DE69534877T2

DE69534877T2 - Verfahren zur bestimmung von bilirubin

Info

Publication number: DE69534877T2
Application number: DE69534877T
Authority: DE
Inventors: Ryo Koriyama-shi Kojima; Katsuhiro Koriyama-Shi Katayama; Yoshikiyo Koriyama-shi SASAGAWA
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1994-12-02
Filing date: 1995-11-30
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2015-12-01
Also published as: US5872009A; WO1996017251A1; EP0795753A1; JP3216138B2; EP0795753A4; EP0795753B1; DE69534877D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen von Bilirubin, das in Flüssigkeit des lebenden Körpers, wie Plasma, Serum, Urin etc., enthalten ist.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen von Bilirubin, welches erlaubt, dass salpetrige Säure als Oxidationsmittel auf eine Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper einwirken gelassen wird, wodurch optische Veränderungen der Probe gemessen werden, und ebenfalls ein Verfahren zum Messen von direktem Bilirubin mit hoher Empfindlichkeit, welches umfasst, dass ein Oxidationsmittel auf eine Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper in Gegenwart eines spezifischen, nicht ionischen Tensids einwirken gelassen wird, wobei die optischen Änderungen der Probe gemessen werden.
Stand der Technik
Bilirubin ist ein Stoffwechselprodukt aus Hämoglobin, das aus alternden Erythrozyten stammt, und ist Hauptbestandteil des Gallenpigments. Blut-Bilirubin schließt direktes Bilirubin (konjugierte Form) und indirektes Bilirubin (freie Form) ein. Direktes Bilirubin, dessen Propionsäuregruppe an der Seitenkette hauptsächlich mit Glucoronsäure in der Leber enzymatisch eine Esterbindung bildet, ist stark wasserlöslich und reagiert direkt mit einem Diazoreagenz, um ein Azofarbmaterial zu bilden. Indirektes Bilirubin, dessen Propionsäuregruppe in einem freien Zustand ist, ist schwach wasserlöslich und reagiert mit einem Diazoreagenz nur in Gegenwart eines Reaktionsbeschleunigers, wie einem Alkohol etc., um ein Azo-Farbmaterial zu bilden.
Messwerte, die durch Messen von Bilirubin im Blut gewonnen werden, schließen Gesamtbilirubinwerte und den direkten Bilirubinwert ein. Der Gesamtbilirubinwert ist der Messwert der konjugierten Form und der freien Form insgesamt, welcher durch eine Reaktion mit einem Diazoreagenz in Gegenwart eines Reaktionsbeschleunigers gewonnen wird. Der direkte Bilirubinwert ist ein Messwert von ausschließlich der konjugierten Form, welcher durch eine Reaktion mit einem Diazoreagenz in Abwesenheit eines Reaktionsbeschleunigers gewonnen wird. Individuelle Bilirubinkonzentrationen in konjugierter und freier Form können getrennt von diesen Messwerten bestimmt werden, um eine Diagnose verschiedener Lebererkrankungen und Diacrisis der Gelbsucht zu erstellen. Daher ist die Messung von Bilirubin ein wichtiger Abschnitt klinischer Labortests.
Ein Diazoverfahren zum Messen der Farbintensität von Azobilirubin, welches durch die oben erwähnte Reaktion von Bilirubin mit einem Diazoreagenz gebildet wird, ist die konventionell führende Methode zum Messen von Bilirubin und ist für die Diagnose zahlreicher Lebererkrankungen umfassend verwendet worden.
Ein anderes Verfahren ist, Bilirubin auf der Grundlage von Änderungen der Absorption von Bilirubin zu messen, indem einem Oxidationsmittel ermöglicht wird, auf Bilirubin in einer Probe einer Flüssigkeit des lebenden Körpers einzuwirken, um Bilirubin zu oxidieren. Das Verfahren zum Messen von Bilirubin, bei dem ein solches Oxidationsmittel verwendet wird, schließt beispielsweise das BOD-Verfahren unter Verwendung von Bilirubinoxidase (BOD) als Oxidationsmittel ein, ein chemisches Oxidationsverfahren unter Verwendung von Ferricyanidionen, Kupferionen, Vanadateionen etc. als Oxidationsmittel anstelle von BOD etc.
Andere Verfahren schließen beispielsweise ein Hochleistungsflüssigchromatographieverfahren mittels Hochleistungsflüssigchromatographie ein, ein Schichtverfahren unter Verwendung einer Beize beschichteten Schicht etc.
Jedes dieser Verfahren hat sowohl Vor- als auch Nachteile und ist deswegen noch nicht zufriedenstellend.
Das bedeutet, dass das Diazoverfahren die Probleme hat, dass das Reaktionsmittel instabil ist, so dass es nur über 5 Tage nach der Herstellung wirksam ist und dass auch Ascorbinsäure oder Hämoglobin, die in der Probe vorhanden sind, mit den Messwerten interferieren. Das BOD-Verfahren hat die Probleme, dass die Verwendung des Enzyms unweigerlich die Messkosten erhöht, und das Enzym im wesentlichen nur über 2 Wochen nach der Herstellung wirksam ist, da das Enzym schwer zu stabilisieren ist. Das chemische Oxidationsverfahren hat den Nachteil, dass die Verwendung von hochtoxischen Metallionen etc. unweigerlich ein Abwasserbehandlungsproblem und das Problem der Verunreinigung der Umwelt einschließt. Das Hochleistungsflüssigchromatographieverfahren oder das Filmverfahren benötigen einen speziellen Messapparat trotz der zufriedenstellenden Messergebnisse, und haben den Nachteil einer schlechten Vielseitigkeit in simultanen Multiphasenmessungen einer großen Anzahl an Proben wie andere Phasen der klinischen Labortestchemie.
Unter den gegebenen Bedingungen ist es wünschenswert, ein Verfahren zum Messen von Bilirubin zu entwickeln, bei dem ein stabiles und sicheres Reaktionsmittel verwendet wird, welches in vielseitigen automatischen Analysegeräten anwendbar ist und das eine gute Korrelation mit konventionellen Verfahren hat, insbesondere mit dem enzymatischen Verfahren mit seinen einzigartigen Eigenschaften.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf die gegenwärtige Situation etabliert worden und das Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein sicheres Verfahren zum Messen von Bilirubin zu niedrigen Kosten mit einer guten Korrelation mit einem konventionellen enzymatischen Verfahren, einer herausragenden Stabilität des Reaktionsmittels, weniger Interferenzen durch gleichzeitig vorhandene Substanzen in einer Probe mit den Messwerten und weniger Gefahren einer Umweltverschmutzung bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Messen von Bilirubin mit hoher Empfindlichkeit.
Als Ergebnis der intensiven Studien, um diese Ziele zu erreichen, hat der vorstellige Erfinder die überraschende Tatsache gefunden, dass direktes Bilirubin und Gesamtbilirubin quantitativ durch Verwendung von salpetriger Säure als Oxidationsmittel und dem Auswählen der Reaktionsbedingungen, wie der Zugabe eines Reaktionsbeschleunigers zur Beschleunigung der Oxidierung von Bilirubin durch salpetrige Säure, insbesondere die Oxidation indirekten Bilirubins oder die Zugabe eines Reaktionsinhibitors zum Inhibieren einer solchen Oxidation etc. quantitativ bestimmt werden kann.
