DE2949065C2

DE2949065C2 -

Info

Publication number: DE2949065C2
Application number: DE2949065A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Ageo Saitama Jp Gushima; Shunichi Omiya Jp Watanabe; Takeshi Tokio/Tokyo Jp Saito; Toshio Toda Saitama Jp Sasaki; Hideo Omiya Saitama Jp Eiki; Yoshihiko Kawagoe Saitama Jp Oka; Takashi Tokio/Tokyo Jp Osono
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1978-12-12
Filing date: 1979-12-06
Publication date: 1990-08-23
Also published as: GB2037764B; FR2444041A1; JPS5579394A; DE2954638C2; JPS5931517B2; US4410626A; DE2949065A1; ES486832A0; GB2037764A; IT7969378A0; FR2444041B1; US4259326A; IT1119970B; ES8107309A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 7α-Methoxycephalosporinderivaten der allgemeinen Formel

worin R₁ eine α-Aminocarboxymethylgruppe bedeutet und R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Sulfogruppe darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces oganonensis ATCC 31167 in Gegenwart oder in Abwesenheit von Hydroxyzimtsäure gezüchtet werden, die so erhaltenen 7-Methoxycephalosporinderivate der Formel

isoliert werden und nötigenfalls die Hydrolyse des Schwefelsäureesters in üblicher Weise und in gewünschter Reihenfolge ausgeführt wird.

Die nach dem Verfahren erhaltenen Produkte können als Antibiotika aufgrund ihrer hohen antibakteriellen Aktivitäten verwendet werden. Weiterhin sind die Verfahrensprodukte als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer 7α-Methoxycephalosporinderivate geeignet.

Auf dem Gebiet der Cephalosporinchemie ist es bekannt, daß die Verbindungen mit einer 7α-Methoxygruppe den Vorzug besitzen, daß sie ihre antibiotischen Aktivitäten für einen langen Zeitraum behalten, ohne die Aktivitäten zu verlieren, da sie resistent gegen β-Lactamasen sind. Daher ist ihr Gebrauchswert sehr hoch. Verschiedene Arten von 7α-Methoxycephalosporinderivaten werden durch den Fortschritt der Studien über diese Derivate erhalten. Es wird dadurch möglich, diese Derivate wirksam gegen verschiedene Infektionskrankheiten zu verwenden, die bisher unzureichend behandelt werden konnten. Für die Entwicklung von 7α-Methoxycephalosporinverbindungen, die bessere wirksame Aktivitäten aufweisen, hat ein Bedarf bestanden. In dieser Situation werden Verbindungen mit einer 5-Amino-5-carboxyvaleramidogruppe oder 4-Carboxybutyramidogruppe in der 7β-Position und einer α-Methoxy- p-hydroxycinnamoyloxymethylgruppe oder α-Methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethylgruppe in der 3-Position (abgekürzt als 810A in US-PS 39 14 157) und die Verbindung mit einer 5-Amino-5- carboxyvaleramidogruppe oder 4-Carboxybutyramidogruppe in der 7b-Position und einer heterocyclischen Thiometylgruppe in der 3-Position (DE-OS 26 57 599) durch Fermentationsmethoden erhalten. Diese Verbindungen besitzen ausgezeichnete antibakterielle Aktivitäten. Für die Entwicklung von weiteren Verbindungen mit noch besseren ausgezeichneten antibakteriellen Aktivitäten hat weiterhin ein Bedürfnis bestanden.

Als Ergebnis von verschiedenen Untersuchungen haben die Erfinder gefunden, daß die neuen 7a-Methoxycephalosporinderivate der allgemeinen Formel I

worin R₁ eine α-Aminocarboxymethylgruppe bedeutet und R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Sulfogruppe bedeutet, ausgezeichnete antibakterielle Aktivitäten aufweisen, insbesondere antibakterielle Aktivitäten gegen gramnegative Bakterien, wodurch eine Aufgabe dieser Erfindung gelöst worden ist. Die Verbindungen der Formel I besitzen eine charakteristische Eigenschaft in bezug darauf, daß sie eine Sulfooxy- oder Hydroxycinnamoyloxymethylgruppe in der 3-Position aufweisen und als Antibiotika verwendbar sind. Auch sind die Verbindungen der Formel I in völlig unerwarteter Weise stabil im Vergleich mit der zuvor beschriebenen bekannten Verbindung 810A mit einer α-Methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethylgruppe oder einer α-Methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethylgruppe in der 3-Position. Deshalb kann die Isolierung der Verbindungen der Formel I aus der Fermentationsbrühe und die Reinigung dieser Verbindungen leicht ohne Auftreten einer Herabsetzung in der Ausbeute ausgeführt werden, die durch Zersetzung der Produkte während der Stufen ihrer Isolierung und Reinigung auftreten könnten.

Weiterhin haben die Verbindungen der Formel I den unerwarteten Vorteil, daß die Stabilität der Cinnamoyloxymethylgruppe in der 3-Position während den Arbeitsstufen ihrer Isolierung und Reinigung dennoch nicht die Überführung der genannten Gruppe in eine substituierte Thiomethylgruppe in der 3-Position durch Umsetzen der Verbindungen mit einer Thiolverbindung behindert. Als Thiol ist z. B. ein heterocyclisches Thiol, wie Methyltetrazol-5-thiol, 5-Methyl-1,3,4-thiadiazol-2-thiol etc, geeignet. Dadurch können verschiedene neue oder bekannte Arten von 7α-Methoxycephalosporinen in großen Mengen hergestellt werden, indem zuerst 7α- Methoxycephalosporinderivate der Formel I durch das Verfahren dieser Erfindung, wie noch später beschrieben wird, hergestellt werden, dann wird die Cinnamoyloxymethylgruppe in der 3-Position in eine substituierte Thiomethylgruppe überführt und weiter wird eine andere Acylaminogruppe in deren 7β-Position eingeführt.

