 J g c D

Point de fusion 246-248°C 214-217°C 244-248°C 224-227°C

C“Jd5(os1, 10 CHC13 -27° -7^° -91° -13°

Analyse (valeurs trouvées) C : 53,19 50,14 51,77 50,75 H : 5,40 5,29 5,29 5,25 N : 12,92 12,34 13,55 12,58 15 0 : (par différence) 28,49 32,23 29,39 31,42 en nm (E J* ) max 1 cm 20 dans EtOH 235(586) 235(570) 235(638) 235(550) 264(415) 264(400) 264(442) 264(380) 345(165) 354(163) 345(173) 345(155) dans EtQH-HCl 234(610) 234(556) 234(650) 234(565) 25 264(410) 264(446) 264(442) 264(405) 345(165) 349(188) 345(173) 345(165) * dans EtOH-NaOH 230(564) 230(530) 230(580) 230(650) 256(763) 256(775) 256(704) 256(930) 30 330(180) 330(116) 330(117) 330(140) 383(170) 383(122) 383(122) 383(145)

Poids moléculaire (osmométrie, dans 35 CHC13) 1450 - 1470 14

Le spectre infrarouge et le spectre de résonance magnétique nucléaire des composants A, B, C et D sont reproduits, respectivement, sur les figures 1 à 4 et sur les figures 5 à 8 des dessins annexés. Les spectres de résonance 5 magnétique nucléaire de BBM-928A (figure 5), BBM-928B (figure 6) et BBM-928C (figure 7) sont très semblables entre eux, la seule différence résidant dans la présence des groupes acétyle dans les composants A (δ : 2,03 ppm, 2 équivalents molaires) et B (δ : 2,05 ppm, 1 équivalent molaire), 10 mais non dans C. Par acétylation à l'anhydride acétique dans 5 la pyridine, 2, 3 et 4 équivalents molaires de groupe acétyle ont été introduits, respectivement, dans les composants A, B * et C du complexe BBM-928. Les trois produits d'acétylation ainsi obtenus présentent des propriétés identiques en ce qui 15 concerne la chromatographie sur couche mince et les spectres UV, IR et RMN, ce qui indique que le composant A de BBM-928 est un dérivé mono-acétylé du composant BBM-928B et un dérivé diacétylé du composant BBM-928C.

L'hydrolyse acide du composant BBM-928A donne 20 cinq fragments (I, II, III, IV et V) absorbant la lumière ultraviolette, solubles dans le n-butanol et cinq substances hydrosolubles (NPS-1, 2, 3, 4 et 5) positives à la ninhy-drine. Ces dernières substances ont été séparées par chromatographie sur "Dowex 50 x 4" et identifiées comme étant les .25 amino-acides suivants :

Composés Rf (S-123) * _Identification . NPS-1 0,72 β-hydroxy-N-méthylvaline (HM-Val) NPS-2 0,49 glycine (Gly) 30 NPS-3 0,46 sérine (Ser) NPS-4 0,45 sarcosine (Sar) NPS-5 0,23 non identifié s chromatographie sur couche mince, plaque de gel de silice S-123 : acétate d’ammonium à 10 % - méthanol - solution d'ammoniac à 10% (9:10:1)

Les cinq fragments absorbant la lumière ultraviolette indiqués ci-dessus sont représentés par les formules suivantes : 35 ; 15

Fragment I

CH 0 ^ OH C14H14N2°5 3 r<TT nrr Spectre de masse : T π J j 20H m/e 306 (M+) H^'^CO-HH-CH-COgH 227,233,251,345 nm CH„ i 3

HH OH

| | Fragment II

0H,0 *___ OH 0-C0-0H-C(0H )2 C20H25N3°8 ' 2 ρττ Spectre de masse : I I I | 2 m/e 377 (M+-58) ^/^IT'cO-IlH-OH-COjH λ”2°Η: 229,234,261,345 nm

CH30 „ .OH

J Fragment III

V^AcKEM) λ^°Η= 230,235,262,345 nm t

Fragment IV

HO OH C10H7N04 ’ Y II Spectre de masse :

