DE2732998A1

DE2732998A1 - Verfahren zur herstellung von serumalbumin

Info

Publication number: DE2732998A1
Application number: DE19772732998
Authority: DE
Inventors: Jun Charles Lewis; James Michael Schuck
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1976-07-22
Filing date: 1977-07-21
Publication date: 1978-01-26
Also published as: DE2732998C2; SU736861A3; SE442589B; RO72952A; BE856991A; CH633019A5; US4097473A; FR2358886A1; SE7708406L; JPS6034521B2; CA1069820A; HU175972B; ATA528677A; AU513473B2; IT1081299B; NL7708005A; AU2720177A; JPS5315414A; MX4620E; FR2358886B1

Description

DR. BERG DPL-ING. STAPF DIPL-ING. SCHWABE DR. DR. SANDMAIR

PATENTANWÄLTE

8 MÜNCHEN 86. POSTFACH 86 02

Anwaltsakte 28 229 ²¹· ^Jul1 !977

MONSANTO COMPANY ST.LOUIS / MISSOURI / USA

Verfahren zur Herstellung von Serumalbumin

Die Erfindung betrifft Blutfraktionen und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer Serumalbuminfraktion, das eine hohe Ausbeute und große Reinheit erbringt.

Albumin stellt die größte Blutplasmafraktion dar und findet in der medizinischen Therapie vielfache Anwendung, zum Beispiel bei der Schockbehandlung und als Plasmaexpander.

D/b. 11-21-0276

1108«| 4« 82 72 « München M), MauerkirihrrsiraUe 45 Banken: Bayerische Vereinsbank MOnchen 453100

9S7043 Tele»ramme: BERGSTAPFPATENT München Hypo-Bank München J890O02624

«13)10 TELEX: 05245*0 BERG d Pojtscheck München 65343-MM

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Die Blutfraktionierung mittels verschiedener Verfahren zur Gewinnung von Albumin und anderer abgetrennter Komponenten ist allgemein gebräuchlich. Eine wichtige handelsübliche Albuminfraktion, bekannt als normales Serumalbumin, ist eine osmotisch stabile Lösung einer stark gereinigten Plasmafraktion, die mindestens 96% Albumin enthält. Seine Gewinnung wurde weitgehend durch die Arbeit von Cohn und seiner Mitarbeiter an der Harvard Medical School möglich gemacht und seine Herstellung ist in den US-PSen 2 390 074 und 2 469 193, in J. Amer. Chem. Soc. 6j}, 469-475 (1946) und Kirk-Othmer, Encycl. of Chem. Tech. 2> 584-588 (2. Auflage 1964) beschrieben. In den USA wird für die Herstellung von normalem Serumalbumin z.Zt. vorzugsweise die sogenannte Methode 6 nach Cohn angewandt.

Eine weitere wichtige handelsübliche Albuminfraktion ist die sogenannte Plasmaproteinfraktion (PPF); sie ist eine Lösung einer Plasmafraktion, die mindestens 83% Albumin zusammen mit einem Gemisch von höchstens 17% o- und ß-Globulinen enthält. Die derzeit in den USA bevorzugte Methode zur Herstellung von PPF ist das in der US-PS 2 958 62 8 und in Vox Sang. _2» 174 (1957) beschriebene Verfahren nach Hink.

Bei diesen Verfahren zur Gewinnung des höher konzentrierten normalen Serumalbumins und des weniger konzentrierten PPF wird als Fällungsmittel in den Auftrennungsverfahren kaltes

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Äthanol verwendet. In verschiedenen anderen bekannten Verfahren für die Herstellung von Albuminfraktionen werden andere Fällungsmittel wie Äther, Methanol oder Ammoniumsulfatsalz verwendet, oder eine Adsorption an Gel oder Ionenaustauschchromatografie angewandt.

In letzter Zeit wurden für die Blutfraktionierung, einschließlich der Abtrennung von Albumin, verschiedene polymere Stoffe entwickelt, z.B. Polyäthylenglycol (PEG, Carbowax) gemäß US-PS 3 415 8OU; Mischpolymere aus Äthylenoxid und Polyoxypropylenpolymer (Pluronics) gemäß US-PS 3 850 903 und Deutsche Offenlegungsschrift 2 403 065; sowie bestimmte besondere Polyelektrolyte wie vernetzte Äthylen/Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerderivate gemäß US-PSen 3 554 9 85 und 3 555 001. Ein Vorteil bei der Verwendung dieser Polymere besteht darin, daß sie bei normaler Zimmertemperatur verwendet werden können, und die für das Cohn'sche Äthanolfraktionierungsverfahren notwendigen niedrigen Temperaturen vermieden werden. Die verschiedenen Polymer-Fraktionierungsverfahren sind zwar brauchbar für die Herstellung von PPF, sie erbrachten jedoch im allgemeinen nicht die optimale Ausbeute und Reinheit der mit dem kalten Äthanol-Verfahren gewonnenen normalen Serumalbuminfraktion.

