DE3001187C2

DE3001187C2 -

Info

Publication number: DE3001187C2
Application number: DE3001187A
Authority: DE
Inventors: Akinobu Funatsu; Shuzoh Oyama; Yoshinori Akimoto; Komei Kumamoto Jp Ohashi
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1979-01-17
Filing date: 1980-01-15
Publication date: 1989-01-19
Also published as: JPS647050B2; AT368887B; GB2039490B; DE3001187A1; US4302384A; NL7909110A; SE435786B; CH643861A5; ATA19180A; FR2446839B1; IT1127308B; CA1128418A; JPS5598117A; FR2446839A1; SE7909897L; IT7928295A0; GB2039490A

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von gereinigtem, S-sulfoniertem Gamma-Globulin sowie das hierbei erhaltene Verfahrenserzeugnis gemäß Anspruch 2.

Gamma-Globulin, das vom Blutplasmagemisch fraktioniert worden ist, weist bekanntlich Antikörper-Aktivitäten gegen verschiedene Infektionskrankheiten auf und ist wertvoll als sog. Immunglobulinpräparat für die Prophylaxe und Therapie verschiedener Infektionskrankheiten. Das übliche Immunglobulinpräparat enthält jedoch agglutinierte Moleküle, die während seiner Reinigung gebildet werden, und kann daher nicht intravenös, sondern nur intramuskulär verabreicht werden. Es ist ferner bekannt, daß, wenn ein Gamma-Globulinpräparat, das eine große Menge agglutinierter Moleküle enthält, einem Patienten intravenös verabreicht wird, ein Komplement im Patienten schnell aktiviert wird, wodurch verschiedene Nebenwirkungen wie Blutdrucksenkung, Erhöhung der Körpertemperatur, Störungen des Kreislaufsystems oder dgl. ausgelöst werden. Wenn andererseits das Gamma-Globulin intramuskulär verabreicht wird, sind die verabreichte Menge und die Penetrationsgeschwindigkeit des Gamma-Globulins in die Blutgefäße begrenzt, so daß die intramuskuläre Verabreichung ungeeignet ist, wenn ein schneller Anstieg der Antikörperkonzentration im Blut erforderlich ist. Es besteht somit ein Bedürfnis für ein verbessertes Gamma-Globulin, das intravenös ohne Störungen durch antikomplementäre Aktivität verabreicht werden kann.

Für die Herstellung von intravenös verabreichbarem Gamma-Globulin wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, beispielsweise ein Verfahren zur Behandlung mit Pepsin (siehe H. E. Schultze, Deutsche Medizinische Wochenschrift 87 (1962) 1643 und ein Verfahren zur Behandlung mit Plasmin (siehe J. T. Sgouris, Vox Sanguinis 13 (1967) 71). Bei dem Verfahren zur Behandlung mit einer Protease wie Pepsin wird jedoch das Gamma-Globulin in zwei oder mehr Verbindungen mit niedrigerem Molekulargewicht zersetzt, so daß der gebildete Antikörper innerhalb einer kürzeren Zeit verschwindet und ferner die biologische Aktivität des Fc-Fragments des Gamma-Globulinmoleküls durch Abschneiden des Fc-Fragments erniedrigt wird.

Es wurde ferner vorgeschlagen, ein intravenös verabreichbares Gamma-Globulin ohne die vorstehend genannten Nachteile zu bilden, d. h. das gewünschte Gamma-Globulin herzustellen, ohne die Struktur des Gamma-Globulins wesentlich zu verändern, beispielsweise nach einem Verfahren zur Behandlung von Gamma-Globulin bei pH 4 (siehe S. Barundun et al. in Vox Sanguinis 13 (1967) 93) und nach einem Verfahren zur Behandlung mit β-Propiolacton (siehe W. Stephan in Vox Sanguinis 28 (1975) 422). Bei dem Verfahren der Behandlung bei pH 4 wird jedoch der Gehalt an agglutinierten Molekülen während der Lagerung des hierbei erhaltenen Gamma-Globulins erhöht, wodurch wiederum die antikomplementäre Wirkung erhöht wird. Außerdem heißt es, daß das durch Behandlung mit b-Propiolacton gebildete Gamma-Globulin möglicherweise als Antigen wirksam ist, wenn es verabreicht wird.