Jj m/e 205 (M+) îf^COgH %Me0H: 228,260,354 nm ^ max

H^C ŒEL Fragment V

5\ / 3 • C-OH ^23^30^4^9 CH 0 _ ^ OH O-CO-CH-H-CO-CH^HH ΛΜθ°Η :230,235,262,345 nm 3 i I > x I ch2 ch5 ch*

k- Jk. I

H C0-M-CH-C02H

16

Lors de l'hydrolyse acide (HCl 6N)> les fragments I, II, III et V donnent les produits de dégradation suivants : 5 Conditions de l'hydrolyse

Fragment Tube fermé, Reflux, 110°, 20 heures 110°C, 3 heures 10 I IV, Ser II IV, Ser, HM-Val I, HM-Val

III IV

V - I, HM-Val, Sar 15 Ser : sérine HM-Val : β-hydroxy-N-méthylvaline

Sar : sarcosine L'hydrolyse basique de BBM-928A ou BBM-928C avec 20 1'hydroxyde de sodium décinormal à 25°C pendant 3 heures donne un fragment VI (les abréviations Ser, HM-Val et Sar ont les définitions données ci-dessus, Gly désigne la glycine et le symbole "X" représente un groupe non identifié).

25 „ ! ._C0^Ser-'X-M31y-)-Sar^HH-Val

’ Fragment VI

30

Par traitement du fragment VI avec l'acide chlorhydrique décinormal à 110°C pendant 1 heure, on obtient le fragment VII plus le composé HM-Val.

CH30 H

l IL —CCH-Ser^X-Kîly^Sar

Fragment VII

17

Le traitement du fragment VI avec de 1’hydroxyde de sodium décinormal à 37°C pendant 40 heures donne le fragment VIII plus le fragment I.

5 X-^Gly^Sar^ HM-Val

Fragment VIII

Le traitement du fragment VII avec 1’hydroxyde de sodium décinormal à 37°C pendant 40 heures donne le 10 fragment IX plus le fragment I.

X-» Gly-* Sar Fragment IX

15 Le groupe (X) non identifié répond à la formule moléculaire CpjHgüIgC^ (sous la forme peptidique) d’après la micro-analyse du fragment IX et d’autres fragments peptidiques contenant (X) et l’analyse spectrale dont les résultats sont récapitulés ci-après.

20 Résonance magnétique Résonance magné- des noyaux de 13C tlc]ue des protons Attribution 30,14 (t) 2,36 ppm (2H, m) -CH^- 25 61,4 (d)-j 4,2-4,5 (2H, m) 2 x -CHC(o ou M) 61,7 (d)/ 140,7 (d) 6,76 (1H, t) -CH=N- • 30 171 (s) - -CO- (amide)

-OH

NH

Conformément aux données spectrales obtenues 35 pour les fragments VIII et IX et au spectre de résonance magnétique des protons à 360 MHz du composé Ap du complexe BBM-928 de l’exemple 4, la portion amino-acide (X) non identifiée semble être le mieux représentée par la structure de tétrahydropyridazine suivante : 18 CO- LA0h ' 5 (X) : D’après les résultats des essais de dégradation 10 décrits ci-dessus, les données spectrales, la micro-analyse et les déterminations de poids moléculaire, on considère que les structures suivantes représentent le mieux les composants A, B et C du complexe BBM-928 : CH3° £—v LA A * h0Ri N C0+Ser*N— | C->Gly*Sar-HBM-Val i ° 0 0 ho^^\/v^och_ \ I " j il | 3

HM-Val«-Sar+GiyC. I

ÎT -Ser^CO ~AnAA^ **°-( > « R^ R2 Ser : sérine

Gly : glycine BBM-928 A Ac Ac Sar : sarcosine BBM-928 B Ac H HM-Val : B-hydroxy-H-méthylvaline