Ein weiteres Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten Serumalbumins verwendet die selektive Denaturierung von Serumglobulinen ohne Denaturierung des Serumalbumins durch Er-

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hitzen in Gegenwart von Caprylat oder anderen Fettsäureanionenstabilisatoren, wie dies in den US-PSen 2 705 2 30 und 2 765 299, J. Biol. Chem. JJÜ, 181-198 (1946) und Blut .30, 121-134 (1975) beschrieben ist.

Dieses Verfahren ist zwar für die Herstellung von Albuminfraktionen des PPF-Typs brauchbar, es ist jedoch nicht allgemein für die Herstellung des stärker gereinigten Serumalbumins in hoher Ausbeute, und ohne daß die wertvollen Gammaglobuline zerstört werden, geeignet. Es wird im allgemeinen als Pasteurisationsstufe zur Erzeugung eines virusfreien Albuminproduktes ausgeführt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Serumalbuminfraktion mit hoher Ausbeute und großem Reinheitsgrad aus Plasma und anderen albuminhaltigen Blutfraktionen hergestellt, indem man diese mit einem Polymerharz, das eine hohe Albuminadsorptionskapazität besitzt, in Kontakt bringt, sie etwa 1 bis 4 Stunden auf 65 ⁰C bis 72 ⁰C erhitzt und dabei einen pH von etwa 5,0 bis 5,5 aufrechterhält. Dann wäscht man das Albumin selektiv bei einem pH von etwa 3,5 bis 4,5 aus der Harz-Proteinmasse aus. Die im Rahmen dieser Erfindung verwen deten Polymerharze sind wasserunlösliche, vernetzte PoIy- elektrolyt-Mischpolymere aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid, die anhängende funktioneile Dimethylaminopropylgruppen ent halten. Kombiniert man bei diesen Polyelektrolyt-Mischpoly- meren die Wärmebehandlung und die Schritte der Adsorption

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und Auswaschung, dann erhält man ein Albuminprodukt mit wesentlich höherer Reinheit und Ausbeute, als man sie getrennt bei Anwendung entweder der Wärmebehandlung oder der Adsorptions-Auswaschungsschritte erhält.

Das erfindungsgemäß hergestellte Serumalbumin kann aus Vollblut, Blutplasma und Serum oder deren albuminhaltigen Fraktionen gewonnen werden. Da die hier angewandte Wärmebehandlung dazu tendiert, die in dem behandelten Material vorhandenen Globuline zu denaturieren, ist es häufig angezeigt, zunächst bestimmte erwünschte Globulinfraktionen, wie z.B. die Gammaglobuline, vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu isolieren. Auch andere wertvolle Blutfraktionen, wie z.B. Gerinnungsfaktoren, AHF und Prothrombinkomplex, können von dem Plasmaausgangsmaterial abgetrennt werden, bevor das erfindungsgemäße Verfahren begonnen wird. Diese Fraktionen können mit den üblichen bekannten Verfahren abgetrennt werden.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten wasserunlöslichen, vernetzten Polyelektrolytmischpolymere sind Mischpolymere aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid, die anhängende funktioneile Dimethylaminopropylgruppen enthalten. Das Ausgangs-Mischpolymer aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid (EMA) kann z.B. durch Umsetzung von Äthylen und Maleinsäureanhydrid in Gegenwart eines Peroxidkatalysators in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden. Das Mischpolymer

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sollte vorzugsweise praktisch äquimolare Mengen des Äthylenrestes und des Anhydridrestes enthalten. Das EMA-Mischpolymer kann dann mit Methyliminobispropylamin umgesetzt werden, das zwei primäre Amingruppen besitzt und zu einem vernetzten EMA-Mischpolymer führt. Die erwünschten anhängenden funktionellen Dimethylaminopropylgruppen können dann in das vernetz te Mischpolymer durch eine Reaktion von Dimethylaminopropylamin mit Anhydridgruppen des EMA-Mischpolymers aufgenommen
werden. Das Polyelektrolytmischpolymer wird vorteilhafterwei se in das -HCl-SaIz umgewandelt, da es so besser verarbeitet werden kann.

