DE69019149T2

DE69019149T2 - Verfahren zur analyse, reagenszusammensetzung sowie deren verwendung bei der glukosebestimmung.

Info

Publication number: DE69019149T2
Application number: DE69019149T
Authority: DE
Inventors: Jan Evert S-253 68 Helsingborg Lilja; Sven-Erik Lennart S-283 67 Helsingborg Nilsson
Original assignee: MIGRATA UK Ltd
Current assignee: MIGRATA UK Ltd
Priority date: 1989-04-25
Filing date: 1990-04-24
Publication date: 1995-09-07
Anticipated expiration: 2010-04-25
Also published as: NO914181D0; JPH04504661A; LV10122A; KR920701476A; CA2053315C; WO1990012889A1; LT3136B; RU2050546C1; FI97551C; EP0470201B1; SE466158B; DK0470201T3; DE69019149D1; AU5557590A; NO914181L; ES2071821T3; SE8901515L; FI915020A0; ATE122102T1; US5278047A

Description

Die Erfindung betrifft die Glukose-Bestimmung und insbesondere die Bestimmung der Gesamtglukosemenge in unverdünntem Vollblut. Die Erfindung betrifft ein Analyseverfahren, ein Reagenzmittel hierfur und die Verwendung dieses Reagenzmittels.
Eine bedeutende Routineanalyse in der klinischen Chemie ist die Blutglukosebestiinmung. Diese Analyseform findet Verwendung bei der Diagnose und Therapie der Zuckerkrankheit und bei der Diagnose einer ganzen Anzahl von anderen Stoffwechselstörungen. Verschiedene Verfahren zur mengenmäßigen Glukosebestimmung im Vollblut sind bekannt.
Eines dieser bekannten Verfahren basiert auf der enzymatischen Glukosebestimmung mittels Glukasedehydrogenase. Die Zusammensetzung eines Reagenzmittels für dieses Verfahren ist in US 4,120,755 beschrieben. Dieses Reägenzmittel enthält einen Puffer, einen Pyridinaktivator und Glukosedehydrogenase. Der Puffer hat einen pH-Wert zwischen 7,9 und 9,0. Eine andere bekannte Zusammensetzung eines Reaktionsmittels für die Glukosebestimmung ist aus US 3,964,974 bekannt. Dieses Reaktionsmittel besteht in erster binie aus einer Glukosedehydrogenase van bestimmter Reinheit und Art, einem Pyridinaktivator wie z. B. NAD, einem Puffersystem zur Erhaltung des pH-Werts einer wässrigen Lösung des Reagenzmittels zwischen 6,5 und 8,5, und Mutarotase. Keines dieser beiden Patente beschreibt ein Verfahren oder ein Reagenzmittel, das geeignet wäre, die Gesamtglukosemenge in unverdunntein Vollblut direkt zu bestimmen, d. h. ohne vorangegangenes Verdünnen oder Ausfällen. Die einzige Information zur Frage, wie Glukose in Vollblut analysiert werden kann, ist im Beispiel 7 in US 3,964,974 enthalten, wonach die naß-chemische Glukosebestimmung an einer Vollblutprobe ausgeführt wird. Die Proteine werden jedoch aus der Vollblutprobe entfernt, bevor die Glukose gemessen wird. Durch das Entfernen der Proteine werden gleichfalls die roten Blutkörperchen entfernt. Damit erfolgt die Glukosemessung nicht am Vollblut. Es wird auf S. 9, Zeilen 19 - 24 der US-Veröffentlichung verwiesen, wo der Leser ausdrücklich von dem Gedanken weggefu-hrt wird, die roten Blutkörperchen bei der Vollblutmessung zurückzubehalten. Nachdem das unverdünnte Blut von Proteinen in einem Vorverdünnungsschritt befreit wurde, wird es mit einer Enzym-/Pufferlösung vermischt. Die Reaktion wird dann durch Zugabe einer Aktivatorlösung (NAD) ausgelöst, woraufhin der Glukosegehalt bestimmt wird. Es ist festzustellen, daß der Glukosegehalt u. a. durch eine NADH&sub2;- anzeigende Färbe- bzw. Farbreaktion, d. h. durch Hydrieren eines Tetrazolsalzes zu einem entsprechenden Formazan unter dem Einfluß des Enzyms Diaphorase, gemessen werden kann. Die Veröffentlichung enthält jedoch nicht den Vorschlag, dieses NADH&sub2;-anzeigende Verfahren zur Gesamtglukosemessung in einer Vollblut-Hämolysate zu verwenden, sondern lediglich zur Glukosemessung im Blutplasma. Darüber hinaus werden in der Blutglukosemessung gemäß US 3, 964, 974, beispielsweise nach dessem Beispiel 7, Messungen durchweg an verdünntem Blut ausgeführt. Demgegenüber beruht die vorliegende Erfindung auf unmittelbaren Messungen an unverdunnten Blutproben.