Als Ergebnis weiterer Studien auf Grundlage der oben angegebenen Befunde hat der vorstellige Erfinder außerdem herausgefunden, dass insbesondere direktes Bilirubin selektiv mit hoher Empfindlichkeit bestimmt werden kann, indem salpetriger Säure als Oxidationsmittel ermöglicht wird, auf eine Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper in Gegenwart eines nicht ionischen Tensids, ausgewählt aus Polyoxyethylen(n-alkyl oder iso-alkyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber nicht mehr als 15 und Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber nicht mehr als 19, bestimmt werden kann, und das Verfahren selbst auf Verfahren, bei denen andere Oxidationsmittel als salpetrige Säure verwendet werden, umfassend angewendet werden kann, und hat so die vorliegende Erfindung erfüllt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Messen von Gesamtbilirubin oder direktem Bilirubin bereit, welches umfasst, dass salpetriger Säure als Oxidationsmittel ermöglicht wird, auf eine Probe einer Flüssigkeit des lebenden Körpers einzuwirken, und indem optische Änderungen der Probe gemessen werden.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen direkten Bilirubins bereit, welches umfasst, dass salpetriger Säure als einem Oxidationsmittel ermöglicht wird, auf eine Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper in Gegenwart eines Reaktionsinhibitors zur Inhibierung der Oxidation indirekten Bilirubins einzuwirken, und indem optische Änderungen der Probe gemessen werden.
Weiter stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen von Gesamtbilirubin bereit, welches umfasst, dass salpetriger Säure als Oxidationsmittel ermöglicht wird, auf eine Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper in Gegenwart eines Reaktionsbeschleunigers einzuwirken, um die Oxidation des direkten Bilirubins zu beschleunigen, und indem die optischen Änderungen der Probe gemessen werden.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zum Messen von Bilirubin in einer Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper bereit, welcher (i) eine saure Lösung und (ii) ein Nitritlösung umfasst.
Noch weiter stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zum Messen direkten Bilirubins in einer Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper bereit, welcher (i) eine saure Lösung, die einen Reaktionsinhibitor enthält, und (ii) eine Nitritlösung umfasst.
Noch weiter stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zum Messen von Gesamtbilirubin in einer Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper bereit, welcher (i) ein saure Lösung enthaltend einen Reaktionsbeschleuniger und (ii) eine Nitritlösung umfasst.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen direkten Bilirubins bereit, welches umfasst, dass salpetriger Säure als Oxidationsmittel ermöglicht wird, auf eine Probe der Flüssigkeit aus einem lebenden Körper in Gegenwart von mindestens einem nicht ionischen Tensid ausgewählt aus Polyethylen(n-alkyl oder iso-alkyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber weniger als 15 und Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber nicht mehr als 19 einzuwirken, und indem optische Änderungen der Probe gemessen werden.
Noch weiter stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zum Messen direkten Bilirubins in einer Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper bereit, welches (i) eine saure Lösung, enthaltend mindestens ein nicht ionisches Tensid ausgewählt aus Polyoxyethylen(n-alkyl oder iso-alkyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber weniger als 15 und Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber nicht mehr als 19, und (ii) eine Nitritlösung zum Oxidieren von Bilirubin umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die spezifischen Bedingungen zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Messen von Bilirubin in einem automatisierten Analysegerät.
2 zeigt die Ergebnisse der Messungen direkten Bilirubins oder indirekten Bilirubins durch das vorliegende Oxidationsverfahren mit salpetriger Säure in Gegenwart von Schwefelharnstoff als Reaktionsinhibitor, wobei Änderungen der Absorption über die Reaktionsdauer beobachtet werden, und wo die Messpunkte (0,3 min/Punkt) auf der Abszisse angegeben werden und die Absorption bei 459 nm auf der Ordinate angegeben wird.
3 zeigt die Korrelation des erfindungsgemäßen Oxidationsverfahrens mit salpetriger Säure in Gegenwart von Schwefelharnstoff mit dem BOD-Verfahren bei der Messung direkten Bilirubins, wobei die direkte Bilirubinkonzentration (mg/dl), die durch das BOD-Verfahren gemessen wird, auf der Abszisse angegeben wird, und die direkte Bilirubinkonzentration (mg/dl), die durch das erfindungsgemäße Oxidationsverfahren mit salpetriger Säure in Gegenwart von Schwefelharnstoff gemessen wird, auf der Ordinate angegeben wird.
4 zeigt die Ergebnisse der Messung direkten Bilirubins oder indirekten Bilirubins durch das erfindungsgemäße Oxidationsverfahren mit salpetriger Säure in Gegenwart von Cetyltrimethylammoniumbromid als Reaktionsbeschleuniger, wobei die Änderungen der Absorption über die Zeit beobachtet werden, und wobei die Messpunkte (0,3 min/Punkt) auf der Abszisse angegeben werden und die Absorption bei 450 nm auf der Ordinate angegeben ist.
5 zeigt die Korrelation des erfindungsgemäßen Oxidationsverfahrens mit salpetriger Säure in Gegenwart von Cetyltrimethylammoniumbromid gegenüber dem BOD-Verfahren bei der Messung des Gesamtbilirubins, wobei die Gesamtbilirubinkonzentration (mg/dl), die durch das BOD-Verfahren gemessen wird, auf der Abszisse angegeben ist, und die Gesamtbilirubinkonzentration (mg/dl), die durch das erfindungsgemäße Oxidationsverfahren mit salpetriger Säure gemessen wird, in Gegenwart von Cetyltrimethylammoniumbromid auf der Ordinate angegeben wird.
6 zeigt eine Arbeitskurve, die durch Messung des direkten Bilirubins durch das erfindungsgemäße Verfahren zum Messen direkten Bilirubins unter Verwendung von Vanadiumsäure als Oxidationsmittel in Gegenwart eines spezifischen nicht ionischen Tensids gewonnen wurde.
7 zeigt eine Arbeitskurve, die durch Messung direkten Bilirubins durch das erfindungsgemäße Verfahren zum Messen direkten Bilirubins unter Verwendung von Bilirubinoxidase als Oxidationsmittel in Gegenwart eines spezifischen nicht ionischen Tensids gewonnen wurde.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung wird Gesamtbilirubin oder direktes Bilirubin dadurch bestimmt, dass salpetriger Säure als Oxidationsmittel erlaubt wird, auf eine Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper einzuwirken, und indem die optischen Änderungen der Probe gemessen werden. Eine solche Bestimmung kann durchgeführt werden, indem ein Kit zum Messen von Bilirubin einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper verwendet wird. Ein Kit umfasst eine saure Lösung und eine salpetrige Lösung und wird für die Bestimmung verwendet.