Weitere Einzelheiter, über Herstellung und Struktur dieser
Polyelektrolytmischpolymere sind der US-PS 3 55H 9 85 zu entnehmen. Die Verwendung dieser Polyelektrolytmischpolymere
bei der Blutfraktionierung ist in der US-PS 3 555 001 beschrieben.

Ein für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugtes Polyelektrolytmischpolymer enthält etwa fünf Methyliminobispropylamin-Vernetzungsgruppen und etwa 90 anhängende funktioneile
Dimethylaminopropylamingruppen auf 100 Maleinsäureanhydrideinheiten in dem EMA-Mischpolymer.

Unerwarteterweise wurde gefunden, daß die obigen Polyelektro lytmischpolymere, verglichen mit bestimmten anderen Polyelek trolytmischpolymeren, die andere anhängende funktioneile

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Amingruppen besitzen, eine hohe Adsorptionskapazität für Albumin haben. So kann das hier beschriebene Polyelektrolytmischpolymer das gesamte in der Blutfraktion vorhandene Albumin praktisch vollständig adsorbieren, das nach Wärmebehandlung und selektiver Auswaschung dann mit über 90% Ausbeute und 94% Reinheit zurückgewonnen werden kann. Vergleichsweise adsorbierte ein ähnliches Polyelektrolytmischpolymer, das anhängende 2-(Aminoäthyl)-l-äthylpyrrolidingruppen besaß, nur etwa 22% Albumin, und die Auswaschung des adsorbierten Stoffes nach der Wärmebehandlung ergab ein Produkt mit nur etwa 67% Reinheit. Ein anderes ähnliches Polyelektrolytmischpolymer mit anhängenden 3-(Di-n-butylamino)-propylamingruppen adsorbierte einen größeren Anteil des Albumins, nach der Wärmebehandlung konnte jedoch kein Albumin ausgewaschen werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die oben beschriebenen Polyelektrolytmischpolymere mit Blutplasma oder Serum oder albuminhaltigen Blutfraktionen vermischt, und zwar vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 1% bis 5% MischpoVmer. Durch Einstellen des pH des Harz-Proteingemisches auf verschiedene Werte können ausgewählte Proteine zuerst entfernt werden. Bei einem pH von 5,5 bis 7,5 werden Albumin, α- und B-Globuline und Fibrinogen von dem Harz adsorbiert, während ein größerer Teil der Gammaglobuline nicht adsorbiert wird und aus dem Überstand für therapeutische Zwek-

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ke gewonnen werden kann. Diese anfängliche Abtrennung von Gammaglobulin wird vorzugsweise bei einem pH von etwa 6 durchgeführt. Ein Teil der adsorbierten α- und ß-Globuline und des Fibrinogens kann dann durch Einstellen des pH des Harz-Proteingemisches auf etwa 4,7 und Sammeln des desorbierten Oberstandes gewonnen werden. Das Harz-Proteingemisch kann dann auf einen pH von etwa 5,0 bis 5,5 eingestellt und etwa eine bis vier Stunden auf etwa 65 ⁰C bis 72 ^PC erhitzt werden. Vorzugsweise wird der pH auf etwa 5,2 bis 5,3 eingestellt und das Harz-Proteingemisch etwa 1 Stunde auf etwa 70 C erhitzt.

Während der Wärmebehandlung werden die restlichen Globuline, und zwar hauptsächlich die α- und ß-Globuline, denaturiert, während das Albumin nicht denaturiert wird und leicht gewonnen werden kann.

Anschließend an die Wärmebehandlung wird der pH auf etwa 3,5 bis 4,5 eingestellt, so daß man das gewünschte Albumin aus dem Harz-Proteingemisch auswaschen kann. Vorzugsweise wird das Harz-Proteingemisch vor der pH-Einstellung gekühlt und der pH wird dann auf etwa U eingestellt.

Die Albumingewinnung kann mit einer Reihe von Trennverfahren erfolgen, so z.B. durch Sedimentierung, Filtrierung oder Zentrifugierung, vorzugsweise jedoch durch Filtrieren des pH-eingestellten Harz-Proteingemisches, Waschen des Filterkuchens

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und Sammeln des Filtrats in Form der stark gereinigten Albuminfraktion.

