FI97621C - Kiteinen 2-O- -D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo ja menetelmä sen valmistamiseksi - Google Patents

Description

, · 97621

Kiteinen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo ja menetelmä sen valmistamiseksi

Esillä olevan keksinnön kohteena on kiteisen 2-0-5 α-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon valmistus ja käyttö.

L-askorbiinihappoa, jonka kemiallinen rakennekaava on (I)

CHa-OH

10 H-C-OH

hoyK

o 15 HO'n/ ib f]

O

eivät ihmiset, apinat ja marsut syntetisoi in vivo ja tästä syystä se on välttämätön ravinnon aineosa, so. C-vita-20 miini.

L-askorbiinihappo on osallisena joissakin fysiologisissa toiminnoissa in vivo; esimerkiksi proliinin ja lysiinin hydroksyloinnissa, jotka aminohapot ovat välttämättömiä elävän sidekudoksen pääasiallisen aineosan, kol-25 lageenin synteesissä; sytokromi C:n hapetus-pelkistysreaktiossa, jossa Fe+++ pelkistyy Fe++:ksi; ja immuuniuden tehostuksessa lisäämällä valkosoluja. Näistä syistä C-vita-miinilla on tärkeä tehtävä elävän kehon terveyden ylläpitämisessä ja edistämisessä.

30 Keripukki on ollut kauan tunnettu L-askorbiinihapon puutoksesta johtuva tauti ja sille ovat ominaisia ihon heikkous, hiussuonipurkaumat, mustelmat ja ikenien ja luuytimen verenvuoto. Keripukin ehkäisemiseksi ja terveyden ylläpitämiseksi L-askorbiinihapon suositelluksi päivään- 2 97621 nokseksi (RDA) on määritelty aikuiselle miehelle 60 mg ja aikuiselle naiselle 50 mg.

Nykyisin L-askorbiinihappoa ei käytetä ainoastaan valmisteissa, joiden tarkoituksena on C-vitamiinin lisää-5 minen välttämättömänä ravinnon aineosana, vaan sen käyttö on laajentunut erilaisiin tarkoituksiin. Erityisesti kemiallisesta rakenteestaan ja fysiologisista vaikutuksistaan johtuen L-askorbiinihappo on käyttökelpoinen happa-meksi tekevänä aineena, pelkistimenä, hapetuksenestoainee-10 na, valkaisuaineena ja stabilointiaineena erilaisissa kemiallisissa reagensseissa, elintarvikkeissa ja juomissa; tautien, kuten virustautien, bakteeritautien ja pahanlaatuisten kasvainten ehkäisyyn ja parantamiseen käytetyissä farmaseuttisissa valmisteissa; ja lisäksi pelkistimenä, 15 uv-absorbenttina ja melaniinin muodostumista ehkäisevänä aineena kosmeettisissa ihonhoito- ja ihonvalkaisutuot-teissa.

L-askorbiinihapon suurimpana haittana on, että se suoran pelkistysaktiivisuuden, huonon pysyvyyden ja hapet-20 tumistaipumuksen johdosta helposti menettää fysiologisen vaikutuksensa.

L-askorbiinihapon stabiloimiseen on ehdotettu käytettäväksi joitakin L-askorbiinihapon sakkaridijohdannaisia. Esimerkiksi julkaisuissa Vitamin, voi. 43, s. 205 -25 209 (1971), ibid., voi. 47, s. 259 - 267 (1973) ja JP-pa- tenttijulkaisussa 38 158/73 hakija on esittänyt L-askor-biinihappoglukosidien biokemiallisen synteesin.

Kun otetaan huomioon, että glukosideja valmistetaan samankaltaisin menetelmin ja että muodostamalla eetterisi-30 dos L-askorbiinihapon hiilessä numero 6 olevaan primaariseen alkoholiryhmään saadaan glukosideja, joita on kuvattu JP-patenttijulkaisussa esimerkiksi toisen sarakkeen riveillä 14 - 16 ja että sakkaridin siirtoreaktio maltoosis-ta α-glukosyyliryhmäksi saa aikaan glukosidien muodostumi-35 sen ja että glukosideilla on suoraa pelkistysaktiivisuut- 3 97621 ta, niin glukosidien kemiallinen rakenne voidaan esittää seuraavalla kaavalla (II):

CHa-OH

f-f 0 H-C-OH

" “ “γΐχ “ 1 / HO^X/

II

O

Kuten JP-patenttijulkaisun taulukosta 1 ilmenee, 15 glukosidien pysyvyys on selvästi parempi kuin L-askorbii-nihapon pysyvyys, mutta ei kuitenkaan kaupalliseksi tuotteeksi riittävän hyvä.

Ishido et ai. ovat JP-patenttijulkaisussa 5 920/83 esittäneet orgaanisen kemiallisen menetelmän L-askorbiini-20 hapon sakkaridijohdannaisten valmistamiseksi.

Nämä johdannaiset ovat kuitenkin sellaisia, joissa kaikki D-glukoosit on sidottu β-asemaan, sillä tämän patenttijulkaisun selityksessä on sarakkeen 7 riviltä 6 sarakkeen 8 riville 11 kuvattu kaikkiaan 21 L-askorbiiniha-·; 25 pon B-D-glukopyranosyylityypin johdannaista, mm. 2,3-di- 0-(B-D-glukopyranosyyli)-L-askorbiinihappo.

Masamoto et ai. ovat JP-patenttijulkaisussa 198 498/83 esittäneet orgaanisen kemiallisen menetelmän L-askorbiinihapon sakkaridijohdannaisten valmistamiseksi, 30 jotka kaikki ovat myös B-glukosyylityyppiä.

L-askorbiinihapon B-D-glukopyranosyylityypin johdannaisilla tehdyt tutkimukset osoittivat, että näillä oli tuskin lainkaan haluttuja fysiologisia vaikutuksia elävässä kehossa, varsinkaan ihmiskehossa. Lisäksi tavanomaisten 35 orgaanisten kemiallisten menetelmien haittana on, että ne 4 97621 taloudelliselta teholtaan ovat huonompia, koska reaktio on erittäin monimutkainen ja saannoltaan alhainen, lisäksi saatujen johdannaisten myrkyttömyyden ja turvallisuuden toteaminen on erittäin vaikeaa.

5 Kuten edellä on kuvattu, L-askorbiinihapon sakkari- dijohdannaisia koskevat aikaisemmin esitetyt ehdotukset ovat osoittautuneet vähemmän tyydyttäviksi koskien pysyvyyttä, turvallisuutta, fysiologista aktiivisuutta ja taloudellista tehokkuutta eikä niitä tähän mennessä ole käy-10 tännössä hyödynnetty.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on voittaa nämä tavanomaisten L-askorbiinihapon sakkaridijohdannaisten haitat. Hakija on erityisesti tutkinut uusia L-askorbiinihapon sakkaridijohdannaisia, joita voidaan valmistaa 15 biokemiallisella menetelmällä käyttäen sakkaridinsiirto- reaktiota.

Kuten JP-hakemusjulkaisussa 127 072/89 on esitetty, hakija on keksinyt uuden yhdisteen, a-glykosyyli-L-askor-biinihapon, erityisesti 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askor-20 biinihapon, jolla ei ole suoraa pelkistysaktiivisuutta, jonka pysyvyys on erittäin hyvä, joka helposti hydrolysoituu in vivo ja jonka fysiologinen aktiivisuus on tyydyttävän korkea; hakija on myös kehittänyt menetelmän tämän yhdisteen valmistamiseksi ja sen käyttämiseksi elintarvik-: 25 keissa, juomissa, farmaseuttisissa tuotteissa lääkehoitoon reagoivien tautien hoitoon sekä kosmeettisissa tuotteissa.

Voitiin myös todeta, että koska L-askorbiinihappo nautitaan α-glukosyylisakkaridina 2-0-a-D-glukopyranosyy-li-L-askorbiinihappona, joka on syntetisoitu ja sitten 30 metaboloituu in vivo, se on turvallisuuden kannalta ihanteellinen ja sopiva uusi L-askorbiinihapon sakkaridijohdannainen.

2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon vesi-liuoksesta konsentroimalla ja jauhamalla saatu jauhe on 35 amorfinen ja erittäin hygroskooppinen ja sen epäkohtana , 97621 o on, että se helposti imee itseensä kosteutta tavallisissa ympäristöolosuhteissa, mistä aiheutuu nesteytymistä ja kovettumista.

Esillä olevassa keksinnössä pyritään sitten voitta-5 maan amorfisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon haitat, varsinkin saamaan aikaan tyydyttävästi vapaasti valuva jauhe, joka ei ole olennaisesti lainkaan hygroskooppinen eikä kovetu normaaleissa ympäristön olosuhteissa.

10 Hakija tutki kiinteää 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L- askorbiinihappoa, joka on olennaisesti ei-hygroskooppinen tavallisissa ympäristön olosuhteissa, minkä johdosta pystytään välttämään amorfisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon epäkohdat.

15 Tutkimusten tuloksena hakija keksi uuden substans sin, kiteisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon sekä totesi sen olevan olennaisesti ei-hygroskooppinen, tyydyttävästi vapaasti valuva, vedetön kiteinen jauhe, joka ei nesteydy eikä kovetu tavallisissa ympäristöolosuh-20 teissä. Edelleen hakija kehitti menetelmän tällaisen kiteisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon valmistamiseksi sekä myös menetelmät sellaisten elintarvikkeiden ja kosmetiikkatuotteiden valmistamiseksi, jotka sisältävät tätä.

: 25 Kuviossa 1 on keksinnön mukaisen kiteisen 2-0-a-D- glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon uv-absorptiospektri liuoksessa pH-arvossa 2,0.

Kuviossa 2 on kiteisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon uv-absorptiospektri liuoksessa pH-arvossa 30 7,0.

Kuviossa 3 on kiteisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon infrapunaspektri.

Kuviossa 4 on kontrollina amorfisen 2-0-o-D-gluko-pyranosyyli-L-askorbiinihapon infrapunaspektri.

, 97621

O

Kuviossa 5 on mikroskooppikuva (40x) ylikylläste-tyssä liuoksessa kasvaneesta kiteestä.

Kuviossa 6 on keksinnön mukaisen kiteisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon ORTEP-kuva.

5 Esillä olevaa keksintöä voidaan soveltaa mihin ta hansa 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoon riippumatta siitä, millä menetelmällä, biokemiallisella tai orgaanisella kemiallisella menetelmällä se on valmistettu.

Kun otetaan huomioon turvallisuus ja taloudelli-10 suus, niin 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo val mistetaan edullisesti biokemiallisella menetelmällä, jossa käytetään joko pelkästään sakkaridinsiirtoentsyymiä tai sitä yhdessä glukoamylaasin kanssa liuoksessa, joka sisältää L-askorbiinihappoa ja a-glukosyylisakkaridia.