Erfindungsgemäß ist die Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper eine Probe, die aus Flüssigkeiten eines lebenden Körpers erhältlich ist, und schließt beispielsweise Proben von Plasma, Serum, Urin, etc. ein.
Erfindungsgemäß kann die Einwirkung von salpetriger Säure als Oxidationsmittel auf eine Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper für gewöhnlich durch Zugabe einer sauren Lösung aus Zitronensäure etc. zu der Probe der Flüssigkeit aus dem lebenden Körper und, indem weiter eine salpetrige Lösung hinzugegeben wird, durchgeführt werden. Die saure Lösung und die salpetrige Lösung sind für gewöhnlich wässrige Lösungen.
Die zu einer Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper hinzugegebene Säurelösung enthält eine Säure, wie Zitronensäure, Milchsäure, Essigsäure, Phthalatsäure etc. und kann bevorzugt einen pH-Wert von 2 bis 6 haben, wenn sie mit der salpetrigen Lösung zusammengegeben wird.
Nitrit, welches für die Herstellung einer salpetrigen Lösung verwendet wird, ist nicht spezifisch beschränkt, solange es verwendet werden kann, um das Ziel der vorliegenden Erfindung zu erreichen, und ist bevorzugterweise ein Alkalimetallsalz. Natriumsalz und Kaliumsalz sind auf Grund ihrer leichten Verfügbarkeit besonders bevorzugt.
Die Konzentration an Nitrit zum Messen von Bilirubin hängt von einer Menge der Probe ab, ist aber nicht spezifisch begrenzt, solange es eine Konzentration ist, die in der Lage ist, Bilirubin in der Probe zu oxidieren. Die Nitritkonzentration in der endgültigen Reaktionslösung sollte in einem Bereich von für gewöhnlich 0,01 bis 20 mMol/l, bevorzugt 0,05 bis 4 mMol/l liegen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Messen direkten Bilirubins ist es bevorzugt, einen Reaktionsinhibitor zu verwenden, der in der Lage ist, zu dem Reaktionsmittel hinzugefügt zu werden, um zu verhindern, dass indirektes Bilirubin durch salpetrige Säure oxidiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Messen direkten Bilirubins kann durch Verwendung eines Kits zum Messen direkten Bilirubins in einer Probe aus der Flüssigkeit eines lebenden Körpers durchgeführt werden, welcher eine saure Lösung umfasst, die einen Reaktionsinhibitor, der in der Lage ist, die Oxidation des indirekten Bilirubins zu hemmen, sowie eine salpetrige Lösung enthält.
Ein solcher Reaktionsinhibitor für das indirekte Bilirubin zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließt Schwefelharnstoff, Schwefelharnstoff mit einem Niederalkyl an der N-Position, ein quarternäres niederes Alkylammoniumsalz, ein niederes N-Alkylpyridinsalz, ein Bipyridinsalz mit einem Niederalkyl an den N-Positionen ein. Ein Alkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen wird hier als Niederalkyl bezeichnet. Erfindungsgemäß ist ein bevorzugtes Niederalkyl, auf Grund ihrer leichten Verfügbarkeit, ein geradkettiges Niederalkyl.
Bevorzugte Schwefelharnstoffe haben ein Niederalkyl an der N-Position und schließen 1,1,3,3,-Tetramethylthioharnstoff, 1,1,3-Trimethylthioharnstoff, 1,3-Dimethylthioharnstoff und N-Methylthioharnstoff auf Grund ihrer leichten Verfügbarkeit ein.
Quarternäre Niederalkylammoniumsalze schließen beispielsweise N-(Niederalkyl)-N,N,N-Trimethylammoniumsalz, N-(Niederalkyl)-N,N,N-Triethylammoniumsalz, und N-(Niederalkyl)-N,N,N-Tripropylammoniumsalz ein. Chloride, Bromide sind als diese Salze bevorzugt, da sie leicht verfügbar sind.
Weitere Reaktionsinhibitoren schließen beispielsweise Hydrazine wie beispielsweise Hydrazin, Phenylhydrazin, Salze davon ein; Hydroxylamine wie beispielsweise Hydroxylamin, Phenylhydroxylamin, Salze davon; Oxime wie beispielsweise Acetoxim, Diacetyloxim, Salicylaldoxim; aliphatische Polyamide wie beispielsweise Tetraethylenpentamin, Triethylentetraamin; Phenole wie beispielsweise Phenol, p-Chlorphenol, β-Naphthol und so weiter ein.
Diese Reaktionsinhibitoren sind selbst wirksam, wenn sie allein vorliegen, aber die inhibitorische Wirkung kann in einigen Fällen durch eine Kombination von mindestens zweien davon verbessert werden, und daher können sie nach passender Auswahl im Hinblick auf diese Situationen verwendet werden.
Die Reaktion salpetriger Säure mit direktem Bilirubin in Gegenwart eines Reaktionsinhibitors kann für gewöhnlich durch Hinzugeben einer sauren Lösung, die einen Reaktionsinhibitor enthält, zu einer Flüssigkeitsprobe aus dem lebenden Körper durchgeführt werden und indem dann die salpetrige Lösung hinzugegeben wird. Die saure Lösung, die für diesen Zweck verwendet werden soll, kann durch Hinzugeben eines Reaktionsinhibitors zu der oben erwähnten sauren Lösung hergestellt werden und die gleiche salpetrige Lösung, die oben erwähnt wurde, kann für diesen Zweck verwendet werden.
In der Reaktion des salpetrigen Säure mit dem direkten Bilirubin in Gegenwart eines Reaktionsinhibitors sollte die Reaktionslösung in einem pH-Wert von vorzugsweise 2 bis 6 liegen, mehr bevorzugt von 3,5 bis 4,5. Bei einem zu hohen pH-Wert wird die Oxidationsreaktion schwer ablaufen, während bei einem zu niedrigen pH-Wert der Reaktionsinhibitor die reaktionsinhibierende Wirkung auf das indirekte Bilirubin gesenkt werden wird und demgemäß die Reaktionsselektivität verloren geht.
Die Konzentration eines Reaktionsinhibitors, der für diesen Zweck verwendet werden soll, ist nicht besonders beschränkt, solange es eine Konzentration ist, die in der Lage ist, die Oxidation von indirektem Bilirubin in einer Probe zu hemmen, und sie liegt für gewöhnlich in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gew.-Volumenprozent Konzentration in der endgültigen Reaktionslösung, obwohl es von der Art des Reaktionsinhibitors abhängt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zum Messen des Gesamtbilirubins ist es bevorzugt, einen Reaktionsbeschleuniger zu haben, der in der Lage ist, die Oxidationsreaktion indirekten Bilirubins durch ein gewöhnliches Oxidationsmittel zu beschleunigen, d.h. dass das sog. direkte Oxidationsmittel in dem Reaktionsmittel enthalten ist, da die Messdauer verkürzt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Messen des Gesamtbilirubins kann unter Verwendung eines Kits durchgeführt werden, der eine saure Lösung umfasst, der einen Reaktionsbeschleuniger, der in der Lage ist, die Oxidation indirekten Bilirubins zu beschleunigen, sowie eine salpetrige Lösung enthält.
Der Reaktionsbeschleuniger zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist einer, der für gewöhnlich für diesen Zweck in dem Gebiet verwendet wird, und schließt beispielsweise anionische Tenside wie Natriumlaurylsulfat, Natriumlaurylbenzolsulfonat, Natriumcholat; kationische Tenside wie beispielsweise Cetyltrimethylammoniumbromid, Cetlypyridinchlorid; amphoterische Tenside wie Alkylbetain usw. ein. Von allen sind die kationischen Tenside und die amphoterischen Tenside auf Grund der geringeren Interaktion mit Proteinen unter sauren Bedingungen bevorzugt.
