DE2636757C2

DE2636757C2 - Verfahren zum Aufkonzentrieren und Reinigen des Antihämophiliefaktors

Info

Publication number: DE2636757C2
Application number: DE19762636757
Authority: DE
Inventors: Edward Santa Ana Calif. Shanbrom
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1976-08-14
Filing date: 1976-08-14
Publication date: 1984-07-05
Also published as: DE2636757A1; CA1054052A; SE7609012L; GB1551928A; NL7609349A; NL177181B; AT349639B; JPS5910645B2; NL177181C; ATA611376A; JPS5326313A; SE448274B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufkonzentrieren und Reinigen des Antihämophiliefaktors (AHF oder Faktor VIII) durch selektive Ausfällung einer Lösung mit geringer lonenstärke in der Kälte. Zur Herstellung des für therapeutische Zwecke geeigneten Antihämophiliefaktors (Faktor VIII oder AHF bzw. AHG) sind verschiedene Verfahren beschrieben worden, beispielsweise die selektive Ausfällung, die absatzweise Absorption und Eiution, die Extraktion mit Medien mit geringer lonenstärke und die Chromatographie. Die am häufigsten für die Ausfällung eingesetzten Chemikalien schließen Alkohol, Gerbsäure, Ammoniumsulfat, Glycin und Polyäthylenglykol ein. Obwohl die Reinigung des Faktors VIII die Beseitigung einer Vielzahl von anderen Plasmaproteinen umfaßt, stellt Fibrinogen das wichtigste und am schwierigsten zu beseitigende dieser Proteine dar, insbesondere wenn es denaturiert ist, beispielsweise durch Ausfällen mit Alkohol oder durch Gefrieren und Auftauen. Dieses denaturierte Fibrinogen beeinträchtigt die Filtration des Faktors VIII, verursacht erhebliche Verluste des Faktors VIII während der Reinigungsschritte und vermindert die Löslichkeit des gefriergetrockneten Produktes in der für die Herstellung einer Lösung eingesetzten Flüssigkeit. Somit muß ein zufriedenstellendes Verfahren zur Reinigung des Faktors VIII in der Lage sein, erhebliche Mengen Fibrinogen zu entfernen. Die oben beschriebenen selektiven Ausfällungstechniken sind für diesen Zweck entwickelt worden, besitzen jedoch den Nachteil, daß sie entweder das Fibrinogen und den Faktor VIII denaturieren oder unerwünschte Verluste an dem Faktor VIII mit sich bringen.

Jene Methoden, bei denen lediglich eine Ausfällung in der Kälte ohne die Anwendung von Chemikalien (Kryopräzipitation) durchgeführt wird, sind auf Verfahren in kleinem Maßstab beschränkt, die üblicherweise in Blutbanken durchgeführt werden, und führen bei der therapeutischen Anwendung der Materialien zu hohen Fibrinogenspiegeln im Blut, eine Tatsache, die von gewissen Fachleuten als unerwünscht angesehen wird.

Die Verfahrensweisen, bei denen der Faktor VIII mit Hilfe von Puffern mit geringer lonenstärke aus dem Kryopräzipitat (bzw. dem in der Kälte ausgefällten Produkt) extrahiert wird, ergeben, obwohl sie zu einer gewissen Erniedrigung des Fibrinogengehalts des Endprodukts führen, Produkte mit einem noch unerwünscht hohen Proteingehalt, erfordern die Anwendung spezieller Vorrichtungen und Verfahrensweisen zum Zentrifugieren und sind in der Gesamtmenge des Faktors VIII, der ohne die Reinigung zu beeinträchtigen aus dem Kryopräzipitat extrahiert werden kann, beschränkt.

Weitere Probleme, die üblicherweise bei der großtechnischen Herstellung des Faktors VIII auftreten, sind die Verunreinigung des Endprodukts durch pyrogene Substanzen und Viren, die Hepatitis verursachen können (mit Hepatitis verbundenes Antigen, HAA). Durch chemische Ausfällungsmittel können diese unerwünschten Verunreinigungen noch weiter verstärkt werden.