15 Ilmaisulla "ilman suoraa pelkistysaktiivisuutta" tarkoitetaan, että toisin kuin L-askorbiinihapon tapauksessa, sen sakkaridijohdannainen ei pelkistä eikä tee värittömäksi 2,6-dikloorifenoli-indofenolia.

Ilmaisulla "L-askorbiinihappo" tarkoitetaan tässä 20 keksinnössä myös L-askorbaatteja, kuten alkalimetallisuo- loja, maa-alkalimetallisuoloja ja näiden seoksia, milloin keksintöä voidaan soveltaa näihin eikä tämä ilmaisu rajoitu siis pelkästään vapaaseen L-askorbiinihappoon. Niinpä tarvittaessa voidaan yhtä hyvin kuin vapaata L-askorbiini-25 happoa sopivasti käyttää natrium-L-askorbaattia ja kal-sium-L-askorbaattia.

Ilmaisut "α-glykosyyli-L-askorbiinihappo" ja "2-0- o-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo" tarkoittavat paitsi vapaita happomuotoja, myös niiden suoloja, milloin kek-30 sintöä voidaan soveltaa käyttäen niitä.

Keksinnössä käytettäviksi sopivia a-glukosyylisak-karideja ovat sellaiset, joita käyttäen sakkaridinsiirto-entsyymin avulla voidaan muodostaa L-askorbiinihaposta a-glykosyyli-L-askorbiinihappo, jossa L-askorbiinihappoon on 35 sitoutunut ekvimolaarinen määrä tai enemmän a-D-glukosyy- li 97621 liryhmiä. Esimerkiksi malto-oligosakkaridit, kuten maltoosi, maltotrioosi, maltotetroosi, maltopentoosi, maltohek-soosi, maltoheptoosi ja malto-oktoosi ovat sopivia, samoin osittain hydrolysoitu tärkkelys, kuten dekstriini, syklo-5 dekstriini ja amyloosi, nesteytetty tärkkelys, gelatinoitu tärkkelys ja liuennettu tärkkelys.

a-glykosyyli-L-askorbiinihapon muodostumisen helpottamiseksi tulisi valita α-glukosyylisakkaridi, johon käytetty sakkaridinsiirtoentsyymi hyvin vaikuttaa.

10 Esimerkiksi käytettäessä a-glukosidaaria (EC

3.2.1.20) sakkaridinsiirtoentsyyminä, sopivia ovat malto-oligosakkaridit, kuten maltoosi, maltotrioosi, maltotetroosi, maltopentoosi, maltoheksoosi, maltoheptoosi ja malto-oktoosi sekä myös osittain hydrolysoidut tärkkelykset 15 ja dekstriinit, joiden DE (dekstroosiekvivalentti) on noin 5-60. Kun käytetään syklomaltodekstriiniglukanotransfe-raasia (EC 2.4.1.19) sakkaridinsiirtoentsyyminä, sopivia ovat osittain hydrolysoidut tärkkelykset, kuten gelatinoi-dut tärkkelykset, joiden De on alle 1 ja dekstriinit, joi-20 den DE on korkeintaan 60. Kun käytetään a-amylaasia (EC 3.2.1.1) sakkaridinsiirtoentsyyminä, sopivia ovat osittain hydrolysoidut tärkkelykset, kuten gelatinoitu tärkkelys, jonka DE on alle 1 ja dekstriinit, joiden DE on korkeintaan 30.

25 Reaktiossa L-askorbiinihapon konsentraatio on yleensä 1 paino/til.-% tai suurempi, edullisesti noin 2 -30 paino/til-%, kun sen sijaan α-glukosyylisakkaridin konsentraatio on yleensä noin 0,5 - 30-kertainen L-askorbiinihapon konsentraatioon verrattuna.

30 Keksinnössä käytettäviksi sopivia sakkaridinsiirto- entsyymejä ovat sellaiset, jotka siirtävät yhden a-gluko- • . .

syyliryhmän tai useampia α-glukosyyliryhmiä ainakin hiili-atomiin 2 L-askorbiinihapossa ilman tätä hajoamista, kun entsyymin annetaan vaikuttaa liuokseen, joka sisältää L- e 97621 askorbiinihappoa ja entsyymin vaikutukselle sopivan herkkää a-glukosyylisakkaridia.

Sopivasti valitaan esimerkiksi a-glukosidaaseja, joita on saatu eläimistä, kasveista ja mikro-organismeis-5 ta, kuten hiiren munuaisista, rotan suoliston limakalvosta, koiran ohutsuolesta, sian ohutsuolesta, riisinsieme-nistä, maissinsiemenistä sekä sukuihin Mucor, Penicillium ja Saccharomyces kuuluvien bakteerien viljelmistä; syklo-maltodekstriiniglukanotransferaaseja, joita on saatu su-10 kuihin Bacillus ja Klebsiella kuuluvien bakteerien viljelmistä; ja a-amylaaseja, joita on saatu sukuun Bacillus kuuluvien bakteerien viljelmistä.

Tällaista sakkaridinsiirtoentsyymiä ei välttämättä tarvitse puhdistaa ennen käyttöä, mikäli se täyttää edellä 15 esitetyt vaatimukset. Yleensä esillä oleva keksintö voidaan toteuttaa käyttäen epäpuhtaita entsyymejä. Tarvittaessa sakkaridinsiirtoentsyymi voidaan puhdistaa tavallisella tavalla ennen käyttöä. Keksinnössä voidaan tietenkin käyttää kaupallisesti saatavaa sakkaridinsiirtoentsyymiä. 20 Sakkaridinsiirtoentsyymin määrä ja reaktioaika ovat läheisesti riippuvaisia toisistaan. Taloudelliset näkökohdat huomioiden sakkaridinsiirtoentsyymiä käytetään määrä, jolla saadaan täydellinen reaktio 3-80 tunnissa.

Immobilisoituja sakkaridinsiirtoentsyymejä voidaan 25 edullisesti käyttää annoksittain ja jatkuvana suoritetuissa menetelmissä.

Keksinnön mukainen reaktioprosessi suoritetaan tavallisesti lisäämällä sakkaridinsiirtoentsyymiä liuokseen, joka sisältää edellä kuvattuja L-askorbiinihappoa ja a-30 glukosyylisakkaridia ja pitämällä seosta olosuhteissa, joissa entsyymi on aktiivinen, tavallisesti pH-arvossa noin 3 - 9 ja lämpötilassa noin 20 - 80 eC. Koska reaktion aikana L-askorbiinihappo on taipuvainen hajoamaan hapettumalla, seosta pidetään edullisesti olosuhteissa, joissa se 35 on suojattu mahdollisimman hyvin ilman ja valon vaikutuk- 9 97621 seita, jotta L-askorbiinihappo pysyisi pelkistävässä muodossa. Reaktio suoritetaan tarvittaessa edullisesti sellaisten aineiden kuin tiourean tai rikkivedyn läsnä ollessa.

5 Haluttu substanssi voidaan saada lisäämällä L-as- korbiinihappoa ja α-glukosyylisakkaridia sellaisen kasvavan mikro-organismin viljelmään, joka pystyy tuottamaan sakkaridinsiirtoentsyymiä.

Yleensä keksinnön mukainen reaktioprosessi suoriteli) taan antamalla sakkaridinsiirtoentsyymin vaikuttaa sellaisenaan tai yhdessä glukoamylaasin kanssa liuokseen, joka sisältää L-askorbiinihappoa ja a-glukosyylisakkaridia.

Tällainen prosessi on toteutettavissa käyttäen glu-koamylaaseja, joita saadaan eri lähteistä, kuten mikro-15 organismeista ja kasveista. Sopivia ovat tavallisesti kaupalliset glukoamylaasit, joita saadaan sukuihin Aspergillus ja Rhizopus kuuluvista mikro-organismeista.

2-0-a-D-glukopyranosyy1i-L-askorbiinihapon muodostamiseksi glukoamylaasia voidaan käyttää samanaikaisesti 20 sakkaridinsiirtoentsyymin kanssa. Reaktion tehon paranta miseksi on kuitenkin yleensä edullisempaa käyttää sakkari-dinsiirtoentsyymiä ensin siirtämään ekvimolaarinen määrä tai enemmän D-glukoosiryhmiä L-askorbiinihappoon, jolloin muodostuu α-glykoosi-L-askorbiinihappoa ja käyttäen sitten 25 glukoamylaasia 2-O-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon muodostamiseen. B-amylaasia (EC 3.2.1.2) voidaan vapaasti käyttää yhdessä glukoamylaasin kanssa.

Sakkaridinsiirtoentsyymin avulla valmistetuissa a-glykosyyli-L-askorbiinihapoissa on a-D-glukosyyliryhmä, 30 joka sisältää 1-7 glukosyyliryhmää a-1,4 liitoksella, y jolloin tällainen α-D-glukosyyliryhmä on sitoutunut aina kin hiiliatomissa 2 olevaan primaariseen alkoholiryhmään. Erityisesti mainittakoon esimerkkeinä 2-0-a-D-glukopyrano-syyli-L-askorbiinihappo, 2-0-a-D-maltosyyli-L-askorbiini-35 happo, 2-0-a-D-maltotriosyyli-L-askorbiinihappo, 2-0-a-D- t - 97621 10 maltotetrosyyli-L-askorbiinihappo, 2-0-a-D-maltopentosyy-li-L-askorbiinihappo, 2-0-a-D-maltoheksosyyli-L-askorbii-nlhappo ja 2-0-a-D-maltoheptosyyli-L-askorbiinihappo. Vaikka α-glukosidaasi tavallistaa muodostaa vain 2-0-a-D-5 glykosyyli-L-askorbllnihappoa, niin tarvittaessa 2-0-a-D- maltosyyli-L-askorbiinihappoa ja 2-0-a-D-maltotriosyyli-L-askorbiinihappoa voidaan muodostaa seoksena.

