DE2826560C2 - Verfahren zur Herstellung von Süßungsmitteln - Google Patents

Description

bei 20 bis «0"C und einem pll-Wen von 3 ms 10 umseizi.

2. Verfahren gemäß Anspruch I. dadurch gekennzeichnet, daß man als Ä-Glucosyltransfcrasc «-Glucosida.se. A-Amylasc. Cyclodexirin-glucanotransfcrnsc. Dexiransaccharasc. Dextrindcxtraiiase oder

Chemische Struktur von Steviosid AmylC'sacchitrase oder ein Gemisch daraus verwendet.

IO

20 IDa in jüngster Zeit die Verwendung künstlicher Süßstoffe, wie beispielsweise Dulcin. Natriumcyclamat und Saccharin, aus Gründen der Freihaliung der Lebensmittel von bedenklichen Substanzen unterbunden oder eingeschränkt worden ist, steigt der Bedarf an unschädlichen natürlichen Süßungsmitteln standig. Auf grund dieses Bedarfs isi unter dun mil landwirtschaftlichen Produkten und Süßungsmittel befaßten Herstellern ein starkes Bestreben zur Erhöhung der Produkiion von Steviosid erkennbar.

Steviosid ist ein natürlich vorkommendes Glycosid, das durch Extraktion de- oberirdischen Teile, d. h. der Blatter und Stengel, von Stevia Rcbtiudiana BI RTONI (im folgenden einfach als Stcvia bezeichnet), aus der Familie Chrysanthemum erhalten wird. Das Glycosid ist. wie |n der folgenden Formel gez.cigt, ein" /?-Glucosyl-Glycosid* dessen Aglycon Steviol ist.

HO

HO

OH

Steviosid wird als Extrakt von Steviabiättern in roher und gereinigter Form oder im Gemisch mit anderen Süßungsmitteln zur Süßung von Nahrungsmitteln ,und Getränken verwendet.

Bekanntlich ist das Anwendungsgebiet von Steviosid oder herkömmlichen Süßungsmitteln mit einem Gehalt an Steviosid beschränkt bzw. erfordert besondere Vorsichtsmaßnahmen oder bereitet Schwierigkeiten, weil Steviosid die folgenden Nachteile besitzt:

1. Steviosid ist nicht nur süß, sondern auch bitter und adstringierend.

2. Die Süße von Steyiosid entwickelt sich langsamer im Mund als die von Saccharose und besitzt außerdem einen langer anhaltenden unangenehmen Nachgeschmack.

3. Steviosid löst sich nur schwierig in Wasser (0,12% bei 20⁰C).

Aufgabe der Erfindung ist daher die Eliminierung der! b5 genannten Schwierigkeiten mit Hilfe biochemischer] Mittel.

Gegenstand der Erfindung ist somit das in den! vorstehenden Patentansprüchen aufgezeigte Verfahrenj

■υ - J _. ι

ι· ,.A

zur Herstellung von Süßungsmittel.

Die ft-Glucosyltransferasen sind hierbei in der Lage, einen nt-Glucosylrest auf das Steviosid zu übertragen, wie beispielsweise Λ-Glucosidase {B.C. (Enzyme Comission) 3.2.1.20), Λ-Amylase (E.C. 3.2.1.1.), Cyclodextringlucanotransferase (E.C. 2.4.1.19) und Dextransaccnarase (E.C. 2.4.1.5). Dabei wird ein Süßungsmittel erhalten, das das durch die Umsetzung gebildete A-Glycosyl-Steviosid enthält und die folgenden außergewöhnlichen wünschenswerten Eigenschaften besitzt, die mit herkömmlichen Steviosidprodukten oder Steviosid enthaltenden Süßungsmittel nicht erreichbar sind:

1. Das neue Süßungsmittel ist weder bitter noch adstringierend. sondern liefen eine milde, weiche, runde und angenehme Süße.

2. Es besitzt keinen langer anhaltenden Nachgeschmack.

3. Es besitzt eine betrachtlich verbessere Wasserlöslichkeit.

Außerdem wurde durch Dünnschichichromaiographie festgestellt, daß die Umwandlung zu- Überführung eines Teiles oder nahezu der Gesamtmenge des bei der Umsetzung verwendeten Steviosids in ein Λ-Glycosyl-Steviosid. wie beispielsweise «-Monoglucosylsieviosid.

ίο Λς-Diglucosylsteviosid und /x-Triglucosylsteviosid, führt.

Kürzlich wurden neue Verbindungen, die Rebaudiosid

A und Rebaudiosid B genannt wurden und von Steviosid

völlig verschieden sind, in den Blättern von Sievia

gefunden. Wie sich aus den folgenden Formeln ergibt.

sind Rebaudiosid A und Kebuudiosid H ,i-Cjlll
coside. in denen vv ic im IaIIo von Steviusjd il.
Steviol isi.

Chemische Struktur von Rebaudiosid A

HO

CH₂

HO

OH

l^; Chemische Struktur von Rebaudiosid B

HO

CH₂

COOH

OH

Während das iX-Glycosylsicviosid, das in dem crfindungsgcniäß hergestellten Süßungsmittel vorhanden ist, von Enzymen, die «-glycosidische Bindungen hydrolysieren, wie beispielsweise Glucoamykise, a-Glticosidase,/?-Amylase und fsomaltodextranase, zu Slcviosid, D-GIucose. Maltose oder Isomaltose zersetzt wird, erwiesen sich Rebaudiosid A und B (im folgenden, wenn nicht anders angegeben, einfach als Rebaudioside bezeichnet) als von solchen «-glucosidischc Bindungen hydrolysierenden Enzymen unzersctzlich. Außerdem werden, wenn man eine wäßrige Lösung, die einen Λ-Glucosylzucker und Rebaudioside enthält.der Einwirkung von it-Glucosyliransferase unterwirf!, die Rebaudioside nichl zersetzt, sondern bilden a-Glycosylrebaudioside ähnlich wie in dem oben beschriebenen Fall, bei dem das Enzym auf Sieviosid einwirken gelassen wird. Das erhaltene Reaktionsgemisch besitzt ebenfalls eine ähnlich milde, weiche, runde und angenehme Süße, die derjenigen des nicht umgesetzten Gemisches in ihrer Qualität wesentlich überlegen ist. Demzufolge ist das «-Glucosylsteviosid. das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, offfensichtlich von dem herkömmlichen, bekannten Steviosid oder den Rebaudiosiden verschieden.

Das Steviosid, das zur Herstellung des erfindungsgemäß erhaltenen Süßungsmittel in Gegenwart einer «-Glucosylzuckerverbindung verwendet wird, ist nicht notwendigerweise ein hochraffiniertes oder gereinigtes Steviosidprodukt, sondern kann ein Gemisch aus Steviosid oder Rebaudiosiden oder ein rohes Steviosidprodukt oder sogar ein Steviosidnebenprodukt sein, das Verunreinigungen enthält, wie beispielsweise Mutterlauge, die noch eine grolle Menge an Steviosid und Rebaudiosiden enthält und durch Extraktion von Stevia erhalten wird und aus der kristallines Steviosid entfernt worden ist.

Die ft-Glucosylzuckerverbindung. die sich beim erfindungsgemäßen Verfahren verwenden läßt, ist eine solche, die aus Steviosid a-Glycosylsteviosid bildet, wenn beide der Einwirkung einer ix-Glucosyltransferase unterworfen werden. Demzufolge werden solche Subsiraie gewählt, die die Einwirkung einer rx-Glucosyliransferasc ermöglichen, nämlich die im Anspruch 1 genannten /vGlucoi-ylzuckerverbindungen. Wenn als ft-GIucosyltransferase nc-Glucosidasc (E-C. 3.2.1.20) verwende! wird, sind geeignete Substrate für sie Maliooligosaccharide. zum Beispiel Mallose. Maltotriose. Maltoteiraose. ein partielles Stärkehydrolysat mit einem Dextroscäquivalent (D.E.) von etwa 10 bis etwa 70 oder Saccharose; für a-Amylase (B.C. 3.2.1.1) geeignete Substrate sind nt-GIucosylzuckerverbindungcn. die von einem gelatinierten Stärkeproduki mit einem Dextroseäquivalent von nicht über 1 bis zu einem partiellen Stärkehydrolysat (Maliodextrin) mit einem Dextroseäquivalent von etwa 30 reichen: für Cyclodextrin-glucanotransferase (E.C. 2.4.1.19) geeignete Substrate sind ein Cyclodextrin oder «-Glucosylzuckerverbindungen. die von einem gelatinierten Slärkeprodukt mit einem Dextroseäquivalent von nicht über 1 bis zu einem partiellen Stärkehydrolysat mit einem Dextroseäquivalent von etwa 60 reichen, und für Dextransaccharase (E.C. 2.4.U) ist ein geeignetes Substrat Saccharose.