Die Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, diese Probleme zu überwinden und ein Verfahren bereitzustellen, das nicht an den Nachteilen, die durch die Verwendung von chemischen Ausfällungsmitteln auftreten, leidet und das in einfacher Weise eine selektive Ausfällung des Fibrinogens und der davon abgeleiteten denaturierten und abgebauten Produkte in der Kälte ermöglicht. (Wenn im folgenden auf die Entfernung von Fibrinogen Bezug genommen ist, so ist hiermit die Entfernung von Fibrinogen und den davon abgeleiteten denaturierten und abgebauten Produkten gemeint.)

Diese Aufgabe wird nun durch das erfindungsgemäße Verfahren zum Aufkonzentrieren und Reinigen von Faktor VIII Antihämophiliefaktor unter Extraktion eines Kryopräzipitats bei Raumtemperatur mit einem wäßrigen Medium mit geringer lonenstärke gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Extrakt eine halbe Stunde oder mehr auf eine Temperatur von I⁰C bis 2°C abkühlt, die erhaltene überstehende Flüssigkeit abtrennt und

zur Langzeitlagerung des darin vorhandenen Konzentrats des Faktors VIII behandelt.

Die selektive Ausfällung von Fibrinogen ohne einen damit verbundenen Verlust des Faktors VIII ist bislang in einem praktischen Verfahren für die großtechnische Herstellung eines gereinigten Konzentrats des Faktors VIII nicht erreicht worden. In der Tat hebt Wickerhauser(M. Wickerhauser »Large scale fractionation of Factor VIII — Concentrate from cryoeihenol precipitate«, Thromb. Diath. Haemorrh. 43 (1971) 165) die Tatsache hervor, beim Extrahieren des Faktors VIII die Zeit und die Temperatur einzuschränken. »Etwas höhere Ausbeuten an bo dem Faktor VIII wurden durch längere Extraktion mit Tris-Puffer bei 30°C während mehr als 60 Minuten erzielt, wobei jedoch der Extrakt zunehmend mit zusammengeballtem Fibrinogen verunreinigt ist, das das Endkonzentrat schlecht filtrierbar macht. Andererseits wurden mit einer kürzeren Extraktionszeit oder bei niedrigerer Temperatur geringere und variable Ausbeuten an dem Faktor VlU erzielt«. Das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt nun ;ill diese Probleme, da ohne einen Verlust des Faktors VIII die gesamten überschüssigen Fibrinogenverunreinigungcn während des Abkühlcns entfernt werden.

Obwohl der Kühleffckt bereits von Hershgold et al. (E.). Hershgold. ).G. Pool und A. R. Papperhagen »The potent aniihemophilic concentrate derived from a cold insoluble fraction of human plasma; Characterization and further data on preparation and clinical trial« ). Lab. C'lin. Med. 67 (1966) 23) bemerkt worden ist, benötigten die

Autoren 18 bis 30 Stunden bei 4° C und erzielten oder empfehlen die beschleunigte und selektive Ausfällung des Fibrinogens und der Isohämagglutinine bei der niedrigeren Temperatur von O¹³C bis 2°C nicht. (In der Tat haben Hershgoid et al. in einer späteren Arbeit, die sich mit der Bildung von sehr stark gereinigtem Faktor VIII befaßt, vollständig auf die Kühlstufe verzichtet (E. J. Hershgoid, A. M. Davison und M. E. Janzen »Isolaiion and some chemical properties of human Factor VIII (antihemophilic factor)« J. Lab. Clin. Med. 77 (1971) 185.) Hershgoid et aL (siehe die erstgenannte Literaturstelle) geben zu, daß sie nicht in der Lage waren, ein therapeutisch geeignetes Konzentrat herzustellen, das ohne weiteres einer Stcrilfiltration unterzogen werden kann und daß sie weitere Schritte, wie die Ausfällung mit Alkohol oder Glycin, durchführen mußten. Angesichts dieser enttäuschenden Ergebnisse, über die Hershgoid und andere Autoren berichtet haben, erscheinen die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielten drastischen Verbesserungen als äußerst überraschend.