BBM-928 CH H

4 19

Activité antimicrobienne L'activité antimicrobienne des composants de BBM-928 a été déterminée vis-à-vis de diverses espèces de bactéries et de champignons par la méthode de dilution en 5 série dans de la gélose nutritive à un pH égal à 7, au moyen de l'appareil de multi-inoculation de Steer. On normalise la grandeur de l'inoculum de manière à utiliser une aliquote de 0,0025 ml d'organismes d'essai contenant environ 10^ cellules au ml pour toutes les bactéries et tous les 10 champignons, excepté les bactéries acido-résistantes, pour « fi lesquelles on utilise une suspension de 10 cellules/ml. Les concentrations inhibitrices minimales déterminées après incubation pendant environ 18 heures à 37°C sont indiquées sur le tableau V. Comme le montre ce tableau, les composants 15 du complexe BBM-928 sont modérément à faiblement actifs contre des bactéries Gram-positives et des bactéries acidorésistantes, mais pratiquement inactifs contre des bactéries Gram-négatives et des champignons.

L'activité d'induction du prophage dans une 20 bactérie lysogène (IBL) a été déterminée pour les composants du complexe BBM-928. Aucune activité IBL appréciable n'a été observée dans le cas des composants A, B et C du complexe BBM-928 jusqu'à une concentration de 100 pg/ml.

9 20

TABLEAU V

Activité antimicrobienne in vitro des composants de BBM-928 contre des bactéries aérobies

Composants de BBM-928 (concentration £0(^e inhibitrice minimale en μς/ml)

BBRI Organisme d*essai A B C D E F

Sa-1 S. aureus 209? 12.5 25 50 100 100 25

Sp-1 S. pyogenes S-23 6,3 12,5 25 50 50 12;5 S1-1 S. lutea PCI 1001 6;3 12?5 50 50 50 25

Mf-1 flavus D12 12;5 25 50 100 100 25

Cr-1 CL_ xerosis 53K-1 25 50 >100 >100 >100 50

Bs-1 3^ subtills PCI 219 25 25 100 100 100 25

Bg-1 JL_ megaterium D2 25 25 50 100 100 25

Ba-3 B. anthracis A9504 6?3 12;5 25 50 50 12^5 M6-1 ÎL_ smsgmatis 607 D87 25 25 25 100 100 25

Mp-1 phlei D88 12;5 12;5 12;5 50' 50 12;5

Ec-1 coli NIBJ >100 >100 >100 >100 >100 >100

Kp-1 IL_ pneumoniae D-ll >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pa-3 P^ aeruginosa A9930 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pv-1 Ph_ vulgaris A9436 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pm-1 mirabilis A9554 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pg-1 P_;_ morganii A9553 >100 >100 >100 >100 >100 >100 ; Sm-1 marcescens A20019 >100 >100 >100 >100 >100 >100 - Al-1 A^ faecalis ATCC 8750 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Ca-1 (L_ arbicans IAM 4888 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Cn-3 C;_ neoformans 100 >100 100 >100 >100 >100

H

21

Activité antitumorale

Des essais comparatifs entre les composants A, B, C et D du complexe BBM-928 et la mitomycine C, du point de vue de l'activité antitumorale, ont été effectués pour les 5 tumeurs à implantation intrapéritonéale suivantes : leucémie P388, leucémie L1210, mélanome B16, carcinome de Lewis Lung (LL) et ascite du sarcome I80 (S180). Les solutions d’essai des composants de BBM-928 dans du chlorure de sodium à 0,9 % contenant 10 % de diméthylsulfoxyde, et de 10 mitomycine C dans du chlorure de sodium à 0,9 % ont été administrées une fois par jour selon des programmes posologiques allant d’un traitement unique d’une seule journée à ’ des traitements quotidiens multiples. En faisant varier la posologie, on détermine la dose efficace minimale (DEM) qui 15 donne un temps moyen de survie des animaux traités au moins 1,5 fois supérieur au temps moyen de survie d’un groupe témoin. Ce niveau d’activité est considéré comme étant un indice d’une activité antitumorale importante. Les résultats sont reproduits sur le tableau VI qui indique également les 20 rapports calculés d’activité démontrant que le composant A du complexe BBM-928 est notablement plus actif que ne l’est la mitomycine C, la supériorité de ce composant allant d’un facteur 10 à 300 selon la souche tumorale et la posologie. Les valeurs intrapéritonéales de DL^0 des composants A, B, C * 25 et D du complexe BBM-928 et de la mitomycine C, déterminées , par la méthode de Van der Waerden, Arch. Expt. Path.