Kürzlich wurde von Masuho et al. berichtet, daß ein geeignetes, intravenös verabreichbares Gamma-Globulin durch Sulfonierung der S-S-Kette von Gamma-Globulin hergestellt werden kann (US-PS 40 59 571; japanische Patentveröffentlichung (ungeprüft) Nr. 1630/1976). Das von Masuho et al. hergestellte S-sulfonierte Gamma-Globulin bewahrt das ursprüngliche große Molekül durch Wasserstoffbindung, während die S-S-Bindung gebrochen wird und es somit eine erheblich verringerte antikomplementäre Wirkung zeigt, während es die Antikörperfunktion vollständig bewahrt (es wird festgestellt, daß die Höhe der antikomplementären Wirkung bei einer Proteinkonzentration von 5 Gew.-% (nachstehend als "CH₅₀" bezeichnet) 30% oder weniger beträgt). Ferner wird das S-sulfonierte Gamma-Globulin leicht reduziert und dann unter Bildung des ursprünglichen Gamma-Globulins oxidiert, wenn es dem menschlichen Körper verabreicht wird (siehe Masuho et al., Journal of Biochemistry 19 (1976) 1377). Ferner wurde durch klinische Versuche nachgewiesen, daß das S-sulfonierte Gamma-Globulin an Patienten mit Hypogammaglobulinämie oder Agammaglobulinämie stabil verabreicht werden kann (siehe Noboru Kobayashi, International Academy of Blood Transfusion (Paris) 1978).

Das S-sulfonierte Gamma-Globulin ist somit ausgezeichnet und wertvoll als intravenös verabreichbares Gamma-Globulinpräparat, so daß ihm viel Aufmerksamkeit gewidmet wird. Dieses Produkt hat jedoch den Nachteil, daß es kaum im technischen Maßstab hergestellt werden kann. Wenn nämlich bei dem vorstehend genannten Herstellungsverfahren nach Masuho et al. das als Ausgangsmaterial dienende Gamma-Globulin genügend gereinigt wird und weniger agglutinierte Moleküle enthält, kann das gewünschte S-sulfonierte Gamma-Globulin mit niedriger antikomplementärer Aktivität erhalten werden; wenn jedoch das übliche für die Großherstellung verwendete Gamma-Globulin, z. B. das nach der Cohn' Fraktioniermethode unter Verwendung von Äthanol bei niedriger Temperatur hergestellte Gamma-Globulin als Ausgangsmaterial verwendet wird, hat das hergestellte S-sulfonierte Gamma-Globulin nicht eine so niedrige antikomplementäre Aktivität (beim niedrigsten CH₅₀-Wert etwa 30 bis 20%). Das Verfahren nach Masuho et al. ist somit im Prinzip ausgezeichnet, jedoch ist bei ihm irgendeine zusätzliche Behandlung erforderlich, um das gewünschte Produkt mit hoher Stabilität bei der Großherstellung zu erhalten.

Bei intensiven Bemühungen der Anmelderin, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung des gewünschten S-sulfonierten Gamma-Globulins mit genügend niedriger antikomplementärer Wirkung zu entwickeln, auch wenn irgendein übliches Gamma-Globulin, das viel agglutinierte Moleküle enthält, als Ausgangsmaterial verwendet wird, wurde nun gefunden, daß das angestrebte Ziel erreicht wird, wenn nach der Sulfonierungsreaktion das erhaltene S-sulfonierte Gamma-Globulin mit einem Ionenaustauscher behandelt wird, wodurch das gewünschte S-sulfonierte Gamma-Globulin mit äußerst geringer antikomplementärer Wirkung erhalten wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem S-sulfoniertem Gamma-Globulin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein S-sulfoniertes Gamma-Globulin mit einem Ionenaustauscher in einer Pufferlösung für die Entwicklung behandelt und hierdurch das als Einzelmoleküle vorliegende S-sulfonierte Gamma-Globulin am Ionenaustauscher adsorbiert und dann das als Einzelmoleküle vorliegende S-sulfonierte Gamma-Globulin mit einer Pufferlösung für die Elution eluiert, wobei man im Fall eines Anionenaustausches eine Pufferlösung für die Entwicklung mit einem pH-Wert von 4 bis 10 und einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,15 und eine Pufferlösung für die Elution mit einem pH-Wert von 3 bis 4 und einer Ionenstärke im Bereich von 0,05 bis 0,8; im Fall eines Kationenaustauschers eine Pufferlösung für die Entwicklung mit einem pH-Wert von 4 bis 6,5 und einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,1 und eine Pufferlösung für die Elution mit einem pH-Wert von 6 bis 9 und einer Ionenstärke im Bereich von 0,05 bis 0,8 einsetzt.