James und Wickerhauser (H. L. James und M. Wickerhauser »Development of large scale fractionation methods« Vox Sang. 23 (1972) 402) führen zwar aus: »Weiterhin muß die Methode bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um die Ausfällung des Fibrinogens zu vermeiden«, waren jedoch nicht in der Lage, irgendein Verfahren zu entwickeln, mit dem man auf der Grundlage der Prinzipien der vorliegenden Erfindung ein Konzentrat des Faktors VIII bereiten kann. Das Endprodukt, das diese Autoren erhielten, wurde mit sehr viel geringerer Ausbeute und mit niedrigerer Reinheit im Vergleich zu dem erfindungsgemäß erhaltenen Produkt gebildet. Eine weitere Behandlung mit Polyäthylenglykol (PEG) zur Entfernung des Fibrinogens und zur Steigerung der Reinheit führte zu noch stärkeren Verlusten des Faktors VIII (siehe die Literaturstelle M. Wickerhauser (Thromb. Diath. Haemorrh. 43 (1971) 165) und J. T. Sgoüris und M. Wickerhauser »Use of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concentrate« Transfusion 13 (1973) 399).

Es ist somit zu erkennen, daß andere Autoren angenommen oder aufgrund ihrer Erfahrungen geschlossen haben, daß keine besondere Verbesserung der Ergebnisse zu erwarten ist, wenn man bei der Ausfällung und Abtrennung von Fibrinogen nur geringfügig niedrigere Temperaturen und dies bei einer sehr kurzen Ausfällzeit, anwendet. Die unerwarteten und überraschend verbesserten Ergebnisse, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich sind, stehen somit im Gegensatz zu den Lehren und Vorschlägen des Standes der Technik.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit spezifisch geeignet zur großtechnischen Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII. Das wesentliche Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die selektive Ausfällung in der Kälte von übermäßigen Mengen von Fibrinogen, denaturiertem Fibrinogen und Fibrinogenabbauprodukten aus einer Lösung mit geringer lonenstärke, ohne daß hierbei Chemikalien zugesetzt werden müssen und ohne daß ein unerwünschter Verlust der Aktivität des Faktors VIII auftritt. Dadurch wird eine überraschend hohe Ausbeute erreicht, mit der der Faktor VIII erhalten wird, die etwa 25 bis 40% der theoretischen Plasmamenge beträgt. Im Vergleich zu anderen Produkten ist trotz der hohen Rückgewinnung des Faktors VIII der Proteingehalt zusätzlich um 50 bis 75% erniedrigt. Dies wird durch die folgende Tabelle I verdeutlicht. Das Bedürfnis für ein mit hoher Ausbeute erhaltenes, hochreines, gefriergetrocknetes Konzentrat des Faktors VIII ist international anerkannt (»Recent Advances in Hemophilia« Ann. N. Y. Acad. Sei. 240(1975) 1 —426; J. H. Pool »Recent chapters in the Factor VIII saga: perils of a protein« West. J. of Med. 122(1975)406), wobei es allgemein geläufig ist, daß die kommerziellen Konzentra te im allgemeinen weniger als 20% des theoretisch in dem Plasma vorhandenen Faktors VIII enthalten (Ann. N. Y. Acad. Sei. 240 (1975) 1 -426, West. J. of Med. 122 (1975)406 und L. F. Fekete und S. L. Holst »Stabilization of AHF using Heparin«, U. S. Patent No. 38 03 115,9. April 1974).

