NL7909110A

NL7909110A - Zuivering van gamma-globuline-derivaat.

Info

Publication number: NL7909110A
Application number: NL7909110A
Authority: NL
Original assignee: Chemo Sero Therapeut Res Inst
Priority date: 1979-01-17
Filing date: 1979-12-18
Publication date: 1980-07-21
Also published as: SE435786B; AT368887B; DE3001187A1; IT1127308B; GB2039490A; FR2446839A1; FR2446839B1; DE3001187C2; JPS647050B2; CA1128418A; US4302384A; ATA19180A; JPS5598117A; SE7909897L; IT7928295A0; GB2039490B; CH643861A5

Description

*

V

3r/0/lh/l

Zuivering van ^-globuline-derivaat.

Werkwijze voor het verschaffen van gezuiverd S-gesulfoneerd ^f-globuline, waarbij het-^-globuIine-derivaat met een ionenuitwisselaar wordt behandeld teneinde geagglutineerde moleculen van het derivaat voldoende te verwijderen, 5 · het gehalte aan de monomoneculaire verbinding te vergroten en de ongewenste anticomplementaire werking voldoende te verzwakken ter verschaffing van het gewenste, biologisch en fysisch stabiele S-gesulfoneerde-^-globuline.

Door fractioneren uit bloedplasma verkregen 10 7-globuline vertoont een werking tegen verschillende infectieziekten en is te gebruiken als een zogenaamd immunoglobu-line-prepr raat voor het voorkomen en genezen van verschillende infectieziekten. De bekende immunoglobuline-preparaten bevatten echter geagglutineerde moleculen van het ^-globu- 15. line-derivaat, die bij de zuivering zijn ontstaan. Ze kunnen dan ook niet intraveneus toegediend worden, doch enkel intramusculair. Bij toediening van een preparaat met geagglutineerde moleculen van het $*-globuline-derivaat wordt in de patient snel een complement geactiveerd, hetgeen leidt 20 tot neveneffecten, zoals verlaging van de bloeddruk, verhoging van de lichaamstemperatuur, ontregeling van de bloedcirculatie, enz. Bij intramusculaire toediening echter zijn de toe te dienen hoeveelheid en de snelheid van penetratie in de bloedvaten beperkt, welke wijze van toediening dus 25 niet geschikt is voor het snel doen stijgen van de bloedspiegel van het anti-lichaam. Er is dan ook behoefte aan een T-globuline-preparaat, dat intreveneus kan worden toegediend zonder dat een anti-complementaire werking optreedt.

Er zijn verschillende werkwijzen bekend voor 30 de bereiding van intraveneus toe te dienen ^-globuline-preparaten, zoals de behandeling met pepsine (Deutsch Medizinishe Wochenschrift, 87^, 1643 (1962)) of met piasmine (Vox Sanguinis, 13, 71 (1967)). Bij behandeling met een protease, zoals pepsine, wordt het ^-globuline echter ont- 7909110 • · -- 'm -2- »* * v leed tot. twee of meer verbindingen met een lager moleculair gewicht, zodat het anti-lichaam na korte tijd verdwijnt en de biologische werking van de Fc-groep van het "/“Slobuline afneemt door het verdwijnen van voornoemde groep.

5 Bekend is ook een werkwijze ter verschaffing van een intraveneus toe te dienen ^'-glebuiine zonder voornoemde nadelen, met name zonder wijzigingen in de ^"Slobu-linestructuur, zoals de behandeling van het ^“STlohuline bij pH 4 (Vox Sanguinis, 13, 93 (1967)), behandeling met 1Ö β-propyolaceton (Vox Sanguinis, 28, 422 (1975)). Volgens de eerstgenoemde werkwijze wordt echter een preparaat ver7 kregen, waarvan het gehalte aan geagglutineerde moleculen bij het bewaren toeneemt, zodat de anti-complementaire werking daarvan sterker pleegt te worden. Er is gesteld, dat 15 de tweede van voornoemde twee werkwijzen een ^-globuline-preparaat verschaft, dat bij toediening als een antigeen kan werken.