Die 7α-Methoxycephalosporinderivate mit einer heterocyclischen Thiomethylgruppe in der 3-Position können durch das in der DE-OS 26 57 599 beschriebene Verfahren erhalten werden, jedoch benötigt die dort beschriebene Methode die Untersuchung und Modifizierung der Fermentationsbedingungen gemäß den Eigenschaften der Thiolverbindung, die bei der Fermentation benutzt wird. Andererseits können 7α-Methoxycephalosporinverbindungen mit verschiedenartig 3-substituierten-Thiomethylgruppen leicht in großen Mengen aus den 7α-Methoxycephalosporinderivaten der Formel I hergestellt werden, die stabiler sind als die in der US-PS 39 14 157 beschriebenen Verbindung durch Überführung der Cinnamoyloxymethylgruppe in der 3-Position in eine gewünschte substituierte Thiomethylgruppe durch ein chemisches Verfahren.

Es ist bemerkenswert und von speziellem Interesse, daß solche Zwischenprodukte, bei denen Substituenten der Verbindungen der Formel I in der 3-Position und 7β-Position des Cephalosporinringes sind, leicht in andere verschiedene Substituenten durch übliche Methoden überführt werden können. Als Verbindungen, die durch Einführen in Verbindungen der Formel I hergestellt werden, werden Serien von Cephalosporinderivaten mit einer 1-Methyltetrazol-5- ylthiomethylgruppe in der 3-Position und eine 1,3,4-Thiadiazol- 2-ylthioacetamidogruppe, eine Cyanomethylthioacetamidogruppe, eine Trifluormethylthioacetamidogruppe, eine {4-(Carbamoylcarboxymethylen)-1,3-dithietan-2-yl}-carboxamidogruppe, eine 4-Carboxy-3-hydroxyisothiazol-5-ylthioacetamidogruppe etc., in der 7β-Position genannt. Der Austausch der Substituenten in der 3-Position und der 7β-Position kann in jeder gewünschten Reihenfolge durchgeführt werden.

Der Austausch des Substituenten in der 3-Position wird durchgeführt durch Umsetzen der Verbindung der Formel I oder deren Salz oder ihrer 7β-substituierten Verbindung mit 1-Methyltetrazol-5- thiol oder deren Alkalimetallsalz in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel, z. B. Aceton, Dimethylformamid, Acetonitril, Methanol, Äthanol etc. oder ihrer Mischung bei etwa neutraler Bedingung oder alternativ in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, in Gegenwart von Bortrifluorid oder deren Komplexverbindung. Auch kann der Austausch des Substituenten der 7β- Position durch Umsetzen der Verbindung der Formel I oder deren 3-substituierten Verbindung zuerst mit einem Halogenierungsmittel, wie z. B. Phosphorpentachlorid, und dann mit einem niederen Alkohol, z. B. Methanol, bei -50°C bis -20°C in Gegenwart einer Base in einer Menge von 2,5 bis 3,5 Molen pro Mol des Halogenierungsmittels erfolgen, um eine entsprechende Iminoätherverbindung zu bilden und dann durch Reaktion des Produktes mit 1,3,4-Thiadiazol-2-ylthioessigsäure, Cyanomethylthioessigsäure, Trifluormethylthioessigsäure, 4-Carboxy-3-hydroxyisothiazol-5-ylthioessigsäure, 4-(Carbamoyl-carboxymethylen)-1,3-dithietan-2-carbonsäure oder deren reaktivem Derivat ausgeführt werden.

Als in dieser Erfindung benutzter Stamm ist der Actinomyces, Streptomyces oganonensis Saito und Osono Y-G19Z Stamm zuvor als ATCC No. 31 167 isoliert und durch die Erfinder hinterlegt worden. Wenn die Züchtung ohne Zugabe von Hydroxyzimtsäure unter Verwendung des Stammes durchgeführt wird, wird die gewünschte Verbindung I₁, worin R₂ eine Sulfogruppe darstellt, erhalten, aber wenn die Züchtung unter Zugabe von Hydroxyzimtsäure ausgeführt wird, wird die Verbindung, die das Additiv enthält, erhalten.

Die Züchtung wird nach den herkömmlichen Züchtungsverfahren für Mikroorganismen ausgeführt, aber submerse Züchtung in einem flüssigen Kulturmedium wird gewöhnlich vorzugsweise angewendet. Jedes Kulturmedium, welches Nährstoffe für 7α-Methoxycephalosporin-Antibiotika herstellende Stämme, gehörend zum Genus Streptomyces, enthält, kann verwendet werden, Synthetische Kulturmedien, semi-synthetische Kulturmedien oder natürliche Kulturmedien werden verwendet. Als Komponente für das Kulturmedium sind Glukose, Saccharose, Mannit, Glycerin, Dextrin, Stärke, vegetabiles Öl etc. als Kohlenstoffquelle geeignet. Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsaatmehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Maisquellwasser, Trockenhefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und andere organische oder anorganische Stickstoffquellen sind als Stickstoffquellen geeignet. Auch, falls erforderlich, werden Metallsalze, z. B. Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate, Phosphate etc. von Na, K, Mg, Ca, Zn, Fe etc. zu dem Kulturmedium zugegeben; weiterhin kann, falls erforderlich, ein Material zur Begünstigung der Produktion von Antibiotika und Entschäumungsmittel, z. B. Methionin, Cystein, Cystin, Methyloleat, Schmalzöl, Silikonöl, ein oberflächenaktives Mittel etc., in geeigneter Weise verwendet werden.

Unter Bezug auf die Züchtungsbedingungen ist es allgemein wünschenswert, unter aeroben Bedingungen zu züchten. Die Züchtungstemperatur liegt vorzugsweise bei etwa 18°C bis etwa 35°C, bevorzugter bei etwa 30°C, und gute Resultate werden erhalten, wenn das pH des Kulturmediums bei etwa 5 bis 10, vorzugsweise etwa 6 bis 8 gehalten wird. Die Züchtungsperiode der Zeit hängt von der Zusammensetzung des Kulturmediums und der Kultivierungstemperatur ab, aber sie beträgt im allgemeinen etwa 3 bis 10 Tage.

Zur selektiven Erhöhung der Produktionsmenge an der Verbindung I₁ ist es wirksam, z. B. 4-Hydroyzimtsäure

zu dem Kulturmedium zuzugeben. Das Additiv wird zu dem Kulturmedium als solches oder als dessen Salz in einer Menge von 0,1-5 mg/ml, vorzugsweise 0,5- 2 mg/ml, als Einzelgabe vor der Kultivierung oder zu verschiedenen Zeiten bei Beginn der Kultivierung hinzugegeben.