<

Tabelle I¹)

Einige Eigenschaften von Konzentraten des Faktors VIII²)

Produkt	Einheiten	gesamtes ver	Gesamt	Gesamt-	Gesamt-	Gesamt	Gesamt	Gesamt	Quelle	K) σ>
	des Faktors	abreichtes	einheiten	fibrinogen-	protein-	natrium	chlorid	kosten
	Vlll/ml	Volumen	des Faktors	gehalt	gehalt	gehalt	gehalt	(Dollar)		σ>
		(ml)	VIII	(g)	(g)	(mÄq)	(mÄq)
(1) Frisches gefrorenes Plasma	0,5	8000	4000	8,0	240	1200	800	400	Blutbank	t ti
(2) Kryopräzipitat	10³)	400	4000	4,0	2C	40	40	400	Blutbank	Wi
(3) Faktorat	10	400	4000	0,8	14	96	80	480	Armour- Pharmaceutical
(4) Faktor VIII	10	400	4000	-⁴)	20	80	48	480	Abbott-Labcratory
(5) Hemofil	25	160	4000	1,0	5,6	25	20	528	Hyland
(6) Faktor VII!⁵)(erfindungsgemäß)	10	400	4000		6,0				Shanbrom
(7) Faktor VI11⁶)(erfindungsgemäß)	10	400	4000		2,0				Shanbrom

') Diese Tabelle stammt, mit Ausnahme der Angaben hinsichtlich »Shanbrom« aus dem Artikel von Robert T. Breckenridge »Recent Advances in Hemophilia«, Ann. N. Y. Acad. Sciences 240 (1975) 165 bis 171. Die Shanbrom-Ergebnisse stammen von der Anmelderin.

²) Diese Zahlen basieren auf den Erfahrungen des Hemophilia Center of Rochester and Monroe County und sind als Gesamtmenge ausgedrückt, die erforderlich ist, einen Patienten mit einem Gewicht von 70 kg mit einer Einheit pro Milliliter zu behandeln. Es wird dabei von einer in vivo-Rückgewinnung von 80% ausgegangen.

³) Variabel, jedoch üblicherweise zwischen 7 bis 12 μ/ml.

⁴J Wegen einer Ausfällung bei 37° C ist die Bestimmung des Fibrinogens nicht möglich.

⁵) Einstufengewinnung ohne weitere Ausfällung.

⁶) Weitere Ausfällung mit Hilfe eines Polyols.

Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel

Man taut gefrorenes Plasma, beispielsweise 100 bis 3000 I, von etwa —5"C auf etwa +2"C auf und bringt das ·> Material in einen geeigneten Tank oder ein geeignetes Gefäß ein. Größere Volumina können ebenfalls verarbeitet werden, wobei sich jedoch die Verfahrensmaßnahmen erschweren. Die in der Kalte unlösliche Fraktion (Kryopräzipitat) wird bei weniger als 3"C abgetrennt, vorzugsweise unter Anwendung von kontinuierlich betriebenen Zentrifugen (Sharpless oder ähnliche Zentrifugen). Man kann das Material auch mit anderen Methoden gewinnen, die jedoch weniger wirksam sind. Das Kryopräzipitat wird gewogen und dann mit einer geringen Menge von destilliertem, pyrogenfrciem Wasser unter Bildung einer Aufschlämmung oder einer Emulsion vermischt, wozu man das Material vorzugsweise während einiger Sekunden in einer Mischeinrichtung (Waring-type blender) durchrührt. Die Aufschlämmung wird dann mit etwa 2 bis etwa 3 Volumen destilliertem, pyrogenfreiem Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 während etwa 30 bis etwa 60 Minuten nach dem Erwärmen auf 20°C bis 30^cC extrahiert. Dann gibt man Aluminiumhydroxidgel in einer Menge von 10 bis 30 ml/l zu und läßt die Absorption während 15 Minuten ablaufen. Zu einer weiteren Reinigung kann man 0,5 bis 2,0Gew.-% Tricaiciumphosphat zusetzen und die Menge des Aiuminiumhydroxids vermindern. Diese Maßnahmen unterstützen die Abtrennung der Lipide, der denaturierten Proteine und des Prothrombinkomplexes. Die gesamte Behandlung erfolgt in einem mit einem Mantel ausgerüsteten Reaktionsgefäß unter ständigem Rühren, wobei Sorge dafür getragen wird, daß das Material nicht schäumt. Der Gefäßinhalt wird dann während einer halben Stunde bis 2 Stunden auf eine Innentemperatur von 1 bis 2°C abgekühlt. Der gebildete voluminöse Niederschlag wird durch kontinuierliche Zentrifugation (beispielsweise mit Hilfe einer Sharpless-Zentrifuge) abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 0,02 molarem Trinatriumcitrat und 0,1 molarem Glycin bei einer Temperatur von 20 bis 25^CC stabilisiert, worauf man den pH-Wert mit Zitronensäure auf 7,0 einstellt. Die Lösung wird dann geklärt und sterilisiert, indem man die Flüssigkeit durch 293 mm Millipore-Membranfilter (oder äquivalente Patronenfilter) führt, die typischerweise Poren mit Durchmessern von 1,2, 0,65, 0,45 oder 0,3 μιη aufweisen. Die erhaltene sterile Lösung, die etwa 25 bis 40% des in dem als Ausgangsmaterial eingesetzten ursprünglichen Plasmas enthaltenen Faktors VIII enthält, wird dann in üblicher Weise zur Verbesserung der Lagerfähigkeit gefriergetrocknet.