Diese Gamma-Globulin-Fraktion wird aufgefangen, wobei das gewünschte S-sulfonierte Gamma-Globulin mit äußerst niedriger antikomplementärer Aktivität erhalten wird. Das nach dem Verfahren gemäß der Erfindung in Einzelmolekülen erhaltene S-sulfonierte Gamma-Globulin hat einen CH₅₀-Wert von weniger als 10% und eignet sich daher als intravenös verabreichbares Immunglobulinpräparat.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein gereinigtes S-sulfoniertes Gamma-Globulin mit hohem Gehalt an Einzelmolekülen und geringer antikomplementärer Wirkung, welches nach dem erfindungsgemäßen, vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wird.

Das als Ausgangsmaterial dienende S-sulfonierte Gamma-Globulin kann aus einem üblichen Gamma-Globulin hergestellt werden, das gewöhnlich nach dem Cohn' Fraktionierverfahren, das international in großem Umfang für die Herstellung von Gamma-Globulin angewendet wird (siehe J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) 459), hergestellt wird. Das Gamma-Globulin wird durch Behandlung mit einem Oxidationsmittel, z. B. einem Alkalimetalltetrathionat, einem Alkalimetalljodosobenzoat, einem molekularen Sauerstoff enthaltenden Gas (z. B. Luft) oder einer Sulfitionen bildenden Verbindung (z. B. schweflige Säure) sulfoniert (siehe US-PS 40 59 571; japanische Patentveröffentlichung (ungeprüft) 1630/1976 und 76418/1976). Das S-sulfonierte Gamma-Globulin kann gegebenenfalls nach einem üblichen Verfahren, z. B. durch Dialyse, gereinigt werden.

Der im Rahmen der Erfindung verwendete Ionenaustauscher ist vorzugsweise eine wiederholt verwendbare Säule ohne spezielle Aktivierung, hat ein hohes Bindungsvermögen und ist vorzugsweise ein autoklavierbares Gel mit guter Stabilität unter verschiedenen Bedingungen, z. B. bei verschiedenen pH-Werten, Ionenstärken usw.

Als Ionenaustauscher eignen sich Anionenaustauscher und Kationenaustauscher, jedoch werden Anionenaustauscher vom Standpunkt der biologischen und physikalischen Stabilität des Produkts bevorzugt. Der Anionenaustauscher kann in Kombination mit dem Kationenaustauscher verwendet werden.

Beispiele geeigneter Anionenaustauscher sind Agarosegel, in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ist (z. B. das Produkt "DEAE-Sepharose CL-6B"), Dextrangel, in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ist (z. B. die Produkte "DEAE-Sephadex®" und "QAE- Sephadex®"), Cellulosegel, in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ist (z. B. DEAE-Cellulose und TEAE-Cellulose), Polyvinylgel, in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ist (z. B. das Produkt "DEAE-TOYOPEAL"), Amylosegel, in das ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, und dgl. Als anionische Substituenten kommen Diäthylaminoäthyl (DEAE), Triäthylaminoäthyl (TEAE) und Diäthyl-(2-hydroxypropyl)aminoäthyl (QAE) in Frage.

Beispiele geeigneter Kationenaustauscher sind Agarosegel, in das ein kationischer Substituent eingeführt worden ist (z. B. das Produkt "CM-Sepharose CL-6B"), Dextransgel, in das ein kationischer Substituent eingeführt worden ist (z. B. die Produkte "CM-Sephadex®" und "SP-Sephadex®"), Cellulosegel, in das ein kationischer Substituent eingeführt worden ist (z. B. CM-Cellulose), Polyvinylgel, in das ein kationischer Substituent eingeführt worden ist (z. B. das Produkt "CM-TOYOPEAL") und Amylosegel, in das ein kationischer Substituent eingeführt worden ist. Als kationische Substituenten kommen Carboxymethyl (CM), Sulfopropyl (SP) und Sulfoäthyl (SE) in Frage.