Die Reaktion mit direktem Bilirubin und indirektem Bilirubin in Gegenwart eines Reaktionsbeschleunigers kann durch die Hinzugabe einer sauren Lösung, die einen Reaktionsbeschleuniger enthält, zu einer Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper durchgeführt werden und indem dann eine salpetrige Lösung in gleicher Weise wie oben erwähnt hinzugegeben wird. Die Reaktionslösung sollte in einem pH-Bereich von vorzugsweise 1,5 bis 6 liegen, mehr bevorzugt von 2,5 bis 4. Bei einem zu hohen pH-Wert wird die Oxidationsreaktion verzögert und möglicherweise wird ein negativer Fehler beim Messwert auftreten, während bei einem zu niedrigen pH-Wert möglicherweise eine nicht spezifische Reaktion stattfindet und möglicherweise ein positiver Fehler bei den Messwerten auftreten kann.
Die Konzentration eines Reaktionsbeschleunigers, der für diesen Zweck verwendet werden soll, ist nicht besonders beschränkt, solange es eine Konzentration ist, die in der Lage ist, die Oxidation von Bilirubin in einer Probe zu beschleunigen, und für gewöhnlich liegt sie in einem Bereich von 0,01 bis 10 Gew./Volumenprozent, bevorzugt 0,1 bis 5 Gew./Volumenprozent Konzentration in der endgültigen Reaktionslösung.
Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen direkten Bilirubins bereit, das in der Lage ist, andere Oxidationsmittel als salpetrige Säure als Oxidationsmittel zu verwenden, d.h. ein Verfahren zum Messen direkten Bilirubins, das umfasst, dass einem Oxidationsmittel ermöglicht wird, auf eine Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper in Gegenwart von mindestens einem nicht ionischen Tensid, ausgewählt aus Polyoxyethylen(n-alkyl oder iso-Alkyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber weniger als 15 und Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber nicht mehr als 19 einzuwirken, und indem die optischen Änderungen der Probe gemessen werden.
Im Fall der Verwendung eines Oxidationsmittels, das auf eine Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper in Gegenwart eines spezifischen nicht ionischen Tensids wie oben erwähnt einwirken gelassen wird, ist das Oxidationsmittel anfällig dafür, dass es mit direktem Bilirubin reagiert, während es weniger anfällig dafür wird, mit dem indirekten Bilirubin zu reagieren, und dementsprechend wird die Selektivität der Reaktion des Oxidationsmittels mit direktem Bilirubin verbessert werden. Desweiteren kann direktes Bilirubin exakt gemessen werden, selbst in einer Probe einer Flüssigkeit aus einem lebenden Körper, die direktes Bilirubin in einer hohen Konzentration enthält.
Das Verfahren zum Messen des direkten Bilirubins kann unter Verwendung eines Kits durchgeführt werden, der eine saure Lösung umfasst, die ein spezifisches nicht ionisches Tensid, wie oben erwähnt wurde, und eine Oxidationsmittellösung enthält.
Polyoxyethylen(n-alkyl oder iso-alkyl)ether mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber weniger als 15 als ein Mitglied der spezifischen nicht ionischen Tensids schließen beispielsweise Adekatol SO-145 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(iso-alkyl)ether, hergestellt von Asahi Denka K.K.), Adekatol SO-135 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(isoalkyl)ether, hergestellt von Asahi Denka K.K.), Adekatol SO-120 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(iso-alkyl)ether, hergestellt von Asahi Denka K.K.), Emalgen 707 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(n-alkyl)ether, hergestellt von Kao K.K.), Emalgen 709 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(n-alkyl)ether, hergestellt von Kao K.K.), etc. ein. Ein nicht ionisches Tensid mit einem HLB-Wert von weniger als 12 ist nicht bevorzugt, da dessen Lösung einen niedrigen Trübungspunkt hat und dafür anfällig ist, bei der Messtemperatur weiß-trüb zu werden, d.h. bei einer Temperatur, die von der Raumtemperatur bis 37°C reicht. Ein nicht ionisches Tensid mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 15 ist nicht bevorzugt, da die Absorption des direkten Bilirubins in der Lösung dazu neigt, gesenkt zu werden, und deswegen wird keine zufriedenstellende Farbintensität bei der Messung erreicht werden, und ein negativer Fehler wird möglicherweise bei dem Messwert des direkten Bilirubins auftreten. Der HLB-Wert liegt bevorzugt in einem Bereich von 12 bis 14,5, noch mehr bevorzugt 12 bis 14. Ein solches bevorzugtes nicht ionisches Tensid schließt beispielsweise Adekatol SO-135, Emalgen 707, Adekatol SO-145 etc. ein.
Ein weiteres Mitglied der nicht ionischen Tenside zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ether mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber nicht mehr als 19, und schließt beispielsweise Adekatol NP-675 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(n-nonylphenyl)ether, hergestellt von Asahi Denka K.K.), Adekatol NP-683 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(n-nonylphenyl)ether, hergestellt von Asahi Denka K.K.), Adekatol NP-690 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(n-nonylphenyl)ether, hergestellt von Asahi Denka K.K.), Adekatol NP-695 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(n-nonylphenyl)ether, hergestellt von Asahi Denka K.K.), Adekatol NP-700 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(n-nonylphenyl)ether, hergestellt von Asahi Denka K.K.), Adekatol NP-720 (Handelsmarke von Polyoxyethylen(n-nonylphenyl)ether, hergestellt von Asahi Denka K.K.) ein. Im Fall dieser nicht ionischen Tenside ist ein HLB-Wert von weniger als 12 aus dem gleichen Grund, wie oben erwähnt, ebenfalls nicht bevorzugt und ein HLB-Wert von mehr als 19 ist aus dem gleichen Grund, wie für den oben erwähnten HLB-Wert von nicht weniger als 15, auch nicht bevorzugt. Ein besonders bevorzugter HLB-Wert liegt im Bereich von 12 bis 14,8, noch mehr bevorzugt 12 bis 14,5, typischerweise derjenige von Adekatol NP-695.
Bei der Messung direkten Bilirubins in Gegenwart eines spezifischen nicht ionischen Tensids wird das Oxidationsmittel, wie oben erwähnt wurde, weniger anfällig dafür sein, mit indirektem Bilirubin zu reagieren. Für eine selektivere Messung des direkten Bilirubins ist es bevorzugt, den gleichen Reaktionsinhibitor, wie oben erwähnt, zu verwenden. Die Verwendung von Polyvinylpyrrolidon zusammen mit einem Reaktionsinhibitor wird die Reaktivität des Oxidationsmittels mit dem direkten Bilirubin verbessern, und deswegen ist es besonders bevorzugt, Polyvinylpyrrolidon bei der Messung von direktem Bilirubin zu verwenden.