Es versteht sich von selbst, daß ein einfacher und schnell durchzuführender Test zur Bestimmung der Gesamtglukosemenge im unverdünnten Vollblut eine wertvolle Hilfe in klinischen Laboratorien darstellen würde.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Bestimmung der Gesamtglukosemenge in unverdünntem Vollblut durch Übertragungs-Spektralphotometrie zu entwickeln.
Eine andere Aufgabe ist es, ein Trockenreagenz mit einer bestimmten Zusammensetzung für eine derartige Messung zu entwickeln.
Erfindungsgemäß ist das Blut vorzugsweise nicht nur unverdünnt sondern auch unbehandelt.
Nach einem ersten Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Gesamtglukosemenge in unverdünntem Vollblut vorgesehen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Probe unverdünnten Vollbluts mit einem Reagenzmittel in trockener Form in Kontakt gebracht wird, das enthält:
- Glukosedehydrogenase (GDH);
- eine oder mehrere Substanzen der Gruppe, die aus Diaphorase, Phenazin-Methosulfat, Phenazin-Äthosulfat, Phenazin-Phenosulfat und Meldola Blau besteht;
- eine oder mehrere Substanzen der Gruppe, die aus NAD, NADP, Thio-NAD, Thio-NADP, Nikotinsäureamid- Purin-Dinukleotid, Nikotinsäureamid-Methylpurin-Dinukleotid, Nikotinsäureamid-2-Chlor-Methylpurin-Dinukleotid besteht;
- eine oder mehrere Hämolyse-Substanzen aus der Gruppe, die aus Phosphorlipase, Hämolyse-Saponinen und Hämolyse-Verbindungen besteht, wobei der hydrophile Teil des Moleküls aus einem Mono-, Di- oder Trisaccharid und der hydrophobe Teil des Moleküls aus einem aliphatischem Kohlenwasserstoff mit 10 bis 16 Kohlenstoffatomen besteht;
- einen Red-Ox-Farbindikator, der in keinerlei Wirkungszusamrnenhang mit der Absorption des Hämoglobins steht und aus einem Tetrazolsalz besteht; und
- ggf. Mutarotase;
und dadurch, daß eine durch die Reaktion des Reagenzmittels mit Glukose im unverdünnten Vollblut herbeigeführte Farbveränderung durch Übertragungs-Spektralphotometrie gemessen wird.
Eine Hilfe zur Durchfuhrung dieses Verfahrens ist in US 4,088,448 beschrieben.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Reagenzmittel zur Bestimmung der Gesamtglukosemenge im unverdünnten Vollblut vorgesehen, wobei das Reagenzmittel dadurch gekennzeichnet ist, daß es in trockener Form vorliegt und enthält:
- Glukosedehydrogenase (GDH);
- eine oder mehrere Substanzen aus der Gruppe, die aus Diaphorase, Phenazin-Methosulfat, Phenazin-Ethosulfat, Phenazin-Phenosulfat und Medola Blau besteht;
- eine oder mehrere Substanzen aus der Gruppe, die aus NAD, NADP, Thio-NAD, Thio-NADP, Nikotinsäureamid-Purin-Dinukleotid, Nicotinsäureamid-Methylpurin-Dinukleotid, Nikotinsäureamid-2-Chlor-6-Methylpurin-Dinukleotid besteht;
- eine oder mehrere Hämolyse-Substanzen aus der Gruppe, die aus Phosphorlipase, Hämolyse-Saponinen und Hämolyse-Verbindungen besteht, wobei der hydrophile Teil des Moleküls aus einem Mono-, Di- bzw. Trisaccharid und der hydrophobe Teil aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 10 bis 16 Kohlenstoffatomen besteht;
- einen Red-Ox-Farbindikatior, der nicht von der Spektralabsorption des Hämoglobins beeinflußt wird und aus Tetrazolsalz besteht; und
- ggf. Mutarotase.
Nach einem dritten Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Reagenzmittels vorgesehen, das enthält:
- Glukosedehydrogenase (GDH);