Von den bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren a-Glucosylzuckerverbindungen kann das gelatinierte Stärkeprodukt oder das partielle Stärkehydrolysat ein Produkt sein, das aus Getreidestärke, wie beispielsweise Wci/cn- oder Maisstärke, oder aus Knollen- und Wurzelstärke, wie beispielsweise Süf.5k;;rloffelstärke, Kartoffelstärke oder Tapiocastärke, erhalten worden ist.

Das gelatinierte Stärkeprodukt wird durch Gelatinieren hergestellt, das dadurch erreicht wird, daß man eine Stärkeaufschlämmung auf die Temperatur oberhalb des Gelatinierungspunktes, im allgemeinen auf eine Temperatur von 70 bis 140⁰C, erhitzt. Das partielle Stärkehydrolysat wird durch Hydrolysieren einer

ίο Stärkeaufschlämmung mit einer oder mehreren Säuren und/oder mehreren Amylasen bis zu dem gewünschten Dextroseäquivalent erhalten. Erfindungsgemäß kann die a-Glucosylzuckerverbindung aus einer einzigen Art bestehen, oder es können mehrere Arten gemeinsam verwendet werden.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können beliebige «-Glycosyltransferasen frei gewählt werden, solange sie Λ-Glycosylsteviosid bilden, ohne das Steviosid zu zersetzen, wenn sie auf eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt an einer «-Glucosylzuckerverbindung und Steviosid einwirken gelassen werden.

Verwendbare «-Glycosyltransferasen, die günstige Ergebnisse erzielen lassen, sind beispielsweise «-Gluco- % sidase (E.C. 3.2.1.20) tierischer Herkunft, wie beispiels- |

weise aus Schweineleb-r, pflanzlicher Herkunft, wie | beispielsweise aus Buchweizensamen, oder aus Pilzen, wie denen der Gattungen Mucor und Penicillium. oder aus Hefen stammend, wie denen der Gattung Saccharomyces; «-Amylase (E.C. 3.2.1.1.). aus verschiedenen Mikroorganismen stammend, insbesondere aus Bakterien der Gattung Bacillus, sowie aus Pilzen der Gattung Aspergillus stammend: Cyclodextrin-glucanotransfera- % se (E.C. 2.4.1.19), ebenfalls aus verschiedenen Mikroor- f ganismen stammend, insbesondere aus Bakterien der I,

Gattungen Bacillus und Klebsieila: Dextran-saccharasel¹ (E.C. 2.4.1.5), aus Bakterien der Galtung Leuconostoc| stammend: Dextrin-dextranase (E.C. 2.4.1.2), aus Bakte-1 rien der Galtung Acetobacter stammend: oder Amylo-| saccharase (E.C. 2.4.1.4). aus Bakterien der Gattung S.

Neisseria stammend. |

Die Reinigung der oc-Glucosyltransferase muß nicht |

notwendigerweise erfolgen, solange die oben beschrie-f

benen Bedingungen eingehalten werden und die Ziele f* des erfindungsgemäßen Verfahrens üblicherweise mit|

einer rohen «-Glucosyltransferase erreichbar sind. . |

Beispielsweise wird eine rohe «-Glucosyltransferase*

tierischer oder pflanzlicher Herkunft erhalten, indem f,

man eine Extraktionslösung von gemahlenen oder^e

zerhackten tierischen oder pflanzlichen Geweben mit|

Ammoniumsulfat aussalzt oder die Extraktionslösungl mit organischen Fäüungsmitteln. wie beispielsweise! Alkohol oder Aceton, ausfällt und das Produkt abtrenntJ Nötigenfalls kann die rohe Transferase vor ihrer| Verwendung nach einer beliebigen bekannten Methode!'

gereinigt werden. ' g>

Die bekannte mikrobielle «-Glucosyltransferasel

umfaßt Produkte aus Bakterien, Pilzen, Hefen und|

anderen Mikroorganismen. Gewöhnlich werden für die;·

Herstellung derartiger Transferasen die Festkulturme-f?

6tt thode, wie sie für »Koji« verwendet wird, und die', Flüssigkulturmethode, wie beispielsweise das Tankkulf turverfahren, angewandt Analog wie im Fall de^g; Transferase tierischen oder pflanzlichen Ursprungs|· wird die mikrobielle «-Glucosyltransferase durchj:

Extraktion hergestellt und kann nötigenfalls vor ihrcr^ Verwendung nach beliebigen bekannten Verfahren^ gereinigt werden.
Wenngleich im Falte der Verwendung einer flüssigen¹?:

Kultur die Kulturbrühe als Ganzes als a-Glucosyltransferase verwendet werden kann, wird üblicherweise nur die überstehende Flüssigkeit, aus der die unlöslichen Bestandteile entfernt worden sind, als «-Glucosyltransferase verwendet. Alternativ kann das entv/ickelte Enzym in Form von Zellen oder nach einer Extraktion aus den Zellen verwendet werden und nötigenfalls vor seiner Verwendung weiter gereinigt werden.

Gleichfalls verwendbar ist im Handel erhältliche «-Glucosyltransferase. to

a-Glucosyltransferase kann auf geeignete Träger aufgebracht werden, und dieses Enzym kann dann wiederholt in absatzweise oder kontinuierlich arbeitenden Systemen verwendet werden. Das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel kann hergestellt werden, indem man einen «-Glucosyllransferase erzeugenden Mikroorganismus bzw. ein «-Glucosyltransferase erzeugendes tierisches oder pflanzliches Gewebe in einem eine «-Glucosylzuckerverbindung und Steviosid enthaltenden Medium zur Erzeugung von «-Glycosylsteviosid züchtet.

Die Steviosid und die «-Glucosylzuckerverbindung enthaltende wäßrige Lösung wird hergestellt, indem man sie bis zur Auflösung des Stevicsids erhitzt und auf eine Steviosidkonzentration von etwa 0.1 bis 20% (Gewieht/Gewicht) sowie eine Konzentration an der «-Glucosylzuckerverbindung von etwa 1 bis etwa 50% (Gewieht/Gewicht) bringt. Das bevorzugte Verhältnis von «-Glucosylzuckerverbindung zu Steviosid liegt im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 500 :1, bezogen auf feste Trockensubstanz.

pH-Wert und Temperatur der Umsetzungslösung müssen in dem Bereich liegen, in dem die Bildung von «-Glycosylsteviosid durch die Einwirkung von «-GIucosyltransferase(n) herbeigeführt wird, weshalb ein pH-Wert von 3 bis 10 und eine Temperatur von 20 bis 80^cC gewählt werden. Bei der Umsetzung hängt die Menge an verwendetem tnzym eng mit der Reaktionsdauer zusammen. Deshalb wird aus wirtschaftlichen Gründen normalerweise eine Enzymmenge verwendet, die ausreicht, um die Umsetzung in etwa 5 bis 80 h vollständig ablaufen zu lassen.

Die Umsetzungslösung, in der auf diese Weise «-Glycosylsteviosid gebildet wird, kann als Ganzes ais Süßungsmittel verwendet werden. Gewünschtenfalls wird die Umsetzungslösung erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren, filtriert, durch Hindurchleiten des Filtrats durch ionenaustauscherharze, wie stark saures lonenaustauscherharz vom Η-Typ und schwach basisches lonenaustauscherharz vom OH-Typ, entsalzt und zu einem sirupösen Süßungsmittel konzentriert, oder das Konzentrat kann getrocknet und zu einem pulverförmigen Süßungsmittel pulverisiert werden. Zum Konzentrieren, Trocknen und Pulverisieren kann jede beliebige Methode angewandt werden, wie beispielsweise Vakuumverdampfen. Vakuumtrocknen und Sprühtrocknen. Die Süße des erhaltenen «-Glycosylstevrosid enthaltenden Süßungsmittel ist im aligemeinen ungefähr gleich derjenigen oder nur geringfügig schwächer als diejenige der gleichen Gewichtsmenge Steviosid, die in die Umsetzung eingesetzt wurde. Außerdem ist die Süße des erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittel mild, weich, rund und angenehm, verleiht kaum einen bitteren ' oder adstringierenden Geschmack und weist außerdem keinen langer anhaltenden Nächgeschmack auf.