Siinä tapauksessa, että käytetään joko syklomalto-dekstriiniglukanotransferaasia tai a-amylaasia, muodostuu 10 seoksena α-glykosyyli-L-askorbiinihappoja, joissa on suu rempi α-D-glukosyyliryhmä. Siten syklomaltodekstriiniglu-kanotransferaasi muodostaa α-glukosyylisakkaridista a-D-glukosyyliryhmän, jonka polymerointiaste on jakautuneena alueella 1-7, kun taas α-amylaasilla saadaan jonkin ver-15 ran kapeampi jakauma. Tällainen seos voidaan tarvittaessa osittain hydrolysoida joko α-amylaasilla (EC 3.2.1.1), β-amylaasilla (EC 3.2.1.2) tai glukoamylaasilla (EC 3.2.1.3) α-D-glukosyyliryhmän polymerointiasteen pienentämiseksi. Esimerkiksi 2-0-a-D-maltosyyli-L-askorbiinihappo ja kor-20 keammat polymeerit hydrolysoituvat glukoamylaasin vaikutuksesta, jolloin saadaan 2-0-a-D-glykosyyli-L-askorbiini-happoa. B-amylaasi hydrolysoi pääasiassa 2-0-a-D-maltotet-rosyyli-L-askorbiinihapon ja korkeammat polymeerit 2-0-a-D-glykosyyli-L-askorbiinihapon, 2-0-a-D-maltosyyli-L-as-25 korbiinihapon ja 2-0-a-D-maltotriosyyli-L-askorbiinihapon seokseksi.

Näillä menetelmillä saadut reaktioseokset sisältävät tavallisesti yhdessä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askor-biinihapon kanssa jäljelle jäänyttä L-askorbiinihappoa, D-30 glukoosia ja a-glukosyylisakkaridia.

Kun tarvitaan puhdas tuote, jonka 2-0-a-D-glukopy- ranosyyli-L-askorbiinihapposisältö on korkea, tälle reak-tioseokselle suoritetaan yksi tai useampi erotustoimenpi-de, jossa käytetään hyväksi 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-35 askorbiinihapon ja epäpuhtauksien, kuten jäljelle jääneen 11 97621 L-askorbiinihapon, D-glukoosin ja α-glukosyylisakkaridien molekyylipainon ja/tai affiniteetin eroja; tällaisia menetelmiä ovat esimerkiksi membraanierotus, geelisuodatuskro-matografia, pylväskromatografia, suurisuorituskykyinen 5 nestekromatografia (HPLC) ja ioninvaihtokromatografia. Tässä tapauksessa erotettua L-askorbiinihappoa ja a-gluko-syylisakkaridia voidaan edullisesti käyttää uudelleen lähtöaineina sakkaridinsiirtoreaktiossa. Tarvittaessa reak-tioseosta voidaan käsitellä sakkaridinsiirtoreaktion pää-10 tyttyä, mutta ennen erottamista esimerkiksi kromatogra-fialla yhdellä tai useammalla menetelmällä; tällaisia menetelmiä ovat esimerkiksi menetelmä, jossa reaktioseosta kuumennetaan ja liukenematon aines poistetaan suodattamalla; ja toinen menetelmä, jossa reaktioseosta käsitellään 15 esimerkiksi aktiivihiilellä proteiiniainesten ja värjää vien ainesten poistamiseksi absorboimalla; ja menetelmä, jossa reaktioseos demineralisoidaan kationinvaihtajahart-silla (H*-muoto) ja jossa sitä sitten käsitellään anionin-vaihtohartsilla (OH‘-muoto) anionien ja suolojen poistami-20 seksi adsorption avulla.

Seuraavassa selvitetään 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon kiteyttämistä. Kiteytettävä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo on tavallisesti ylikyl-lästettynä liuoksena, jolloin mitä tahansa 2-0-a-D-gluko-25 pyranosyyli-L-askorbiinihappoa voidaan valmistustavasta riippumatta käyttää edellyttäen, että siitä voidaan saada kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa. Yli-kyllästysaste on tavallisesti noin 1,05 - 1,5. Lähemmin määriteltynä puhtausasteeltaan noin 75-%:inen tai puhtaam-30 pi 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo valmistetaan noin 65 - 95-paino/paino-%:iseksi vesiliuokseksi ja lämpötila säädetään tasolle, jossa liuos ei jäädy ja jossa prosessin aikana aiheutuu mahdollisimman vähän lämpöhäviöitä, edullisesti alueelle 0 - 95 °C. Ylikyllästysastetta ja 35 viskositeettia voidaan säätää lisäämällä esimerkiksi meta- nolla, etanolia tai asetonia. 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon ylikyllästetty liuos pannaan suhteellisen korkeassa lämpötilassa, kuten 20 - 60 °C:ssa kiteyttimeen, siihen lisätään kideytimiä, edullisesti 0,1 - 10 paino/ 5 paino-% ja se kiteytetään kidemassaksi samalla hitaasti sekoittaen kiteytymisen nopeuttamiseksi. Täten lisäämällä kideytimiä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon yli-kyllästettyyn liuokseen saadaan helposti keksinnön mukaista kiteistä 2-O-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa. 10 Saatu kidemassa muutetaan lopulliseksi kiteiseksi tuot teeksi tavanomaisin menetelmin, esimerkiksi erottamalla, jauhamalla, sumutekuivaamalla tai rakeistamalla leijupe-dissä.

Erotusmenetelmä, jossa kidemassa tavallisesti ero-15 tetaan kiteiseksi 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiiniha- poksi ja emäliuokseksi (melassi) korityyppisessä sentrifu-gissa, on sopiva käytettäväksi ei-hygroskooppisen erittäin puhtaan kiteisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiiniha-pon valmistuksessa ja milloin suurempaa puhtausastetta 20 vaaditaan, erotetut kiteet voidaan pestä suihkuttamalla niille pieni määrä vettä. Erotettu emäliuos puhdistetaan ja konsentroidaan samalla tavalla kuin edellä kidemassa ja käytetään sitten uudestaan, jolloin saadaan talteen toinen ja kolmas kide-erä. Tämä parantaa kiteisen 2-0-a-D-gluko-25 pyranosyyli-L-askorbiinihapon saantoa.

Koska mainitut kolme muuta menetelmää eivät poista melassia, ne eivät koskaan paranna kiteisen 2-0-a-D-gluko-pyranosyyli-L-askorbiinihapon puhtausastetta lopullisessa tuotteessa, mutta niillä saadaan tuotetta korkealla saan-30 nolla. Siten tällainen tuote sisältää tavallisesti esimer kiksi L-askorbiinihappoa, 2-0-a-D-maltosyyli-L-askorbiini-happoa, korkeampia α-glykosyyli-L-askorbiinihappoja, glukoosia ja α-glukosyylisakkarideja yhdessä kiteisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon kanssa.

13 97621

Sumutekuivauksen tapauksessa kidemassa, jonka kon-sentraatlo on 70 - 85 paino/paino-% ja kiteisyys 25 -60 paino/paino-%, tavallisesti sumutekuivataan korkeapa!-nesuuttimen lävitse ja saadut pisarat kuivataan ilmavir-5 rassa lämpötilassa esimerkiksi 30 - 60 eC, jossa kiteinen jauhe ei sula ja sitten vanhennetaan 30 - 60 °C:ssa ilmavirrassa noin 1-20 tuntia.Näin saadaan helposti ei-hyg-roskooppinen tai vain lievästi hygroskooppinen kiteinen jauhe. Kun käytetään kappaleen jauhamismenetelmää, niin 10 kidemassa, jonka kosteuspitoisuus on 5,15 paino/paino-% ja kiteisyys noin 10 - 60 paino/paino-%, saa tavallisesti seistä 0,5-5 vuorokautta, jolloin se kokonaisuudessaan kiteytyy ja muuttuu kiinteäksi kappaleeksi. Hienontamalla ja kuivaamalla saatu kappale saadaan ei-hygroskooppista 15 tai vain lievästi hygroskooppista kiteistä jauhetta.

Vaihtoehtoisesti 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askor-biinihapon liuos konsentroidaan kuumentamalla se sulassa muodossa olevaksi ylikyllästetyksi liuokseksi, jonka kos-teussisältö on alle 5 paino/paino-%, jota sulatetta sitten 20 vaivataan yhdessä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiiniha-pon kideytimien kanssa alle sen sulamispsiteen olevassa lämpötilassa ja sulate valmistetaan haluttuun muotoon, esimerkiksi jauheeksi, rakeiksi, tangoksi, levyksi tai kuutioksi. Näin saadaan ei-hygroskooppinen tai tuskin 25 lainkaan hygroskooppinen kiteinen kiinteä tuote. Riippuen puhtausasteesta ja kiteisyydestä kiteinen 2-0-a-D-glukopy-ranosyyli-L-askorbiinihappo saadaan tällä tavalla olennaisesti ei-hygroskooppisena tai tuskin lainkaan hygroskooppisena, vapaasti valuvana adheesiovapaana tuotteena. Seu-30 rasvassa luetellaan joitakin sen hyviä ominaisuuksia: (1) Sillä ei ole suoraa pelkistysaktiivisuutta ja se on erittäin pysyvä. Toisin kuin L-askorbiinihappo se ei juuri aiheuta Maillard-reaktiota. Näiden ominaisuuksien vuoksi se ei saa aikaan mitään ei-toivottuja reaktioita 35 seoksissa proteiinien, lipidien, sakkaridien ja fysiologi- m 97621 sesti aktiivisten aineiden kanssa, vaan se stabiloi nämä aineet.

(2) Se hydrolysoituu helposti L-askorbiinihapoksi ja tämä tekee siitä L-askorbiinihapon veroisen pelkistimen 5 ja hapetuksenestoaineen.

(3) Se hydrolysoituu helposti in vivo entsyymisys-teemin vaikutuksesta D-glukoosiksi ja L-askorbiinihapoksi, joten näin sen avulla saadaan L-askorbiinihapolle ominainen fysiologinen vaikutus.

10 (4) Se on erittäin turvallinen, koska se on synte tisoitu ja se metaboloituu nautittaessa in vivo L-askorbiinihapoksi ja a-glukosyylisakkaridiksi.

(5) Se on olennaisesti ei-hygroskooppinen tai tuskin lainkaan hygroskooppinen, mutta se on erittäin hyvin 15 1lukeva veteen. Näiden ominaisuuksien vuoksi sitä käyte tään edullisesti C-vitamiinin rikastukseen, makua parantavana, happamuutta säätävänä ja stabilointiaineena elintarvikkeissa ja juomissa, jauheissa, rakeissa ja tableteissa, kuten vitamiinivalmisteissa, kreemitäytteissä, suklaassa 20 purukumissa, pikajuomissa ja kastikeseoksissa.

(6) Se on olennaisesti ei-hygroskooppinen tai tuskin lainkaan hygroskooppinen, vapaasti valuva, kovettuma-ton tuote. Siten sitä on huomattavasti helpompi käsitellä kuin amorfista tuotetta ja tämä vaikuttaa huomattavasti 25 materiaali- ja työkustannusten alenemiseen pakkaus-, kuljetus- ja varastointivaiheissa.