Man kann das Verfahren auch abwandeln, insbesondere durch die Anwendung von erneut gefrorenem Kryopräzipitat oder Varianten der Cohn-Fraktion, obwohl in diesem Fall die Ausbeute an dem Faktor VIII erniedrigt wird und von der Konzentration dieses Materials in dem Ausgangsmaterial abhängt. Die Extraktion des Faktors VIII kann auch mit Hilfe von anderen Puffern mit geringer lonenstärke, wie Tris-Puffer, durchgeführt werden. Die Kühlzeit kann ebenfalls variiert werden und kann verlängert oder wiederholt angewandt werden, wobei eine weitere Zusammenballung des Fibrinogens erfoigt. In ähnlicher Weise kann man die bei dem Verfahren angewandte Extraktionszeit auf bis zu 24 Stunden verlängern.

Das erhaltene Produkt kann während längerer Zeitdauern und mindestens während eines Jahres bei +5°C gelagert werden und mit destilliertem Wasser oder eine physiologischen Salzlösung in eine für die therapeutische Anwendung geeignete Form gebracht werden. Wegen seines relativ niedrigen Fibrinogengehalts und seinem höheren Albumingehalt löst sich das Material sehr schnell. Da beginnend von dem Zeitpunkt, da die Plasmabehälter geöffnet werden, die gesamte Behandlungszei; im Vergleich zu den anderen Herstellungsmethoden sehr kurz ist. wird das Bakterienwachstum ebenfalls stark eingeschränkt. Durch die Tatsache, daß die Extraktion in destilliertem Wasser erfolgt, werden die Mengen, in denen sich Fibrinogen und ;«-Globuline lösen, vermindert. Durch Abkühlen auf 2⁰C wird eine selektive Ausfällung von überschüssigem Fibrinogen und den davon abgeleiteten denaturierten und abgebauten Produkten und der lsohämagglutinine (Makroglubuline) erreicht, ohne daß ein merklicher Verlust des Faktors VIII auftritt. Zusätzlich schließt der flockige, voluminöse Fibrinogen-Niederschlag offensichtlich vorhandenes pyrogenes Material ein und vermindert die Mengen des Hepatitis verursachenden Antigens (HAA oder Hepatitisvirus). Dies führt insgesamt zu einem Produkt, das im Vergleich zu Plasma um den Faktor 30 bis 60 gereinigt ist und einen sehr geringen Gehalt an Fibrinogen und »Sa!z«-Isohämagglutininen aufweist. Gewünschtenfalls kann dieses Produkt in üblicher Weise oder mit Hilfe neuer Verfahrensweisen weiter gereinigt und aufkonzentriert werden. Gemäß einem Beispiel für eine solche neue Verfahrensweise kann man den Faktor VIII mit extrem hoher Reinheit mit Hilfe einer zusätzlichen Verfahrensstufe herstellen, gemäß der man 3 bis 6% eines Polyols (Polyäthylenglykol oder ein Λ-Hydroxy-iy-hydroxy-polyioxyäthylenJ-polyioxypropylenJ-polyioxyäthylenJ-Blockcopolymeres (Pluronic der Firma BASF-Wyandotte Corp.: »The Wonderful World of Pluronic Polyols, (1971)) zusetzt und dann das Material erneut während 55 ■-:

1 bis 2 Stunden auf 0° C bis 2° C kühlt Hierzu sei auf das Produkt 7 der obigen Tabelle I hingewiesen. Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß man in weniger als 8 Stunden extrem reinen ί

Faktor VHl herstellen kann, im Vergleich zu den um den Faktor 2 bis 3 längeren Behandlungszeiten, die bei den £

herkömmlichen Verfahren erforderlich sind. f

Das obige Beispiel steht für eine besonders bevorzugte optimale Ausführungsform des erfindungsgemäßen 60 i

Verfahrens. Es versteht sich jedoch, daß man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch übliche Verarbei- |

tungstechniken und Materialien anwenden kann. Obwohl es beispielsweise im allgemeinen nicht wirtschaftlich §

ist von weniger als etwa 100 1 Plasma oder einem aus dieser Plasmamenge gewonnenen Kryopräzipitat auszuge- J

hen, ist es unkritisch, entweder größere oder kleinere Volumina und demgegenüber Veränderungen von etwa |

50% durchzuführen, ohne daß hierdurch die erzielten Effekte beeinträchtigt wurden. Die in dem obigen Beispiel 65

angegebenen Verfahrensweisen werden unter Anwendung gut bekannter und leicht zugänglicher Vorrichtun- |

gen durchgeführt wie der Sharpless-Zentrifuge, dem Waring-Blender etc, obwohl jedoch ersichtlich ist daß *J

diese Schritte als solche, abgesehen von dem erfindungsgemäßen Prinzip, und die angewandten Vorrichtungen %

nicht kritisch sind, so daß in Abhängigkeit von dem vorhandenen Personal, den vorhandenen Vorrichtungen etc. erhebliche Variationen angewandt werden können. Die bekannte Adsorption an Aluminiumhydroxid ist erfindungsgemäß nicht kritisch. Man kann demzufolge auch andere Adsorbentien etc. verwenden oder den gleichen Zweck mit Hilfe einer äquivalenten Maßnahme erreichen oder auch ganz darauf verzichten. Nachdem man die den Faktor VIII in hoher Ausbeute enthaltende überstehende Flüssigkeit gewonnen hat, wird sie in üblicher Weise zum Zwecke der Lagerung und der späteren Verwendung behandelt, das heißt durch eine übliche Sterilfiltration geklärt und sterilisiert, zur Einengung des Faktors VIII auf ein kleines, leicht lagerfähiges Volumen gefriergetrocknet und bei der Verwendung unter Anwendung üblicher Flüssigkeiten, beispielsweise pyrogenfreiem Wasser oder physiologischer Salzlösung, wieder aufgelöst.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zum Aufkonzentrieren und Reinigen von Faktor VIII (Antihämophiliefaktor) unter Extraktion eines Kxyopräzipitats bei Raumtemperatur mit einem wäßrigen Medium geringer Ionenstärke, dadurch gekennzeichnet, daß man

den Extrakt '/2 Stuiide oder mehr auf eine Temperatur von 1 bis 2"C abkühlt die erhaltene überstehende Flüssigkeit abtrennt und zur Langzeitlagerung des darin vorhandenen Konzentrats des Faktors VIII behandelt.