Die Adsorption des S-sulfonierten Gamma-Globulins am Ionenaustauscher kann wie folgt durchgeführt werden: Das S-sulfonierte Gamma-Globulin wird mit einem Ionenaustauscher in einer Pufferlösung für die Entwicklung behandelt, die optimale Wasserstoffionenkonzentration (pH-Wert) und optimale Ionenstärke aufweist. Hierdurch wird das in Einzelmolekülen vorliegende S-sulfonierte Gamma-Globulin am Ionenaustauscher adsorbiert. Bei dieser Behandlung durchlaufen die agglutinierten Moleküle des S-sulfonierten Gamma-Globulins und auch das nicht sulfonierte Gamma-Globulin den Ionenaustauscher, ohne daran adsorbiert zu werden. Nach der Adsorption wird der Ionenaustauscher mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, um das agglutinierte Gamma-Globulin und andere Verunreinigungen vollständig zu entfernen.

Die für die Adsorption des als Einzelmoleküle vorliegenden Gamma-Globulins verwendete Pufferlösung hat einen pH-Wert von 4 bis 10, vorzugsweise von 7 bis 8, und eine Ionenstärke (µ) von 0,01 bis 0,15, vorzugsweise von 0,03 bis 0,09 im Fall des Anionenaustauschers. Bei Verwendung eines Kationenaustauschers hat die Pufferlösung einen pH-Wert von 4 bis 6,5, vorzugsweise von 5 bis 6, und eine Ionenstärke von 0,01 bis 0,1, vorzugsweise von 0,035 bis 0,07. Die Konzentration des der Adsorptionsbehandlung zu unterwerfenden S-sulfonierten Gamma-Globulins ist nicht entscheidend wichtig, jedoch wird es unter Berücksichtigung des Austauschvermögens des Ionenaustauschers vorzugsweise in einer Konzentration von 2 bis 12% (Gew./Vol.) verwendet.

Als Pufferlösungen für die Entwicklung eignen sich beispielsweise eine Phosphatpufferlösung, eine Citratpufferlösung, eine Tris-phosphatpufferlösung, eine Tris-HCl-Pufferlösung, eine Boratpufferlösung und eine Acetatpufferlösung.

Das am Ionenaustauscher in Form von Einzelmolekülen adsorbierte S-sulfonierte Gamma-Globulin läßt sich durch Elution mit einer Pufferlösung, die im pH-Wert und in der Ionenstärke von der Pufferlösung für die Entwicklung verschieden ist, leicht davon isolieren. Die Pufferlösung für die Elution hat bei Verwendung eines Anionenaustauschers einen pH-Wert von 3 bis 4 und bei Verwendung eines Kationenaustauschers einen pH-Wert von 6 bis 9. Die Pufferlösung für die Elution muß eine höhere Ionenstärke (µ) als die Pufferlösung für die Entwicklung haben.

Vorzugsweise liegt diese Ionenstärke im Bereich von 0,05 bis 0,8. Als Pufferlösungen für die Elution eignen sich beispielsweise Phosphatpufferlösungen, Glycin-HCl-Pufferlösungen, Citratpufferlösungen und wäßrige Natriumacetatlösungen. Diese Pufferlösungen können Natriumchlorid enthalten.

Die Reinigungsbehandlung gemäß der Erfindung wird gewöhnlich bei Raumtemperatur durchgeführt, kann jedoch auch unter Kühlen erfolgen.