Zur Isolierung des gewünschten Produktes aus der Kulturbrühe werden die üblichen Verfahren zur Isolierung von Antibiotika aus Kulturbrühen der verwendeten Mikroorganismen angewendet. Verbindung I₁ ist hauptsächlich in der Kulturbrühe enthalten. Nach Entfernen des Mycels aus der Kulturbrühe durch zentrifugale Abtrennung oder Filtration wird die gewünschte Verbindung aus dem Filtrat extrahiert. Das gewünschte Produkt wird abgetrennt, gesammelt und nach den für das Isolieren und Gewinnen von Antibiotika üblichen Verfahren gereinigt, wie z. B. durch Ausnützen der Differenzen in der Auflösung oder Löslichkeit in geeigneten Lösungsmitteln, Differenzen in den Abscheidungseigenschaften oder Abscheidegeschwindigkeiten aus Lösungen, Differenzen in adsorptiven Affinitäten gegenüber verschiedenen Absorbentien oder Differenzen in der Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen. Diese Methoden können, falls erforderlich, einzeln oder in geeigneter Kombination verwendet werden oder sie können wiederholt angewendet werden.

Die so isolierte Verbindung I₁ ist ausschließlich eine Verbindung mit einer Sulfooxycinnamoylgruppe

in der Seitenkette der 3-Position des Cephalosporinringes. Um die entsprechende Verbindung I₁ mit einer Hydroxygruppe von dieser Verbindung zu erhalten, kann der Schwefelsäureester durch Behandeln der Verbindung mit Wasser enthaltendem Aceton (Wassergehalt von 1-10%) mit oder ohne Zugabe einer Säure in bekannter Weise hydrolysiert werden.

Die Herstellungsverfahren der Verbindungen der Formel I dieser Erfindung wurden vorstehend erläutert. Nachstehend werden die physiko-chemischen Eigenschaften und die antibakterielle Aktivität der neuen 7α-Methoxycephalosporinverbindungen, die durch das Verfahren erhalten wurden, beschrieben.

(A) 7b-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7α-methoxy-3-(p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-Δ³-cephem-4-carbonsäure (Verbindung A):

wobei die Ziffern in den Seitenketten zur Erläuterung eingetragen sind.

Die physio-chemischen Eigenschaften des Natriumsalzes der Verbindung (A) sind die folgenden:

(1) Weißes Pulver.
(2) Besitzt keinen definierten Schmelzpunkt und es wird braun bei 138-140°C.
(3) Leicht löslich in Wasser, jedoch schwer löslich in Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Butylacetat, Butanol und anderen organischen Lösungsmitteln.
(4) Amphoteres Material mit positiver Ninhydrinreaktion.
(5) Ergibt das in Fig. 1 gezeigte Ultraviolettabsorptionsspektrum bei der Messung in einer 1/100 M Phosphorsäurepufferlösung bei pH 6,5, wobei das Absorptionsmaximum bei 282 nm liegt.
(6) Ergibt das in Fig. 2 gezeigte Infrarotabsorptionsspektrum bei der Messung als Kaliumbromid-Tablette mit Absorptionen bei 3050, 1760, 1500, 1215, 1165, 1050, 870 und 845 cm^-1.
(7) Ergibt das in Fig. 3 gezeigte kernmagnetische Resonanzspektrum bei der Messung unter Verwendung von Natrium-3- trimethylsilylpropionat, (nachstehend als TSP bezeichnet), als inneren Standard in schwerem Wasser. Es wurden folgende Signale erhalten:
δ-Wert (ppm):
1,90 (4H, Multiplett), 2,49 (2H, Multiplett), 3,34- 3,67 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,53 (3H, Singlett), 3,76 (1H, Multiplett, J = 5,0 Hz),
5,00 (2H, Quartett, J = 13 Hz), 5,16 (1H, Singlett), 6,43 (1H, Doublett, J = 16 Hz), 7,32 (2H, Doublett, J = 8,5 Hz), 7,61 (2H, Doublett, J = 8,5 Hz), 7,66 (1H, Doublett, J = 16 Hz).
(8) Die Elementaranalyse nach dem Trocknen im Vakuum für 4 Stunden bei 50°C für C₂₄H₂₆N₃O₁₃S₂Na·2H₂O:
Berechnet: C 41,88% H 4,36% N 6,11% S 9,31%
Gefunden: C 42,06% H 4,41% N 6,08% S 9,51%
(9) Wenn Verbindung (A) 16 Stunden bei 100°C mit 6n-Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert wurde und sie dann mit einem Hitachi 835 Typ Hochgeschwindigkeitsaminosäure-Analysenapparat analysiert wurde, wurde die Anwesenheit von α-Aminoadipinsäure bestätigt.
(10) Wenn Verbindung (A) mit Dowex 50W (H⁺-Typ, Handelsname) in Methanol hydrolysiert und mittels Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie (unter Verwendung einer 6000 A Pumpe, Hersteller: Waters Co., UV Detector 280 nm, UVIDECK 100 II, Hersteller: Nippon Bunko K.K., Lichrosolve Rp 18 (Handelsname, Hersteller: Merck & Co., Inc.) einer Säule aus rostfreiem Stahl 4 mm × 150 mm, Lösungsmittel: Mischung aus Methanol, Essigsäure und Wasser (20 : 0,1 : 80 im Volumenverhältnis)) untersucht wurde, wurde die Anwesenheit von Cumarinsäure bestätigt.

Wenn das hydrolysierte Produkt silyliert wurde nach Einengung unter vermindertem Druck mittels BSA N,N-Bis(trimethylsilyl)- acetamid und einer gasmassenspektrograhischen Analyse unterworfen wurde, wurde die Anwesenheit des Fragments von Trimethylsilyl-p-trimethylsilyloxycinnamat

mit 308 m/e bestätigt.