- eine oder mehrere Substanzen aus der Gruppe, die aus Diaphorase, Phenazin-Methosulfat, Phenazin-Äthosulfat, Phenazin- Phenosulfat und Meldola Blau besteht;
- eine oder mehrere Substanzen aus der Gruppe, die aus NAD, NADP, Thio-NAD, Thio-NADP, Nikotinsäureamid-Purin-Dinukleotid, Nikotinsäureamid-Methylpurin-Dinukleotid, Nicotinsäureamid-2-Chlor-Methylpurin-Dinukleotid besteht;
- eine oder mehrere Hämolyse-Substanzen aus der Gruppe, die aus Phosphorlipase, Hämolyse-Saponin und Hämolyse-Verbindungen besteht, wobei der hydrophile Teil des Moleküls aus einem Mono-, Di- oder Trisaccharid und der hydrophobe Teil aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 10 bis 16 Kohlenstoffatomen besteht;
- einen Red-Ox-Farbindikator, der von der Spektralabsorption des Hämoglobins nicht beeinflußt wird und der aus einem Tetrazolsalz besteht; und
- ggf. Mutarotase,
und das zur Bestimmung der Gesamtglukosemenge in unverdünntem Vollblut durch Übertragungs-Spektrophotometrie in trockener Form vorliegt.
Die im erfindungsgemäßen trockenen Reagenzmittel enthaltene jeweilige Menge seiner verschiedenen Bestandteile ist nicht entscheidend. Auf der Basis einer Probe von 1 ml unverdünnten Vollbluts berechnet kann die jeweilige Menge jedoch vorzugsweise in der folgenden Größenordnung liegen: Substanz Menge Glukosedehydrogenase Diaphorase/entsprechende Substanzen Phosphor-Lipase/entspr. Subst. Mutarotase Red-Ox-Farbindikator (Aktivitäts-Einheiten)
Dieser Grundzusammensetzung des Reaktionsmittels können Bestandteile zugesetzt werden, die die Reaktionsfunktion in verschiedenen Anwendungsbereichen optimieren. Mutarotase kann verwendet werden, um Alpha-Glukose rasch in Beta-Glukose zu verwandeln, also in die Glukoseform, die mit Glukosedehydrogenase reagiert. Dies ist von besonderem Interesse, wenn eine Probe, die nicht unmittelbar dem Patienten entnommen wurde, analysiert werden soll. Glukosedehydrogenase zerlegt vor allem Beta-Glukose. In wässrigen Lösungen liegen Alpha- und Beta-Glukose in temperaturabhängigem Gleichgewicht vor, das relativ langsam aufgebaut wird. Da die Körpertemperatur relativ konstant ist, muß Mutarotase, die den Aufbau des Gleichgewichts beschleunigt, im Reagenzmittel nicht enthalten sein, wenn Proben aus Blut mit Körpertemperatur vorliegen. Abgesehen von der Kostenreduktion liegen die Vorteile in einer verkürzten Reaktionszeit und einem vergrößerten Analysebereich. Ein Nachteil besteht darin, daß die Eich-Lösungen und die Kontrollösungen für wenigstens eine Stunde auf die geeignete Temperatur gebracht werden sollten.
Dem Reagenzmittel können Substanzen zugegeben werden, die eine pH-regulierende Wirkung haben, wodurch sichergestellt wird, daß der pH-Wert während des Versuchs im Wirkungsbereich der Enzyme liegt.
Substanzen, die die Löslichkeit und Dauerhaftigkeit der Bestandteile des Reagenzmittels beeinflussen, können dem Reagenzmittel für den Einsatz in verschiedenen anspruchsvollen Anwendungsbereichen zugesetzt werden.
Glukosedehydrogenase ist in verschiedenen Formen erhältlich, die unterschiedliche Molekulargewichte, optimale pH-Werte etc. aufweisen. Im vorliegenden Fall umfaßt die Glukosädehydrogenase lediglich NAD-abhängige Enzyme bzw. Enzyme, die von NAD-ähnlichen Substanzen abhängig sind, nicht jedoch Enzyme, die sauerstoffabhängig sind und mit Kinoid-Aktivatoren arbeiten und die auch als Glykose-Dehydrogenasen bezeichnet werden.
Diaphorase ist gleichfalls in verschiedenen Formen erhältlich, kann jedoch durch bekannte Substanzen wie beispielsweise Phenazin-Methosulfat, Meldola Blau etc ersetzt werdem. Es gibt weitere bekannte NAD-ähnliche Substanzen, beispielsweise das am besten bekannte NADP, die durch die Reaktion zwischen Glukose und Glukose-Dehydrogenase reduziert werden können, und diese Reduktion auf ein Färbe- oder Farbsystem übertragen.