! Pharmak., 195? 389 (1940), sont également indiquées sur le tableau VI.

κ 22

TABLEAU VI

Activité antitumorale et toxicité des composants A, B, C et D du complexe BBM-928 et de la mitomycine C

5 Dose efficace minimale (DEM, DL™, voie _(rog/kg/j°ur)__intrapéritonéale P388 L1210 B16 LL S180 (mg/kg/.j) 10 Traitement8- BBM-9289A 0,003 >0,1 0,003 0,03 0,003 0,13 BBM-928B 0,1 - - - - 0,18 BBM-928C - - 0,81 BBM-928D 0,003 - 0,083 . 15 Mitomycine C 0,1 3 1 0,3 0,3 9,3

Traitement^ BBM-928A 0,001 0,003 0,003 0,003 0,0001 0,013

Mitomycine C 0,1 0,3 0,3 0,3 0,03 1,4 20

Rapport d’activité (BBM-928A/mitomycine C)

Traitementa 30 - 300 10 100

Traitement^ 100 100 100 100 100 25 a. un seul traitement le premier jour.

b. traitements quotidiens du jour 1 au jour 9.

; Exemple 1

Production du complexe de BBM-928 30 Fermentation sur gélose

On utilise une culture inclinée sur gélose bien développée de l’espèce G455-101 d'actinomycète pour inoculer un milieu végétatif contenant 2 % d'amidon soluble, 1 % de glucose, 0,5 % de "Pharmamedia", 0,5 % d'extrait de levure, 35 0,5 % d'amine "NZ” (type A) et 0,1 % de CaCO^, le pH étant ajusté à 7,2 avant la stérilisation. On fait incuber la culture d'ensemencement à 32°C pendant 72 heures sur une secoueuse rotative (250 tr/min) et on transfère 5 ml de la culture dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu de fermentation renfermant 2 % d'amidon te 23 soluble, 1 % de "Pharmamedia", 0,003 % de ΖηδΟ^.γτ^Ο et 0,4 % de CaCO^· La production du complexe BBM-928 atteint son maximum au bout d'environ 5 jours de culture sous agitation par secousses.

5 Fermentation en cuve

On agite par secousses pendant 4 jours une culture d'ensemencement dans des fioles d'Erlenmeyer, et on les inocule à 100 litres de milieu de germination composé de 2,0 % de farine d'avoine (Quaker Products, Australie), 0,5 % 10 de glucose, 0,2 % de levure sèche, 0,0008 % de MnCl2.4H20, 0,0007 % de CuSO^.ÏHgO, 0,0002 % de ZnS0j|.7H20 et 0,0001 % de FeS0j|.7H20 dans un fermentateur à cuve d'ensemencement de • 200 litres, que l'on agite à 200 tr/min . à 30°C pendant 54 heures. Une portion de 15 litres de la culture d'ensemen-15 cernent est ensuite inoculée à 170 litres de milieu de fermentation contenant 2,0 % d'amidon soluble, 1,0 ί de milieu "Pharmamedia", 0,003 % de ZnSO^.78^0 et 0,4 % de CaCO^ dans un fermentateur à cuve de 400 litres que l'on fait fonctionner à 30°C à 200 tr/min à une vitesse d'aération de 20 150 1/min. Le pH du bouillon s'élève graduellement à mesure que la fermentation progresse et il atteint 8,4-8,5 après 100-120 heures ; à ce moment, la puissance maximale de l'antibiotique est atteinte pour une concentration de 30 pg/ml.