Näiden ominaisuuksien vuoksi 2-0-a-D-glukopyrano-syyli-L-askorbiinihappoa voidaan edullisesti lisätä stabilointiaineeksi, laatua parantavaksi aineeksi, uv-absorben-30 tiksi ja kosmeettisten tuotteiden (ihonhoito- ja ihon-valkaisuaineet) yhteen tai useampaan aineosaan sekä myös aineisiin, joiden tarkoituksena on rikataa tuote erittäin turvallisella luonnon C-vitamiinilla. Tässä tapauksessa yhdessä kiteisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiiniha-35 pon kanssa käytetään edullisesti L-askorbiinihappoa, 15 97621 E-vitamiinia, rutiinia, α-glukosyylirutiinia ja/tai hes-peridiiniä.

Koska 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo on erittäin hapon- ja kuumuudenkestävä ja koska se sopii yh-5 teen erilaisten happamien, suolaisten, kitkerien, makeiden ja kutistavien aineiden kanssa, sitä käytetään edullisesti C-vitamiinilisäyksenä, makua parantavana aineena, hapetuk-senestoaineena ja laatua parantavana aineena elintarvikkeissa ja juomissa yleisesti; esimerkkejä ovat: maustekas-10 tikkeet kuten soijakastike, soijakastikejauhe, miso, miso-jauhe, "moromi", "hishio", "furikake", majoneesi, salaattikastike, viinietikka, "sanbai-zu", "funmatsu-sushi-su", "chuka-no-moto", (tensuya (tenpurakastike)", "mentsuyu (j apanilainen makaronikastike)", Worcester-kastike, 15 ketchup, "yakiniku-no-tare (grillilihakastike)", curry roux, paistikastikejauhe, keittojauheet, "dashi-no-moto", maustekastikeseokset, "mirin (erittäin makea sake)”, hie-nosokeri ja palasokeri, japanilaiset leivonnaiset kuten "senbei (riisicrackerit)", "arare (pelletin muotoinen sen-20 bei)", "okoshi (hirssi-riisicrackerit)", "karinto (rasvassa keitetty leivonnainen)", "gyuhi (tärkkelystahna)", riisitahna, "manju (papumarmeladitäytteinen pulla)", "uiro (makea riisihyytelö)", "an (papumarmeladi)", "yokan (makea papuhyytelö)", "mizu-yokan (pehmeä adzuki-papuhyytelö)", 25 "kingyoku", hyytelö, castella ja "amedama (japanilainen toffee)"; länsimaiset leivonnaiset ja makeiset kuten pullat, keksit, crackerit, piirakat, vanukkaat, tuulihatut, vohvelit, sienikakut, donitsit, suklaa, purukumi, karamellit ja makeiset; jäädytetyt jälkiruoat kuten jäätelö ja 30 sorbetti; siirapit kuten hedelmäsäilykkeissä käytetyt siirapit "kaki-gori (jäälastut)", levitteet ja tahnat kuten voikreemi, custard-kastike, jauhotahna ja hedelmätahna; hedelmävalmisteet kuten hedelmäsose, marmeladi, siirapin kanssa säilötyt hedelmät ja kuivatut sokeroidut hedelmät; 35 ruokavalmisteet kuten hedelmistä ja vihanneksista valmis- 16 97621 tetut tuotteet; viljatuotteet kuten leipomotuotteet, makaronit, vermisellit, keitetty riisi ja synteettinen liha; rasvaelintarvikkeet kuten salaattiöljy ja margariini; etikkasäilykkeet kuten "fukujin-zuke (vihannesviipaleita 5 soijakastikkeessa)", "bettara-zuke (retiisipikkelsi)" ja "hakusai-zuke-no-moto"; lihatuotteet kuten kinkku ja makkarat; kalatuotteet kuten kalaniihakinkku, kalamakkara, "kamaboko (keitetty kalatahna)", chikuwa (tarkka käännös: bambupyörät)" ja "hanpen"; alkupalat kuten "uni-no-shioka-10 ra (suolattu merisiilinsuoli)", "ika-no-shiokara (suolattu kalmarinsuoli)", "su-konbu", "saki-surume" ja "fugu-no-mirinboshi"; tsukudanit (soijakastikkeessa keitetyt elintarvikkeet) kuten "nori (kuivattu merilevä)", "sansai (vuoristovihannekset)", surume (kuivattu kalmari)", pikku-15 kalat ja äiriäiset; arkiruoat kuten "nimame (keitetyt pavut)", perunasalaatti, "kombuki-maki (ruskolevärulla)" ja "tempura (pakasteruoat)"; muna- ja maitotuotteet kuten "kinshi-tamago", maitojuomat, voi ja juusto; pullotetut ja purkitetut tuotteet kuten liha-, kalanliha-, hedelmä- ja 20 vihannessäilykkeet; alkoholijuomat kuten synteettinen sake, "zojo-shu", liköörit, viinit ja whisky; juomat kuten kahvi, kaakao, mehu, hiilihappoiset juomat, maitohappojuomat ja lactobacillus-juomat; ja esiseos- ja instant-val-misteet kuten vanukasjauheet, kuumakakkuesiseos, pikamehu, 25 pikakahvi, "sokuseki-shiruko (adzuki-papukeittoesiseos, jossa riisikakkuja)" ja pikakeittojauhe. Edelleen kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa voidaan edullisesti lisätä kotieläinten ja siipikarjan rehuihin ja lemmikkieläinten ruokiin, myös mehiläisten, silkkiperhosen 30 toukkien ja akvaariokalojen ruokiin C-vitamiinilisäykseksi ja näiden ruokien makua ja hapetuksenkestoa parantamaan.

2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoavoidaan myös edullisesti lisätä erityisruokiin ja -juomiin, joita käytetään kosmetiikkatuotteisiin, kuten ihonhoitoainei-35 siin ja ihonvalkaisuaineisiin; esimerkkejä tällaisista 17 97621 tuotteista ovat sikarit, savukkeet, trokeet, kalanmaksaöljy, suun kautta otettavat virkistysalueet, hengityksen raikastamispastillit, suuvedet, intubaatioravintoaineet, hammastahna, huulipuna, luomivärit, maitomaiset ihovoi-5 teet, kosteuttava ihovesi, ihovoide, pohjavoide, auringon-suojavoide, ihonhoitosaippua, shampoo ja huuhteluaine; lisäksi sitä voidaan käyttää uv-absorbenttina ja hajoamista ehkäisevänä aineena muoveissa sekä myös substraattina glykosidihydrolaasien määrityksissä.

10 Kiteinen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihap- po sisällytetään tuotteisiin tavallisella tavalla, esimerkiksi sekoittamalla, vaivaamalla, liuottamalla, sulattamalla, kastamalla, imeyttämällä, levittämällä, sivelemällä, päällystämällä, suihkuttamalla, injektoimalla, kiteyt-15 tämällä ja seostamalla ennen tuotteiden valmistusprosessin päättymistä.

Kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihap-poa käytetään edullisesti aineksena sellaisissa kemiallisissa reaktioissa, jotka suoritetaan vedettömissä olosuh-20 teissä, koska se on käytännöllisesti katsoen vedetöntä ja se saadaan täysin vedetömäksi puhaltamalla sitä jonkin aikaa kuumalla ilmalla, siten käyttämällä kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa tavanomaiseen kemialliseen reaktioon vedettömissä olosuhteissa voidaan 25 helposti valmistaa esimerkiksi sen eetteri- ja esterijoh-dannaisia. Näitä johdannaisia käytetään edullisesti esimerkiksi pinta-aktiivisissa aineissa, emulgointlaineissa, stabilointiaineissa ja lipofiilisena C-vitamiinina.

Vapaassa happomuodossa oleva kiteinen 2-O-a-D-glu-30 kopyranosyyli-L-askorbiinihappo voidaan tarvittaessa muuttaa esimerkiksi natriumsuolaksi, kalsiumsuolaksi, magne-siumsuolaksi, rautasuolaksi, kuparisuolaksi tai sinkkisuo-laksi saattamalla se reagoimaan vastaavan metallihydroksidin tai metallikarbonaatin vesiliuoksen kanssa, jolloin 35 saadaan tuote, jolla voidaan sopivasti säätää pH-arvoa ja jolla on sekä mineraalien että C-vitamiinin ominaisuudet.

18 97621 Tällaista ainetta käytetään edullisesti ravinnon rikastus-aineissa ja kemiallisissa aineissa.

Seuraavat kokeet kuvaavat yksityiskohtaisesti keksinnön mukaista tyypillistä kiteistä 2-0-a-D-glukopyrano-5 syyli-L-askorbiinihappoa.

Koe 1

Kiteisen2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon valmistus

Yhdeksän paino-osaa dekstriiniä (DE noin 6) liuo-10 tettiin kuumentaen 15 paino-osaan vettä ja liuokseen li sättiin pelkistävissä olosuhteissa 3 paino-osaa L-askor-biinihappoa ja sitten 400 yksikköä/g dekstriiniä syklomal-todekstriiniglukanotransferaasia (Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japani) ja seoksen annettiin 15 reagoida 14 tuntia 60 °C:ssa ja pH-arvossa 5,5. Reaktio-seos syötettiin "AQ-303 ODS" HPLC-systeemiin (Yamamura Chemical Laboratories Co., Ltd., Kioto, Japani), joka oli varustettu "LC-6"-kolonnilla (Shimadzu Seisakusho Ltd., Kioto, Japani) ja eluoitiin 0,1-m KH2P04-H3P04-puskurilla 20 (pH 2,0) virtausnopeudella 0,5 ml/min käyttäen tarkkailuun "Mult-340"-detektorisysteemiä (Japan Spectroscopic Co., Ltd., Tokio, Japani). Tulokseksi saatiin L-askorbiinihap-poa 9,5 minuutin retentioajan jälkeen ja vastamuodostunei-ta α-D-glykosyyli-L-askorbiinihappoa, o-D-maltosyyli-L-25 askorbiinihappoa, a-D-maltotriosyyli-L-askorbiinihappoa, a-D-maltotetrosyyli-L-askorbiinihappoa,a-D-maltopentosyy-li-L-askorbiinihappoa, a-D-maltoheksosyyli-L-askorbiini-happoa ja a-D-maltoheptosyyli-L-askorbiinihappoa vastaavasti 11,2 minuutin, 15,7 minuutin, 20,6 minuutin, 24,9 30 minuutin, 28,1 minuutin, 32,1 minuutin ja 38,6 minuutin retentioajan jälkeen. Noin 60 % L-askorbiinihaposta oli muuttunut α-glykosyyli-L-askorbiinihapoksi. Sitten reak-tioseos suodatettiin UF-membraanilla entsyymin poistamiseksi, pH säädettiin 5,0:ksi ja lämpötila 55 °C:seen ja 35 seokseen lisättiin 10 yksikköä/g dekstriiniä glukoamylaa- 19 97621 sla (EC 3.2.1.3) (Seikagaku Kogyo Ltd., Tokio, Japani) ja seoksen annettiin reagoida 24 tuntia. Reaktloseoksen HPLC-analyysi osoitti, että a-D-maltosyyli-L-askorbiinihappo ja korkeammat a-glykosyyli-L-askorbiinihapot olivat hydroly-5 sortuneet 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapoksi.