Aus den vorstehenden Ergebnissen wurde die Struktur der Verbindung (A) bestimmt. Die Anwesenheit des 7α-Methoxycephalosporingerüstes ergibt sich aus dem Wert 1760 cm^-1 (cyclisches Lactam) in den Infrarotabsorptionsspektra und den Werten 3,53 ppm (3H, Singlett, 7-OCH₃), 5,16 ppm (1H, Singlett, 6-CH), 3,34-3,67 ppm (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂), und 5,00 ppm (2H, Quartett, J = 13 Hz, 3-CH₂) im kernmagnetischen Resonanzspektrum; die Existenz eines a-Aminoadipinsäurerestes in der 7-Position ergibt sich aus den Ergebnissen der Aminosäureanalyse und weiter aus den Werten der Signale bei 1,90 ppm (4H, Multiplett, 3′′, 4′′-CH₂), 2,49 ppm (2H, Multiplett, 2′′-CH₂), und 3,76 ppm (1H, Multiplett, 5′′-CH) im kernmagnetischen Resonanzspektrum; die Existenz des p-Sulfooxyzimtsäurerestes in der 3-Position ergibt sich aus (i) den Werten 7,32 ppm (2H, Doublett, J = 8,5 Hz, 3′,5′-CH), 7,61 ppm (2H, Doublett, J = 8,5 Hz, 2′,6′-CH), 6,43 ppm (1H, Doublett, J = 16 Hz, α-CH) und 7,66 ppm (1H, Doublett, J = 16 Hz, β-CH) im kernmagnetischen Resonanzspektrum, (ii) der Wert des Fragmentes mit 308 m/e ergibt sich aus dem Massenspektrum des silylierten Produktes der Verbindung (A), hydrolysiert mit Dowex 50W (H⁺-Typ, Handelsname) in Methanol, (iii) die Existenz von zwei S Atomen ergibt sich aus dem Resultat der Elementaranalyse und (iv) den Absorptionen bei 870 cm^-1 (Spannungsvibration von S-O), 1050 cm^-1 (Spannungsvibration von S = O) und etwa 1215 cm^-1 (Spannungsvibration von SO₂) in den Infrarotabsorptionsspektren.

(C) 7β-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7α-methoxy-Δ³-cephem-4-carbonsäure (Verbindung C):

Elementaranalyse der Verbindung (C) für C₂₄H₂₇N₃O₁₀S·1 1/2 H₂O:
Berechnet: C 50,00% H 5,24% N 7,29% S 5,56%
Gefunden: C 49,79% H 5,13% N 7,15% S 5,42%

Die physiko-chemischen Eigenschaften des Natriumsalzes der Verbindung (C) sind die folgenden:

(1) Weißes Pulver.
(2) Besitzt keinen definierten Schmelzpunkt und es wird braun bei 145-150°C.
(3) Leicht löslich in Wasser, jedoch schwer löslich in Methanol, Äthanol, Butylacetat, Äthylacetat und anderen organischen Lösungsmitteln.
(4) Amphoteres Material mit positiver Ninhydrinreaktion.
(5) Ergibt das in Fig. 4 dargestellte Ultraviolettabsorptionsspektrum mit dem Absorptionsmaximum bei 307,5 nm bei der Messung in 1/100 M Phosphorsäurepufferlösung bei pH 6,5.
(6) Ergibt das in Fig. 5 wiedergegebene Infrarotabsorptionsspektrum bei der Messung als Kaliumbromidtablette und zeigt Absorptionen bei 3200, 1765, 1600, 1510, 1405, 1255, 1170 und 836 cm^-1.
(7) Ergibt das in Fig. 6 dargestellte kernmagnetische Resonanzspektrum bei der Messung in schwerem Wasser unter Verwendung von TSP als einen inneren Standard und besitzt die folgenden Signale:
δ-Wert (ppm):
1,88 (4H, Multiplett), 2,50 (2H, Multiplett), 3,35-3,73 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,54 (3H, Singlett), 3,76 (1H, Multiplett), 4,92 (2H, Quartett, J = 13 Hz), 5,19 (1H, Singlett), 6,41 (1H, Doublett, J = 16 Hz), 6,94 (2H, Doublett, J = 8,5 Hz), 7,59 (2H, Doublett, J = 8,5 Hz) und 7,71 (1H, Doublett, J = 16 Hz).
(8) Elementaranalyse der Verbindung nach dem Trocknen im Vakuum während 4 Stunden bei 50°C für C₂₄H₂₆N₃O₁₀SNa·2 H₂O:
Berechnet: C 47,45% H 4,94% N 6,92% S 5,27%
Gefunden: C 46,15% H 4,81% N 6,81% S 5,42%
(9) Nach der Hydrolyse der Verbindung (C) mit 6n-Chlorwasserstoffsäure für 16 Stunden bei 100°C wurde die Anwesenheit von α-Aminoadipinsäure, wie im Falle der Verbindung (A), bestätigt.
(10) Wenn Verbindung (C) mit Dowex 50W (H⁺-Typ, Handelsname) in p-Cumarinsäure wie im Falle der Verbindung (A) bestätigt.

Aus den vorstehenden Ergebnissen wurde die Struktur der Verbindung (C) bestimmt. Die Existenz des 7α-Methoxycephalosporingerüstes ergibt sich aus dem Wert 1765 cm^-1 (cyclisches Lactam) in dem Infrarotabsorptionsspektrum und die Werte von 3,54 ppm (3H, Singlett, 7-OCH₃), 5,19 ppm (1H, Singlett, 6-CH), 3,35-3,73 ppm (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂) und 4,92 ppm (2H, Quartett, J = 13 Hz, 3-CH₂); die Existenz des α-Aminoadipinsäurerestes in der 7-Position ergibt sich aus der Aminosäureanalyse und den Werten der Signale bei 1,88 ppm (4H, Multiplett, 3′′,4′′-CH₂), 2,50 ppm (2H, Multiplett, 2′′-CH₂) und 3,76 ppm (1H, Multiplett, 5′′-CH); und der Abspaltung der Sulfogruppe (-SO₃H) der Verbindung (A) aus (i) den Werten von 6,94 ppm (2H, Doublett, J = 8,5 Hz 3′,5′- CH), 7,59 ppm (2H, Doublett, J = 8,5 Hz, 2′,6′-CH), 6,41 ppm (1H, Doublett, J = 16 Hz, α-CH) und 7,71 ppm (1H, Doublett, J = 16 Hz, β-CH) in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum, (ii) dem Fragment mit 308 m/e (entsprechend der Trimethylsilyl-p-trimethylsilyloxyzimtsäure) in dem Massenspektrum des silylierten Produktes an Verbindung (C), hydrolysiert mit Dowex 50W (H⁺-Typ, Handelsname) in Methanol, (iii) der Existenz von einem S Atom aus den Ergebnissen der Elementaranalyse und (iv) dem Verschwinden der Absorption bei 870 cm^-1 (Spannungsvibration von S-O), 1045 cm^-1 (Spannungsvibration von S=O), und etwa 1215 cm^-1 (Spannungsvibration von SO₂) der Verbindung (A) in dem Infrarotabsorptionsspektrum.