Het Amerikaanse octrooischrift 4.059.571 en de Japanse octrooiaanvrage 1630/1976 vermelden recentelijk 20 een werkwijze voor het verschaffen van een intraveneus toe te dienen /f-globuline-preparaat, waarbij Jf-globuline bij de S-S-binding wordt geoxideerd ter verschaffing van een derivaat met sulfonzuurresten (in het vervolg met S-ge-sulfoneerd ^jf-globuline aan te duiden) . Zulk een derivaat 25 behoudt de oorspronkelijke molecuulgrootte, omdat de S-S-binding is vervangen door een waterstofbinding, zodat het een aanzienlijke zwakkere anti-complementaire werking vertoont met behoudt van volledige anti-lichaamwerking (er is aangegeven, dat het anti-complementaire werkingsniveau bij 30 een proteineconcentratie van 5 gew.% (hierna met "CHj-q") bij 30% of minèër licht). Bovendien wordt het S-gesulfoneer-de ^-globuline gemakkelijk gereduceerd en dan geoxideerd ter verschaffing van het oorspronkelijke molecuul, indien aan mensen toegediend (Journal of Biochemistry, 2J^, 1377 35 (1976)). Ook is met clinische proeven aangetoond, dat het derivaat veilig kan worden toegediend aan mensen, waarvan het bloed weinig of geen 2f"*gl°buline bevat (International Academy of Blood Transfusion (Parijs) 1978) .

-·’ ,f% a ** 3 * (ft, „ v r' v

V

-3-

Voornoemd ^globuline-preparaat heeft welliswaar de vereiste eigenschappen, doch kan nauwelijks op industriële schaal geproduceerd worden. Met name kunnen voor-noemde resultaten bereikt worden, indien wordt uitgegaan 5 van y-globuline, dat voldoende is gezuiverd en weinig geagglutineerde moleculen bevat, doch bij gebruik van technisch ^f-globuline, volgens Cohn gefractioneerd met ethanol bij lagere temperatuur, als uitgangsmateriaal, vertoont het verkregen S-gesulfoneerde “Jjf-globuline een niet geringe anti-10 complementaire werking (CH^q = tenminste circa 30-20%).

In principe is de in vorenstaande beschreven werkwijze dus goed, doch er is een extra behandeling nodig voor het op industriële schaal verschaffen van het gewenste produkt met een goede houdbaarheid.

15 Er is naar een werkwijze gezocht voor de pro- duktie van het gewenste S-gesulfoneerde ^-globuiine met een voldoende lage anti-complementaire werking*, waarbij van technische ^globuline wordt uitgegaan. Gebleken is nu, dat het doeleinde kan worden bereikt door na het sulfoneren het 20 verkregen S-gesulfoneerde ^f-globuline met een ionenuitwisselaar te behandelen.

De uitvinding verschaft dan ook een werkwijze voor de produktie van een intraveneus toe te dienen ^~glo-buline op industriële schaal. Volgens een ander aspect ver-25 schaft de uitvinding een S-gesulfoneerd ^-globuline met hoofdzakelijk enkelvoudige moleculen, weinig geagglutineerde moleculen en uiterst zwakke anti-complementaire werking.

Verder verschaft de uitvinding een werkwijze voor de zuivering van een S-gesulfoneerd ^-globuline.

30 Volgens de uitvinding wordt een op gebruike lijke wijze door oxidatie verkregen S-gesulfoneerd y'-globu-line met een ionenuitwisselaar gefractioneerd ter verschaffing van een fractie met hoofdzakelijk geagglutineerde moleculen en een fractie met hoofdzakelijk monomoleculaire 35 ^globuline, welke laatste fractie het gewenste ^-globuline- derivaat met een uiterst lage anti-complementaire werking verschaft, met name met een CH^q van minder dan 10%. Het S-gesulfoneerde ^globuline van de uitvinding kan dus ge- 7909110 y*' -4- bruikt worden als een intraveneus toe te dienen immunoglobu-line-preparaat.