- Exemple 2 , Isolement du complexe BBM-928 par extraction au solvant , Le bouillon récolté (170 litres, pH 8,5) obtenu dans l'exemple 1 est filtré avec un agent de clarification. On détecte une activité tant dans le gâteau mycélien que dans 30 le filtrat. Le gâteau mycélien est extrait deux fois avec un mélange de solvants formé d'acétone et de méthanol (1:1, deux fois 30 litres). Les extraits sont rassemblés et évaporés sous pression réduite en donnant un concentré aqueux qui est extrait au n-butanol. Le filtrat du bouillon est 35 extrait deux fois avec 40 litres de n-butanol à chaque fois. Par concentration sous pression réduite des extraits n-butanoliques rassemblés et lyophilisation du résidu, on obtient 21,4 g d'une substance solide brute. D'après

H

24 l'analyse par chromatographie sur couche mince, cette substance consiste en un complexe renfermant trois composants principaux A, B et C, et trois composants secondaires D, E et F, dont les valeurs de Rf sont indiquées sur le ; 5 tableau VII suivant.

TABLEAU VII

Chromatographie sur couche mince de gel de silice des composants du complexe de BBM-928

Valeurs de Rf x 10 -

Système N-118 xx Système N-103 *** BBM-928A 0,71 0,48 BBM-928B 0,53 0,26 15 BBM-928C 0,27 0,07 BBM-928D 0,73 0,53 BBM-928E 0,56 0,34 BBM-928F 0,39 0,17 x détection par l'analyseur à rayons ultraviolets 20 (Shimadzu CS- 910) à 345 nm xx n-butanol - méthanol - eau (63 : 27 : 10) xxx xylène - méthyléthylcétone - méthanol (5 : 5 : 1)

Exemple 3 25 Purification du complexe BBM-928

Le complexe brut de l'exemple 2 est purifié au , moyen d'un appareil de distribution préparative à contre- . courant (Mitamura, 100 ml/tube) au moyen d'un système de . solvants comprenant du tétrachlorure de carbone, du chloro- 30 forme, du méthanol et de l’eau dans la proportion de 5:2:5:1. Après 50 transferts, les contenus des tubes N° 5 à 20 sont rassemblés et concentrés en donnant 4,4 g d'une poudre de couleur jaune pâle contenant les composants A, B, D, E et F. On dissout le mélange dans un faible volume de chloroforme et 35 on charge la solution sur une colonne de gel de silice "C-200" (500 ml) préalablement traitée à l'acétate d'éthyle. La colonne est développée avec de l’acétate d'éthyle renfermant une quantité croissante de méthanol (2-5 % volume à volume) et les fractions sont contrôlées par détermination de la 25 densité optique à 345 nm. Le composant D secondaire est élue le premier avec de l’acétate d’éthyle et il est suivi du composant A. Les composants E, B et F sont ensuite élués dans cet ordre à une concentration au méthanol de 3 %· Chaque 5 fraction contenant le composant désiré est évaporée sous pression réduite et le résidu est cristallisé dans un mélange ’ de chloroforme et de méthanol. De même, la préparation brute du composant C est obtenue à partir du contenu des tubes N° 21 à 35 résultant du partage à contre-courant décrit ci-10 dessus. La purification du composant C est effectuée par chromatographie sur gel de silice et cristallisation dans un mélange de chloroforme et de méthanol. Les rendements des composants, A, B, C, D, E et F ont les valeurs respectives suivantes : 988 mg, 420 mg, 848 mg, 130 mg, 119 mg et 114 mg. 15 Exemple 4

Purification subséquente du composant A du complexe BBM-928 de l’exemple 3 L'épreuve chromatographique sur couche mince du composant BBM-928A de l'exemple 3 (effectuée en utilisant un 20 système formé de méthanol à 10 % dans le toluène) indique que l’échantillon n'est pas entièrement homogène, du fait qu’il renferme une matière additionnelle qui passe juste avant le composant BBM-928A. Les étapes suivantes ont été mises en oeuvre pour effectuer la purification : ,25 (1) On effectue la chromatographie de l’échan tillon sur gel de silice en utilisant un gradient linéaire . allant du chloroforme à un mélange méthanol-chloroforme à 6 % de méthanol. Les fractions éluées entre les proportions de 2,4 % et 3,3 % de méthanol dans le mélange méthanol-chloro-30 forme (contenant le composant BBM-928A plus une certaine quantité d’impureté) sont réunies en vue de l’opération suivante.