Ferner werden die Ergebnisse der Dünnschichtchromatographie, Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie und die antibakterielle Aktivität der Verbindungen (A) und (C) nachstehend angegeben:

1. Rf-Werte der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung feiner kristalliner Cellulose (Avicel SF, Handelsname) sind in der Tabelle I wiedergegeben:

Tabelle I

Dünnschichtchromatographie (Rf-Werte)

(Bemerkung 1): Entwicklungslösungsmittel (im Volumenverhältnis)
A⁺: n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2)
B⁺⁺: Isopropanol : Wasser (7 : 3)
(Bemerkung 2): Der Nachweis erfolgte unter Verwendung von Ninhydrin oder Ultraviolettabsorption (Manasulu-Licht 2536 Å).
(Bemerkung 3): Kontrollsubstanz Y-G19Z-G ist 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)thiomethyl- Δ³-cephem-4-carbonsäure, beschrieben in Japanischer Offenlegungsschrift 79 081/'77 und Y-G19Z-GG ist 7-(4-Carboxybutyramido)- 7-methoxy-3-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-Δ³-cephem-4- carbonsäure. Sie ist beschrieben in Japanischer Offenlegungsschrift 15 494/'78.

2. Die Elutionszeiten bei der Hochgeschwindigkeitschromatographie sind die folgenden:

Tabelle II
Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie

Elutionszeit
Verbindung (A)
2 Min. 46 Sek.
Verbindung (C)	30 Min. 00 Sek.
Y-G19Z-G	2 Min. 14 Sek.
Y-G19Z-GG	4 Min. 35 Sek.

Pumpe: 6000 A (Hersteller: Waters Co.)
Detector: UVIDEK 100 II UV Detector 280 nm.
Säule: Rostfreie Stahlsäule 4 mm × 150 mm, gefüllt mit Lichrosolve RP. 18.
Entwicklungslösemittel : Acetonitril : Essigsäure : Wasser (10 : 0,2 : 90 im Volumenverhältnis).
Fließrate: 1 ml/Min.
Druck: 1800 P.S.I.
Säulentemperatur: 30°C.

3. Die antibakteriellen Aktivitäten gegenüber Proteus mirabilis und Salmonella gallinarum sind die folgenden:

Tabelle III: Antibakterielle Aktivität

(Bemerkung): Pepton 1%, Hefeextrakt 0,1%, Agar-Agar 1%, pH 8,0, Plattenschalenmethode, die numerischen Werte sind die Durchmesser der Inhibitionskreisflächen.

Minimum-Inhibitions-Konzentration (γ/ml)

Die Verbindungen können oral, rektal oder mittels Injektion, wie subkutan, intramuskulär oder intravenös in Mengen von 100-5000 mg pro Tag an Erwachsene verabreicht werden. Die Dosen können entsprechend der Art der Erkrankung, dem Alter, Gewicht und dem Status des Patienten angepaßt werden.

Nun soll das Verfahren dieser Erfindung im einzelnen durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium, enthaltend 1% Stärke, 1% Glucose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid wurde in 500 ml Sakaguchi- Flaschen mit je 100 ml eingefüllt und bei 120°C für 20 Minuten sterilisiert. Jedes Medium wurde dann mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z Stamm beimpft und 48 Stunden bei 30°C gezüchtet, um eine Beimpfungs-Kulturbrühe zu erhalten. Gesondert von diesen wurde zu 5 Liter Kulturmedium, enthaltend 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1% Caseinhydrolysat, 0,01% Ferrisulfat, 4,6 g Natriumhydroxid und 1 ml Adekanol (Handelsname) 500 ml einer Lösung hinzugefügt, die 10 g p-Cumarinsäure enthält. Das pH wurde auf 7,5 mittels 4n-Natriumhydroxidlösung eingestellt, und das Gemisch wurde in einen 10 Liter Fermenter gefüllt und sterilisiert für 30 Minuten bei 120°C. Das Kulturmedium wurde dann mit 100 ml der vorstehend hergestellten Beimpfungskultur beimpft und 120 Stunden bei 30°C kultiviert. Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 3,0 eingestellt und Radiolite (Handelsname) zugefügt und durchgerührt.

Das Gemisch wurde unter Absaugen filtriert. Der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen, das Waschwasser wurde mit dem Filtrat vereinigt. Es wurden 5,6 Liter Filtrat erhalten. Nach Einstellen des pH des Filtrats auf 3,0 mit 4n-Chlorwasserstoffsäure wurde die Lösung durch eine Säule mit einer Packung von einem Liter Diaion HP.20 (Handelsname) gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 5 Liter Wasser wurde das absorbierte Material mit wässeriger 30%iger Aceton-Lösung eluiert. Die Fraktionen, die antibakterielle Aktivität gegen Proteus mirabilis zeigten, wurden gesammelt. Die aktive Fraktion wurde unter vermindertem Druck bei 50°C eingeengt. Das pH des Rückstandes wurde auf 3,5 mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Die Fraktion wurde durch eine Säule mit einer Füllung von einem Liter Amberlite IRA-68 (Cl^--Typ, Handelsname) gegeben, um daran das Produkt zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit 5 Liter Wasser wurden die adsorbierten Materialien mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), enthaltend 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat, eluiert. Die Fraktionen mit antibakterieller Aktivität wurden gesammelt. Nach dem Einstellen des pH der so gesammelten Fraktion auf 3,0 wurde die Fraktion durch eine Säule mit einer Füllung aus einem Liter Diaion HP.20 (Handelsname) gegeben. Die Säule wurde mit 5 Liter Wasser gewaschen. Die adsorbierten Materialien wurden mit einer wässerigen 30%igen Acetonlösung eluiert. Die Fraktionen mit antibakterieller Aktivität wurden gesammelt. Es wurden etwa 500 ml Lösung erhalten. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck bei 50°C eingeengt, um Aceton zu entfernen. Es wurde gefriergetrocknet. Es wurden etwa 11 g pulvrige rohe Verbindung (A) erhalten.