Het uitgangsmateriaal kan bestaan uit S-gesul-foneerd ^-globuline, dat gewoonlijk wordt verkregen door 5 fractioneren volgens Cohn, een internationaal toegepaste werkwijze voor de bereiding van ^"-globuline (J. Am, Chem. Soc., 68_, 459 (1946)). Het oxideren van het ^-globuline geschiedt met een oxidatiemiddel/ zoals een alkalimetaal-tetraionaat, alkalimetaaljodosoaat/ een moleculaire zuur-10 stof bevattend gas (lucht) of een sulfietion vormende verbinding (zwavelig zuur) (Amerikaans octrooischrift 4.059.571/ Japanse octrooiaanvragen 1630/1976 en 76418/1976). Het S-gesulfoneerde 2^globuline kan eventueel op gebruikelijke wijze, zoals door dialyse/ gezuiverd worden.

15 De gebruikte ionenuitwisselaar is bij voor keur herhaaldelijk te gebruiken zonder extra activering en met een groot bindingsvermogen. Hij bestaat bij voorkeur uit een in een autoclaaf te bewerken gel met een goede stabiliteit onder verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld 20 bij verschillende pH's, ionensterkten, enz. De zuivering geschiedt in een kolom van zulk een ionenuitwisselaar.

De ionenuitwisselaar kan anionisch of cat-ionisch zijn, met voorkeur voor de anionische vanwege de biologische en fysische stabiliteit van het produkt. Een 25 anionische uitwisselaar kan te zamen met een cationische gebruikt worden.

Voorbeelden van geschikte anionische uitwisselaars zijn agarosegel (bijvoorbeeld DEAE-Sepharose CL-6B), dextrangel (DEAE- of QAE-Sephadex), cellulosegel (bijvoor-30 beeld DEAE- of TEAE-cellulose), polyvinylgel (DEAE-Toyopeal), amylosegel, enz. Geschikte anionische groepen zijn diethyl-aminoethyl (DEAE), triethylaminoethyl (TEAE) en diethyl-(2-hydroxypropyl)aminoethyl (QAE).

Voorbeelden van geschikte cationische ionen-35 uitwisselaars zijn met cationische groepen gesubstitueerde agarosegel (bijvoorbeeld CM-Sepharose CL-6B), dextrangel (bijvoorbeeld CM- of SP-Sephadex), cellulosegel (bijvoorbeeld CM-cellulose), polyvinylgel (bijvoorbeeld CM-Toyopeal), 7909110 w.

-5- amylosegel en dergelijke. Geschikte cationische groepen zijn de groepen carboxymethyl (CM), sulfopropyl (SP) en sulfoethyl (SS) -

Voor de absorptie wordt het S-gesulfoneerde 5 ^-globuline net een ionenuitwisselaax in een bufferoplossing met een optimale pH en ionensterkte behandeld onder het absorberen van het monomoleculaire S-gesulfoneerde ^-globu-line door de ionenuitwisselaar, doch niet de geagglutineerde moleculen en het niet gesulfoneerde globulins. De ionen-10 uitwisselaar wordt dan met dezelfde bufferoplossing uitgewassen.

De pH van de bufferoplossing dient 4-10 te bedragen, bij voorkeur 7-8 en de ionensterkte (ji) 0,01-015, bij voorkeur 0,03-0,09, bij gebruik van een anionische ionen-15 uitwisselaar. Bij gebruik van een cationische ionenuitwisse-laar dient de pH van de bufferoplossing 4-6,5 te bedragen, bij voorkeur 5-6, en de ionensterkte 0,01-0,1, bij voorkeur 0,035-0,07. De concentratie van het te absorberen S-gesulfoneerde ^-globuline is niet aan beperkingen onderhevig, 20 doch met het oog op het uitwisselingsvermogen van de ionenuitwisselaar gaat de voorkeur uit naar een concentratie van 2-12% (gewicht/volume).

De bufferoplossing bestaat bij voorkeur uit een fosfaat-, citraat-, tris/fosfaat-, tris/HCl-, boraat-, 25 acetaat-buffer of dergelijke.