Unter Umständen ist die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen zur leichteren Befeuchtung der Oberflächen einer Hilfsvorrichtung nötig. Die Oberflächenspannung abbauende Substanzen können zugeführt werden, um das Aufbringen auf hydrophobe Kunststoffoberflächen zu erleichtern.
Um die Suspension an verschiedene Arten von Trägereinrichtungen anzupassen, kann ihre Viskosität verändert werden, indem ihr geeignete Polymere von hohem Molekülgewicht zugegeben werden. Die gewählte Art von Polymeren mit hohem Molekülgewicht ist nicht entscheidend, doch beeinflußt sie die Auflösungsgeschwindigkeit des trockenen Reagenzmittels. Zu den verwendbaren Polymeren gehören u.a. Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Dextran und verschiedene Zellulosederivate. Die Wahl der Polymere kann auch im Hinblick auf die Stabilisierung der Suspension erfolgen. Da bereits Präparationstechniken beispielsweise aus der Lebensmittel- oder Kosmetikindustrie bekannt sind, werden kaum Probleme bei der Anpassung des Reagenzmittels an die verschiedenen Oberflächen auftreten.
Die Oberflächenspannung reduzierende Substanzen können gleichfalls einen Hämolyse-Effekt haben, beispielsweise Dekanol-N-Methyl-Glukonamid. Dies ist eine hinreichend bekannte Tatsache, weshalb eine Vielzahl von Substanzen oder Substanzkombinationen Verwendung finden können. Es gibt Hämolyse-Substanzen, die nicht sonderlich oberflächenaktiv sind, beispielsweise Mellitin und Phosphorlipase.
Es gibt auch verschiedene bekannte Arten von farbändernden Substanzen, die in der Lage sind, unter dem Einfluß von NADH und Diaphorase ihre Farbe zu wechseln. Tetrazol-Verbindungen sind insoweit vorteilhaft, als bei ihnen Formazan-Färbemittel unter normalen Reaktionsbedingungen irreversibel ausgebildet wird. 3- (4,5-Dimethyl-Thiazl-2-1)-2,5-Diphenyl-2H-Tetrazol-Bromid (MMT) bringt als Bestandteil des Reagenzmittels ein gutes Ergebnis; es können jedoch viele andere Tetrazol- Verbindungen Verwendung finden. Es sollte an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, daß die Gruppe, aus der die Hämolyse-Substanz oder -Substanzen ausgewählt wird bzw. werden, lediglich solche Substanzen enthält, die in Kombination mit Tetrazol-Verbindungen nicht zu störendem Ausfällen führen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand einiger Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung beschrieben.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der betreffenden Reaktionen.
Fig. 2 ist ein Diagramm zur Darstellung der Streuung und der Wechselwirkung mit einem Bezugsverfahren zur Bestimmung des "Abschlußpunktes".
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung eines Reaktionsverfahrens in der "Abschlußpunkt"-Bestimmung.
Fig. 4 zeigt die Spektra in Hämoglobin und MTT- Formazan und deutet die Meß- und die Bezugswellenlängen an.
Fig. 5 ist ein Diagramm zur Darstellung der Wechselwirkung mit der Bezugsmethode in kinetischen Messungen.
Messungen wurden an Vollblutproben durchgeführt, die mit Glukose präpariert wurden, um unterschiedliche Glukoseniveaus zu erzielen. Das Bezugsverfahren bestand in einem Glukose-Dehydrogenase-Prüfsystem der Firma Merck, dem Gluc-DH (R) Verfahren, Typ 12886, 13887. Für die Bezugsmessungen wurde eine Spektralphotometrie im UV-Bereich, bei 320 nm entsprechend der dem Prüfsystem beigefügten Packungsbeilage durchgeführt. Das Bezugsverfahren ist ein analytisches Verfahren der naß-chemischen Art.