Das gemäß der Erfindung gereinigte S-sulfonierte Gamma-Globulin hat einen höheren Gehalt an Einzelmolekülen, eine geringere antikomplementäre Aktivität und eine größere Stabilität als das Produkt vor der Reinigung. Wenn beispielsweise das bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch verwendete S-sulfonierte Gamma-Globulin (drei Chargen) nach dem Verfahren gemäß der Erfindung unter Verwendung von DEAE-Sepharose CL-6B und CM-Sepharose CL-6B gereinigt und das erhaltene Produkt so eingestellt wurde, daß seine Proteinkonzentration 5% betrug, zeigten die Produkte die in Tabelle 1 genannten Werte für antikomplementäre Aktivität (CH₅₀), Gehalt an Einzelmolekülen (gemessen durch Analyse mit der Ultrazentrifuge) und Schüttelstabilität (gemessen mit Hilfe des Unterschiedes in der Lichtstreuung nach Schütteln in einer Kahn-Schüttelmaschine).

Tabelle 1

Wie die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, weist das gemäß der Erfindung gereinigte S-sulfonierte Gamma-Globulin eine äußerst stark verringerte antikomplementäre Wirkung von 10% oder weniger bei einer Proteinkonzentration von 5% im Vergleich zu dem Produkt vor der Reinigung auf. Bei Verwendung eines Anionenaustauschers wird sie ganz besonders stark verringert. Der Gehalt an Einzelmolekülen steigt von 75 bis 80% (vor der Reinigung) auf 90 bis 95% (nach der Reinigung). Bei der Analyse durch Ultrazentrifugation sind die stark agglutinierten Moleküle kaum nachzuweisen, weil sie unmittelbar nach Beginn der Zentrifugation ausgefällt werden, jedoch können die agglutinierten Moleküle bei der Gelchromatographie-Analyse (z. B. Dünnschicht-Gelchromatographie) in Polymere und Oligomere getrennt werden. Diese Analyse durch Gelchromatographie bestätigte, daß der Gehalt an Monomeren (Einzelmolekül) von 60% bis 70% (vor der Reinigung) auf 85% oder mehr (nach der Reinigung) erhöht wurde. Ferner ergibt die Messung der Lichtstreuung vor und nach der Reinigung, daß das gemäß der Erfindung gereinigte S-sulfonierte Gamma-Globulin eine äußerst hohe Stabilität aufweist und selbst durch Schütteln keine unlösliche Substanz ausgefällt wird.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen beziehen sich die Prozentsätze auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

248 g Natriumtetrathionat wurden in 1500 ml Natriumchlorid enthaltender Phosphatpufferlösung (pH 7,6) gelöst, und 408 g Natriumsulfit wurden in 3500 ml der gleichen Pufferlösung gelöst, worauf die Lösungen zur Sterilisation filtriert wurden. Jede in dieser Weise hergestellte Lösung wurde zu 10 l einer 15%igen wäßrigen Lösung von Gamma-Globulin gegeben, das aus menschlichem Blutplasma nach der Äthanol-Fraktionierungsmethode hergestellt worden war. Das Gemisch wurde 4,5 Stunden bei 43°C langsam gerührt, um die Sulfonierung vorzunehmen.

Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert, um überschüssiges Sulfonierungsmittel zu entfernen, und dann mit einer Pufferlösung für die Entwicklung (Phosphatpufferlösung; µ=0,06, pH 7,5) ins Gleichgewicht gebracht.

Die Lösung des S-sulfonierten Gamma-Globulins in dem Phosphatpuffer wurde auf eine Proteinkonzentration von etwa 8% eingestellt, und 15 l Lösung wurden entwickelt, indem sie durch eine Säule (16 l) des Ionenaustauschers DEAE-Sepharose CL-6B, die mit der gleichen, vorstehend genannten Phosphatpufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war, geleitet wurde. Die Fraktion (P-I), die durch die Säule lief, ohne am Ionenaustauscher adsorbiert zu werden, war eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 2% (16 l).

Die Säule wurde mit der gleichen, vorstehend genannten Phosphatpufferlösung gewaschen, und als fast kein Protein mehr nachgewiesen wurde, wurde eine Acetatpufferlösung (µ=0,1, pH 4,0) durch die Säule geleitet und die eluierte Fraktion (P-II) aufgefangen. Diese Fraktion (P-II) war eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 2,5% (32 l).