Het monomoleculaire S-gesulfoneerde T^globu-line wordt gemakkelijk uit de ionenuitwisselaar geelueerd enwel met een tweede bufferoplossing met een andere pH en ionensterkte dan die van de eerste bufferoplossing. De pH 30 van de bufferoplossing voor het elueren bedraagt 3-4 bij gebruik van een anionenuitwisselaar en 6-9 bij gebruik van een cationenuitvisselaar. De ionensterkte (μ) van de bufferoplossing voor het elueren dient hoger te zijn dan die van de eerste bufferoplossing en bedraagt bij voorkeur 0,05-0,8. 35 Voorbeelden van elutieoplossingen zijn fosfaat-, glycine/ HC1-, citraat-, natriumacetaat-buffers of dergelijke. Ze kunnen natriumchloride bevatten.

7909110 De zuivering geschiedt volgens de uitvinding

V

♦ '·* -6- κ\ bij kamertemperatuur, doch ook onder koeling.

Het volgens de werkwijze van de uitvinding gezuiverde S-gesulfoneerde ^-globuline heeft een hoger gehalte aan het monomoleculaire bestanddeel, minder anti-ccmplemen-5 taire werking en een grotere stabiliteit dan het nog niet gezuiverde produkt. Indien bijvoorbeeld het in het later te bespreken voorbeeld I gebruikte S-gesulfoneerde j^-globu-line (3 partijen) volgens de werkwijze van de uitvinding wordt gezuiverd met DEAE-Sepharose CL-6B en CM-Sepharose 10 CL-6B ter verschaffing van een preparaat met een proteine-concentratie van 5% dan bedragen de anti—complementaire werking (CH^q), het gehalte aan monomoleculaire bestanddeel (met een ultracentrifuge bepaald) en de schut-bestandheid (waarbij het verschil in lichtverstrooiing voor en na het 15 schudden in de schudinrichting van Kahn wordt gemeten) als in tabel A weergegeven. Voor de tabel gelden de volgende opmerkingen:

Hf 1) bepaald volgend Kabat Mayer (Experimental Immunochemistry, 225 (1961)).

20 2) gemeten na 50 min centrifugeren bij 60.000 o.p.m. met de ultra-centrifuge van Beckmann.

.3) gemeten is het verschil van de lichtverstrooiing voor en na 4 uren schudden met een amplitude van 3,4 cm en een frequentie van 3,7 (Standard for Biological Preparations, 25 uitgegeven door het Ministerie van Gezondheid van Japan).

79 0 9 1 1 0 -7- «V.

TABEL A

Partij yoor Ha zuivering jfo. zuivering-------- j DEAE- CK- ! , Sepharcse Sapharose *1 i 25 6 8

Cl!S0 Ü 20 3 10 ( % ’ ill 22 5__7 'Gehalte - *2 i 82 92 90 moleculen ϋ 84 92 y ( % 5 iii 85 94 95

Schud- *3 i 100 5 ** · 42 bestandheid . Λ _rt ii 80 8 38 iii 136 2 30

Uit de tabel blijkt, dat het volgens de werkwijze van de uitvinding gezuiverde S-gesulfoneerde ^-globu-line in een concentratie van 5% een veel zwakkere anti-complementaire werking, met name 10% of minder, bezit dan 5 het nog niet gezuiverde produkt. Bij gebruik van een anioni-sche ionenuitwisselaar wordt voornoemde werking erg veel kleiner. Het gehalte aan het monomoleculaire bestanddeel neemt toe van 75-80% voor de zuivering tot 90-95% erna.

Bij de analyse met de ultracentrifuge doet het grootste 10 deel van de geagglutineerde moleculen nauwelijks mee, omdat het bij het centrifugeren direkt wordt neergeslagen, doch met de dunne laag chromatografie (op een dunne gel) blijken de geagglutineerde moleculen in polymeren en oligomeren te scheiden te zijn. De chromatografie stelt vast, dat het 15 gehalte aan monomeren toneemt van 60-70% voor de zuivering tot tenminste 85% erna. Bovendien toont de lichtverstrooiing aan, dat,.het volgens de uitvinding gezuiverde ^-globuline- 79 0 9 1 1 0 'ï' /!» -8- preparaat uiterst stabiel is, hetgeen hieruit blijkt, dat zelfs door schudden er geen neerslag ontstaat.