Dann wurde 11 g des Pulvers einer Säulenchromatographie unter Verwendung feiner kristalliner Cellulose (Avicel, Handelsname) und eines Gemisches aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) unterworfen.

Die Fraktionen, die die Verbindung (A) enthielten, wurden gesammelt unter Bestätigung der antibakteriellen Aktivität. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,55, mittels UV-Absorption (Manasulu Licht 2536 Å) und Ninhydrin-Anfärbung geprüft, wurden nach Auftragen auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF (Handelsname) und Entwicklung mit einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis) behandelt. Dadurch wurden etwa 150 ml Lösungsmittelgemisch, die Verbindung (A) enthaltend, erhalten. Zu dem Lösungsmittelgemisch wurden 150 ml Toluol zugefügt, durchgeschüttelt und nach dem Stehenlassen des Gemischs wurde die obere Schicht aus n-Butanol und Toluol entfernt. Die untere wäßrige Schicht, die die Verbindung (A) enthält, wurde unter vermindertem Druck auf etwa 30 ml eingeengt. Es wurde gefriergetrocknet. Es wurden 1,36 g trockenes Pulver erhalten.

Dann wurde das erhaltene Produkt einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie [Pumpe: 6000 A, Detector: UV-Detector, UVIDEK 100 II 280 nm, Säule: Säule aus rostfreiem Stahl 8 mm × 1 Meter, gefüllt mit Bondapak C₁₈ Poracil (Handelsname), Lösungsmittel: Acetonitril : Essigsäure : Wasser (9 : 0,2 : 90,8 im Volumenverhältnis), Fließrate: 9 ml/Min. und Druck: 35 kg/cm²] zur Reinigung unterworfen.

Dann wurde 1,36 g des vorstehend genannten Pulvers in 10 ml Wasser aufgelöst, 2 ml der Lösung wurde in die vorstehend genannte Säule gefüllt, und die Fraktionen, die die Verbindung (A) enthielten und die zwischen 24 bis 44 Minuten nach Beginn der Eluierung austreten, wurden gesammelt. Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt. Die Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck bei 50°C eingeengt und anschließend gefriergetrocknet. Es wurde 75 mg weißes Pulver erhalten.

Das Pulver wurde erneut in Wasser aufgelöst und an Sephadex G.10 (Handelsname) in einer Säule mit der Abmessung 1,5 cm × 50 cm adsorbiert. Das Produkt wurde mit destilliertem Wasser entwickelt. Die Fraktionen, die die Verbindung (A)′ enthielten, wurden unter Bestätigung der antibakteriellen Aktivität gesammelt. Diese Fraktionen besitzen den RF-Wert 0,55 durch UV-Absorption und Ninhydrinanfärbung nach dem Auftragen der Fraktion auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF und Entwicklung mit einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis). Dann wurde gefriergetrocknet. Es wurde 66 mg weißes Pulver der reinen Verbindung (A) erhalten.

Beispiel 2

Nach dem Auflösen von 25 mg Verbindung (A), hergestellt gemäß Beispiel 1, in 0,5 ml Wasser wurde 45,4 ml Aceton zu der Lösung hinzugefügt. Dabei wurde die Lösung weiß trüb. Durch Zugabe von 0,2 ml 1n-Chlorwasserstoffsäure zu der Lösung wurde die Lösung sofort klar. Man ließ die Lösung 2 Stunden bei Zimmertemperatur (22-23°C) stehen. Wenn die Lösung auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen und entwickelt wurde mit einem Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) und mittels UV-Absorption und Ninhydrinanfärbung geprüft wurde, wurde bestätigt, daß Verbindung (A) mit dem Rf-Wert 0,39 in die Verbindung (C) überführt worden war mit dem Rf-Wert 0,65. Durch Entwickeln des Produktes mit einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie [Pumpe: 6000 A, Säule: Säule aus rostfreiem Stahl 4 mm × 150 mm, gefüllt mit Lichrosolve RP 18, Detector: UV-Detector, UVIDECK 100 II 280 nm, Lösungsmittel: Acetonitril : Essigsäure : Wasser (15 : 0,5 : 90 im Volumenverhältnis), Fließrate: 1 ml/Min.], wurde bestätigt, daß Verbindung (A) mit einer Eluierzeit von 1 Minute und 38 Sekunden in Verbindung (C) überführt worden war mit einer Eluierzeit von 11 Minuten und 0 Sekunden. Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch neutralisiert mit 0,2 ml 1n-Natriumhydroxidlösung und dann unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 2 ml eingeengt.

Die so erhaltene Verbindung (C) wurde mittels Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie [Pumpe: 6000 A, Detector: UV-Detector, UVIDECK 100 II 280 nm, Säule: rostfreie Stahlsäule 8 mm × 1 Meter, gefüllt mit Bondapack C₁₈ Poracil (Handelsname), Lösungsmittel: Acetonitril : Essigsäure : Wasser (15 : 0,5 : 90 im Volumenverhältnis), Fließrate: 9 ml/Min], gereinigt.

Die Fraktionen mit der Verbindung (C) traten von 14 Minuten an, nach Beginn der Eluierung, bis 19 Minuten aus und sie wurden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt bei 50°C bis das Volumen etwa 10 ml betrug. Nach dem Einstellen des pH auf 5 mit 1n-Natriumhydroxidlösung wurde das Konzentrat gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde an einer Sephadex G-10 Säule 1,5 cm × 50 cm adsorbiert und mit destilliertem Wasser eluiert. Die antibakteriell aktiven Fraktionen wurden auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, entwickelt mit einem Gemisch aus n- Butanol, Essigsäure und Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis), und deren Rf-Wert wurde mittels UV-Absorption und Ninhydrin-Anfärbung geprüft. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,65 wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Es wurden 14 mg weißes Pulver der reinen Verbindung (C) erhalten.