Beispiel 1

Reagenzmittel 1 ml
100 E Glukose-Dehydrogenase (Merck)
20 E Diaphorase (Merck)
22 mmmol NAD (Merck)
30 mmmol MTT (Merck)
25 mg Weißes Saponin (BDH)
5 mg Decanol-N-Methylglukonamid
1 ml von einem Ionen-Austausch unterzogenen Wasser
Diese Stoffe ergeben eine Lösung, die in im Spritzgußverfahren entsprechend US 4.088,488 hergestellten Mikrogießwannen gefriergetrocknet werden kann, welche im Handel erhältlich (HemoCue AB) sind. Eine gute Reproduzierbarkeit und Linearität wurden erzielt (vgl. Fig. 2). Die Messungen wurden bei 660 nm mit 880 nm als Bezugswellenlänge durchgeführt und weisen eine "Abschlußpunkt"-Messung auf.

Beispiel 2

Reagenzmittel 1 ml
1 kE Glukose-Dehydrogenase (Merck)
200 E Diaphorase (Merck)
220 mmmol NAD (Merck)
0,3 mmol MTT (Merck)
250 mg Weißes Saponin (BDH)
50 mg Pluronic P 85 (SERVA)
250 mml von einem Ionen-Austausch unterzogenem Wasser
Die genannten Bestandteile können fein in eine Suspension aufgeteilt werden, die geeignet ist, Oberflächen mit Hilfe unterschiedlicher Drucktechniken zu bedecken, wie beispielsweise mit Hilfe des Siebdruckverfahrens oder des Zylinderdruckverfahrens usw. Diese Suspensionsart ist zur Beschichtung von geteilten Mikrogießwannen entsprechend US 4,088.448 geeignet.