Die Einstellung des pH auf den gewünschten Wert während des beschriebenen Verfahrens kann durch Behandlung mit sauren oder alkalischen Puffern, die klinisch verträglich sind, erfolgen, z.B. mit Natriumacetat-Essigsäurepuffer oder Zitronensäure zur Ansäuerung oder mit Natriumbicarbonat oder Natriumhydroxid zur Erhöhung der Alkalinität.

Vorzugsweise werden auch bekannte Albuminstabilisatoren wie Natriumacetyltryptophanat und Natriumcaprylat während der Wärmebehandlung in das Harz-Proteingemisch aufgenommen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

Das in diesem Beispiel verwendete Polyelektrolytpolymer bestand aus dem Harzreaktionsprodukt aus praktisch äquimolaren Mengen Äthylen und Maleinsäureanhydrid (EMA), war mit Methyliminobispropylamin (MIBPA) vernetzt und ferner mit Dimethylaminopropylamin (DMAPA) umgesetzt, so daß etwa fünf MIBPA-Vernetzungsgruppen und etwa 90 anhängende DMAPA-Gruppen pro 100 Maleinsäureanhydrideinheiten in dem EMA-Mischpolymer vorhanden waren; ferner war es in das HCl-SaIz umgewandelt. Zunächst wurde das Polyelektrolytmischpolymer in 0,04 mol/1 NaCl gewaschen. Plasma aus konserviertem menschlichen Blut

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wurde mit 3 Teilen Wasser auf 1 Teil Plasma verdünnt und dann mit 2 Gew.% des gewaschenen Polyelektrolytmischpolymers (2 g/100 ml) vermischt. Das Harz-Plasmagemisch wurde auf den pH 6 eingestellt, 30 Minuten gemischt, gefiltert und dann mit 0,002 mol/1 NaCl gewaschen. Das Filtrat, das vorwiegend aus Gammaglobulinen, ß-Globulinen, Fibrinogen und assoziierten Blutfaktoren bestand, wurde von dem verbleibenden Harz-Proteinfilterkuchen abgetrennt. Dieser Harz-Proteinfilterkuchen, der das adsorbierte Albumin enthielt, wurde auf den pH 5,2 angesäuert. Dem vom Harz adsorbierten Protein wurde soviel Natriumcaprylatstabilisator zugemischt, daß eine 0,012 mol/1 Konzentration entstand, ferner wurde NaCl bis zu einer 0,002 mol/1 Konzentration zugegeben. Das vom Harz adsorbierte Protein wurde dann 1 Stunde auf 70 ⁰C erhitzt, anschließend wurde das Material filtriert und das Filtrat beseitigt. Das Albumin wurde aus dem verbliebenen Harz-Proteinfilterkuchen durch Ansäuern mit Zitronensäure auf pH 4,0 in 0,002 mol/1 NaCl, anschließendes halbstündiges Mischen und Abfiltrieren ausgewaschen. Das Filtrat bestand aus der Albuminfraktion, die Ausbeute betrug 96,6% (bezogen auf die Albuminkonzentration im Originalplasma), die Reinheit lag bei 98,5%. Die Reinheit des Albumins des aus dem Harz ausgewaschenen Produkts wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese in einem Veronal-Puffer bei pH 8,6 mit einem Corning ACI Elektrophoreseapparat bestimmt. Bei dieser Bestimmung wurde ein Coomassie Brilliant Blue R 250 (CI. 42660) Färbeverfahren praktisch in Obereinstimmung mit dem von Fazekas de St. Groth et al. in

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Biochim. Biophys. Acta J7_l, 377-391 (1963) beschriebenen Verfahren angewandt, und für die Ablesungen wurde ein Gelman ACD-15 Densitometer bei 600 nm verwendet. Coomassie Brilliant Blue R 250 ist ein Proteinfärbemittel mit großer Sensitivität, das sich bis zu 20 pg/cm Cuvettenbreite nach dem Lambert-Beer'sehen Gesetz verhält und bis 0,5 pg/cm Cuvettenweite empfindlich ist. Aufgrund dieser Empfindlichkeit kann man Proteinverunreinigungen in dem Albuminprodukt in einem hohen Maß feststellen und die durchgeführte Messung bestätigt die Herstellung eines Albuminproduktes von großer Reinheit.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde als Ausgangsplasma ein von AHF befreites Plasma verwendet. Ausbeute und Reinheit des Albuminproduktes waren praktisch die gleichen wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde nach dem ersten Filtrieren und vor der Wärmebehandlung eine Zwischenstufe zur Entfernung von weiteren Globulinen und von Fibrinogen aus dem Plasma eingefügt. In dieser Zwischenstufe wurde der Harz-Proteinfilterkuchen aus der ersten Filtrierung mit Zitronensäure auf einen pH von 4,7 in 0,002 mol/1 NaCl eingestellt und 30 Minuten gemischt. Das Gemisch wurde fil-