(2) On engendre un gradient concave en utilisant trois récipients dont les deux premiers contiennent un 35 mélange de méthanol et de toluène à 2 % de méthanol et dont le troisième contient un mélange de méthanol et de toluène à 6 % de méthanol. Les fractions rassemblées au terme de la première étape de chromatographie sur colonne de gel de 26 silice donnent, d’après ce gradient, un composant secondaire qui est élue le premier et qui est suivi de près du composant BBM-928A purifié (appelé ci-après composant BBM-928A ).

sr

Le poids moléculaire du composant BBM-928Ap, 5 déterminé d'après la méthode spectrométrique de masse par désorption dans un champ, est égal à 1427, ce qui correspond à la formule brute C^HygN 1 (poids moléculaire 1427,417). Analyse élémentaire (échantillons séchés à 100°C pendant 18 heures) 10 Cl E%n%0%a • Calculé pour c64h78n14°24 : 53,85 5’51 13’74 26’90 trouvé13 : 52,47 5,48 13,81 28,24a 15 a. par différence b. moyenne de trois mesures.

Claims (13)

1,- I C-Hlly-Sar-*HM-Val ° ? « 0 i HO Λ ππτ T 0 « 0 HM-Val«-Sar*-Gly«-C j |j /—N. «— Ser<-C0 -L^ i* ^ ΖοΛ_) 20 dans laquelle Ser est la sérine, Gly est la glycine, Sar est la sarcosine et HM-Val est la β-hydroxy-N-méthylvaline.

1. Le composé antibiotique-antitumoral BBM-928A qui présente les caractéristiques suivantes : (a) soluble dans le chloroforme et le chlorure de 5 méthylène, légèrement soluble dans le benzène, l’éthanol, le méthanol et le n-butanol et sensiblement insoluble dans l'eau et le n-hexane ; (b) donne une réaction positive avec le réactif 10 au chlorure ferrique et le réactif d'Ehrlich et une réaction négative avec le réactif de Tollens, le réactif de Sakaguchi et le réactif à la ninhydrine ; (c) est un agent antitumoral efficace contre la 15 leucémie P388, la leucémie L1210, le mélanome B16, le carcinome de Lewis-Lung et l’ascite du sarcome 180 par implantation intrapéritonéale chez la souris $ (d) a un point de fusion de 246-248°C ; 20 (e) a une rotation spécifique [aj^égale à 27° (c=1, CHC13) ; (f) a un poids moléculaire de 1427 ; (g) contient approximativement, d’après l’analyse élémentaire, 52,47 % de carbone, 25 5,48 % d’hydrogène, 13,81 % d’azote et . 28,24 % d’oxygène ; (h) présente, dans l’analyse par chromatographie sur couche mince de gel de silice, une valeur de Rf de 0,71 avec le mélange de solvants 30 formé de n-butanol, de méthanol et d’eau dans la proportion de 63:27: 10 et une valeur; de Rf de 0,48 avec le mélange de solvants formé de xylène, de méthyléthylcétone et de méthanol dans la proportion de 5:5:1 ; 35 (i) donne par hydrolyse acide des substances hydrosolubles positives à la ninhydrine comprenant la 8-hydroxy-N-méthylvaline, la glycine, la sérine et la sarcosine ; 28 (j) donne par hydrolyse basique un fragment VI de formule :

2. Le composé antibiotique-antitumoral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la portion amino-’ 25 acide X a la formule brute sous la forme peptidique.

3· Le composé antibiotique-antitumoral suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la portion amino-acide X sous la forme peptidique est le radical tétrahydro-pyridazine de formule : 30 o kA»

4. Le composé antibiotique-antitumoral suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu’il correspond à la structure : 29 I ^ / V-OR 5 1 \ I C-M51y->Sar^HM-Val t 3 ° i H0.^-V/>^OCH3 / HM-Val^SarKîly^C ’ 1 ' )—N «—SerKIO—i R o—\ \ H .-