Beispiel 3

Mikrogießwannen entsprechend US 4,088,448 aus Zellulose-Acetat/Butyrat und mit einer Tiefe von etwa 0,15 mm wurden mit einem Reagenzmittel entsprechend Beispiel 2 bedeckt, und zwar mittels einer Kleschierdruckmaschine (4fach-Druck). Nach dem Trocknen und der Montage wurden die Funktionen der verschiedenen Gießwannen mit unterschiedlichen Vollblutproben untersucht. Die Hämolyse wurde bei 660 nm gemessen und die Meßzeit variierte zwischen 20 und 40 s, in Abhängigkeit von der Menge der roten Blutkörperchen. Die Farbentwicklung wurde bei der gleichen Wellenlänge untersucht; für eine Vollblutprobe mit einer Glukosekonzentration von etwa 12 mmol/L wurde ein Abschlußpunkt, der aus Meßsicht zufriedenstellend war, nach 1,5 min erreicht (vgl. Fig. 3). Fig. 4 zeigt das Hämoglobinspektrum und das Farbspektrum, die von einer Vollblutprobe mit etwa 12 mmol/L Glukose in einer Gießwanne entsprechend Beispiel 3 abgeleitet wurden. Es zeigt sich eindeutig, daß es gute Möglichkeiten zum Messen der gebildeten Formazan-Farbe gibt, d. h. ohne die unerwünschte Einwirkung durch das Hämoglobin. Es zeigt sich ferner, daß es möglich ist, die Trübung für Hintergrundkompensation außerhalb dieser Spektra zu messen. Ein Variieren der Dicke der aufgetragenen Schicht beeinflußt selbverständlich die Reaktionszeiten und, in gewissem Umfang, auch auf die maximal bestimmbare Konzentration. Beispiel 4 Reagenzmittel 1 ml
25 E Glukose-Dehydrogenase mit einer Maximalmenge von damit verbundenen Polyethylen-Glykolaldehyd-Methyläther 750
5 E Diaphorase (Merck)
5 mmol NAD (Merck)
20 mmol MTT (Merck)
25 mg Weißes Saponin (Merck)
1 ml einem Ionenwechsel unterzogenen Wassers
Diese Stoffe erzeugen eine Lösung, die entsprechend dem Beispiel 1 gefriergetrocknet werden kann. Die Zusammensetzung des Reagenzmittels wurde hier so gewählt, daß es für die Verwendung in einem kinetisches Meßverfahren geeignet ist, während sich die vorangegangenen Beispiele auf Abschlußpunkt -Messungen bezogen.
Die relativ große Menge an Glukose-Dehydrogenase erklärt sich durch die Verringerung der Aktivität, die beim Zusammenschluß der Polymermoleküle eintritt. Das Verbinden der Polymermoleküle mit den Enzymen erhöht die Stabilität, was hinlänglich bekannt und darüberhinaus bei kinetischen Meßverfahren auch wünschenswert ist. Man hat noch nicht herausgefunden, welche Polymerart am günstigsten ist; dieses Beispiel dient daher lediglich der Darstellung der Möglichkeit, Polymere zu verwenden. Der Polyethylen-Glykol-Monomethyl-Äther wurde durch eine Reaktion mit Dimethylsulfin und essigsaurem Anhydrid in Aldehyd umgewandelt. Nach der Verbindung mit Glukose-Dehydrogenase in Natriumchlorid/Karbonatpuffer ph 10, mit einem Überschuß an Polymerisat, wurde das Gemisch einer Dialyse unterzogen und konzentriert. Der Enzym/Polymerisat-Komplex zeigte eine höhere Stabilität als das reine Enzym. Beispiele von Ergebnissen kinetischer Messungen unter Verwendung eines Reagenzmittels entsprechend diesem Beispiel ergeben sich aus Fig. 5. Die Messungen wurden bei 660 nm für 3 bis 3,5 min gegenüber einer Bezugswellenlänge von 880 nm durchgeführt.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Gesamtglukosemenge in unverdünntem Vollblut in einer Mikrogießwanne, dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe unverdünnten Vollbluts mit einem Reagenzmittel in trockener Form in Kontakt gebracht wird, enthaltend:

- Glukose-Dehydrogenase (GDH);

- eine oder mehrere Substanzen der Gruppe, die aus Diaphorase, Phenazin-Methosulfat, Phenazin-Äthosulfat, Phenazin-Phenosulfat und Meldola Blau besteht;

- eine oder mehrere Substanzen der Gruppe, die aus NAD, NADP, Thio-NAD, Thio-NADP, Nikotinsäureamid-Purin-Dinukleotid, Nikotinsäureamid-Methylpurin-Dinukleotid, Nikotinsäureamid-2-Chlor-Methylpurin-Dinukleotid besteht;