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triert, gewaschen und anschließend der Wärmebehandlung und den nachfolgenden Schritten von Beispiel 1 unterzogen. Das Filtrat aus der Behandlung bei pH H,7 enthielt α- und ß-Globuline sowie Fibrinogen, die für verschiedene bekannte therapeutische oder diagnostische Zwecke zurückbehalten werden können. Ausbeute und Reinheit des endgültigen Albuminproduktes waren praktisch die gleichen wie in Beispiel 1.

Anschließend an die erfindungsgemäße Gewinnung des gereinigten Albuminproduktes kann das Albumin bis zu einem gewünschten Grad konzentriert und das konzentrierte Produkt kann auf einen physiologisch verträglichen pH und Elektrolytgehalt eingestellt werden; ferner kann es zur Viruszerstörung erhitzt und durch Filtrieren oder ähnliche Verfahren geklärt werden, so daß es klinisch brauchbar ist und die Bestimmungen des Bureau of Biologies für ein normales Serumalbuminprodukt erfüllt. Beispiele für brauchbare Konzentrationsverfahren, die verwendet wurden, sind 1. Lyophilisierung, mit nachfolgender Wiederauflösung bis zu einem gewünschten Grad, wie 5% oder 25%, und 2. Ultrafiltration.

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Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung einer Serumalbuminfraktion mit hoher Ausbeute und großem Reinheitsgrad aus einem Gemisch mit anderen Blutproteinkomponenten, dadurch gekennzeichnet , daß das Albumin-Proteingemisch mit einem Polymerharz, das aus der Gruppe wasserunlöslicher vernetzter Polyelektrolytmischpolymere aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid, die anhängende funktioneile Dimethylaminopropylgruppen enthalten, gewählt wird, bei einem pH von etwa 5,0 bis 5,5 und bei einer Temperatur von etwa 65 ⁰C bis 72 ⁰C etwa 1 bis U Stunden in Kontakt gebracht wird, und das Gemisch dann auf einen pH von etwa 3,5 bis 4,5 eingestellt wird, um das gewünschte Albumin selektiv daraus auszuwaschen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Polymerharz in einer Konzentration von etwa 1 bis 5 Gew.% des Albumin-Proteingemisches verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Polymerharz mit Methyliminobispropylamin vernetzt wird.

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709884/ 1054 OWGlNAL INSPl

k. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß das Polymerharz etwa 5 Methyliminobispropylamin-Vernetzungsgruppen und etwa 90 anhängende Dimethylaminopropylgruppen pro 100 Maleinsäureanhydrideinheiten enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der pH während der Wärmebehandlung bei etwa 5,2 bis 5,3 liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der pH während des Auswaschens bei
etwa 4,0 liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzei chnet , daß die Wärmebehandlung bei einer Temperatur von etwa 70 ⁰C durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Albumin-Proteingemisch Vollblut-Plasma ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Albumin-Proteingemisch eine von
AHF befreite Blutplasmafraktion ist.

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10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Albumin-Proteingemisch Blutplasma ist, das zuvor zur Entfernung von Gammaglobulin fraktioniert worden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß bei der anfänglichen Fraktionierung zur Entfernung von Gammaglobulin das Albumin-Proteingemisch mit dem Polymerharz bei einem pH von etwa 5,5 bis 7,5 in Kontakt gebracht und das nicht adsorbierte Material daraus als Gammaglobulinfraktion abgetrennt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß die anfängliche Fraktionierung bei einem pH von etwa 6,0 durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß in einem weiteren Schritt α- und JJ-GIobuline entfernt werden, wobei das adsorbierte Albumin-Proteingemisch auf einen pH von etwa 4,7 eingestellt und der desorbierte Überstand davon abgetrennt wird.

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