5. Le composé antitumoral-antibiotique BBM-928B ayant un Chromophore de quinoléine et donnant, par hydrolyse acide, des composants hydrosolubles comprenant la sérine, la 20 glycine, la sarcosine et la β-hydroxy-N-méthylvaline, qui a sous sa forme essentiellement pure les caractéristiques suivantes : (a) est soluble dans le chloroforme et le chlorure de méthylène, légèrement soluble *25 dans le benzène, l'éthanol, le méthanol et le n-butanol et sensiblement insoluble dans ' l’eau et le n-hexane ; (b) donne une réaction positive avec le réactif au chlorure ferrique et le réactif d'Ehrlich 30 et une réaction négative avec les réactifs de Tollens et de Sakaguchi et le réactif à la ninhydrine ; (c) est un agent antitumoral efficace contre la leucémie P388 implantée par voie intrapéri- 35 tonéale chez la souris ; (d) a un point de fusion de 214-217°C ; (e) a une rotation spécifique (aj^de -74° (e=1, CHClg) ; 3° .ο (f) renferme approximativement, d’après l’analyse élémentaire, 50,14 t de carbone, 5,29 % d’hydrogène, 12,34 % d’azote et 32,23 % d’oxygène ; 5 (g) présente dans la chromatographie sur couche mince de gel de silice une valeur de Rf de 0,53 avec le mélange de solvants n-butanol-méthanol-eau dans la proportion de 63:27:10 et une valeur de Rf de 0,26 avec le mélange 10 de solvants formé de xylène, de méthyléthyl- cétone et de méthanol dans la proportion de 5:5:1 5 (h) a un spectre d’absorption infrarouge dans le bromure de potassium correspondant sensible- 15 ment à la représentation de la figure 2 ; et (i) donne à l’état dissous dans le deutéro- chloroforme un spectre de résonance magnétique des protons correspondant sensiblement à la courbe de la figure 6.

5 CH3°'Yÿ*v"Y'%v«'0H A. —CCH-S er*X*Gly*Sar-»-EM-Val v N Fragment VI 10 dans laquelle Ser est la sérine, Gly est la glycine, Sar est la sarcosine, HM-Val est la β-hydroxy-N-méthylvaline et le symbole X représente une portion amino-acide ; 15 (k) a un spectre d'absorption infrarouge dans le bromure de potassium correspondant sensiblement à la représentation donnée sur la figure 1 ; et (1) à l’état dissous dans le deutérochloroforme, 20 donne un spectre de résonance magnétique des protons correspondant sensiblement à la représentation donnée sur la figure 5.

6. Le composé suivant la revendication 5, ayant la structure : CH30V^\ pH

25 XjOl s CO-^Ser+N—( i OCly+S Val t n 0 1 H0 ^ ^ ΩΓΗ HM-Val«*Sar<-Gly+C | T T 30 35 dans laquelle Ser est la sérine, Gly est la glycine, Sar est la sarcosine, HM-Val est la e-hydroxy-N-méthylvaline et R1 est un groupe acétyle. 31 si j-

7. Le composé antitumoral-antibiotique BBM-928C ayant un Chromophore de quinoléine et donnant, par hydrolyse acide, des composants hydrosolubles comprenant la sérine, la glycine, la sarcosine et la β-hydroxy-N-méthylvaline, qui 5 présente sous sa forme essentiellement pure les caractéristiques suivantes : (a) est soluble dans le chloroforme et le chlorure de méthylène, légèrement soluble dans le benzène, 1»éthanol, le méthanol et le 10 n-butanol et sensiblement insoluble dans l'eau et dans le n-hexane ; (b) donne une réaction positive avec le réactif au chlorure ferrique et le réactif d*Ehrlich et une réaction négative avec le réactif de