De uitvinding zal worden verduidelijkt aan de hand van de volgende niet beperkende voorbeelden, waarin 5 percentages betrekking hebben op gewichten, tenzij anders vermeld.

Voorbeeld I

Een oplossing van 248 g natriumtetrathionaat en ëën van 408 g natriumsulfiet in respectievelijk 1500 en 10 3500 ml NaCl houdend fosfaatbufferoplossing van pH 7,6 wor den, na door filtratie gesteriliseerd te zijn, aan 10 1 15%tige waterige oplossing van Qf~globuline toegevoegd, welke laatste oplossing is verkregen door menselijk bloedplasma met ethanol te fractioneren. Het geheel wordt ter sulfonering 15 langzaam 4,5 uur bij 43°C geroerd.

Het reaktiemengsel wordt dan aan dialyse tegen een fysiologische zoutoplossing onderworpen ter verwijdering van de overmaat sulfoneringsmiddel, waarna het gedialyseerde mengsel in evenwicht wordt gebracht met een eerste buffer-20 oplossing (μ = 0,06; pH 7,5).

De verkregen oplossing wordt op een proteifte-concentratie van circa 8% gebracht. 15 liter van de oplossing wordt door een kolom van 16 liter, gepakt met DEAE-Sepharose CL-6B (van Pharmacia), dat eveneens met de eerste . 25 bufferoplossing in evenwicht is gebracht, gevoerd ter verschaffing van 16 liter van een fractie (P-I) met circa 2% niet door de kolom geabsorbeerde proteine.

Door de kolom wordt, nadat deze zolang met de eerste bufferoplossing is uitgewassen, dat in de was-oplos-30 sing nauwelijks proteine kan worden aangetoond, een acetaat (tweede) bufferoplossing (p = 0,1; pH 4,0) gevoerd ter verschaffing van 32 liter van een fractie (P-II) met een proteineconcentratie van circa 2,5%.

De fracties worden elk, na met een waterige 35 NaOH-oplossing geneutrSliseerd te zijn, geconcentreerd tot de proteine-oplossing circa 5% wordt. De geconcentreerde oplossingen worden dan tegen een 2,25 %tige glycinehoudende isotonische fosfaatbufferoplossing gedialyseerd. Enige /©091 10 ·< -9- '«ί eigenschappen van de verkregen produkten op dezelfde wijze als die van de in tabel E getoonde getoonde produkten gemeten. De resultaten zijn in tabel B verzameld.

TABEL B

I ^

Voor Ra zuivering

zuivering P-I j P-XX

4 : “ π- ! | ! /irr | 50 24 52 I 4

c * 1 I

Gehalte aan mono- I moleculen 94 j c * i_ . Schud- '! | * \ bestandheid t 120 i 207 3 i

)-1_!_;_I

Uit de tabel blijkt, dat de fractie P-I een 5 sterke anti-conplementaire werking vertoont, veel geagglutineerde moleculen bevat en een slechte schudbestandheid bezit. Zulks in tegenstelling tot de fractie P-II met een voldoende zwakke anti-complementaire werking, hoog gehalte aan het monomoleculaire bestanddeel en zeer goede schud-10 bestandheid. De fractie P-I bevat dus geen componenten met ongewenste eigenschappen meer.

De scheidingspatroon van de fracties van voorbeeld I is in figuur 1 te zien, met op de abscis het fractie-nummer en op het ordinaat de optische densiteit van de frac-15 ties, gemeten bij een golflengte van 280 nm.