Das gebildete «-Glycosylsteviosid sowie in dem erfindungsgemäß hergestellten sirupösen Süßungsmittel vorhandenes, nicht umgesetztes Steviosid kristallisieren selbst nach längerem Aufbewahren nicht aus. Das erfindungsgemäß hergestellte pulverförmigc Süßungsmittel ist eine sog. pulverförmige Fesistofflösung, bei der sich das gebildete «-Glycosylsteviosid, nicht umgesetztes Steviosid sowie umgesetzte und nicht umgesetzte a-Glucosylzuckcrverbindungen wechselseitig lösen. Demzufolge ist die Wasserlöslichkcit des pulverförmigen Süßungsmittel so groß, daß es sich unbegrenzt und sofort löst: es löst sich selbst mit hoher Konzentration ohne weiteres zu einem Sirup oder eine Paste.

Wie oben beschrieben, ist das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel von herkömmlichen Stevio-,sidprodukten oder einfachen Gemischen, die Steviosid und andere Süßungsmittel enthalten, dadurch verschieden, daß es sich vermöge seiner beträchtlich höheren Löslichkeit ohne weiteres und ohne Erwärmen löst. Wie im folgenden im einzelnen beschireben, kann dieses Merkmal zur Erzielung hervorragender Ergebnisse bei der Süßung von pulverförmigen Instantnahrungsmilleln. ersten Nahrungsmitteln (sog. first foods), sowie •bequem zubereitbaren Nahrungsmitteln (sog. convenient foods) und Bestandteilen davon ausgenutzt werden.

Das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel kann als Ganzes zum Süßen von Nahrungsmitteln und ,Getränken verwendet weiden. Das Süßungsmittel kann auch mit anderen Süßungsmittel vermischt werden, wie beispielsweise mit Stärkesirupen, Glucose, Maltose, isomerisiertem Zucker, Saccharose, Honig. Ahornzukker. Sorbit, Maltit, Dihydrochalon, L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester. Saccharin, Alanin und Glycyrrhizin, sowie mit Füllstoffen, wie Dextrinen, Stärke und Lactose, Aromastoffen und Farbstoffen vermisch! werden.

Unter den erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittel können die pulverförmigen Produkte als solche oder nach Verformen zu Granula, Kugeln und Tabletten 'mit Hilfe geeigneter zugesetzter Füllstoffe und Bindemittel verwendet werden, während im Falle von sirupösen Produkten die Konzentration entsprechend ■dem Endverbrauch eingestellt und der Sirup in beliebigen Behältern verpackt werden kann.

Da. wie oben beschrieben, die Süße des erfindungsgemäß ncrgcsteiiierr Süßungsmiiicls etwa gleich oder nur geringfügig schwächer ist als die derselben Feststoffgewichtsmenge Steviosid, die in die Umsetzung eingesetzt wurde, variiert die Süße mit dem Verhältnis von Steviosid zu «-Glucosylzuckerverbindung, das bei der Umsetzung angewandt wurde. Die Süße, die unter Anwendung eines Verhältnisses von Steviosid zu a-Glucosylzuckcrverbindung von etwa 1 :50 bis 100 erzielt wird, ist im allgemeinen gleich der Süße von Saccharose, bezogen auf trockene Feststoffe.

Wenn das Verhältnis jenseits von etwa I : 100 liegt und insbesondere wenn gelatinierte Stärke, partielles Stärkehydrolysat oder ein Maltooligosaccharid als «-Glucosylzuckerverbindung verwendet wird, ist die erhaltene Süße schwächer als diejenige von Saccharose, bezogen auf trockene Feststoffsubstanz. Deshalb kann ein derartiges Süßungsmittel als ein Süßungsmittel verwendet werden, das Nahrungsmitteln, Getränken. Zuckerwaren und Arzneimitteln eine erwünschte Textur, wie beispielsweise Dicke, Viskosität, Konsistenz, Schwere oder Körper verleiht und das die Süße des Endproduktes vermindert.

Wenn andererseits das Verhältnis jenseits von etwa 1 :50 liegt, ist die Süße des erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittel:) im allgemeinen größer als diejenige

von Saccharose, bezogen auf trockene Feststoffe: die Süße wird umgekehrt proportional zur Abnnahme des Verhältnisses verstärkt. Völlige Beseitigung des Anteils der a-Glucosylzuckerverbindung aus dem erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittel führt zu einer Zunahme der Süße auf etwa das 50- bis lOOfache der Süßkraft von Saccharose. Die Verbindung derartiger, in ihrer Süßkraft verstärkter 'jßungsmittel zum Süßen Von Nahrungsmitteln, Getränken und Zuckerwaren führt zu einer Senkung ihres Nährwertes, dt beirächtlieh weniger Süßungsmittel zur Erzielung derselben Süße erforderlich ist, wie sie durch Saccharose bewirkt wird. Mit anderen Worten, das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel kann als nährwertarmes, diätetisches Süßungsmittel für Korpulente, Diabetiker und solche Personen verwendet werden, deren Nahrungsaufnahme beschränkt wird, sowie zum Süßen von nährwertarmen, diätetischen Nahrungsmitteln. Getränken und Zuckerwaren, d. h. für die sog. Schönheitsdiät, Gesundheitsdiät und andere Diäten.

Außerdem kann das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel als Süßungsmittel verwendet werden.das nur im geringen Maße Karies erzeugt, da es von kariogenen Mikroorganismen nur schlecht vergärbar ist. Anwendungsgebiete hierfür sind Nahrungsmittel und Getränke einschließlich Zuckerwaren, die nur im geringen Maße Karies hervorrufen, wie beispielsweise Kaugummis. Schokoladen. Biskuits, Kekse. KaramelboHDons, Sahnckaramellen und Bonbons: alkoholfreie Getränke, wie beispielsweise Cola, Fruchtsäfte, Kaffee. Tee und Getränke auf Milchsäurebasis; alkoholische Getränke: ferner Zahnpulzmittel, Mundwasser und Arzneimittel, die dem gleichen Zweck dienen.

Da das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel mit Nahrungsmittelbeslandteilen oder Nahrungsmittelzusätzen, die andere Geschmacksrichtungen, wie Säure. Salzigkeil. Adstringenz. Bitterkeit und allgemeine Schmackhaftigkeit betreffen, verträglich ist und mit ihnen gut und zweckmäßig harmonisicrt. so daß Geschmack und Qualität der Endprodukte verbessert ή> werden und das Süßungsmittel auch äußerst widerstandsfähig gegenüber Säuren und Hitze ist. kann es in beliebigem Ausmaß in Nahrungsmitteln. Getränken und Genußmittcln auch außerhalb der oben beschriebenen Produkte ganz allgemein verwendet werden, wobei es -»5 zufriedenstellende Ergebnisse liefert und zu einer Verbesserung des Geschmacks der Erzeugnisse führt.

Weiterhin kann das Süßungsmittel auch als Geschmacksverbesjcrer für solche Nahrungsmittel verwendet werden, die an Haustiere verfüttert werden, wie beispielsweise Rindvieh. Pferde. Geflügel. Fische. Bienen und Seidenraupen.

Das Süßungsmittel kann auch /.um Süßen verschiedener Tabakwaren, Genußmitlei, Kosmetika und Arzneimittel verschiedener Form (Feststoffe, Pasten, Flüssigkeiten) verwendet werden, wie beispielsweise für Lippensalbc, Lippenstifte, Zahnputz.nittel. Munderfrischungsmiitel. Mundwasser, Atemrein.igungstabletten, Paslilien, Zuckerbeschichtungstropfen von Lebertran oder einzunehmende Medizin.

Das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel kann auch in beliebiger Weise als Geschmacksverbesserungsmittel verwendet werden.