Jede in der beschriebenen Weise erhaltene Fraktion wurde mit wäßriger Natriumhydroxidlösung neutralisiert, auf eine Proteinkonzentration von etwa 5% eingeengt und dann gegen eine 2,25% Glycin enthaltende isotonische Phosphatpufferlösung dialysiert. Verschiedene Eigenschaften der in der beschriebenen Weise erhaltenen Produkte wurden auf die unter Tabelle 1 beschriebene Weise gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt.

Tabelle 2

Wie die vorstehenden Ergebnisse zeigen, hat die Fraktion P-I eine hohe antikomplementäre Wirkung und enthält eine große Menge agglutinierter Moleküle und weist schlechte Schüttelstabilität auf. Im Gegensatz hierzu weist die gewünschte Fraktion P-II eine genügend niedrige antikomplementäre Wirkung, einen hohen Gehalt an Einzelmolekülen und eine äußerst stark gesteigerte Schüttelstabilität auf. Die Komponenten mit unerwünschten Eigenschaften sind somit als Fraktion P-I wirksam entfernt worden.

Das Trennschema oder -modell der Fraktionen bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch ist in Fig. 1 dargestellt, in der die Fraktionsnummer als Abszisse und die optische Dichte jeder Fraktion bei einer Wellenlänge von 280 nm als Ordinate aufgetragen ist.

Die Lösung des S-sulfonierten Gamma-Globulins vor der Reinigung (A), die Fraktion P-I (B) und die Fraktion P-II (C) wurden ferner der Analyse durch Ultrazentrifugation (X) und der Analyse durch Dünnschicht-Gelfiltration (Y) unterworfen. Der Verlauf dieser Analysen ist in Fig. 2 dargestellt. Die Analyse durch Ultrazentrifugieren wurde bei einer Proteinkonzentration von etwa 1,67% und bei 60 000 UpM für 50 Minuten unter Verwendung einer Beckmann-Ultrazentrifuge und die Analyse durch Dünnschicht-Gelfiltration nach der Migita-Methode (Annual Report of Inst. Virus Research, Kyoto Univ. 8 (1965) 130) durchgeführt. In Fig. 2 bedeutet "a" die aus Einzelmolekülen bestehende Substanz (7S); "b", "c" und "d" sind Oligomere (9S, 11S und 13S), während "p" ein Polymeres bedeutet. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, zeigen beide Analysen einen ähnlichen Verlauf bzw. ein ähnliches Schema, jedoch erscheint die Menge der stark agglutinierten Moleküle bei der Analyse durch Dünnschicht-Gelfiltration höher als bei der Analyse durch Ultrazentrifugation. Im Schema der Analyse durch Ultrazentrifugation erscheint das Polymere nicht. Beide Analysen zeigen, daß die Fraktion P-I eine große Menge agglutinierter Moleküle und die Fraktion II eine erhöhte Menge an Einzelmolekülen enthält.

Beispiel 2

Eine 15%ige wäßrige Gamma-Globulinlösung wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise sulfoniert und anschließend dialysiert. Die hierbei erhaltene Lösung von S-sulfoniertem Gamma-Globulin wurde auf eine Proteinkonzentration von etwa 7% eingestellt. Etwa 100 l der Lösung wurden durch 150 l einer Säule geleitet, die mit dem Ionenaustauscher DEAE-Sepharose CL-6B, der mit einer Citratpufferlösung (µ=0,03, pH 7,5) ins Gleichgewicht gebracht worden war, gefüllt war. Die Fraktion (P-I), die die Kolonne durchlief, ohne am Ionenaustauscher adsorbiert zu werden, war eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 1,5% (etwa 125 l).

Nach dem Waschen der Säule auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurde eine Natriumchlorid enthaltende Glycin-HCl-Pufferlösung (µ=0,55, pH 3,5) durch die Säule geleitet und die eluierte Fraktion (P-II) aufgefangen. Die Fraktion (P-II) war eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 2% (etwa 245 l).

Die in dieser Weise erhaltenen Fraktionen wurden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, worauf ihre Eigenschaften in der gleichen Weise gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.