Beispiel 3

Eine Kulturbrühe wurde in einem 20 Liter Fermenter nach der gleichen Züchtungsmethode, wie im Beispiel 1 beschrieben, jedoch ohne Zugabe von p-Cumarinsäure kultiviert. Nach beendeter Kultivierung wurde das pH der Kulturbrühe auf 3,0 eingestellt, Radiolite wurde zugefügt und dann durchgerührt. Das Gemisch wurde unter Absaugen filtriert, der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen. Das Waschwasser wurde mit dem Filtrat vereinigt, wodurch 23 Liter wässerige Lösung erhalten wurden. Nach dem Einstellen des pH der wässerigen Lösung auf 3,0 mit 4n-Chlorwasserstoffsäure wurde die Lösung durch eine Säule mit einer Füllung von 3 Liter Diaion HP.20 gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 20 Liter Wasser wurde das adsorbierte Produkt mit einer wässerigen 30%igen Acetonlösung eluiert. Dann wurde die Fraktion mit antibakterieller Aktivität gegen Proteus mirabilis gesammelt. Die aktive Fraktion wurde unter vermindertem Druck bei 50°C eingeengt. Nach dem Einstellen des pH auf 3,5 mit 4n-Chlorwasserstoffsäure wurde die Lösung durch eine Säule, gefüllt mit 3 Liter Amberlite IRA-68 (Cl^--Typ), gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 10 Liter Wasser wurde das darin adsorbierte Produkt mit wässeriger Lösung (pH 7,2), enthaltend 1 M Natriumnitrat und 0,1 n Natriumacetat, eluiert. Die Fraktion mit antibakterieller Aktivität wurde gesammelt. Nach dem Einstellen des pH auf 3,0 wurde die Fraktion durch eine Säule mit einer Füllung aus 1 Liter Diaion HP.20 gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 10 Liter Wasser wurde das Produkt mit wässeriger 30%iger Acetonlösung eluiert. Die Fraktionen mit antibakterieller Aktivität wurden gesammelt. Es wurden etwa 2,1 Liter wässerige Lösung erhalten. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck bei 50°C eingeengt, um Aceton zu entfernen. Es wurde dann gefriergetrocknet. Es wurden etwa 32 g rohres Pulver erhalten.

10 g des Pulvers wurden dann einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung feiner kristalliner Cellulose-Säule mit einem Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis). Es wurde mit Lösungsgemisch mit der vorstehenden gleichen Zusammensetzung eluiert. Die Fraktionen wurden punktförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen und mit einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis) entwickelt.

Die Fraktionen mit UV-Absorption, Ninhydrin-Anfärbung und antibakterieller Aktivität gegen Proteus mirabilis wurden gesammelt. Es wurden etwa 500 ml Lösungsmittelgemischlösung erhalten. Zu dem Lösungsmittelgemisch wurde 500 ml Toluol hinzugefügt und durchgeschüttelt. Das Gemisch wurde stehen gelassen, n-Butanol und Toluol als gebildete obere Schicht wurden entfernt. Die untere wässerige Schicht wurde unter vermindertem Druck bei 50°C auf etwa 70 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden etwa 3,3 g trockenes Pulver erhalten.

Bei der Analyse des Produktes durch Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie wurde bestätigt, daß der Ausschlag (peak), der mit Verbindung (A) übereinstimmte, (erhalten gemäß Beispiel 1), vorhanden war, wenn das Produkt mittels Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie [Pumpe: 6000 A, Detector: UV-Detector, UVIDECK 100 II, 280 nm, Säule: rostfreie Stahlsäule 8 mm × 1 Meter, gefüllt mit Bondapack C₁₈ Poracil, Lösungsmittel : Acetonitril : Essigsäure : Wasser (7 : 0,3 : 90 im Volumenverhältnis), Fließrate: 9 ml/Min., Säulentemperatur: 30°C] gereinigt wurde.

Dann wurden 3,3 g des vorstehend erhaltenen Pulvers in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst, 2 ml der Lösung wurde in die vorstehend beschriebene Säule gefüllt. Die Fraktionen, enthaltend die Verbindung (A), die 66 bis 94 Minuten nach Beginn der Eluierung austraten, wurden gesammelt. Diese Arbeitsweise wurde fünfmal wiederholt und die Fraktionen vereinigt, unter vermindertem Druck bei 50°C eingeengt und gefriertgetrocknet. Es wurden etwa 70 mg weißes Pulver erhalten. Das Pulver wurde erneut mit Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie [Pumpe: 6000 A, Detector: UV-Detector, UVIDECK 100 II 280 nm, Säule: rostfreie Stahlsäule 8 mm × 1 Meter, gefüllt mit Bondapack C₁₈ Poracil, Lösungsmittel: Acetronitril : Essigsäure : Wasser (8 : 0,2 : 92 im Volumenverhältnis), Fließrate: 9 ml/Min., Säulentemperatur: 10°C] gereinigt.

Dann wurden 70 mg des vorstehend erhaltenen Pulvers in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde in die vorstehend genannte Säule gegeben. Die Fraktionen, die die Verbindung (A) enthielten, traten von 22 Minuten bis 35 Minuten nach Beginn des Eluierens aus, wurden gesammelt, unter vermindertem Druck bei 50°C eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden 10 g weißes Pulver erhalten.

Das Pulver wurde einer Chromatographie unter Verwendung einer Säule 1,5 cm × 50 cm, gefüllt mit Sephadex G-10, unterworfen. Eluiert wurde mit destilliertem Wasser. Die Fraktionen, die die Verbindung (A) enthielten, wurden gesammelt unter Bestätigung ihrer antibakteriellen Aktivität. Hierbei zeigten die Fraktionen den Rf-Wert 0,55 bei der UV-Absorption und Ninhydrin-Anfärbung nach dem Auftragen der Fraktionen auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF und Entwicklung mit einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis). Es wurde gefriergetrocknet. Es wurden 5,5 mg weißes Pulver der reinen Verbindung (A) erhalten.