Zur Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittel in den oben beschriebenen Nahrungsmitteln. Getränken, Zuckerwaren, Futtermitteln, Kosmetika oder Zahnputz- und Arzneimitteln kann jede beliebige bekannte Methode angewandi werden.

beispielsweise Einmischen, Einknctcn, Lösen, Eintauchen, Durchdringenlassen. Dispergieren, Beschichten. Besprühen und Tränken.

Das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel wird nun im folgenden anhand von Versuchen näher beschrieben.

Versuch 1

Herstellung des Süßungsmittel·;
1-(1) Herstellung von a-Glucosyltransferase

10 Liter eines sterilisierten Kulturmediums mit einem Gehalt von 2% (Gewicht/Volumen) löslicher Stärke. 1% (Gewicht/Volumen) Ammoniumnitrat. 0.1% (Gewicht/Volumen) Dikaliumhydrogenphosphat, 0.05% (Gewicht/Volumen) Magnesiumsulfat - 7 H:O. 0.5% (Gewicht/Volumen) Maiseinweichflüssigkeit und 1% (Gewicht/Volumen) Calciumcarbonat wurden mil einem Stamm von Bacillus Stearothermophilus FERM-P Nr. 2222 beimpft und das Gemisch bei 50°C drei Tage lang unter Belüften und Rühren bebrület. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsuffat (Sättigung 0.7) ausgesalzt, wodurch ein rohes Enzympräparat mit einer Aktivität von etwa 80 000 Einheiten erhalten wurde. Die enzymatische Aktivität wurde wie folgt festgestellt. Ein Gemisch, das durch Zugabe von 0.2 ml einer Enzymlösung zu 5 ml einer Lösung mit einem Gehalt von 0.3 g/dl löslicher Stärke, 0,02 Mol/l Acetatpuffer vom pH 5.5 und 10 ' Mol/l Calciumchlorid hergestellt war, wurde 10 min bei 40"C reagieren gelassen. Ein aliquoter Teil von 0.5 ml des Umsctzungsgrnisches wurde entnommen, in 15 ml 0,02 η Schwefelsäure gegossen, um die Umsetzung zu beendigen und nach Zusatz von 0.2 ml 0.1 π |od/|od/Kali-Lösung bei 660 nm auf die optische Dichte uniersucht. Als Aktivitätseinheit wurde die En/ymmenge bestimmt, die bei 40°C innerhalb 10 min das Verschwinden eines Jodflecks in 15 mg löslicher Stärke bewirkte.

I-(2) Umsetzung

200 g Sievia/ucker der Morita Kagaku Kogyo Co.. Ltd. Osaka, Japan, bestehend aus annähernd gleichen Mengen an gereinigtem Steviosid und Lactose, im folgenden als handelsübliches Steviosid bezeichnet, und 1000 g Maltodextrin vom Dextroseäquivalent 30 wurden unter Erhitzen in 3000 ml Wasser gelöst. Nach Abkühlen auf 60"C wurde die Lösung mit 1000 Einheiten roher Cyclodextrin-Glucanotransferase, die in Versuch 1-(1) erhalten worden war, versetzt, der pH-Wert auf 6,0 eingestellt und das Ganze 40 h bei 6O⁰C bebrütet. Nachdem die Umsetzungslösung 10 min bei 95°C gehalten wurde, um das Enzym durch Wärme zu inaktivieren (die Herstellung entspricht Probe 3 in der folgenden Tabelle I), wurde das durch Filtrieren erhaltene Filtrat mit einer geringen Menge Alktivkohle entfärbt und anschließend durch Hindurchleiten durch Ionenaustauscherharze Amberlite (geschützte Bezeichnung) IR-200C (Η-Typ) und Amberlite IRA-93 (OH-Typ) von Rohm und Haas Co., Philadelphia USA bei einer Raumgeschwindigkeit von. 2 entsalzt. Anschließend wurde die Lösung bei 70°C oder darunter unter vermindertem Druck eingedampft und zu einem Pulver getrocknet (die Herstellung entspricht Probe Nr. 4 in Tabelle I). Vergleichsproben wurden wie folgt erhalten:

Vcrgleichsprobe 1 wurde wie Probe 3, jedoch mit der Abweichung hergestellt, daß Dextrin und Enzym weggelassen wurden. Vergleichsprobe 2 wurde eben-

Tabellc I

falls wie Probe 3, jedoch mit der Abweichung hergestellt, daß das zu ihrer Herstellung verwendete Enzym durch Er-hitzen vorher inaktiviert wurde.

Probe

1
Vergleich

2
Vergleich

gemäß Erfindung

gemäß Erfindung

Ausgangs- 200 g handelsübliches 200 g handelsübliches 200 g handelsübliches 200 g handelsmaterial Steviosid Steviosid Steviosid übliches Steviosid

Bemerkungen

1000 g Maltodextrin

1000 Einheiten Enzym, zuvor inaktiviert dujch Erhitzen

1000 g Maltodextrin
1000 Einheiten Fnrym

rohes, flüssiges
Süßungsmittel, durch
Erhitzen hergestellt

1000 g Maltodextrin 1000 Einheiten

pulverförmiges
Süßungsmittel,
hergestellt durch
Reinigen una
Trocknen von
Probe 3

Versuch 2

30

Geschmacksteste
2-(l) Vergleich der Süße

Die Konzentration jeder Geschmackstestlösung wurde je nach dem Ergebnis von Vorversuchen zur Angleichung der Süße eingestellt. Im einzelnen wurde die Konzentration der Vergleichsproben auf eine Konzentration an handelsüblichem Steviosid von 0,13% (Gewicht/Volumen) und die Konzentration für das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel so eingestellt, daß sie einer Konzentration von ü,20% (Gewicht/ •Volumen) an handelsüblichem Sleviosid entsprach.

Die Mitglieder einer Jury gaben die Ergebnisse ihrer Geschmacksuntersuchung auf Süßigkeit in bezug auf eine Lösung aus granulierter Saccharose von bestimmter Konzentration ab, indem sie angaben, ob sie die •Versuchslösung süßer, weniger süß oder genauso süß ;wie die Saccharoselösung gefunden hatten. Die ■ Versuche wurden mit einer Jury aus 20 Mitgliedern bei -Raumtemperatur durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II	Probe 1	gleich süß	weniger süß	2	g.s.	W. S.	3	g. S.	W. S.	4	g. S.	W. S.
Saccharose % (Gew./Gew.)		5	2		3	2		/	/		/	/
		2	8		5	7		/	/		0	0
	Vergleich	4	12	Vergleich	3	'14	erfindungsgemäß	2	2		4	1
	Vergleich der Süße (Süßkraft)	3	16		2	17		5	5		6	6
6	süßer	2	13	S.	1	•19	S.	4	9	erfindungsgemäß	6	14
7	13	I	/	15	/	I	/	3	15		6	14
8	10	I	I	8	/	I	I	2	18	g-	2	18
9	4			3			16			/
10	1		1		10		20
11	0		0		7		15
12	I		I		2		8
	I	I	0	0
		0
0

Bern.: Die Zahlen bedeuten die Anrihl der Voten.

Wie die Ergebnisse der Tabelle Il zeigen, war das 65,.'auf die 8- und 9%ige Saccharoselösung das Verhältnis Voten verhältnis bei Probe 1 von »süßer« zu »weniger "4:12 bzw. 1:16 betrug. Aufgrund des ausgeglichenen süß« in bezug auf die damit verglichene 6- und 7°/aige 'Verhältnisses wurde festgesetzt, daß Probe 1 und die Saccharoselösung 13 :2 bzw. 10:8, während in bezug . 7%ige Saccharoselösung annähernd gleich in ihrer Süße

waren.

Analog erwies sich auch Probe 2 mit der 7%igen Saccharobeiösung als annähernd gleich süß. Somit wurde die Süßkraft von ⁿrobe 1 als derjenigen einer 7%igen Saccharoselösung entsprechend angesehen. Analog wurde die Süßkraft von Probe 3 als derjenigen einer 10%igen Saccharoselösung und die Süßkraft von Probe 4 als derjenigen einer 9%igen Saccharoselösung entsprechend angesehen.