Sitten reaktioseosta kuumennettiin jäljellä olevan entsyymin inaktivoimiseksi, seosta käsiteltiin värinpois-tohiilellä, hiili suodatettiin ja suodos konsentroitiin noin 50-paino/paino-%:iseksi.

10 Konsentraatti kromatografoitiin kolonnissa, jossa oli "XT-1016 (Na+-muoto) -hartsia", joka on vahvasti hapan kationinvaihtaja (Tokyo Chemical Industries, Tokio, Japani), jokin verran modifioiden menetelmää, joka on esitetty JP-hakemusjulkaisussa 23 799/83, jolloin eluoitui ja otet-15 tiin talteen puhtausasteeltaan noin 94-%:inen 2-0-a-D-glu- kopyranosyyli-L-askorbiinihappofraktio, joka sitten puhdistettiin demineralisoimalla kationinvaihtajahartsilla (H*-muoto), konsentroitiin noin 80-paino/paino-%:ksiseksi, pantiin lasiastiaan, jossa sen annettiin seistä 20 - 20 35 °C:ssa noin yhden kuukauden ajan. Tällöin tapahtui ki teytymistä. Osa kiteistä lisättiin toiseen vastavalmistet-tuun erään samaa puhdistettua ja konsentroitua 2-O-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappofraktiota ja tuote kiteytettiin sekoittamalla hiljalleen. Saatu kidemassa ero-25 tettiin melassiksi ja kiteiksi ja paremman puhtausasteen saamiseksi kiteet pestiin suihkuttamalla niille hieman jäähdytettyä vettä, liuottamalla kiteet veteen ja kiteyttämällä uudestaan. Näin saatiin erittäin puhtaita kiteistä, joiden puhtausaste oli noin 99,9 % ja enemmän.

30 Koe 2

Kiteisen2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon fysikaalis-kemial1iset ominaisuudet

Kokeen 1 menetelmällä uudelleenkiteyttämällä saatujen kiteiden ominaisuudet osoittivat, että kyseessä oli 35 uusi vedetön kiteinen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbii-nihappo.

20 - 97621

Kiteiden ominaisuuksia kuvataan seuraavassa.

(1) Alkuaineanalyysi kaavalle C12H18Ou)

Saatu: C = 42,6 H = 5,36 %

Laskettu: C = 42,4 H = 5,37 N < 0,01 % 5 (2) Molekyylipaino FD-massaspektrometrianalyysissä "M-80B"-massaspektrometrillä (Hitachi Ltd., Tokio, Japani) saatiin (M + H)*-piikki kohdassa 339 (kemiallisesta kaavasta 012Η1801Χ laskettu molekyylipaino on 338).

10 (2) Sulamispiste

158,5 - 159,5 °C

(4) Liukenemislämpö Endoterminen (27,2 kcal/g) (5) Ominaiskiertokyky 15 [a]?0 = +189,6° (H20, pH 1,98) [a]j“° = +246,3° (H20, pH 7,10) (6) av-absorptiospektri

uv-absorptiospektri määritettiin 50 pm liuoksessa. pH-arvossa 2,0 määritetty spektri nähdään kuviossa 1 ja pH

20 arvossa 7,0 määritetty spektri kuviossa 2.

(max) = 238 nm, = 0,93 x 104 (pH 2,0) (max) = 260 nm, = 1,50 x 104 (pH 7,0) (7) Infrapuna-absorptiospektri Käytettiin KBr-tablettia. Kiteen IR-spektri nähdään 25 kuviossa 3 ja kontrollina käytetyn amorfisen yhdisteen IR-spektri nähdään kuviossa 4.

(8) Liukoisuus 125 g kiteitä liukenee 100 g:aan vettä 25 °C:ssa.

(9) Liukoisuus liuottimiin 30 Liukenee hyvin veteen, 0,1-n NaOH-liuokseen ja 0,1-n etikkahappoon; liukenee metanoliin ja etanoliin ja on liukenematon eetteriin, bentseeniin, kloroformiin ja etyyliasetaattiin.

(10) Dissosiaatiovakio 35 pKa on 3,0. Kun verrataan tätä arvoihin, joita eri laisille L-askorbiinihapon johdannaisille on ilmoitettu li kirjallisuudessa: J. Jernow et al., Tetrahedron, voi. 35, sivut 1483 - 1486 (1979), taulukko 1 ja Pao-Wen Lu et ai., Journal of Agricultural Food Chemistry, voi. 32, sivut 21 - 28 (1948), taulukko 2, voidaan päätellä, että keksin-5 nön mukaisessa yhdisteessä α-D-glukosyylisidos on askor- biinihapporyhmän hiilessä nro 2 olevassa alkoholiryhmässä ja alkoholiryhmä hiilessä nro 3 on vapaa.

(11) Metylointianalyysi

Kiteet metyloitiin menetelmällä, jonka Pao-Wen Lu 10 et ai., Journal of Agricultural Food and Chemistry, voi. 32, sivut 21 - 28 (1984), ovat kuvanneet, jossa menetelmässä L-askorbiinihappoa metyloitiin diatsometaanilla pääasiassa 3-0-metyyli-L-askorbiinihapoksi. Hydrolysoimalla saatiin pääasillisina tuotteina 3-0-metyyli-L-askorbiini- 15 happoa ja D-glukoosia.

(12) Fysikaaliset ominaisuudet ja väri Värittömiä läpikuultavia kiteitä. Jauhettuina kiteet maistuvat happamilta, ne ovat kuitenkin hajuttomia. Ne eivät ole hygroskooppisia eivätkä ne nesteydy. Painohä- 20 viö kuumennettaessa kaksi tuntia 130 °C:ssa on alle 0,5 paino/paino-%.

Kuviossa 5 nähdään ylikyllästetyssä liuoksessa kasvavan kiteen mikroskooppikuva.

(13) Värireaktio 25 Ei osoita suoraa pelkistysaktiivisuutta eikä pel kistä 2,6-dikloorifenoli-indofenolia, jonka väri säilyy.

Negatiivinen reaktio 2,4-dinitrofenyylihydratsiinin kanssa.

Muuttuu vihreäksi antroni-rikkihapporeaktiossa.

30 (14) Rakenne-elementit

Hydrolysoituu α-glukosidaasin vaikutuksesta tai käsittelemällä 1-n HCl-liuoksella 100 eC:ssa viisi minuuttia, jolloin saadaan L-askorbiinihappoa ja D-glukoosia moolisuhteessa 1:1.

22 97621 (15) Röntgen-diffraktio-j auheanalyysi Röntgen-diffaktio-jauheanalyysillä käyttäen "Gei- gerflex Rad-II B (CuKa-säde)” -laitetta (Rigaku Corp., Tokio, Japani) kiteiden pääasialliset diffraktiokulmat 5 (20) ovat 10,3°, 14,8°, 16,2°, 18,4" ja 24,5°.

(16) Yksittäisen kiteen röntgenanalyysi Yksittäisellä kiteellä ylikyllästetyssä liuoksessa suoritetulla röntgen-diffraktioanalyysillä todettiin, että kide kuului ortorombiseen kidejärjestelmään ja sen alkeis-10 koppi oli P21212z, jonka hilavakiot olivat a = 11,929 A, b = 24,351 A ja c = 4,864 A (a = 8 = =90°).

Nämä tiedot osoittavat, että kiteen kemiallinen rakenne sisältää o-glukosyylisidoksen hiiliatomin nro 2 alkoholiryhmän ja D-glukoosin hiiliatomin nro 1 alkoholi-15 ryhmän välillä.

Kuviossa 6 nähdään kiteen ORTEP-kuva.

Edellä esitetyt tiedot osoittavat, että uuden kiteisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon kaava on (III):

20 CHj-OH

H-C-OH

CHj-OH

H OH 0 Näin ollen on ehdotettu, että a-glykosyyli-L-askor-30 biinihapolla, jossa L-askorbiinihappoon on liittynyt ekvi-molaarinen määrä tai enemmän D-glukoosiryhmiä, on seuraava kemiallinen rakennekaava (IV): 23 97621

CHi-OH

H-C-OH

CHi-OH CHa-OH

H OH H OH 0 k Jn 10 jossa n on kokonaisluku 0-6.

Koe 3

Kite±sen2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon pysyvyys liuoksessa 15 2-0-a-D-glukosyyli-L-askorbiinihapon pysyvyyttä vesiliuoksessa verrattiin JP-patenttijulkaisussa 38 158/ 73 esitetyn 6-0-a-D-glukosyyli-L-askorbiinihapon ja L-as-korbiinihapon vastaavaan pysyvyyteen. Tällöin kustakin näytteestä valmistettiin liuos, jonka konsentraatio oli 20 70 pmol ja pH-arvo 7,0 tai 2,0, liuos pantiin kyvettiin, jossa sen absorbanssi mitattiin lämpötilassa 45 eC aaltopituudella 260 nm pH 7:ssä ja 245 nm pH 2,0:ssä. Jäljellä oleva suhde (%) laskettiin absorbanssista. Tulokset on esitetty taulukossa I.

25 Kuten taulukon I tuloksista huomataan, kiteinen 2- Ο-α-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo on erityisen pysyvä vesiliuoksessa päinvastoin kuin 6-0-a-D-glukosyyli-L-askorbiinihappo ja L-askorbiinihappo.

Taulukko 1 24 97621

Aika (tunteja)

pH

0 1 2 4 18 24 5 -

2GAsA 100Z 1001 100Z 100Z 100Z 100Z

7 6GAsA 100Z 88Z 72Z 43Z 7Z 4Z

10 AsA 100Z 80Z 61Z 32Z 1Z 1Z

2GAsA 100Z 100Z 100Z 100Z 100Z 100Z

2 6GAsA 100Z 99Z 98Z 90Z 25Z 12Z

15 -

AsA 100Z 98Z 95Z 88Z 12Z 4Z

Huom: 2GAsA on keksinnön mukaisen 2-O-a-D-glukopyranosyy- 20 li-L-askorbiinihapon symboli; 6GAsA on vertailuna käytetyn 6-O-a-D-glukosyyli-L-askorbiinihapon symboli ja AsA on toisen vertailuyhdisteen, L-askor-biinihapon symboli.