Beispiel 4

Ein Kulturmedium, enthaltend 1% Stärke, 1% Glucose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid, wurde in eine 500 ml Sakaguchi-Flasche mit je 100 ml eingefüllt und 20 Minuten sterilisiert bei 120°C. Die Kulturmedien wurden mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z Stamm beimpft und 48 Stunden bei 30°C gezüchtet, um eine Kulturbrühe herzustellen.

Unabhängig davon wurde das vorstehend genannte Kulturmedium in zwei Liter Sakaguchi Flaschen mit je 400 ml gefüllt, 20 Minuten bei 120°C sterilisiert, mit 2-3% der vorstehend erhaltenen Kulturbrühe beimpft und 48 Stunden bei 30°C kultiviert, um eine Vermehrungskultur zu erhalten.

Weiterhin wurden 90 Liter eines anderen Kulturmediums, enthaltend 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1% Gaseinhydrolysat, 0,01% Ferrisulfat, 42 g Natriumhydroxid und 10 ml Adekanol (Handelsname) in einen 150 Liter Fermenter eingefüllt und 30 Minuten bei 120°C sterilisiert. Das Medium wurde mit 2 Liter der Vermehrungskultur beimpft und 24 Stunden bei 30°C kultiviert. Getrennt für sich wurden 200 g p-Cumarinsäure in 2 Liter Methanol aufgelöst. Die Lösung wurde mit 8 Liter einer äquimolaren Menge Natriumhydroxidlösung gemischt, nach dem Sterilisieren für 10 Minuten bei 120°C wurde die Lösung zu dem vorstehend genannten Medium nach Kultivierung für 24 Stunden hinzugefügt. Das Medium wurde dann weiter für 12 Stunden kultiviert. Nach beendeter Kultivierung wurde das pH der Kulturbrühe auf 3,0 eingestellt und mittels einer Filterpresse filtriert. Es wurde mit Wasser gewaschen. Es wurden 120 Liter Filtrat erhalten.

Das Filtrat wurde durch eine Säule mit einer Füllung von 22 Liter Diaion HP.20 gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Produkt mit einer wässerigen 30%igen Acetonlösung eluiert und mittels Hochgeschwindigkeitflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Die Fraktionen, die die Verbindung (A) enthielten, wurden gesammelt. Dann wurde die Fraktion durch eine Säule mit einer Füllung aus 6 Liter Amberlite IRA 68 (Cl^--Typ) gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Produkt mit einer Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 n-Natriumacetat enthielt, eluiert. Die Fraktionen wurden mittels HPLC analysiert; die Fraktionen der Verbindung (A) wurden gesammelt. Nach Einstellen des pH der Fraktion auf 3,0 wurde die Fraktion durch eine Säule mit einer Füllung aus 15 Liter Diaion HP.20 gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Produkt mit einer wässerigen 30%igen Acetonlösung eluiert. Die Fraktionen wurden mittels HPLC analysiert, und die Fraktionen der Verbindung (A) wurde gesammelt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck bei 50°C eingeengt. Es wurden 2,5 Liter Lösung mit einem Gehalt an 95 g Verbindung (A) erhalten.

Beispiel 5

Aus 2,5 Liter der Lösung, die die Verbindung (A) enthielt und im Beispiel 6 erhalten wurde, wurden 10 ml der Lösung abgetrennt und gefriergetrocknet. Dann wurde das so gebildete Pulver in 2 ml Wasser aufgelöst. 200 ml Aceton wurden zu der Lösung hinzugegeben. Dadurch wurde die Lösung weiß trüb. Die Lösung wurde jedoch durch Zugabe von 0,6 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure klar. Nach Bestätigung, daß Verbindung (A) in die Verbindung (C) umgewandelt worden war mittels Analyse mit HPLC, wurde das pH der Lösung auf 2 eingestellt durch Zugabe von 4 n-Natriumhydroxidlösung und Filtrieren mit einem Glasfilter. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei 40°C eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden 300 mg Pulver erhalten.

Dann wurde das Produkt unter Verwendung von HPLC weiter gereinigt. [Säule: rostfreie Stahlsäule 8 mm × 1 Meter, gefüllt mit Bondapack C₁₈ Poracil, Lösungsmittel: Methanol : Essigsäure : Wasser (23 : 0,1 : 77 im Volumenverhältnis), Säulentemperatur: 20°C].

Die Fraktionen, die die Verbindung (C) enthalten, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck bei 40°C eingeengt, um Methanol zu entfernen. Nach Einstellen des pH auf 3,0 mittels 4n-Chlorwasserstoffsäure wurde die Lösung durch eine Säule mit einer Füllung aus 7 ml Diaion HP.20 gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Produkt mit wässeriger 30%iger Acetonlösung eluiert. Die Fraktionen wurden mittels HPLC analysiert. So wurden die Fraktionen, die die Verbindung (C) enthielten, gesammelt, unter vermindertem Druck bei 40°C eingeengt, gefriergetrocknet und im Vakuum 4 Stunden bei 55°C getrocknet. Es wurden 55 mg weißes Pulver aus reiner Verbindung (C) erhalten.

Fig. 1, 2 und 3 geben das Ultraviolettabsorptionsspektrum bzw. Infrarotabsorptionsspektrum und kernmagnetisches Resonanzspektrum der Verbindung (A) wieder.

Fig. 4, 5 und 6 zeigen das Ultraviolettabsorptionsspektrum bzw. Infrarotabsorptionsspektrum und kernmagnetische Resonanzspektrum der Verbindung (C).

Claims

Verfahren zur Herstellung von 7α-Methoxycephalosporinderivaten der allgemeinen Formel worin R₁ eine α-Aminocarboxymethylgruppe bedeutet und R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Sulfogruppe darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces oganonensis ATCC 31167 in Gegenwart oder in Abwesenheit von Hydroxyzimtsäure gezüchtet werden, die so erhaltenen 7-Methoxycephalosporinderivate der Formel isoliert werden und nötigenfalls die Hydrolyse des Schwefelsäureesters in üblicher Weise und in gewünschter Reihenfolge ausgeführt wird.