Van de oplossing van S-gesulfoneerd ^-globuline voor de zuivering (A), de fracties P-I (B) en P-II (C) worden analyses met een ultracentrifuge (X) en chromatogrammen op een dunne gel (Y) gemaakt. De patronen van de analyses 20 zijn in figuur 2 te zien. Voor de ultracentrifuge-analyses worden de proteine-oplossingen met een concentratie van 1,67% 50 min bij 60.000 o.p.m. gecentrifugeerd met de in- 79 0 9 1 1 0 -7

Ir -ιο- richting van Beckmann/ terwijl de dunne laag chromatogrammen volgens Migita zijn gemaakt (Annual Report of Inst. Virus Research, Kyoto Univ., 130 (1965)). In figuur 2 heeft a betrekking op een monomoleculaire stof (7S); b,c en d op 5 oligomeren (resp. 9S, 11S en 13S) en p op een polymeer. In figuur 2 is te zien, dat de analyse hetzelfde patroon vertoont, doch dat de dunne laag chromatografie hogere waarden voor de sterk geagglutineerde moleculen aangeeft dan de analyse met de ultracentrifuge, bij welke geen polymeer 10 wordt aangetoond. Beide tonen aan, dat de fractie P-I veel geagglutineerde moleculen en de fractie P-Il meer .enkelvoudige moleculen bevat.

Voorbeeld II

Een I5%tige waterige oplossing van -giobuline 15 wordt op dezelfde wijze als in voorbeeld. I verwerkt ter verschaffing van een S-gesulfoneerd ^-globuline-oplossing met een proteinegehalte van circa 7%. Circa '100 liter van de oplossing wordt gevoerd door een kolom van 150 liter, gepakt met DEAE-Sepharose CL-6B, dat in evenwicht is gebracht 20 met een citraatbufferoplossing (μ = 0,03; pH 7,5) ter verschaffing van 125 liter fractie P-I met circa 1,5% ongeabsorbeerde proteine.

Na op dezelfde wijze als in voorbeeld I te zijn uitgewassen wordt, de kolom geelueerd met een NaCl-bevat-25 tende glycine/HCl-bufferoplossing (ji = 0,55; pH 3,5) ter verschaffing van circa 245 liter fractie P-II met een proteinegehalte van circa 2%.

De verkregen fracties worden op dezelfde wijze verwerkt als in voorbeeld I en de eigenschappen daarvan 30 nagegaan. De resultaten zijn in tabel C opgenomen.

7909110 -11-

TABEL C

I « i * i voor Na zuivering

zuivering ρ_τ P-II

i i CF i i ^50 I : 25 | 58 5 c % ) | r ; t ' j ! · i i

Gehalte aan j ! ? i ! mono“ ï o? i 50 ! Q4 moleculen l i 50 { 94 c % i_1 [_I_

i i ~~T' I

! Schud- ! ! bestandheid | 137 238 J 3

Voorbeeld II

Op dezelfde wijze als in voorbeeld I, behalve dat een citraatbufferoplossing (p = 0,03; pH 7,5) wordt gebruikt in plaats van de fosfaat (eerste) bufferoplossing, 5 wordt circa 15 liter oplossing van S-gesulfoneerd Y-globuline met een proteinegehalte van circa 7% door een kolom van 16 liter, gepakt me£ DEAE-Sepharose CL-6B, gevoerd ter verschaffing van 15,6 liter fractie P-X met een proteinegehalte van circa 1,7%. Na goed uitgewassen te zijn wordt 10 de kolom dan geelueerd met een citraat (tweede) bufferoplossing (p = 0,614; pH 6,0) ter verschaffing van 31 liter fractie P-II met een proteinegehalte van circa 2,2%.

Voorbeeld IV

Voorbeeld III wordt herhaald, behalve dat een 15 fosfaatbufferoplossing (p = 0,06; pH 7,5), als eerste bufferoplossing wordt gebruikt, ter verschaffing van circa 14 liter fractie P-I met een proteinegehalte van circa 1,8%. Na goed uitgewassen te zijn wordt de kolom geelueerd met een glycine/zoutzuur (tweede) bufferoplossing (p = 0,542; pH 20 3,5) ter verschaffing van 29 liter fractie P-II met een proteinegehalte van circa 2,4%.

7909110 -12-

5P

Voorbeeld V

Voorbeeld III wordt herhaald, behalve dat een tris/zoutzuur (eerste) bufferoplossing (μ = 0,0175; pH 8,5) en een NaCl bevattende fosfaat (tweede) bufferoplossing 5 (ju = 0,45; pH 6,0) worden gebruikt ter verschaffing van 22 liter fractie P-I en 27 liter fractie P-II met een proteinegehalte van circa reëp. 1,2 en 2,6%.