25 Koe 4

Akuutti myrkyllisyys

Kokeen 1 menetelmällä valmistettua kiteistä 2-O-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa annettiin suun kautta seitsemän viikon ikäisille dd-hiirille akuutin myrkyl-30 lisyyden testaamiseksi. Tulokseksi saatiin, etteivät hii-.: ret kuolleet annoksilla aina 5 g:aan asti, sitä suuremmat annokset aiheuttivat vaikeuksia.

Nämä tulokset osoittivat näytteiden olevan erittäin vähän myrkyllisiä.

35 Seuraavat esimerkit A ja B kuvaavat kiteistä 2-0- α-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa ja sen käyttöä.

Il 25 97621

Esimerkki A-l

Kiteinen2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo

Yhdeksän paino-osaa α-syklodekstriiniä liuotettiin kuumentamalla 20 paino-osaan vettä ja liuokseen lisättiin 5 pelkistävissä olosuhteissa 3 paino-osaa L-askorbiinihap-poa, sitten liuokseen lisättiin pH-arvossa 5,5 ja lämpötilassa 65 eC 100 yksikköä/g α-syklodekstriiniä syklomalto-dekstriiniglukanotransferaasia (Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japani) ja seoksen annettiin 10 reagoida 40 tuntia. Reaktioseoksen HPLC-analyysi osoitti, että noin 50 % L-askorbiinihaposta oli samoin kuin kokeessa 1, muuttunut a-glykosyyli-L-askorbiinihapoksi.

Tämän jälkeen reaktioseosta kuumennettiin jäljellä olevan entsyymin inaktivoimiseksi, seoksen pH säädettiin 15 4,5:ksi ja lämpötila 55 *C:seen ja seokseen lisättiin 50 yksikköä/g α-syklodekstriiniä glukoamylaasia ja seoksen annettiin reagoida 24 tuntia. Nyt saadun reaktioseoksen HPLC-analyysi osoitti, että a-maltosyyli-L-askorbiinihappo ja korkeammat α-glykosyyli-L-askorbiinihapot olivat hydro-20 lysoituneet 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapoksi.

Sitten reaktioseosta kuumennettiin jäljellä olevan entsyymin inaktivoimiseksi, seosta käsiteltiin aktiivihiilellä värin poistamiseksi, hiili suodatettiin ja suodos vietiin kationista ioninvaihtajahartsia (H*-muoto) sisältä-25 vään kolonniin, jossa se demineralisoitiin ja sitten anio-nista ioninvaihtajahartsia (ΟΗ'-muoto) sisältävään kolonniin, jossa se demineralisoitiin ja sitten anionista ioninvaihtajahartsia (0H"-muoto) sisältävään kolonniin anio-nien absorboimiseksi. Tämän jälkeen kolonni pestiin vedel-30 lä ja eluoitiin 0,5-n HCl-liuoksella, eluaatille suoritet tiin geelisuodatuskromatografia ”HW-40":llä (geelituote, jota toimittaa Tosoh Corp., Tokio, Japani), jolloin saatiin 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa sisältävä fraktio, joka konsentroitiin vakuumissa noin 73-paino/pai-35 no-%:iseksi, pantiin kiteyttimeen, jossa siihen lisättiin 26 97621 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon kideytimiä, lämpötila säädettiin 40 eC:ksi ja alennettiin sitten vähitellen kahden vuorokauden kuluessa 25 °C:seen samalla hiljalleen sekoittaen, sitten kidemassa siirrettiin korityyp-5 piseen sentrifugiin melassin erottamiseksi. Saadut kiteet pestiin pienellä määrällä vesipitoista etanolia, jolloin saatiin puhtausasteeltaan noin 99-%:ista kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa saannolla noin 35 paino/paino-% lähtöaineena käytetystä L-askorbiiniha-10 posta laskettuna.

Vaikka tuotteen sulamispiste ja ominaiskierto olivat jonkin verran erilaiset kuin kokeessa 1 valmistetulla kiteisellä tuotteella, niin muut ominaisuudet olivat olennaisesti samat.

15 Tuote on olennaisesti ei-hygroskooppinen, helposti käsiteltävä, sillä ei ole suoraa pelkistysaktiivisuutta ja sen pysyvyys ja fysiologiset vaikutukset ovat korkeat. Täten tuotetta käytetään edullisesti makua parantavana aineena, happamuutta lisäävänä aineena, fysiologisesti 20 aktiivisena aineena, stabilointiaineena, laatua parantavana aineena, uv-absorbenttina, farmaseuttisena aineena ja kemikaalina elintarvikkeissa, juomissa, käsittelyyn reagoivien sairauksien lääkkeissä, kosmettisissa tuotteissa ja kemiallisissa reagensseissa sekä myös valmisteissa, 25 joiden tarkoituksena on lisätä C-vitamiinia.

Esimerkki A-2

Kiteinen2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo 30 paino-osaa dekstriiniä (DE noin 6) liuotettiin kuumentaen 40 paino-osaan vettä ja liuokseen lisättiin 30 pelkistävissä olosuhteissa 7 paino-osaa L-askorbiinihap-poa, sitten liuokseen lisättiin 60 °C:ssa pH-arvossa 5,6 250 yksikköä/g dekstriiniä syklodekstriiniglukanotransfe-raasia ja seoksen annettiin reagoida 40 tuntia. Reaktio-seoksen HPLC-analyysi, joka suoritettiin samoin kuin esi-35 merkissä A-l, osoitti, että noin 65 % L-askorbiinihaposta 27 97621 oli muuttunut α-glykosyyli-L-askorbiinihapoksi samoin kuin kokeessa 1.

Tämän jälkeen reaktioseos suodatettiin UF-membraa-nilla entsyymin poistamiseksi, pH säädettiin 5,0:ksi ja 5 lämpötila 50 °C:seen ja seokseen lisättiin 100 yksikköä/g dekstriiniä glukoamylaasia ja seoksen annettiin reagoida kuusi tuntia. Reaktioseoksen HPLC-analyysi osoitti, että a-D-maltosyyli-L-askorbiinihappo ja korkeammat a-glykosyy-li-L-askorbiinihapot olivat muuttuneet 2-0-a-D-glukopyra-10 nosyyli-L-askorbiinihapoksi.

Sitten reaktioseosta kuumennettiin jäljellä olevan entsyymin inaktivoimiseksi, seos suodatettiin ja suodos konsentroitiin ja kromatografoitiin "Dowex 50WX4 (Ca++- muoto)" -kolonnissa (vahvasti hapan kationinvaihtajahart-15 si, valmistaja: Dow Chemical Co., Midland, Michigan, USA) kokeessa 1 esitetyllä menetelmällä, jota oli jonkin verran modifioitu. Eluoitu 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiini-happoa sisältävä fraktio puhdistettiin demineralisoimalla kationinvaihtajahartsilla (H+-muoto), konsentroitiin vakuu-20 missä noin 77-paino/paino-%:iseksi, pantiin kiteyttimeen, siihen lisättiin 2 paino/paino-% kideytimiä, lämpötila säädettiin 45 °C:seen ja seosta sekoitettiin hiljalleen kaksi vuorokautta antaen lämpötilan asteittain alentua 28 °C:seen. Saatu kidemassa erotettiin samoin kuin esimer-25 kissä 1, jolloin saatiin 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askor-biinihappoa, jonka puhtausaste oli noin 98 % ja saanto noin 45 paino/paino-% lähtöaineena käytetystä L-askorbii-nihaposta laskettuna.

Samoin kuin Esimerkin A-l tuote, saatu tuote on 30 olennaisesti ei-hygroskooppinen, helposti käsiteltävä tuo-te, jolla ei ole suoraa pelkistysaktiivisuutta ja jonka pysyvyys ja fysiologinen aktiivisuus on tyydyttävän korkea. Täten tuotetta voidaan edullisesti käyttää makua parantavana aineena, happamuutta lisäävänä aineena, kosteut-35 ta säilyttävänä aineena, stabilointiaineena, laatua paran- 97621 tavana aineena, hapetuksenestoaineena, biologisesti aktiivisena aineena, uv-absorbenttina, kemikaalina elintarvikkeissa, juomissa ja kosmeettisissa tuotteissa sekä myös valmisteissa, joiden tarkoituksena on olla C-vitamiinili-5 sänä.

Esimerkki A-3

Kiteinen2-0-α-D-glukopyranosyy1i-L-askorbiinihappo

Samoin kuin esimerkissä A-2, syklomaltodekstriini-glukanotransferaasin ja glukoamylaasin annettiin vaikuttaa 10 reaktioseokseen, jolloin saatiin 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa sisältävä seos, seosta kuumennettiin entsyymien inaktivoimiseksi, käsiteltiin aktiivihiilellä värin poistamiseksi ja hiili suodatettiin. Saatu suodos demineralisoitiin kationinvaihtajahartsilla (H*-muoto) ja 15 kromatografoitiin kolonnissa, joka sisälsi vahvasti hapan ta kationinvaihtajahartsia (H*-muoto) esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä, jota hieman muunnettiin. Eluaattina saatu 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa sisältävä fraktio otettiin talteen, konsentroitiin 90-paino/ 20 paino-%:iseksi, pantiin kiteyttimeen, jossa siihen lisättiin noin 2 paino/paino-% kideytimiä ja sitä sekoitettiin hiljalleen 30 minuuttia, minkä jälkeen seos siirrettiin tarjottimelle, jossa sen annettiin kiteytyä ja muuttua kiinteäksi kolmen vuorokauden aikana 25 °C:ssa. Kiinteä 25 aines poistettiin tarjottimelta, syötettiin jauhinlaittee- seen ja kuivattiin, jolloin saatiin kiteistä 2-0-a-D-glu-kopyranosyyli-L-askorbiinihappoa, jonka puhtausaste oli noin 95 % ja saanto noin 70 paino/paino-% lähtöaineena käytetystä askorbiinihaposta laskettuna.

30 Samoin kuin esimerkin A-l tuote, saatu tuote on olennaisesti ei-hygroskooppinen, helposti käsiteltävä tuote, jolla ei ole suoraa pelkistysaktiivisuutta ja jonka pysyvyys ja fysiologinen aktiivisuus on tyydyttävän korkea. Täten tuotetta voidaan edullisesti käyttää makua pa-35 rantavana aineena, happamuutta lisäävänä aineena, stabi- 29 97621 lointlaineena, laatua parantavana aineena, glukosyyleina, biologisesti aktiivisena aineena, uv-absorbenttina, kemikaalina elintarvikkeissa, juomissa, kosmeettisissa tuotteissa sekä myös valmisteissa, joiden tarkoituksena on 5 olla C-vitamiinilisänä.