- eine oder mehrere Hämolyse-Substanzen aus der Gruppe, die aus Phosphorlipase, Hämolyse-Saponinen und Hämolyse-Verbindungen besteht, wobei der hydrophile Teil des Moleküls aus einem Mono-, Di- oder Trisaccharid und der hydrophobe Teil des Moleküls aus einem aliphatischem Kohlenwasserstoff mit 10 bis 16 Kohlenstoffatomen besteht;

- einen Red-Ox-Farbindikator, der von der Spektralabsorption des Hämoglobins nicht beeinflußt wird und aus einem Tetrazolsalz besteht;

und dadurch, daß eine durch die Reaktion des Reagenzmittels mit Glukose im unverdünnten Vollblut herbeigeführte Farbveränderung durch Übertragungs-Spektralphotometrie gemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenzmittel auch Mutarotase enthält.

3. Reagenzmittel zur Bestimmung der Gesamtglukosemenge in unverdünntem Vollblut in einer Mikrogießwanne, dadurch gekennzeichnet, daß es in trockener Form vorliegt und enthält:

- Glukose-Dehydrogenase (GDH);

- eine oder mehrere Substanzen aus der Gruppe, die aus Diaphorase, Phenazin-Methosulfat, Phenazin-Ethosulfat, Phenazin-Phenosulfat und Meldola Blau besteht;

- eine oder mehrere Substanzen aus der Gruppe, die NAD, NADP, Thio-NAD, Thio-NADP, Nikotinsäureamid-Purin-Dinukleotid, Nicotinsäureamid-Methylpurin-Dinukleotid, Nikotinsäureamid-2-Chlor-6-Methylpurin-Dinukleotid enthält;

- eine oder mehrere Hämolyse-Substanzen aus der Gruppe, die aus Phosphorlipase, Hämolyse-Saponinen und Hämolyse-Verbindungen besteht, wobei der hydrophile Teil des Moleküls aus einem Mono-, Di- bzw. Trisaccharid und der hydrophobe Teil aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 10 bis 16 Kohlenstoffatomen besteht;

- einen Red-Ox-Farbindikator, der nicht von der Spektralabsorption des Hämoglobins beeinflußt wird und aus einem Tetrazolsalz besteht.

4. Reagenzmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es auch Mutarotase enthält.

5. Reagenzmittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:

- Glukose-Dehydrogenase,

- Diaphorase,

- NAD,

- ein oder mehrere Saponine,

- ein Tetrazolsalz.

6. Reagenzmittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es auch Mutarotase enthält.

7. Verwendung eines Reagenzmittels, enthaltend:

- Glukose-Dehydrogenase (GDH);

- eine oder mehrere Substanzen aus der Gruppe, die aus Diaphorase, Phenazin-Methosulfat, Phenazin-Äthosulfat, Phenazin-Phenosulfat und Meldola Blau besteht;

- eine oder mehrere Substanzen aus der Gruppe, die aus NAD, NADP, Thio-NAD, Thio-NADP, Nikotinsäureamid-Purin-Dinukleotid, Nikotinsäureamid-Methylpurin-Dinukleotid, Nicotinsäureamid-2-Chlor-Methylpurin-Dinukleotid besteht;

- eine oder mehrere Hämolyse-Substanzen aus der Gruppe, die aus Phosphorlipase, Hämolyse-Saponin und Hämolyse-Verbindungen besteht, wobei der hydrophile Teil des Moleküls aus einem Mono-, Di- oder Trisaccharid und der hydrophobe Teil aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 10 bis 16 Kohlenstoffatomen besteht;

- einen Red-Ox-Farbindikator, der von der Spektralabsorption des Hämoglobins nicht beeinflußt wird und der aus einem Tetrazolsalz besteht;

wobei das Reagenzmittel in trockener Form vorliegt, und zwar zur Bestimmung der Gesamtglukosemenge in unverdünntem Vollblut durch Übertragungs-Spektrophotometrie.

8. Verwendung eines Reagenzmittels nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenzmittel zusätzlich Mutarotase enthält.