Tabelle 3

Beispiel 3

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise, jedoch unter Verwendung einer Citratpufferlösung (µ=0,03, pH 7,5) anstelle der Phosphatpufferlösung (µ=0,06, pH 7,5) als Pufferlösung für die Entwicklung wurden etwa 15 l einer Lösung von S-sulfoniertem Gamma-Globulin mit einer Proteinkonzentration von etwa 7% entwickelt, indem sie durch 16 l einer Säule, die mit DEAE-Sepharose CL-6B gefüllt war, geleitet wurde. Hierbei wurden 15,6 l einer Fraktion P-I mit einer Proteinkonzentration von etwa 1,7% erhalten. Unter Verwendung einer Citratpufferlösung (µ=0,614, pH 6,0) als Pufferlösung für die Elution wurden 31 l einer Fraktion P-II mit einer Proteinkonzentration von etwa 2,2% erhalten.

Beispiel 4

Der in Beispiel 3 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch eine Phosphatpufferlösung (µ=0,06, pH 7,5) verwendet wurde. Hierbei wurden etwa 14 l einer Fraktion P-I mit einer Proteinkonzentration von etwa 1,8% erhalten. Ferner wurden durch Elution mit einer Glycin-HCl-Pufferlösung (µ=0,542, pH 3,5) 29 l einer Fraktion P-II mit einer Proteinkonzentration von etwa 2,4% erhalten.

Beispiel 5

Der in Beispiel 3 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch eine Tris-HCl-Pufferlösung (µ=0,0175, pH 8,5) als Pufferlösung für die Entwicklung und eine Natriumchlorid enthaltende Phosphatpufferlösung (µ=0,45, pH 6,0) als Pufferlösung für die Elution verwendet wurden. Hierbei wurden 22 l einer Fraktion P-I mit einer Proteinkonzentration von etwa 1,2% und eine Fraktion p-II (27 l) mit einer Proteinkonzentration von etwa 2,6% erhalten.

Beispiel 6

Eine auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellte wäßrige Lösung von S-sulfoniertem Gamma-Globulin wurde durch Dialyse gegen einen Acetatpuffer (µ=0,05, pH 5,3) ins Gleichgewicht gebracht. Die Lösung wurde auf eine Konzentration an S-sulfoniertem Gamma-Globulin von etwa 7% eingestellt. 15 Liter der erhaltenen Lösung wurden durch 16 l einer Säule geleitet, die mit dem Ionenaustauscher CM-Sepharose CL-6B gefüllt war, der mit der gleichen vorstehend genannten Acetatpufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Fraktion (P-I), die die Säule durchlief, ohne daran adsorbiert zu werden, war eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 1,9% (13 l).

Nach dem Waschen der Ionenaustauschersäule auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurde eine wäßrige Natriumacetatlösung (µ=0,2) durch die Säule geleitet und die eluierte Fraktion (P-II) aufgefangen. Diese Fraktion P-II war eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von etwa 2,5% (27 l).

Die in dieser Weise erhaltenen beiden Fraktionen wurden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, worauf ihre Eigenschaften in der gleichen Weise gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt.

Tabelle 4

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem S-sulfoniertem Gamma-Globulin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein S-sulfoniertes Gamma-Globulin mit einem Ionenaustauscher in einer Pufferlösung für die Entwicklung behandelt und hierdurch das als Einzelmoleküle vorliegende S-sulfonierte Gamma-Globulin am Ionenaustauscher adsorbiert und dann das als Einzelmoleküle vorliegende S-sulfonierte Gamma-Globulin mit einer Pufferlösung für die Elution eluiert, wobei man im Fall eines Anionenaustausches eine Pufferlösung für die Entwicklung mit einem pH-Wert von 4 bis 10 und einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,15 und eine Pufferlösung für die Elution mit einem pH-Wert von 3 bis 4 und einer Ionenstärke im Bereich von 0,05 bis 0,8; im Fall eines Kationenaustauschers eine Pufferlösung für die Entwicklung mit einem pH-Wert von 4 bis 6,5 und einer Ionenstärke von 0,01 bis 0,1 und eine Pufferlösung für die Elution mit einem pH-Wert von 6 bis 9 und einer Ionenstärke im Bereich von 0,05 bis 0,8 einsetzt.

2. Gereinigtes S-sulfoniertes Gamma-Globulin mit hohem Gehalt an Einzelmolekülen und geringer antikomplementärer Wirkung, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1.