Demzufolge wurden zwischen der Süßkraft der Proben 1 und 2. bezogen auf die Menge an handelsüblichem Steviosid. die in beiden Proben,

10

bezogen auf trockene Festsioffsubstanz, verwendet wurde, keine Unterschiede festgestellt, und die Süßkraft wurde als das 53faclie der Süßkraft von Saccharose errechnet. Bei den Proben 3 und 4 errechnete sich die Süßkraft als das 50- bzw. 45fache derjenigen von Saccharose, d. h. ihre Süßkraft war annähernd gleich derjenigen bzw. geringfügig niedriger als diejenige der Proben 1 und 2. Mit anderen Worten liegt die Süßkraft der ei findungsgemäß hergestellten Süßungsmittel annähernd auf dem gleichen Wert oder ist nur geringfügig niedriger als diejenige -on Steviosid in der als Material verwendeten Menge.

2-(2) Vergleichsversuche zur Qualität der Süße

Es wurden mit den Vergleichsproben 1 und 2 und den Proben 3 und 4 der erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittel Untersuchungen über die Qualität ihrer Süße durchgeführt.

Dazu wurden wäßrige Lösungen der obigen Proben so hergestellt, daß eine Süße bzw. Süßkraft erhallen wurde, die derjenigen einer 5%igcn, 10%igen bzw. ■5%igcn wäßrigen Saccharoselösung entsprach: hierzu wurden Berechnungen auf der Grundlage der Ergebnisse von Versuch 2-(I) durchgeführt. Die |ury aus den 20 Mitgliedern wurde dahingehend angewiesen, daß sie bei Raumtemperatur unter den wäßrigen Versuchslösungen der Proben 1 bis 4 die entsprechenden Proben heraussuchen sollte, die die am meisten und am wenigstens wünschenswerte Süße aufweisen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III 'zusammengefaßt.

Tabelle III

Qualität der Süße	Probe	am	10	2	am	10	3	am	0	4	am	0
Süße, entsprechend	J	wenigsten	8	Vergleich	wenigsten	12		meisten wenigsten	0		meisten wenigsten	0
	Vergleich	wünschenswert	11	am	wünschenswert	9		wünschenswert	0		wünschenswert	0
	am	0		meisten	0		erfindungsgemäS	4		erfindungsgemäß	16
	meisten	0		0	am	6	am	14
		0		0	7	13
5% Saccharoselösung
10% Saccharoselösung
15% Saccharoselösung

Bern.: Die Zahlen bedeuten die Anzahl der Voten.

Wie sich aus den Ergebnissen von Tabelle IH ergibt, wurde die Qualität der Süße der Vergleichsprobe 1 und 2 auf jeder Süßkraftstufe als am schlechtesten eingruppiert, so daß zwischen den Proben 1 und 2 keine Unterschiede festgestellt wurden, während die Qualität der Süße der Proben 3 und 4 auf jeder Süßkraftstufe überlegen war. Insbesondere das wdtergereinigte Süßungsmittel gemäß Probe 4 erwies sich hinsichtlich der Qualität seiner Süße als der Probe 3 leicht überlegen. Die Voten der Jurymitglieder in bezug auf die Qualität der Süße sind in der folgenden Tabelle IV zusammengefaß'..

Tabelle IV

Süße, entsprechend Probe

1
Vergleich

2
Vergleich erfindungsgemäß

erfindungsgemäß

5% Saccharoselösung

süß., bitter, adstringierend, kein langer anhaltender Nachgeschmack, schlecht
unverändert zu
verwenden

süß, bitter, adstringierend, kein langer anhaltender Nachgeschmack, schlecht unverändert zu verwenden süß, leicht, weich, rund, angenehm, ähnlich Saccharose, kein länger anhaltender Nachgeschmack, mit Vorteil unverändert verwendbar

süß, weich, rund, angenehm, ähnlich Saccharose, kein langer anhaltender Nachgeschmack, mit Vorteil unverändert verwendbar

	15	28 26 560	2	16	3	4
			Vergleich		erfindungsgcmilß	erflndungsgcmiiu
Fortsetzung	Probe		süß, scharf, stimulie		süß, weich, rund.	süß, weich, rund,
SOBe, entsprechend	1		rend, stark bitter,	angenehm, ähnlich	angenehm, ähnlich
	Vergleich	adstringierend, kein	Saccharose, kein	Saccharose, kein
	süß, scharr, stimulie	länger anhaltender	länger anhaltender	länger anhaltender
10% Saccharose	rend, stark bitter,	Nachgeschmack,	Nachgeschmack,	Nachgeschmack,
lösung	adstringi&iend, kein	schlecht unverändert	mit Vorteil unver	mit Vorteil unver
	langer anhaltender	zu verwenden	ändert verwendbar	ändert verwendbar
	Nachgeschmack,	süß, scharf, stimulie	süß, weich, rund.	süß, weich, rund.
	schlecht unverändert	rend, bitter, adstrin	angenehm, ähnlich	angenehm, ähnlich
	zu verwenden	gierend, kein langer	Saccharose, kein län	Saccharose, kein
	süß, scharf, stimulie	anhaltender Nachge	ger anhaltender	länger anhaltender
15% Saccharose	rend, bitter, adstrin-	schmack, schlecht	Nachgeschmack, mit	Nachgeschmack,
lösung	gierend, kein langer	unverändert zu	Vorteil unverändert	mit Vorteil unver
	anhaltender Nachge	verwenden	verwendbar	ändert verwendbar
	schmack, schlecht
	unverändert zu
	verwenden

Wie die ob'gen Ergebnisse zeigen, besitzt das erfindungsgemäß hergestellte Süßungsmittel im Gegensatz zu dem herkömmlichen Steviosid oder einem Gemisch aus Steviosid und anderen Süßungsmittel eine milde, weiche, runde und angenehme Süße, die derjenigen von Saccharose sehr stark ähnelt, ohne daß ein unerwünschter, langer anhaltender Nachgeschmack auftritt, so daß die erfindungsgemäß hergestellten Süßungsmittel ausgezeichnet sind und unmittelbar im Mund eine angenehme und erfreuliche Süße ergeben.

Versuch 3
Löslichkeitsvergleich

Anteile der Proben 2 und 3, die in Versuch l-(2) hergestellt worden waren, wurden in Reagenzgläser überführt und 15 Tage in einem bei 4°C gehaltenen Raum stehengelassen. Danach wurden sie auf ihre Wasserlöslichkeit hin verglichen. Wie sich aus Fig. 1 ergibt, in der die Ergebnisse dargestellt sind, fand bei Probe 2 eine Kristallisation statt, d.h. sie wurde weiß und trüb, während Probe 3 mit dem erfindungsgemäß hergestellten Produkt durchsichtig blieb und eine stark verbesserte Wasserlöslichkeit aufwies.

Probe 4, die durch Reinigen, Eindicken und Trocknen von Probe 3 erhalten worden war, war eine sog. feste Lösung, in der die Bestandteile ar-Glycosylsteviosid, Steviosid und Λ-Glucosylzuckerverbindungen voneinander gegenseitig gelöst wurden, wobei die Löslichkeit so groß war, daß die Probe sich unmittelbar in Wasser löste und selbst mit hohen Konzentrationen ungehindert zu einer Paste löst.

Versuch 4,
Identifizierung der *-Glycosylstevioside

5 g der in Versuch 1 -(2) erhaltenen Probe 4 wurden einem Lösungsmittelsystem aus 200 ml mit Wasser gesättigtem n-Butanol und 200 ml Wasser in einem Scheidetrichler zugesetzt, worauf die Ä-Glucosylzuckerverbindungen und Glycoside in Probe 4 extrahiert und mit dem Lösungsmittelsystem aufgeteilt und die n-Butanol-Phase gesammelt wurde. Nach Trocknen des erhaltenen Feststoffs unter vermindertem Druck zur Entfernung des n-Butanols wurde das getrocknete Produkt in einer geringen Menge Methanol gelöst, wonach übers*, flüssiger Äthyläther zugesetzt und der gebildete Niederschlag gesammelt und unter vermindertem Druck getrocknet und pulverisiert wurde. Es wurden 500 mg eines pulverförmigen Produktes (Probe 5) erhalten. Probe 5 löste sich sehr leicht in Wasser und war eine farblose, weißgefarbie und neutrale Substanz, die eine milde, weiche, runde und angenehme Süße aufwies. Sie löste sich auch teilweise in niedrigmolekularen Alkoholen, wie Methanol, Äthanol und n-Butanol. war jedoch nur schlecht in Chloroform und Äthyläther löslich. Das Infrarotspeklrum der Probe 5 in KBr ist in der Fig.2 dargestellt. Das UV-Spektrum zeigte keine charakteristische Absorption.