Esimerkki Ά-4

Kiteinen2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo

Esimerkin A-3 menetelmällä valmistettu 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa sisältävä fraktio kon-10 sentroitiin noin 80-paino/paino-%:iseksi, pantiin kiteyt- timeen, jossa siihen lisättiin noin 2 paino/paino-% kide-ytimiä ja jossa se asteittain jäähdytettiin 50 eC:seen samalla edistäen kiteytymistä hiljalleen sekoittamalla. Saatu kidemassa, jonka kiteisyys oli noin 35 %, sumutet-15 tiin sumutetornista 1,5 mm läpimittaisen suuttimen kautta suurpainepumpulla paineella 150 kg/cm2.

Samanaikaisesti tornin yläpäästä johdettiin 80 °C:ista ilmaa tornin alaosassa olevaa verkkokuljetinta kohti, jolle kuljettimelle jauhemainen tuote koottiin; 20 saatu kiteinen jauhe kuljetettiin vähitellen pois tornista noin 30 minuutin kuluessa samalla kun verkon lävitse johdettiin 40 eC:einen ilmavirta.

Kiteinen jauhe vietiin sitten vanhennustorniin, jossa sen annettiin vanheta 10 tuntia, jona aikana tapah-25 tui kiteytymistä ja veden poistumista. Näin saatiin ki- « teistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa, jonka puhtausaste oli noin 95 % ja saanto noin 70 paino/paino-% lähtöaineena käytetystä L-askorbiinihaposta laskettuna.

30 Samoin kuin esimerkin A-l tuote saatu tuote on . olennaisesti ei-hygroskooppinen, helposti käsiteltävä tuo te, jolla ei ole suoraa pelkistysaktiivisuutta ja jonka pysyvyys ja fysiologinen aktiivisuus on tyydyttävän korkea. Täten tuotetta voidaan edullisesti käyttää makua pa-35 rantavana aineena, happamuutta lisäävänä aineena, stabi- 30 97621 lointiaineena, laatua parantavana aineena, hapetuksenesto-aineena, biologisesti aktiivisena aineena, uv-absorbentti-na, kemikaalina elintarvikkeissa, juomissa, kosmeettisissa tuotteissa sekä myös valmisteissa, joiden tarkoituksena on 5 olla C-vitamiinilisänä.

Esimerkki A-5 Esimerkki A-5(l) α-glukosidaasin valmistus

Mucor javanicus 1F0 4570 ympättiin kasvualustalle 10 ja viljeltiin 30 °C:ssa 44 tuntia ilmastoidussa ja sekoitetussa nestemäisessä viljelyväliaineessa (500 paino-osaa), joka sisälsi vettä ja 4,0 paino/til.-% maltoosia, 0,1 paino/til.-% yksiemäksistä kaliumfosfaattia, 0,1 paino/ t il. -% ammoniumnitraattia, 0,05 paino/til.-% magnesium-15 sulfaattia, 0,05 paino/til.-% kaliumkloridia, 0,2 paino/ til.-% polypeptonia ja 1 paino/til.-% kalsiumkarbonaattia, jotka aineosat oli steriloitu ja steriilisti lisätty veteen välittömästi ennen ymppäämistä. Viljelyn päätyttyä huovasto otettiin talteen ja immobilisoitiin tavallisella 20 tavalla.

Esimerkki A-5(2)

Kiteisen2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihapon valmistus 40 paino-osaa "SunmaltiaR" (kiteinen maltoosi, jota 25 markkinoi Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japani) liuotet tiin kuumentamalla 70 paino-osaan vettä ja liuokseen lisättiin pelkistävissä olosuhteissa 10 paino-osaa L-askor-biinihappoa ja sen jälkeen 10 yksikköä/g maltoosia esimerkin A-5(1) mukaisesti valmistettua immobilisoitua a-gluko-30 sidaasia ja seoksen annettiin reagoida 50 °C:ssa pH-arvossa 5,5 kolme tuntia valolta suojattuna.

Yksi α-glukosidaasiyksikkö määritellään entsyymi-määräksi, joka vapauttaa 1 pmoolin glukoosia 37 °C:ssa yhden minuutin aikana kokeessa, joka suoritetaan seuraa-35 vissa olosuhteissa. Sopivasti laimennettua entsyymiliuosta 3i 97621 lisätään 100 μΐ liuokseen, joka sisältää 250 μΐ 4-paino/ til.-%:ista maltoosia ja 750 μΐ 0,1-m asetaattipuskuria (pH 6,0), joka sisältää 1,35 mM EDTA ja seoksen annetaan reagoida 37 °C:ssa 30 minuuttia, sitä inkuboidaan kiehu-5 vassa vedessä kolme minuuttia reaktioseoksen suspendoimi-seksi ja sitten lingotaan. Tämän jälkeen päällä olevasta nesteestä otetaan 20 μ1:η näyte, johon lisätään 1 ml "Glukose B test" -reagenssia (glukoosioksidaasimenetelmäs-sä käytettävä värireagenssi, jota markkinoi Wako Pure 10 Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japani), seosta inkuboidaan 37 °C:ssa 20 minuuttia ja kehittyneen värin absor-banssi mitataan aaltopituudella 505 nm.

Tämän jälkeen reaktioseoksesta suodatettiin immobi-lisoitu α-glukosidaasi talteen käytettäväksi toisessa 15 reaktioerässä. Suodosta käsiteltiin värinpoistohiilellä, hiili suodatettiin ja suodos kromatografoitiin vahvasti hapanta kationinvaihtajahartsia sisältävässä kolonnissa esimerkin A-2 menetelmällä, jolloin saatiin 2-0-a-D-gluko-pyranosyyli-L-askorbiinihappoa sisältävä fraktio, joka 20 puhdistettiin kationinvaihtajahartsilla esimerkin A-3 mu kaisella menetelmällä, saatu liuos konsentroitiin vakuu-missa noin 90-paino/paino-%:iseksi, pantiin kiteyttimeen, siihen lisättiin kideytimiä ja se kiteytettiin tarjottimella, kiinteä tuote syötettiin leikkaavaan jauhinlaittee-25 seen ja kuivattiin, jolloin saatiin kiteistä 2-0-a-D-glu-kopyranosyyli-L-askorbiinihappoa, L-askorbiinihappoa, jonka puhtausaste oli noin 88 % ja noin 20 paino/paino-% lähtöaineena käytetystä L-askorbiinihaposta laskettuna.

Kun tätä tuotetta verrataan esimerkin A-l tuottee-30 seen, se on jonkin verran huonompi, se on kuitenkin olennaisesti ei-hygroskooppinen, helposti käsiteltävä tuote, jolla ei ole suoraa pelkistysaktiivisuutta ja jonka pysyvyys ja fysiologinen aktiivisuus on tyydyttävän korkea. Täten tuotetta voidaan edullisesti käyttää makua paranta-35 vana aineena, happamuutta lisäävänä aineena, stabilointi- 32 97621 aineena, laatua parantavana aineena, hapetuksenestoainee-na, uv-absorbenttina, kemikaalina elintarvikkeissa, juomissa, kosmeettisissa tuotteissa sekä myös valmisteissa, joiden tarkoituksena on olla C-vitamiinilisänä.

5 Esimerkki B-l

Purukumi 25 paino-osaa purukumiperusainetta ja 20 paino-osaa esimerkin A-2 menetelmällä valmistettua kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa vaivattiin yhteen 10 60 °C:ssa sekoittimessa ja seokseen lisättiin 50 paino- osaa vedetöntä kiteistä maltitolia ("MabitR, Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Japani), 1,5 paino-osaa kalsiumfos-faattia ja 0,1 paino-osaa L-mentolia sisältävää B-syklo-dekstriiniä sekä lisäksi vähäinen määrä makuainetta, seos 15 valssattiin levyksi ja leikattiin otsikon mukaisiksi tuotteiksi. Tuote on C-vitamiinilla rikastettu, alhaiskario-geeninen ja alhaiskalorinen purukumi.

Esimerkki B-2 "Gyuhi (tärkkelystahna)" 20 Yksi paino-osa vahamaista riisitärkkelystä sekoi tettiin 1,2 paino-osaan vettä ja seokseen lisättiin 1,5 paino-osaa sakkaroosia, 0,7 paino-osaa B-maltoosia ("Sunmalt", Hayashibara Co. Ltd., Okayama, Japani), 0,1 paino-osaa esimerkin A-5 mukaisesti valmistettua ki-25 teistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa ja seos sekoitettiin homogeeniseksi samalla gelatinoiden kuumentamalla. Sitten saatu tuote muovattiin ja pakattiin tavallisella tavalla.

Saatu tuote (gyuhi) on C-vitamiinilla rikastettu 30 japanilaistyylinen makeinen, jonka maku- ja purentaominai-suudet ovat erinomaiset ja joka muistuttaa "kibi-dangoa (hirssikokkare)". Tuotteen säilytyskestävyys on hyvä, koska sen hajaantuminen on tehokkaasti estetty.

33 97621

Esimerkki B-3

Makeutusseos

Makeutusseos saatiin sekoittamalla yhteen 100 paino-osaa hunajaa, 50 paino-osaa isomeroitua sokeria, kaksi 5 paino-osaa raffinoimatonta sokeria ("kurozato") ja yksi paino-osa esimerkin A-3 menetelmällä valmistettua kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa.

Tuote on C-vitamiinilla rikastettu makeutusaine, joka sopii terveysruokaan.

10 Esimerkki B-4

Suklaa 40 paino-osaa kaakaotahnaa, 10 paino-osaa kaakaovoi ta, 50 paino-osaa vedetöntä kiteistä maltitolia ja yksi paino-osa esimerkin A-2 mukaisesti valmistettua kiteistä 15 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa sekoitettiin homogeeniseksi seokseksi ja seos syötettiin hienonnuslaitteeseen hiukkaskoon pienentämiseksi, siirrettiin sitten suklaamyllyyn, jossa sitä vaivattiin 50 °C:ssa kaksi vuorokautta. Vaivausvaiheessa lisättiin 0,5 paino-osaa lesi-20 tiiniä, joka dispergoitiin massaan homogeeniseksi. Tämän jälkeen massan lämpötila säädettiin lämpötilan säätimellä 31 °C:seen ja massa levitettiin muotteihin välittömästi ennen kaakaovoin kovettumista, ilma poistettiin tärytti-mellä ja suklaa kovetettiin johtamalla jäähdytystunnelin 25 (10 °C) lävitse 20 minuutin aikana. Suklaa poistettiin muoteista ja pakattiin, jolloin saatiin otsikon tuote.

Saatu tuote ei ole hygroskooppinen, sen väri, kiilto ja rakenne ovat erinomaiset, se sulaa suussa tasaisesti ja sen maku ja makeus ovat kohtuulliset ja pehmeät. Tuote 30 on C-vitamiinilla rikastettu, alhaiskariogeeninen ja al-haiskalorinen suklaa.