Bei der Messung direkten Bilirubins durch das Ermöglichen, dass ein Oxidationsmittel auf eine Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper in Gegenwart eines spezifischen Tensids, wie oben erwähnt wurde, einwirkt, wird salpetrige Säure als Oxidationsmittel verwendet.
Die Messung von direktem Bilirubin in einer Probe aus einer Flüssigkeit eines lebenden Körpers in Gegenwart eines spezifischen nicht ionischen Tensids, das oben erwähnt wurde, kann durch die Zugabe einer sauren Lösung, die ein nicht ionisches Tensid enthält und falls nötig einen Reaktionsinhibitor und Polyvinylpyrrolidon, zu einer Probe der Flüssigkeit aus dem lebenden Körper, und indem dann hierzu eine Lösung des Oxidationsmittel gegeben wird, durchgeführt werden.
Die Konzentration des nicht ionischen Tensids, die für diesen Zweck verwendet werden soll, muss in einem Bereich von für gewöhnlich 0,01 bis 5% liegen, bevorzugt 0,1 bis 1% als Konzentration der endgültigen Reaktionslösung. Die Konzentration des Reaktionsinhibitors, wenn er verwendet wird, muss der gleiche sein, wie in dem oben erwähnten Verfahren zur Messung des direkten Bilirubins. Die Konzentration von Polyvinylpyrrolidon, wenn es zusammen mit dem Reaktionsinhibitor verwendet wird, muss in. einem Bereich von für gewöhnlich 0,01 bis 5% liegen, bevorzugt 0,1 bis 1% der Konzentration der endgültigen Reaktionslösung.
Konzentration eines Oxidationsmittels, das für diesen Zweck verwendet werden soll: Salpetrige Säure wird bei der gleichen Konzentration wie oben erwähnt verwendet.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Messung direkten Bilirubins oder Gesamtbilirubins, das oben erwähnt wurde, können andere Reaktionsmittel wie beispielsweise Pufferarten, Antiseptika, ein Cheliermittel, ein Tensid etc. nach angemessener Auswahl gemäß wohlbekannten Verfahren verwendet werden. Diese Reaktionsmittel können für gewöhnlich durch Zugabe hiervon zu der oben erwähnten sauren Lösung verwendet werden.
Beispielsweise ist das Vorhandensein eines Cheliermittels bevorzugt, da es den Blind-Wert des Reaktionsmittels absenkt, um die Präzision der Analyse zu verbessern, es stabilisiert die Reaktionsmittellösung und beschleunigt die Oxidation von Bilirubin. Vorzuziehende spezifische Beispiele des Cheliermittels, das für diesen Zweck zu verwenden ist, sind Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Nitrilotriessigsäure (NTA), Cyclohexandiamintetraessigsäure (CyDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Hydroxyethylethylendiamintetraessigsäure (EDTA-OH), Triethylentetraiminhexaessigsäure (TTHA), Hydroxyethyliminodiessigsäure (HIDA), 1-Hydroxyethan-1,1-diphosphonsäure und Alkalimetallsalze (z.B. Lithiumsalze, Natriumsalze und Kaliumsalze) davon, Ammoniumsalze davon, etc.. Die Konzentration dieser Cheliermittel zur Verwendung bei den Messungen von Bilirubin ist nicht besonders beschränkt, solange es eine Konzentration ist, die nicht in der Lage ist, die Messung von Bilirubin zu inhibieren. Sie muss in einem Bereich von für gewöhnlich 0,02 bis 50 mMol liegen, bevorzugt 0,1 bis 30 mMol, mehr bevorzugt in einer 1 bis 20 mMol Konzentration der endgültigen Reaktionslösung.
Das vorliegende Verfahren kann beispielsweise in folgender Weise durchgeführt werden; zur Messung der Gesamtbilirubinkonzentration wird eine saure Lösung, die einen Reaktionsbeschleuniger als erstes Reaktionsmittel enthält, mit einer Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper gemischt, die Bilirubin enthält, beispielsweise mit Plasma, Serum, Urin etc. und die Absorption in einem Wellenlängenbereich (430–460 nm), der auf dem Bilirubin in der Lösung beruht, wird gemessen, um den Messwert „Absorption A" zu erhalten. Dann wird eine zweite Reaktionsmittellösung, die Nitrit enthält, zu der Lösung hinzugegeben, um die Oxidationsreaktion von Bilirubin bei 25°C bis 40°C für 3 bis 10 Minuten durchzuführen, und dann wird wiederum die Absorption in einem Wellenlängenbereich (430–460 nm) beruhend auf dem Bilirubin in der Lösung gemessen, um den Messwert „Absorption B" zu erhalten. Die Absorption A und die Absorption B, die auf diese Weise gewonnen wurden, werden hinsichtlich des Lösungsvolumens etc. korrigiert und die Änderung der Absorption vor und nach der Oxidationsreaktion wird bestimmt. Die Gesamtbilirubinkonzentration in der Probe der Flüssigkeit aus dem lebenden Körper kann durch die Änderung der Absorption, die auf diese Weise bestimmt wurde, und eine Arbeitskurve, die zuvor auf Grundlage von Änderungen der Absorption hergestellt wurde, die durch das gleiche Verfahren, wie oben erwähnt wurde, gewonnen wurde, indem Standardlösungen mit bekannten Bilirubinkonzentrationen verwendet werden, gewonnen werden.
Zur Messung der direkten Bilirubinkonzentration wird eine saure Lösung, die einen Reaktionsinhibitor anstelle des Reaktionsbeschleunigers enthält, oder eine saure Lösung, die ein spezifisches nicht ionisches Tensid enthält, wie oben erwähnt wurde, und falls notwendig einen Reaktionsinhibitor und Polyvinylpyrrolidon als erstes Reaktionsmittel verwendet, und die gleiche Lösung, die für die oben erwähnte Messung der Gesamtbilirubinkonzentration verwendet wurde, wird als zweites Reaktionsmittel verwendet, gefolgt von den gleichen Arbeitsschritten, wie für die Messungen der Gesamtbilirubinkonzentration.
Das vorliegende Verfahren ist ebenfalls in vielseitigen automatischen Analysegeräten anwendbar, die kommerziell für biochemische klinische Tests erhältlich sind. Spezifische Beispiele von Modellen automatischer Analysegeräte zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen ein: Hitachi Modell 7050, Hitachi Modell 705, Hitachi Modell 736, Hitachi Modell 7150, Hitachi Modell 7170, Hitachi Modell 7020 etc., obwohl die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist. D.h., das jedes ähnliche Modell in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Dementsprechend kann der Gesamtbilirubinwert oder der direkte Bilirubinwert in einer großen Anzahl an Proben einer Flüssigkeit des lebenden Körpers innerhalb einer kurzen Zeit gemessen werden.
Die vorliegende Erfindung wird im Detail unten beschrieben, wobei auf Beispiele Bezug genommen wird, welche niemals dazu dienen sollen, die vorliegende Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1:
Messung direkten Bilirubins durch das Oxidationsverfahren mit salpetriger Säure basierend auf der Gegenwart von Thioharnstoff
i) Ziel:
Im Falle der Messung von Bilirubin durch das Oxidationsverfahren mit salpetriger Säure wurde das folgende Experiment durchgeführt, um zu bestätigen, dass direktes Bilirubin selektiv durch Zugeben von Thioharnstoff als Reaktionsinhibitor oxidiert werden kann, ohne indirektes Bilirubin zu oxidieren.
ii) Verwendete Reaktionsmittel:
Erstes Reaktionsmittel
Eine wässrige Lösung enthaltend die folgenden Bestandteile, durch NaOH eingestellt auf einen pH-Wert von 4,0, wurde als erstes Reaktionsmittel (saure Lösung) verwendet:

Zitronensäuremonohydrat 200 mM

Cyclohexandiamintetraessigsäure (CyDTA) 1 mM

Thioharnstoff 120 mM

Tensid 0,3%
Zweites Reaktionsmittel:
Eine wässrige Lösung enthaltend die folgenden Bestandteile wurde als zweites Reaktionsmittel (salpetrige Lösung) verwendet:

Natriumnitrit 5 mM

Natriumchlorid 150 mM
Direkter Bilirubinstandard
Eine wässrige Lösung, die Ditaurobilirubin, entsprechend 40 mg/dl direkten Bilirubins, enthält, wurde als direkter Bilirubinstandard verwendet.
Indirekter Bilirubinstandard
Eine 20 mM Tris-Puffer-Lösung enthaltend freies Bilirubin entsprechend 40 mg/dl indirekten Bilirubins wurde als indirekter Bilirubin-Standard verwendet.
iii) Verfahren:
Die Messung wurde unter den in 1 angegebenen Bedingungen unter Verwendung des automatischen Analysegeräts Hitachi Modell 7170 (hergestellt von Hitachi Ltd.) durchgeführt. Gemäß den Bedingungen wurden 6 μl Bilirubinstandard und 180 μl des ersten Reaktionsmittels zusammengemischt und die erhaltene flüssige Mischung wurde bei 37°C für 5 Minuten stehen gelassen. Dann wurden 45 μl des zweiten Reaktionsmittels zu der Flüssigkeitsmischung hinzugegeben, um die Reaktion zu starten. All diese Arbeitsschritte wurden automatisch durch eingestellte Parameter durchgeführt. Alle 0,3 Minuten nach Mischung des Bilirubinstandars mit dem ersten Reaktionsmittel wurde die Absorption (450 nm) der Flüssigkeitsmischung automatisch gemessen. Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt.
iv) Ergebnisse:
Wie aus 2 klar wird, findet durch Zugabe indirekten Bilirubins und Natriumnitrats zu der sauren Lösung in Gegenwart von Thioharnstoff als Reaktionsinhibitor eine Abnahme der Absorption auf Grund der Verdünnung des Lösungsvolumens statt, aber es gibt keine Veränderung der Absorption, die auf indirektem Bilirubin beruht. Andererseits wird die Absorption, die auf direktem Bilirubin beruht, unter diesen Bedingungen selektiv gesenkt. D.h., dass das indirekte Bilirubin nicht oxidiert werden kann, sondern das direkte Bilirubin selektiv unter diesen Bedingungen oxidiert werden kann.
Beispiel 2
Korrelation des Oxidationsverfahrens mit salpetriger Säure basierend auf der Gegenwart von Thioharnstoff mit dem BOD-Verfahren bei der Messung von direktem Bilirubin
i) Ziel:
Zu zeigen, ob das auf der Gegenwart von Thioharnstoff beruhende Verfahren direktes Bilirubin in einer Probe exakt messen kann, und um zu untersuchen, ob es eine Korrelation des Verfahrens mit dem BOD-Verfahren als Kontrolle gibt oder nicht.
ii) Messung direkten Bilirubins durch das Verfahren, das auf Gegenwart von Thioharnstoff beruht:
Die gleichen ersten Reaktionsmittel und zweiten Reaktionsmittel, wie in Beispiel 1 wurden verwendet. Nescoat BIL-Standardserum (enthaltend 7,8 mg/dl direktes Bilirubin und 12,1 mg/dl Gesamtbilirubin), hergestellt von Nihon Shoji K.K., wurde als Bilirubinstandardserum verwendet, um eine Arbeitskurve zu erhalten.
Die Arbeitsschritte wurden in der gleichen Prozedur wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer dass frisches Humanserum anstelle des Bilirubin-Standards verwendet wurde.
Die Konzentration des direkten Bilirubins wurde auf folgende Weise bestimmt; das erste Reaktionsmittel und frisches menschliches Serum wurden gemeinsam gemischt, und die Absorption der erhaltenen Lösungsmischung wurde bei 450 nm gemessen, um den Messwert „Absorption A" zu erhalten. Dann wurde das zweite Reaktionsmittel zu der Lösungsmischung hinzugegeben, um die Oxidationsreaktion auszulösen. Die Absorption der Reaktionslösung wurde wiederum gemessen, um den Messwert „Absorption B" zu gewinnen. Der Wert der Absorption A und Absorption B, die auf diese Weise gewonnen wurden, wurden hinsichtlich des Lösungsvolumens korrigiert und dann wurde eine Änderung der Absorption vor und nach der Oxidationsreaktion gewonnen. Die Konzentration direkten Bilirubins im frischen menschlichen Serum wurde durch die Änderung der Absorption, die auf diese Weise gewonnen wurde, und durch eine Arbeitskurve, die zuvor auf Grundlage von Änderungen der Absorption erhalten wurde, bestimmt, welche in gleicher Weise wie oben an Standardlösungen bekannter direkter Bilirubinkonzentrationen, die verwendet wurden, hergestellt wurde.
iii) Messung direkten Bilirubins durch das BOD-Verfahren:
Direktes Bilirubin wurde in einem Messkit für Nescoat D-BIL-VE (hergestellt von Nihon Shoji K.K.) gemäß dem Handbuch gemessen.
iv) Korrelation des Oxidationsverfahrens mit salpetriger Säure basierend auf der Gegenwart von Thioharnstoff mit dem BOD-Verfahren:
Die Konzentration des direkten Bilirubins in 44 Proben frischen menschlichen Serums wurde durch das Verfahren gemessen, das auf Gegenwart von Thioharnstoff beruht, und durch das BOD-Verfahren, um ihre Korrelation zu untersuchen.
v) Ergebnisse:
Ein Graph der Korrelationsergebnisse wird in 3 gezeigt. Es wurde gefunden, dass der Korrelationskoeffizient 0,997 ist und dass die Regressionsgleichung Y = 0,996 X + 0,023 ist. Es wurde herausgefunden, dass es eine sehr gute Korrelation dazwischen gab, und die Konzentration des direkten Bilirubins im menschlichen Serum konnte erfindungsgemäß exakt gemessen werden.
Beispiel 3
Messung des Gesamtbilirubins durch das Oxidationsverfahren mit salpetriger Säure basierend auf der Gegenwart von Cetyltrimethylammoniumbromid
i) Ziel:
Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um zu zeigen, dass sowohl indirektes Bilirubin und direktes Bilirubin durch Zugabe von Cetyltrimethylammoniumbromid als Reaktionsbeschleuniger bei der Messung von Bilirubin durch salpetrige Säureoxidationsverfahren oxidiert werden können, wodurch eine Messung des Gesamtbilirubins ermöglicht ist.
ii) Verwendetes Reaktionsmittel:
Erstes Reaktionsmittel:
Eine wässrige Lösung, die die folgenden Bestandteile enthält, und die auf einen pH von 3,00 durch NaOH eingestellt wurde, wurde als erstes Reaktionsmittel verwendet:

Zitronensäuremonohydrat 200 mM

CyDTA 1 mM

Cetyltrimethylammoniumbromid 1%

Tensid 0,3%
Zweites Reaktionsmittel:
Eine wässrige Lösung enthaltend die folgenden Bestandteile wurde als zweites Reaktionsmittel verwendet:

Natriumnitrit 5 mM

Natriumchlorid 150 mM
iii) Bilirubinstandard:
Der gleiche direkte Bilirubinstandard und indirekte Bilirubinstandard, wie in Beispiel 1 wurde verwendet.
iv) Verfahren:
Die Arbeitsschritte wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Alle 0,3 Minuten nach der Mischung des Bilirubinstandards mit dem ersten Reaktionsmittel wurde die Absorption (450 nm) der Flüssigkeitsmischung automatisch gemessen. Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt.
v) Ergebnisse:
In diesem Beispiel wird gezeigt, dass die Absorption, die auf indirektem Bilirubin beruht, vollständig verschwindet, wie auch die Absorption, die auf dem direkten Bilirubin beruht. D.h., dass in diesem Beispiel herausgefunden wurde, dass das indirekte Bilirubin wie auch das direkte Bilirubin vollständig oxidiert wurden.
Beispiel 4
Korrelation des Oxidationsverfahrens mit salpetriger Säure beruhend auf Gegenwart von Cetyltrimethylammoniumbromid mit dem BOD-Verfahren bei der Messung von Gesamtbilirubin
i) Ziel:
Zu zeigen, dass Gesamtbilirubin in einer Probe durch das Oxidationsverfahren mit salpetriger Säure basierend auf der Gegenwart von Cetyltrimethylammoniumbromid exakt gemessen werden kann, und um die Korrelation des Verfahrens mit dem BOD-Verfahren als Kontrolle zu untersuchen
ii) Messung von Gesamtbilirubin durch das auf Vorliegen von Cetyltrimethylammoniumbromid beruhende Verfahren:
Das erste Reaktionsmittel und das zweite Reaktionsmittel des Beispiels 3 wurde verwendet. Nescoat BIL-Standard-Serum (enthaltend 7,8 mg/dl direkten Bilirubins und 12,1 mg/dl Gesamtbilirubins) hergestellt von Nihon Shoji K.K. wurde als Bilirubin-Standardserum verwendet, um eine Arbeitskurve zu erhalten. Die Arbeitsschritte wurde in dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 durchgeführt, außer dass frisches menschliches Serum anstelle des Bilirubin-Standards verwendet wurde.
Die Konzentration des Gesamtbilirubins wurde in folgender Weise gewonnen: Das erste Reaktionsmittel und das frische menschliche Serum wurden miteinander vermischt und die Absorption bei 450 nm der Lösungsmischung wurde gemessen, um den Messwert „Absorption A" zu erhalten. Dann wurde das zweite Reaktionsmittel zu der Lösungsmischung hinzugegeben, um die Oxidationsreaktion auszulösen, und dann wurde die Absorption der Reaktionslösung wiederum gemessen, um den Messwert „Absorption B" zu erhalten. Die so erhaltenen Werte der Absorption A und Absorption B wurden hinsichtlich des Lösungsvolumens korrigiert, und dann wurde eine Änderung der Absorption vor und nach der Oxidationsreaktion gewonnen. Die Konzentration des Gesamtbilirubins im frischen Humanserum wurde durch die Änderung der Absorption bestimmt, die auf diese Weise gewonnen wurde, und durch die Arbeitskurve, die zuvor auf Grundlage von Änderungen der Absorption erstellt wurde, welche in gleicher Weise wie oben erhalten wurde, indem Standardlösungen bekannter Gesamtbilirubinkonzentrationen verwendet wurden.
iii) Messung des Gesamtbilirubins durch das BOD-Verfahren:
Gesamtbilirubin wurde mit einem Mess-Kit für Nescoat T-BIL-VE (hergestellt von Nihon Shoji K.K.) nach dem Handbuch gemessen.
iv) Korrelation des Oxidationsverfahrens mit salpetriger Säure basierend auf der Gegenwart von Cetyltrimethylammoniumbromid mit dem BOD-Verfahren:
Die Konzentration des Gesamtbilirubins in 44 Proben frischen Humanserums wurde durch das Verfahren gemessen, das auf der Gegenwart von Cetyltrimethylammoniumbromid beruht und durch das BOD-Verfahren, um deren Korrelation zu untersuchen.
v) Ergebnisse:
Ein Graph der Korrelationsergebnisse wird in 5 gezeigt. Es wurde gefunden, dass der Korrelationskoeffizient 0,999 ist und dass die Regressionsgleichung Y = 1,013 X + 0,1862 ist. Es wurde weiter herausgefunden, dass es eine sehr gute Korrelation dazwischen gab und dass die Konzentration des Gesamtbilirubins im Humanserum erfindungsgemäß exakt gemessen werden konnte.
Beispiele 5 bis 13 und Vergleichsbeispiele 1 bis 3
Messung des direkten Bilirubins in Gegenwart und Abwesenheit eines nicht ionischen Tensids
i) Ziel:
Direktes Bilirubin oder indirektes Bilirubin wurden durch die Zugabe einer Probe eines nicht ionischen Tensids ausgewählt aus Polyoxyethylen(n-alkyl oder iso-alkyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber weniger als 15 und Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber nicht mehr als 19 und falls notwendig eines Reaktionsinhibitors für das indirekte Bilirubin und Polyvinylpyrrolidon gemessen, wobei salpetriger Säure ermöglicht wurde, auf die erhaltene Flüssigkeitsmischung einzuwirken, und indem die optischen Veränderungen bei 450 nm an der Probe gemessen wurden. Ähnliche Experimente wurden zum gleichen Zeitpunkt ohne ein solches nicht ionischen Tensid durchgeführt.
ii) Verwendete Reaktionsmittel:
Erstes Reaktionsmittel:
Eine wässrige Lösung, die die folgenden Bestandteile enthält, welche auf pH 3,70 durch NaOH eingestellt worden waren, wurde als erstes Reaktionsmittel verwendet:

Zitronensäuremonohydrat 100 mM

EDTA 1 mM
Bestandteile, die weiter im ersten Reaktionsmittel enthalten sind, wie in der folgenden Tabelle 1 angegeben
Zweites Reaktionsmittel:
Eine wässrige Lösung, die die folgenden Bestandteile enthält, wurde als zweites Reaktionsmittel verwendet:

Natriumnitrit 5 mM

Natriumchlorid 150 mM
Probe:
Zur Messung des direkten Bilirubins wurde eine Lösung, die 10 mg/dl oder 50 mg/dl Ditaurobilirubin enthält, verwendet. Für die Messung des indirekten Bilirubins wurde eine Lösung, die 50 mg/dl indirekten Bilirubins enthält, verwendet. Zur Messung einer Probe einer Flüssigkeit aus dem lebenden Körper, wurde Serum, welches 2,3 mg/dl direktes Bilirubin und 12,1 mg/dl Gesamtbilirubins enthält, verwendet.
Arbeitskurven:
Arbeitskurven wurden durch die Messung gemäß dem folgenden Verfahren unter Verwendung von Proben, die 10 mg/dl, 20 mg/dl, 30 mg/dl, 40 mg/dl und 50 mg/dl an Ditaurobilirubin enthalten, durchgeführt. Die Korrelationskoeffizienten der Arbeitskurven werden in Tabelle 1 gezeigt.
iii) Verfahren
Die Messung wurde unter den in Tabelle 1 angegebenen Bedingungen durchgeführt, indem ein automatisches Analysegerät Hitachi Modell 7170 (hergestellt von Hitachi Ltd.) verwendet wurde. Nach diesen Bedingungen wurden 6 μl einer Probe und 180 μl des ersten Reaktionsmittels miteinander gemischt und die erhaltene Flüssigkeitsmischung wurde für 5 Minuten bei 37°C stehen gelassen. Dann wurden 45 μl des zweiten Reaktionsmittels zu der Flüssigkeitsmischung hinzugegeben, um die Reaktion auszulösen. Diese Arbeitsschritte wurden alle automatisch durchgeführt, indem Parameter eingestellt wurden. Alle 0,3 Minuten nach dem Mischen der Proben mit dem ersten Reaktionsmittel wurde die Absorption (450 nm) der Flüssigkeitsmischung automatisch gemessen.
Die Konzentration des direkten Bilirubins wurde in folgender Weise bestimmt: Das erste Reaktionsmittel und die Probe wurden miteinander vermischt, und die Absorption bei 450 nm der erhaltenen Lösungsmischung wurde gemessen, um den Messwert „Absorption A" zu gewinnen. Dann wurde das zweite Reaktionsmittel zu der Lösungsmischung hinzugegeben, um die Oxidationsreaktion auszulösen. Die Absorption der Reaktionslösung wurde wiederum gemessen, um den Messwert „Absorption B" zu erhalten. Die Werte der Absorption A und Absorption B, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden hinsichtlich des Lösungsvolumens korrigiert, und dann wurde eine Änderung der Absorption vor und nach der Oxidationsreaktion erhalten. Die Konzentration des direkten Bilirubins in der Probe wurde aus der Änderung der Absorption, die auf diese Weise gewonnen wurde, und mit Hilfe der Arbeitskurve, die zuvor auf Grundlage von Änderungen der Absorption erstellt wurde, welche auf gleiche Weise wie oben erhalten wurde, in dem Standardlösung bekannter direkter Bilirubinkonzentrationen verwendet wurden, bestimmt.
iv) Ergebnisse:
Die so erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Wie aus den Ergebnissen der Tabelle 1 klar wird, kann direktes Bilirubin spezifisch mit einer hohen Empfindlichkeit durch Durchführen der Messung in Gegenwart von Adekatol SO-135 und Adekatol NP-720 gemessen werden.
Beispiel 14
Messung von direktem Bilirubin durch Vanadiumsäure durch das Vanadiumsäureverfahren und das BOD-Verfahren basierend auf der Gegenwart eines nicht ionischen Tensids
i) Ziel:
Direktes Bilirubin wurde durch die Zugabe eines Probe von Adekatol SO-135 als nicht ionisches Tensid, ausgewählt aus Polyoxyethylen(n-alkyl oder iso-alkyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12, aber weniger als 15 und Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ethern mit einem HLB-Wert von 12 bis 19 gemessen, wobei Vanadiumsäure oder Bilirubinoxidase (BOD) ermöglicht wurde, auf die erhaltene Flüssigkeitsmischung einzuwirken, und indem die optischen Änderungen bei 450 nm an der Probe gemessen wurden, um eine Arbeitskurve zu erstellen.
ii) Verwendete Reaktionsmittel:
Erstes Reaktionsmittel:
Eine wässrige Lösung enthaltend die folgenden Bestandteile, welche auf pH 3,70 durch NaOH eingestellt wurde, wurde als erstes Reaktionsmittel verwendet:

Zitronensäuremonohydrat 100 mM

EDTA 1 mM

Adekatol SO-135 1,00%
Zweites Reaktionsmittel:
Eine physiologische Salzlösung enthaltend 3 mM Vanadiumsäure oder eine physiologische Salzlösung, die 200 Einheiten/l Bilirubinoxidase enthält, wurde als zweites Reaktionsmittel verwendet.
Probe:
Ditaurobilirubin wurde als Probe verwendet.
Arbeitskurven:
Die Arbeitskurven wurden durch das Durchführen einer Messung gemäß dem in den Beispielen 5 bis 13 und Vergleichsbeispielen 1 bis 3 beschriebenen Verfahren erhalten, indem Proben verwendet wurde, die 10 mg/dl, 20 mg/dl, 30 mg/dl, 40 mg/dl und 50 mg/dl Ditaurobilirubin enthalten.
iii) Ergebnisse:
Die durch das Vanadiumsäureverfahren und das BOD-Verfahren erhaltenen Arbeitskurven werden in den 6 und 7 gezeigt.
Die in den 6 und 7 gezeigten Arbeitskurven zeigen gute Linearität, und es kann hieraus ersehen werden, dass direktes Bilirubin bei einer hohen Konzentration mit hoher Empfindlichkeit durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Messen direkten Bilirubins unter Verwendung von Vanadiumsäure oder BOD als Oxidationsmittel in Gegenwart eines spezifischen nicht ionischen Tensids gemessen werden kann.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Wie aus dem Vorhergehenden klar wird, ist die vorliegende Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass salpetrige Säure als Oxidationsmittel für Bilirubin verwendet wird, wobei ein Reaktionsinhibitor für indirektes Bilirubin bei der Messung von direktem Bilirubin verwendet wird, und wobei ein Reaktionsbeschleuniger bei der Messung von Gesamtbilirubin gemessen wird. Außerdem wird die vorliegende Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass direktes Bilirubin in Gegenwart eines spezifischen nicht ionischen Tensids gemessen wird. Das vorliegende Verfahren mit den oben erwähnten Eigenschaften hat eine gute Korrelation zu dem konventionellen BOD-Verfahren mit einer herausragenden Präzision, und auch die Reaktionsmittel, die für die Messung verwendet werden sollen, haben eine sehr gute Stabilität. Außerdem ist das vorliegende Verfahren auf die Messung von Bilirubin durch ein automatisches Analysegerät anwendbar, und daher ist es ein guter Beitrag zur Messung in klinischen Untersuchungen.

Claims

Verfahren zur Messung des Gesamt-Bilirubins oder des direkten Bilirubins, umfassend das Einwirkenlassen von salpetriger Säure als Oxidationsmittel auf eine Probe von Flüssigkeit des lebenden Körpers, und Messung der optischen Veränderungen an der Probe.
Verfahren zur Messung von direktem Bilirubin gemäß Anspruch 1, umfassend das Einwirkenlassen von salpetriger Säure als Oxidationsmittel auf eine Probe von Flüssigkeit des lebenden Körpers in Gegenwart eines Reaktionsinhibitors, der geeignet ist zur Inhibierung der Oxidation von indirektem Bilirubin, und Messung der optischen Veränderungen an der Probe.
Verfahren zur Messung von Gesamt-Bilirubin gemäß Anspruch 1, umfassend das Einwirkenlassen von salpetriger Säure als Oxidationsmittel auf eine Probe von Flüssigkeit des lebenden Körpers in Gegenwart eines Reaktionsbeschleunigers, der geeignet ist zur Beschleunigung der Oxidation von indirektem Bilirubin, und Messung der optischen Veränderungen an der Probe.
Verfahren zur Messung von direktem Bilirubin gemäß Anspruch 1, umfassend das Einwirkenlassen von salpetriger Säure als Oxidationsmittel auf eine Probe von Flüssigkeit des lebenden Körpers in Gegenwart von zumindest einem nicht-ionischen Tensid, ausgewählt aus Polyoxyethylen(n-alkyl oder iso-alkyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12 aber weniger als 15 und Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12 aber nicht mehr als 19, und Messung der optischen Veränderungen an der Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin eine Kombination von zumindest zwei Reaktionsinhibitoren eingesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin ein Reaktionsinhibitor zusammen mit dem nicht-ionischen Tensid als anderem Reaktionsinhibitor eingesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin weiterhin Polyvinylpyrrolidon eingesetzt wird.
Set zur Messung von Bilirubin in einer Probe von Flüssigkeit des lebenden Körpers, umfassend i) eine saure Lösung und ii) eine Nitritlösung zur Oxidation von Bilirubin.
Set zur Messung von direktem Bilirubin in einer Probe von Flüssigkeit des lebenden Körpers gemäß Anspruch 8, umfassend i) eine saure Lösung enthaltend einen Reaktionsinhibitor und ii) eine Nitritlösung zur Oxidation von Bilirubin.
Set zur Messung von Gesamt-Bilirubins in einer Probe von Flüssigkeit des lebenden Körpers gemäß Anspruch 8, umfassend i) eine saure Lösung enthaltend einen Reaktionsbeschleuniger und ii) eine Nitritlösung zur Oxidation von Bilirubin.
Set zur Messung von direktem Bilirubin in einer Probe von Flüssigkeit des lebenden Körpers gemäß Anspruch 8, umfassend i) eine saure Lösung enthaltend zumindest ein Tensid, ausgewählt aus Polyoxyethylen(n-alkyl oder isoalkyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger 12 aber weniger als 15 und Polyoxyethylen(n- alkylphenyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12 aber nicht mehr als 19, und ii) eine Nitritlösung als Oxidationsmittel zur Oxidation von Bilirubin.
Verfahren zur Messung von direktem Bilirubin gemäß Anspruch 4, umfassend das Einwirkenlassen von salpetriger Säure als Oxidationsmittel auf eine Probe von Flüssigkeit des lebenden Körpers in Gegenwart von zumindest einem nicht-ionischen Tensid, ausgewählt aus Polyoxyethylen(n-alkyl oder iso-alkyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger 12 aber weniger als 15 und Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12 aber nicht mehr als 14,8, und Messung der optischen Veränderungen an der Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin ein Reaktionsinhibitor für indirektes Bilirubin zusammen mit dem nicht-ionischen Tensid eingesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin weiterhin Polyvinylpyrrolidon eingesetzt wird.
Set zur Messung von direktem Bilirubin in einer Probe von Flüssigkeit des lebenden Körpers gemäß Anspruch 11, umfassend i) eine saure Lösung enthaltend zumindest ein nicht-ionisches Tensid, ausgewählt aus Polyoxyethylen(n-alkyl oder iso-alkyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12 aber weniger als 15 und Polyoxyethylen(n-alkylphenyl)ethern mit einem HLB-Wert von nicht weniger als 12 aber weniger als 14,8, und ii) Nitritlösung zur Oxidation von Bilirubin.