15 Tollens et de Sakaguchi et le réactif à la ninhydrine ; (c) est un agent antitumoral efficace contre la leucémie P388, la leucémie L1210, le mélanome B16, le carcinome de Lewis-Lung et 20 les tumeurs d’ascite du sarcome 180 implantées par voie intrapéritonéale chez la souris ; (d) a un point de fusion de 244-248°C ; (e) a une rotation spécifique (aj^pde -91° (c=1, '25 CHC13) ; (f) a un poids moléculaire approximatif de 1470 ; (g) contient approximativement d’après l’analyse élémentaire 51,77 % de carbone, 5,29 % 30 d’hydrogène, 13,55 % d’azote et 29,39 % d’oxygène ; (h) présente dans la chromatographie sur couche mince de gel de silice une valeur de Rf de 0,27 avec un mélange de solvants formé de n- 35 butanol, de méthanol et d’eau dans la propor tion de 63:27:10 et une valeur de Rf de 0,07 avec le mélange de solvants formé de xylène, de méthyléthylcétone et de méthanol dans la proportion de 5:5:1 ; 32 (i) a un spectre d'absorption infrarouge dans le bromure de potassium correspondant sensiblement à la courbe de la figure 3 ; et (j) donne à l'état dissous dans le deutéro- 5 chloroforme un spectre de résonance magnétique des protons correspondant sensiblement à la courbe de la figure 7·

8. Le composé suivant la revendication 7, correspondant à la structure : 10 CH,0 ^ OH XjC^x f> '"N CO-^Ser-^N—(

9. Le composé antitumoral-antibiotique BBM-928D ' 25 présentant les caractéristiques suivantes : (a) est soluble dans le chloroforme et le chlorure de méthylène, légèrement soluble dans le benzène, l’éthanol, le méthanol et le n-butanol et sensiblement insoluble dans 30 l’eau et le n-hexane ; (b) donne une réaction positive avec le réactif au chlorure ferrique et le réactif d’Ehrlich et une réaction négative avec les réactifs de Tollens et de Sakaguchi et le réactif à la 35 ninhydrine ; (c) est un agent antitumoral efficace contre la leucémie P388 à implantation intrapéritonéale chez la souris j 33 (d) a un point de fusion de 224 à 227°C ; (e) a une rotation spécifique (aj^pde -13° (c=1, CHC13) ; (f) contient approximativement d’après l’analyse 5 élémentaire 50,75 t de carbone, 5,25 % d’hydrogène, 12,58 % d’azote et 31,42 % -, d'oxygène 5 (g) présente dans la chromatographie sur couche mince de gel de silice une valeur de Rf de 10 0,73 avec le mélange de solvants formé de n- butanol, de méthanol et d'eau dans la proportion de 63:27:10 et une valeur de Rf de 0,53 dans le mélange de solvants formé de xylène, de méthyléthylcétone et de méthanol dans la 15 proportion de 5:5:1 ; (h) a un spectre infrarouge dans le bromure de potassium correspondant sensiblement à la courbe de la figure 4 ; et (i) donne à l’état dissous dans le deutéro- 20 chloroforme un spectre de résonance magnétique des protons correspondant sensiblement à la courbe de la figure 8.

10 BBM-928D 0,73 0,53 BBM-928E 0,56 0,34 BBM-928F 0,39 0,17

10. Procédé de production par fermentation du complexe antitumoral-antibiotique BBM-928, caractérisé en ce *25 qu’il consiste à cultiver une souche d’actinomycètes ayant les caractéristiques de la souche N° G455-101 dans une solution aqueuse contenant une source de carbone assimilable et une source d'azote assimilable dans des conditions aérobies en immersion jusqu'à ce que le complexe BBM-928 30 produit confère une activité antitumorale-antibiotique appréciable à ladite solution.

10 R2° \ / dans laquelle Ser est la sérine, Gly est la glycine, Sar est 15 la sarcosine, HM-Val est la β-hydroxy-N-méthylvaline et R^ et R2 sont des groupes acétyle.

11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape de séparation du complexe BBM-928 du milieu de culture.

12. Procédé suivant la revendication 10, carac térisé en ce qu’il comporte en outre une étape de division du complexe BBM-928 en composants A, B, C, D, E et F qui ont les valeurs suivantes de Rf dans la chromatographie sur couche mince de gel de silice : 34 ; Valeurs de Rf n-butanol-méthanol- xylène-méthyléthyl-eau (63:27:10) cétone-méthanol 5 (5:5:1) BBM-928A 0,71 0,48 BBM-928B 0,53 0,26 BBM-928C 0,27 0,07

13· Médicament, caractérisé en ce qu’il est 15 constitué par ou en ce qu’il contient un composé antitumoral-antibiotique suivant l’une quelconque des revendications 1 à 9- * *