Eine wäßrige Lösung, die durch Lösen eines Teiles der Probe 5 in einer geringen Menge Wasser hergestellt worden war, eine wäßrige Lösung von Probe 1. die in gleicher Weise wie Probe 5 gereinigt worden war, sowie eine Lösung von D-Glucose als Vergleichsubstanz wurden auf eine mit Silicagel 60 (Merck & Co., Inc., New Jersey, USA) beschichtete Dünnschichplatte aufgebracht, und es wurde eine eindimensionale Entwicklung in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform, Methanol und Wasser (30 :20 :4) durchgeführt. Danach wurde .die Dünnschichtplatte hinreichend an Luft getrocknet. Danach wurde sie mit einer 0,1 in Acetatpuffcrlösung vom pH-Wert 4,8, in der handelsübliche kristalline Glucoamylase gelöst war. besprüht und 2 h bei 50⁰C stehengelassen, wobei darauf geachtet wurde, dab ein Trocknen verhindert wurde. Danach wurde die Platte • hinreichend an Luft getrocknet, und es wurde mit demselben Lösungsmittelsystem eine zweidimensional 'Entwicklung der Platte durchgeführt. Nach dem Trocknen wurde die Platte mit einer methanolischen Lösung, die 50% Schwefelsäure enthielt, besprüht, erwärmt und entwickelt. Das Chromatogramm ist in Fig.3 dargestellt. Wie aus Fig.3 hervorgeht, wurden bei der Vergleichsprobe 1 aufgrund der eindimensionalen Entwicklung zusätzlich zu dem Steviosidfleck mit äem Rf-Werk 1,00 kleine Flecken von Rebaudiosid A vom Rf-Wert 0,88 und Rebaudiosid B vom Rf-Wert 1,17 gefunden. Demgegenüber zeigt das Chromatogramm der Probe 5, daß außer den Flecken von Steviosid und ..den Rebaudiosiden sechs neue Flecken von Subcianzen auftreten, die in abnehmender Reihenfolge ihrer

Rf-Werte 1,09.0,80.0.67.0.62.0.51 und 0,48 mil a. b. c, d, e bzw. f bezeichnet wurden.

Das Ergebnis der zweidimensionalen Entwicklung, das erzielt wurde, nachdem Giucoamylase auf Probe 5 einwirken gelassen wurde, ergab, daß Flecken von Rebatidiosid B(Ri 1.17) und von D-Glucose(Rf 0.45) von Substanz a stammten; Flecken von Sieviosid (Rf 1.00) und D-Glucose (Rf 0.45) von Substanz b: Flecken von Substanz b, Steviosid (Rf 1.00) und D-Glucose (Rf 0,45) von Substanz d und Flecken von Substanz b. Steviosid (IU 1.00) und D-Glucose (Rf 0.45) von Substanz f. Analog stimmten Flecken von Rebaudiosid A (Rf 0,88) und D-Glucosi: (Rf 0,45) von Substanz c und Flecken von Substanz c. Rebaudiosid A (Rf 0.88) und D-Glucose (Rf 0.45) von Substanz e.

Aus diesen Ergebnissen wrd ersichtlich, daß die .Substanzen a bis f durch die Einwirkung von Giucoamylase entweder unmittelbar in D-Glucos·* und Stevios d bzw. Rebaudiosid oder zunächst zu DGIucosedcrivalcn von Steviosid bzw. Rcomidiosirl und diese . schließlich zn D-Glucose und .Sieviosid bzw. D-Glucose und Rebaudiosid zersetzt wurden. Daraus wurde geschlossen, daß Substanz u ein Produkt war, in dem D-Glucose durch eine λ-Verknüpfung an Rcbaudiosici B gebunden ist. und daß b. d und f Substanzen sind, in »denen ein Mol Sieviosid ebenfalls mit einer rtt-Verknüpfung an ein oder mehrere Mole D-Glucose gebunden sind. Mit anderen Worten, die Flecken wurden als solche von ot-Monoglucosylsleviosid. «-Diglucosylsteviosid bzw. Λ-Triglucosylsteviosid ermittelt. Analog ergab sich. daß c und e *-Monoglucosylrebaudiosid A bzw. Λ-Diglucosylrebaudiosid A sind.

Die Substanzen a bis f zersetzten sich auch zu Steviosid und D-Glucose bzw. Rebaudiosid und '■- D-Glucose. wenn eine teilweise gereinigte /x-Glucosidase, die aus Schweineleber extrahiert worden war, in analoger Weise auf sie einwirken gelassen wurde. Die Substanz f erwies sich als durch die Einwirkung von handelsüblicher kristalliner /?-Amylase leicht zu Substanz b und Maltose zersetzbar.

Aus diesen Ergebnissen gehl hervor, daß die durch die Einwirkung von Λ-GIucosyltransferase neu gebildeten Substanzen solche sind, in denen 1 Mol Steviosid durch «-Verknüpfung mit einem oder mehreren Mol D-Glucose bzw. ein Mol Rebaudiosid durch «.-Verknüpfung mit einem oder mehreren Mol D-Glucose verknüpft sind. Dies legt die Vermutung nahe, daß diese Substanzen auch im Menschen oder im Tier in vivo in Steviosid oder Rebaudiosid zeaetzbar sind.

Eine in gleicher Weise wie Probe 5 hergestellte Probe wurde an Silicagel in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform, Methanol und Wasser (60 : 30 :5) zur Isolierung der Substanz b der Säulenchromatographie unierzogen, wonach die isolierte Substanz zu einem Pulver getrocknet wurde. Sie war ein äußerst leicht wasserlösliches, geruchloses und weißgefärbtes Süßungsmittel mit einer milden, weichen, jedoch intensiven Süße und einem pH-Wert um den Neutralpunkt.

Sie war außerdem teilweise löslich in niedrigmolekularen Alkoholen, wie Methanol, Äthanol und n-Butanol, jedoch schwer löslich in Chloroform und Äthyläther, Das Infrarot-Spektrum der Substanz b in KBr ist in F i g. 4 dargestellt.

Da Probe 5 als eine erfindungsgemäß hergestellte Substanz eine ausgezeichnete Süße besitzt und frei von einem länger anhaltenden Nachgeschmack sowie äußert leicht wasserlöslich ist, ähnlich wie die Proben 3 und 4 gemäß Versuch 2-(2), kann also die Aufgabe der Erfindung, die darin besteht, die Nachteile von Sieviosid zu beseitigen, durch das in den vorstehenden Ansprüchen aufgezeigte Verfahren gelöst werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Fünf Liter eines sterilisierten Kulturmediums mit einem Gehalt von 4% (Gewicht/Volumen) Maltose, 0,1% (Gewicht/Volumen) Kaliumdihydrogenphosphat, 0.1% (Gewicht/Volumen) Ammoniumnitrat, 0,05% (Gewicht Volumen) Magnesiumsulfat ■ 7 HvO. 0,05% (Gewicht/Volumen) Kaliumchlorid, 0.2% (Gewicht/Volumen) Polypepton und 1% (Gewicht/Volumen) Calciumcarbonat. das getrennt durch trockenes Erhitzen steri5Üiert und aseptisch zu dem beimpften Medium zugegeben worden war. wurden mit einem Stamm von Mucor javanicus IFC) 4570 beimpft und 44 h bei 30 C unter Belüften und Rühren bebrütet. 480 g des feuchten Jvlycels. das aus der Kulturlösung erhallen worden war. wurden zu 51 0.5 in Acetatpufferlösung vom pH 5,3 in 4 in Harnstofflösung hinzugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 40 h bei 3O⁰C stehengelassen. Die überstehende Flüssigkeit des Gemisches wurde über Nacht gegen laufendes Leitungswasser dialysicrt. mit Ammoniumsulfat auf 0,9 gesättigt (saturated to 0,9 ammonium sulfate) und über Nacht bei 4⁰C stehengelassen. Danach wurden die ausgefällten Bestandteile durch Zentrifugieren gesammelt. Nach Suspendieren der Ausfällung in 100 ml Acetatpuffer vom pH 6,0 wurde das Gemisch zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit als Λ-Glucosidase (E.C. 3.2.1.20) verwendet.