Esimerkki B-5

Kreemitäyte

Kreemitäyte valmistettiin sekoittamalla homogeeni-35 seksi seokseksi tavallisella tavalla 1 200 paino-osaa ki- 34 97621 teistä α-maltoosia ("Finetose*", Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japani), 1 000 paino-osaa rasvaa (shortening), 10 paino-osaa esimerkin A-4 mukaisesti valmistettua 2-0-α-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa, yksi paino-osa 5 sitruunaöljyä ja yksi paino-osa vaniljaöljyä.

Tuote on C-vitamiinilla rikastettu kreemitäyte, jonka maku, aromi, sulamisominaisuudet ja tuntu suussa ovat erinomaiset.

Esimerkki B-12 10 Kylpyneste

Kylpyneste valmistettiin sekoittamalla 21 paino-osaa DL-natriumlaktaattia, kahdeksan paino-osaa natriumpy-ruvaattia, viisi paino-osaa esimerkin A-5 menetelmällä valmistettua kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbii-15 nihappojauhetta ja 40 paino-osaa etanolia 26 paino-osaan puhdistettua vettä ja lisäämällä sopivia määriä väriä ja hajustetta.

Tuote sopii käytettäväksi ihonhoitoaineena ja ihon valkaisuaineena, joka käytössä laimennetaan 100 - 10 000-20 kertaisesti kylpyveteen. Tässä tapauksessa kylpyvesi voidaan korvata puhdistusnesteellä, kutistavalla aineella ja kosteuttavalla nesteellä.

Esimerkki B-13

Xhonhoitomaito 25 0,5 paino-osaa polyoksietyleenibehenyylieetteriä, » » yksi paino-osa polyoksietyleenisorbitolitetraoleaattia, yksi paino-osa öljyliukoista glyseryylimonostearaattia, 0,5 paino-osaa palorypälehappoa, 0,5 paino-osaa behenyyli-alkoholia, yksi paino-osa avokadoöljyä, yksi paino-osa 30 esimerkin A-4 mukaisesti valmistettua kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa ja sopivat määrät E-vitamiinia ja antiseptistä ainetta liuotettiin tavallisella tavalla kuumentaen ja liuokseen lisättiin yksi paino-osa L-natriumlaktaattia, viisi paino-osaa 1,3-butyleeni-35 glykolia, 0,1 paino-osaa karboksivinyylipolymeeria ja 35 97621 85,3 paino-osaa puhdistettua vettä, seos emulgoitiin homo-genisaattorin avulla ja siihen lisättiin sekoittaen sopiva määrä hajustetta, jolloin saatiin otsikon tuote.

Tuotetta voidaan edullisesti käyttää korkealaatui-5 sena aurinkosuojamaitona, ihonhoitoaineena ja ihoa valkaisevana aineena.

Esimerkki B-14

Kosmettinen voide

Kaksi paino-osaa polyoksietyleeniglykolimonostea-10 raattia, viisi paino-osaa itse-emulgoituvaa glyserolimono-stearaattia, kaksi paino-osaa esimerkin A-3 mukaisesti valmistettua kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbii-nihappoa, yksi paino-osa parafiiniöljyä, 10 paino-osaa glyseryylitrioktanaattia ja sopiva määrä antiseptistä ai-15 netta liuotettiin kuumentaen tavallisella tavalla ja seokseen lisättiin kaksi paino-osaa L-maitohappoa, viisi paino-osaa 1,3-butyleeniglykolia ja 66 paino-osaa puhdistettua vettä ja seos emulgoitiin homogenisaattorin avulla, siihen lisättiin sopiva määrä hajustetta ja sitä sekoitet-20 tiin, jolloin saatiin otsikon tuote.

Tuote on sopiva käytettäväksi korkealaatuisena aurinkosuojavoiteena, ihonhoitovoiteena ja ihoa valkaisevana voiteena.

Kuten edellä on kuvattu, keksinnön mukainen uusi • 25 yhdiste, kiteinen 2-O-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiini- happoa on olennaisesti ei-hygroskooppinen, ei nesteydy eikä kovetu eikä sillä ole suoraa pelkistysaktiivisuutta, se on helposti käsiteltävä, erittäin pysyvä ja helposti in vivo hydrolysoituva yhdiste, jolla on L-askorbiinihapolle 30 ominaista hapetuksenestoaktiivisuutta ja fysiologista aktiivisuutta. Lisäksi 2-0-o-D-glukopyranosyyli-L-askorbii-nihappo on erittäin turvallinen yhdiste, koska se syntetisoidaan ja metaboloituu in vivo.

Kiteinen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihap-35 poa voidaan helposti kiteyttää ylikyllästetystä liuoksesta 36 97621 antamalla sakkaridinsiirtoentsyymin vaikuttaa yksin tai yhdessä glukoamylaasln kanssa liuokseen, joka sisältää L-askorbllnlhappoa ja α-glukosyylisakkarldla ja puhdistamalla ja konsentroimalla saatu 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-5 askorbllnlhappo. Klteytysmenetelmä on siten taloudellisuuden kannalta ylivoimaisen edullinen ja tuotteen markkinointi on helppoa.

Koska kiteinen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbii-nihappo on tyydyttävän hyvin pysyvä ja fysiologisesti ak-10 tiivinen, sitä käytetään edullisesti stabilointiaineena, laatua parantavana aineena, hapetuksenestoaineena, fysiologisesti aktiivisena aineena, uv-absorbenttina, kemiallisena aineena elintarvikkeissa, kuten juomissa ja valmis-ruokatuotteissa, kosmetiikassa, kuten ihonhoitoaineissa ja 15 ihon valkaisuaineissa. Siten kiteisellä 2-0-a-D-glukopyra-nosyyli-L-askorbiinihapolla on laajaa käyttöä ja sillä on suurta merkitystä näillä teollisuusaloilla.

«« t

Claims (26)

1. 37 97621
2. 1. Kiteinen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiini- happo.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kiteinen 2-0-a- D-glukopyranosyy1i-L-askorbi inihappo, jonka röntgendif-fraktio-jauheanalyysillä määritetyt pääasialliset diffrak-tiokulmat (2Θ) ovat 10,3°, 14,8°, 16,2°, 18,4° ja 24,5°.
4. 3. Menetelmä kiteisen 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-10 askorbiinihapon valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo kiteytetään ylikyllästetystä liuoksestaan ja saatu kiteinen 2-0-α-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo otetaan talteen.
5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että ylikyllästetty liuos valmistetaan antamalla sakkaridinsiirtoentsyymin yksinään tai yhdessä glukoamylaasin kanssa vaikuttaa L-askorbiinihappoa ja o-glukosyylisakkaridia sisältävään liuokseen, jolloin muodostuu 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa ja 20 ottamalla talteen ja puhdistamalla saatu 2-0-a-D-glukopy-ranosyyΪi-L-askorbi inihappo.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu sakkaridinsiirto-entsyymi on syklomaltodekstriiniglukanotransferaasi (EC . 25 2.4.1.19) tai α-glukosidaasi.
7. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että α-glukosyylisakkaridi valitaan seuraavista: malto-oligosakkaridi, tärkkelyksen osit-taishydrolysaatti, nesteytetty tärkkelys, gelatinoitu 30 tärkkelys, liuennut tärkkelys ja näiden seokset. * 7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakkaridinsiirtoentsyymiä käytetään määränä, joka saa aikaan täydellisen reaktion 3-80 tunnissa. 97621
8. 8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakkaridinsiirtoentsyymin annetaan vaikuttaa liuokseen pH-arvossa 3 - 9 ja lämpötilassa 20 - 80 °C.
9. 9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että L-askorbiinihapon konsentraa-tio on vähintään 1 paino/paino-%.
10. 10. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että α-glukosyylisakkaridin kon- 10 sentraatio on 0,5 - 30-kertainen L-askorbiinihapon konsen-traatioon verrattuna.
11. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoamylaasin (EC 3.2.1.3) annetaan vaikuttaa liuokseen yhdessä sakkaridinsiirtoent- 15 syymin kanssa.
12. 12. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteisen 2-O-a-D-glukopyra-nosyyli-L-askorbiinihapon röntgendiffraktio-jauheanalyy-sillä määritetyt pääasialliset diffraktiokulmat (2Θ) ovat: 20 10,3°, 14,8°, 16,2°, 18,4° ja 24,5°.
13. 13. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteytysvaihe suoritetaan kiteyttimen läsnä ollessa.
14. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että kideytimien määrä on 0,1 -10 paino/paino-%.
15. 15. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuoksen ylikyllästysaste on 1,05 - 1,5.
16. 16. Menetelmä elintarvikkeen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että siinä yhtenä vaiheena sisällytetään kiteistä 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiini-happoa elintarvikkeeseen. 97621
17. 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa sisältyy elintarvikkeeseen vähintään 0,01 paino/paino-%.
18. 18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa on valmistettu patenttivaatimuksen 3 mukaisella menetelmällä.
19. 19. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että kiteisen 2-0-a-D-glukopyra- nosyyli-L-askorbiinihapon röntgendiffraktio-jauheanalyy-sillä määritetyt pääasialliset diffraktiokulmat (2Θ) ovat: 10,3°, 14,8°, 16,2°, 18,4° ja 24,5°.
20. 20. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L- askorbiinihappoa sisällytetään elintarvikkeeseen yhdessä E-vitamiinin ja/tai P-vitamiinin kanssa.
21. 21. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteistä 2-0-a-D-glukopyrano- 20 syyli-L-askorbiinihappoa sisällytetään elintarvikkeeseen sellaisenaan tai liuoksena.
22. 22. Menetelmä kosmeettisen tuotteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että tuotteeseen yhtenä vaiheena sisällytetään vaikuttavana aineosana kiteistä 2-0- 25 a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappoa.
23. 23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 2-0-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo on valmistettu patenttivaatimuksen 3 mukaisella menetelmällä.
24. 24. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteisen 2-O-a-D-glukopyrano-syyli-L-askorbiinihaponröntgendiffraktio-jauheanalyysillä määritetyt pääasialliset vallitsevat diffraktiokulmat (2Θ) ovat: 10,3°, 14,8°, 16,2°, 18,4° ja 24,5°. 97621
25. 25. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 2-O-a-D-glukopyranosyyli-L-askorbiinihappo sisällytetään tuotteeseen yhdessä E-vita-miinin ja/tai P-vitamiinin kanssa.
26. 26. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteistä 2-O-a-D-glukopyrano-syyli-L-askorbiinihappoa sisällytetään tuotteeseen sellaisenaan tai liuoksena. Il 41 97621