Voorbeeld VI

Een op dezelfde wijze als in voorbeeld I ver-10 kregen waterige oplossing van S-gesulfoneerd i£-globuline wordt door dialyse in evenwicht gebracht met een acetaat-buffer (p = 0,05; pH 5,3), waarna de oplossing op een proteinegehalte van circa 7% wordt gebracht. 15 liter van de oplossing wordt door een.kolom van 16 liter, gepakt met 15 CM-Sepharose CL-6B (van Pharmacia), dat met dezelfde bufferoplossing in evenwicht is gebracht, gevoerd ter verschaffing van 13 liter fractie P-I met circa 1,9% doorgelaten proteïne.

Na op dezelfde wijze als in voorbeeld I uitgewassen te zijn wordt de kolom met een waterige oplossing 20 van natriumacetaat (p = 0,2) geelueerd ter verschaffing van 27 liter fractie P-II met een proteinegehalte van circa 2,5%.

De fracties worden op dezelfde wijze als in voorbeeld I verwerkt ter bepaling van de diverse eigenschap-25 pen. De resultaten zijn in tabel D verzameld.

TABEL D

Voor Ma zuivering

zuivering p-i P-II I

| _ | j I ch50 i i 25 32 8 c % ) ! i { i I !

Gehalte aan j | I mono- ! 83 48 ! 95 i moleculen ' ' | I ( % ) ; i i __ r I "Ί i Schud- I 102 ; 180 32 j ï bestandheid | [ j ! 7909110

Claims

1. Werkwijze voor het verschaffen van zuiver S-gesulfoneerde ^“globuline, met het kenmerk, dat S-gesulfo-neerde 2T~globuline in een eerste bufferoplossing met een ionenuitwisselaar wordt behandeld onder het absorberen van 5 het monomoleculaire S-gesulfoneerde ^globuline door de ionenuitwisselaar; en het elueren van de ionenuitwisselaar met een tweede bufferoplossing ter verschaffing van een oplossing met het monomoleculaire S-gesulfoneerde 0^-globuli-ne.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de ionanuitwisselaar anionisch is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de anionische ionenuitwisselaar bestaat uit een gel van anionische groepen bevattende agarose, dextran, 15 cellulose, polyvinyl of amylose, welke anionische groepen bestaan uit groepen diethylaminoethyl, triethylaminoethyl of diethyl-(2-hydroxypropyl)aminoethy1.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat als eerste bufferoplossing een bufferoplossing 20 met een pH van 4-10 en een ionensterkte van 0,01-0,15 wordt gebruikt.

5. Werkwijze volgens conclusies 2-4, met het kenmerk, dat als tweede bufferoplossing een bufferoplossing met een pH van 3-4 en een grotere ionensterkte dan die van 25 de eerste bufferoplossing wordt gebruikt.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de ionensterkte van de tweede bufferoplossing 0,05-0,8 bedraagt.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het 30 kenmerk, dat de ionenuitwisselaar cationisch is.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de cationische ionenuitwisselaar bestaat uit een gel van cationische groepen bevattende agarose, dextran, cellulose, polyvinyl of amylose, welke cationische groepen 35 bestaan uit groepen carboxymethy1, sulfopropyl of sulfo-ethyl. 7909110

9. Werkwijze volgens conclusie 7, met het -14- ’·? * _ ' kenmerk, dat als eerste bufferoplossing een bufferoplossing met een pH van 4-6/5 en een ionensterkte van 0,1-0,1 wordt gebruikt.

10. Werkwijze volgens conclusies 7-9, 5 met het kenmerk, dat als bufferoplossing een bufferoplossing met een pH van 6-9 en een grotere ionensterkte dan die van de eerste bufferoplossing wordt gebruikt.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de ionensterkte van de tweede bufferoplossing 10 0,05-0,8 bedraagt.

12. Gezuiverd S-gesulfoneerd ^-globuline met een hoog gehalte aan monomoleculaix bestanddeel en een zwakke anti-complementaire werking, verkregen met de werkwijze van conclusies 1-11. * 7909110