15 g handelsübliches Steviosid und 300 Maltodextrin vom Dextroseäquivalent 40 "vurden in einem Liter heißem Wasser gelöst und das Gemisch auf 50⁰C gekühlt, mit der oben beschriebenen a-Glucosidaselösung versetzt und 24 h bei 50°C und bei einem pH-Wert von 6,0 stehengelassen. Die Umsetzungslösung wurde erhitzt, um das in ihr befindliche Enzym zu inaktivieren, und anschließend filtriert. Das Filtrat wurde durch Hindurchleiten durch Ionenaustauscherharze (Amberlite IR-120B (Η-Typ) und Amberlite IRA-94 (OH-Typ) (Rohm & Haas Co., Philadelphia. USA) entsalzt und unter vermindertem Druck eingedampft. Die erhaltene Lösung war ein flüssiges Süßungsmittel mit einem Wassergehalt von 30% (Gewicht/Gewicht). Die Ausbeute an dem flüssigen Süßungsmittel betrug 97%, bezogen auf trockene Festsubstanz und eingesetztes Material. Das Süßungsmittel war etwa zweimal so süß wie Saccharose, bezogen auf feste Trockensubstanz, und von einem länger anhaltenden Nachgeschmack frei. Es konnte ohne weiteres zum Süßen verschiedener Nahrungsmittel, Getränke und Süßwaren verwendet werden.

Insbesondere kann es als nur geringfügig Karies erzeugendes Süßungsmittel verwendet werden, weil orale Karies erzeugende Mikroorganismen es nicht in Wasser unlösliches Glucan umwandeln.

Beispiel 2

Fünf Liter des in Versuch 1-(1) beschriebenen Kulturmediums wurden mit einem Stamm von Bacillus Megaterium FERM-P Nr. 935 beimpft, und das Gemisch wurde 3 Tage unter Belüften und Rühren bebrütet. Nach Beendigung des Bebrütens wurde die erhaltene Kulturbrühe zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat (Sättigung 0,7) ausgesalzt und anschließend zentrifugiert, wodurch ein Niederschlag

erhalten wurde.

Der Niederschlag enthielt 300 000 Einheiten Cyclodextringlucanotransferase (E.C. 2.4.1.19), bestimmt nach de. in Versuch l-(l) beschriebenen Methode. Eine 30% (Gewicht/Gewicht) Süßkartoffelstärke-Aufschlämmung vom pH 6,0 wurde mit 0.2%, bezogen auf das Stärketruckengewicht. an einem handelsüblichen verflüssigenden Enzym versetzt, und das Gemisch wurde kontinuierlich bei 85 bis 95"C verflüssigt. Die Zersetzung des Gemisches wurde bei 80°C bis zu einem Dextroseäquivalent von 20 durchgeführ', und das verflüssigende Ln/ym wurde durch Erhitzen inaktiviert. Danach wurde handelsübliches Steviosid in der verflüssigicn Stärkt gelöst, so daß man ein Gemisch aus einem Teil handelsüblichem Steviosid und drei Teilen partiellen Stärkehydrolysats, bezogen auf trockene Festsubstan/. erhielt. Das Gemisch wurde auf 50C gekühlt, mit 10 Einheiten Cyclodextringlucanotransferase je Gramm Stärke versetzt und bei 50° C und einem

' pH-Wert von 6,0 48 h lang bebrütet. Nach Inaklivieren " des Enzyms in dem Umsetzungsgemisch durch tsrhiizen wurde das erhaltene Produkt analog, wie in Beispiel beschrieben, gereinigt, unter vermindertem Druck

' eingedampft, getrocknet und pulverisiert, wobei man ein pulverförmiges Süßungsmittel in einer Ausbeute von 'etwa 95%, bezogen auf trockene Festsubstanz, erhielt. Da das Süßungsmittel nur schwach hygroskopist h war.

'ließ es sich leicht handhaben. Seine Wasserlöslichkeit war jedoch sehr hoch, und es löste sich leicht in kaliem Wasser und selbst in hoher Konzentration leicht zu einer Paste.

Das Süßungsmittel war etwa 15mal so süß wie Saccharose, bezogen auf trockene Festsubstanz, und es besaß eine milde, weiche, runde und angenehme Süße, die frei von einem langer anhaltenden Nachgeschmack war. Das Süßungsmittel kann überall da verwendet werden, wo ein Süßen erforderlich ist, insbesondere eignet es sich jedoch als Süßungsmittel mit geringer Neigung zur Karies-Verursachung sowie als nährstoffarmes Süßungsmittel.

Beispiel 3

300 g Kartoffelstärke und 100 g handelsübliches Steviosid wurden zu einem Liter Wasser hinzugegeben, und das Gemisch wurde anschließend mit handelsüblieher bakterieller verzuckernder «-Amylase (E.C. 3.2.1.1) in einer Menge von 10 Einheiten, bestimmt nach der in Versuch 1-(1) beschriebenen Methode, je Gramm Stärke versetzt und unter Rühren auf 80°C erhitzt. Nach Beendigung der Stärkeverflüssigung wurde das Gemisch auf 6O⁰C gekühlt und zwei Tage stehengelassen. Nach dem Inaktivieren der in dem erhaltenen Gemisch vorhandenen «-Amylase durch Erhitzen wurde das Gemisch in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft, getrocknet und pulverisiert, wonach man ein pulverförmiges Süßungsmittel in einer Ausbeute von etwa 95%. bezogen auf feste Trockensubstanz, erhielt.

Das Süßungsmittel besaß ähnliche Eigenschaften wie das gemäß Beispiel 2 erhaltene und kann ebenfalls verschiedenen Verwendungszwecken zugeführt werden.

Beispiel 4

Eine 30%ige (Gewicht/Gewicht) verflüssigte Stärkelösung vom Dextroseäquivalent 15 wurde nach demselben Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Zu der verflüssigten Stärke wurde handelsübliches Steviosid hinzugegeben und in ihr gelöst sowie der dritte Teil des Stärkematcrials an Saccharose sowie anschließend zwei Einheiten Cyclodextringlucanotransferase (E.C. 2.4.1.19) je Gramm Stärke, bezogen auf feste Trockensubstanz, wonach das Gemisch 24 h bei 60^cC umgesetzt wurde. Nach Inaktivieren des Enzyms durch Erhitzen wurde das erhaltene Gemisch nach dem in Versuch 1-(2) beschriebenen Verfahren gereinigt, eingedampft und getrocknet, wonach ein pulverförmiges Süßungsmittel erhalten wurde. Das Süßungsmittel war ein Gemisch mit einem Gehalt an «-Glycosylsteviosid und (X-Glycosylsaccharose, in dem die einzelnen Geschmackskomponenten dieser Verbindungen gut miteinander harmonisiert waren und eine ausgezeichnete Qualität der Süße ergaben. Das Süßungsmittel war etwa 15mal so süß wie Saccharose. Es kann als Süßungsmi'tel für verschiedene Zwecke verwendet werden. Insbesondere ist es. da seine Keduktiunsfähigkeil gering ist, ein geeignetes Süßungsmittel für Produkte, die Aminosäuren und Proteine enthalten, wie beispielsweise süßende Nahrungsmittel, Getränke, Zukkerwaren und Gewürzgurken, die bei ihrer Herstellung erhitzt werden. Da das Süßungsmittel kaum durch im Munde befindliche, Karies erzeugende Mikroorganismen in wasserunlösliches Glucan umgewandelt wird, ist es ein geeignetes Süßungsmittel für Nahrungsmittel und Getränke mit geringer kariesfördernder Eigenschaft.

Beispiel 5

Es wurde die in Versuch l-(2) beschriebene Umsetzung mit der Abweichung durchgeführt, daß das grünlich-ockerfarbene rohe Steviosid STV-B (Ikeda Tohka Industries Co., Ltd., Fukuyama, Japan) mit einem Gehalt von nur etwa 50% Steviosid anstelle des handelsüblichen Steviosids verwendet wurde.

Es wurde festgestellt, daß das erhaltene Süßungsmittel eine beträchtlich verbesserte Qualität der Süße aufwies als das Süßungsmittel, das unter Verwendung von gereinigtem Steviosid erhalten worden war. Das Süßungsmittel wurde analysiert. Dabei wurden große Mengen «-Glycosylrebaudiosid A und «-Glycosylrebaudiosid B neben a-Glycosylsteviosid gefunden.

Das Süßungsmittel war etwa lOmal so süß wie Saccharose und kann zum Süßen verschiedener Nahrungsmittel. Getränke, Zuckerwaren und Arzneimittel verwendet werden.

Bei der Herstellung des Süßungsmittel bietet die Entfernung der Färbung des Ausgangsmatcrials einige Schwierigkeiten, das Süßungsmittel kann jedoch mit Vorteil in Produkten, wie Sojabohnensoße, Gewürzgurken oder eingesalzenem Gemüse oder Nahrungsmittelkonserven, die in Sojasoße eingekocht worden sind, verwendet werden, wobei die Färbung nicht von so großer Bedeutung ist. Ein Vorteil liegt darin, daß als Ausgangsmaterial rohes Steviosid verwendet werden kann, das mit geringeren Kosten und in größeren Mengen hergestellt werden kann als gereinigtes Steviosid.

Beispiel 6

10 Liter eines Kulturmediums mit einem Gehalt von 4% (Gewicht/Volumen) Saccharose, 0,5% (Gewicht/ Volumen) Hefeextrakt, 0,8% (Gewicht/Volumen) KaIiumhydrogenphosphat, 2,4% (Gewicht/Volumen) Dikaliumhydrogenphosphat, 0,02% (Gewicht/Volumen) Magnesiumsulfat · 7 H₂O und 0,5% (Gewicht/Volumen) gereinigtem Steviosid wurden mit 1% einer Impfkultur von Leuconostoc Mesenteroides IAM 1151 beimpft und

das Gemisch 24 h bei 25°C der stationären Züchtung unterworfen. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit in gleicher Weise wie die Reaktionslösung gemäß Beispiel 1 gereinigt und eingedampft, wobei man ein flüssiges Süßungsmittel mit einem Wassergehalt von 30% in einer Ausbeute von etwa 60% erhielt.

Das Süßungsmittel besaß eine milde, weiche, runde und angenehme Süße, die etwa 20mul so süß war wie diejenige von Saccharose und die keine Kristallisation von Steviosid bewirkte. Da das Süßungsmittel hochviskos ist. verleiht es den Produkten, in denen es verwendet wird, zugleich Süße und eine wünschenswerte Viskosität. Es eignet sich vorteilhaftcrweise zum Süßen von beispielsweise Fruchtsaft, Sirup. Likör sowie von Gewürzgurken oder eingesalzenem Gemüse.

Das gleiche Kulturmedium, wie oben beschrieben, dem jedoch kein gereinigtes Steviosid zugesetzt worden war. wurde mit der oben angegebenen Impfkultur beimpfl und das Gemisch in gleicher Weise bcbrüiiM. Die aul diese Weise erhaltene Kiilturbriihe wurde zentrifugiert und die tiberstehende Lösung mit Ciilcuimphosphatgel vcrset/l.

Danach wurde das Gemisch gegen Leitungswasser dialysierl und die dialysierle Lösung erneut zentrifugiert, um das Calciumphosphalgel zu gewinnen. 100 ml der Lösung von Dextransaccharase (EC. 2.4.1.5). die durch Eluieren und Eindampfen einer Suspension des Gels in einer 0.2 m Natriumdihydrogenphosphailösung. die mit Ammoniumsulfat bis zu 0.35 gesättigt war. erhalten worden war. wurden mit 51 einer Lösung umgesetzt, die 4% (Gewicht/Volumen) Saccharose und 0,5% (Gewicht/Volumen) gereinigtes Steviosid enthielt, wobei die Umsetzung 10 h bei 30"C und einem pH-Wert von 5.3 durchgeführt wurde. Nach Inaktivierung durch Erhitzen wurde die Umselzungslösung in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, gereinigt und konzentriert, wonach man ein flüssiges Süßungsmittel in einer Ausbeute von etwa 90%. bezogen auf trockene Feststoffe, erhielt. Da der Gehalt an oc-Glycosylsieviosid in dem Süßungsmittel durch Isomahodextranase (E.C. 3.2.1.94) in Isomallose, Steviosid und oc-Monoglucosylsteviosid umgewandelt wurde, ergab sich, daß das Süßungsmittel ein Gemisch darstellt, in dem ein Mol Steviosid durch /x-Verküpfung an ein oder mehrere Mol D-Glucose gebunden ist.

Beis piel 7 .

Ein flüssiges Süßungsmittel, das durch Lösen von 26 g des pulverförmigen Süßungsmittel, das gemäß Beispiel 2 erhalten worden war. in I kg Malbit (Malfitsirup für Lebensmittel mit 25% Wassergehalt der Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan) hergestellt worden war, besaß eine ausgezeichnete Qualität seiner Süße, die gleich derjenigen von Saccharose war, während der Nährwert des Süßungsmittel etwa V20 dessen von Saccharose betrug.

Das Süßungsmittel eignet sich zur Herstellung von nährstoffarmen Nahrungsmitteln, Getränken und Zukkei waren für Verbraucher, deren Nahrungsmittelaufnahme Beschränkungen unterliegt, wie beispielsweise Fettleibige, Diabetiker und figur- bzw. gewichtsbewußte Personen; es kann auch als solches in Form von Tafelsirup verwendet werden. Da durch im Mund vorhandene, Karies erzeugende Mikroorganismen weder säure- noch wasserunlösliches Glucan aus ihm gebildet wird, eignet es sich zur Herstellung von Nahrungsmitteln und Getränken, die nur in geringem Maße die Bildung von Karies begünstigen.

Beispiel 8

960 g Glucose, 20 g Saccharose und 20 g des gemäß Beispiel 3 hergestellten Süßungsmittel wurden gleichmäßig miteinander vermischt und das Gemisch zu einem pulverförmigen Süßungsmittel pulverisiert.

Seine Süße war un^fähr gleich derjenigen von Saccharose, und die Qualtitä seiner Süße war ausgezeichnet. Außerdem löste sich das Süßungsmittel in kaltem Wasser.

Eine gekühlte wäßrige Lösung des Süßungsmittel selbst kann als wohlschmeckendes Getränk verwendet werden. Es wird angenommen, daß die ausgezeichnete Qualität der Süße des pulverförmigen Süßungsmittclgemisches einem synergistischen Effekt der drei Bestandteile Glucose. Saccharose und oulverförmigcs Süßungsmittel zuzuschreiben ist.

Beispiel 9

Ein komplexes Süßungsmittel wurde hergestellt, ,in dem mim 100 g des in Versuch l-(2) als Probe Nr. 4 erhaltenen pulverförmigen Süßungsmittel in 20 ml Wasser löste und ihm gleichmäßig 1 kg Honig zumischte.

Das Süßungsmittel war etwa 2mal so süß wie Saccharose, und die Quailitat seiner Süße war ausgezeichnet. Außerdem verstärkte die Anwesenheit der Probe 4 das Aroma des Honigs. Das Süßungsmittel kann in beliebiger Weise für Schönheitsgetränke und Gesundheitsdiät sowie als Geschmacksverbesserer für herbe Arzneimittel verwendet werden.

Die Verwertung der Erfindung kann durch gesetztli-: ehe Bestimmungen, insbesondere durch das Lebensmittelgesetz, beschränkt sein.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

* *~ " a. !Si i-Tf r Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Süßungsmitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine wäßrige Lösung, die

Ui) Steviosid (Kon'intralion etwa 0.1 bis 20 Gew.-ⁿ/o)und

a.>) eine 'i-Glucosyl-Zuckerverbindung (Konzentration eiwa 1 bis etwa 50 Gew.-%). nämlich ein Maltooligosaccharid. Stärke, ein partielles Stärkehydrolysat oder Saccharose oder Gemische aus diesen Verbindungen, enthält, mit

b) einer flt-Glucosyltransferase. welche ivGlycosylsteviosid ohne Zersetzung eic» Sieviosids zu bilden vermag.