DE3012014A1 - Istamycine und verfahren zur herstellung derselben - Google Patents
Istamycine und verfahren zur herstellung derselbenInfo
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Description
.}.
301201-
Anmelder; ZAIDAN HOJIN BISEIBUTSU
KAGAKU KENKYU KAI, d 2βοο Bremen
14-23, Kami Osaki 3-chome, sievogutraee 21
Shinagawa-ku, Tokyo, Japan «^«^11*D.uu*iand
Telefon 0421 - 34 2019
Telegramme: PATMEIS BREMEN it ». ι ^ \ ττ TnmniTn Telex: 246157 (melbo d)
Erfinder: 1) Hamao UMEZAWA,
23, Toyotamajtita 4 chome, Datum 27.März 1980
Nerima-ku, Tokyo, Japan
Unser Zeichen 1511
2) Yoshiro OKAMI,
18-14, Denenchofu 4-chome, ""*>"*""
Ohta-ku, Tokyo, Japan
3) Shinichi KONDO,
1157-1, Ichigao-cho,
Midori-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan
Istamycine und Verfahren zur Herstellung
derselben
Die Erfindung betrifft vier neue Antibiotika, die als Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A und Istamycin B
bezeichnet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin die fermentative Herstellung dieser neuen Antibiotika unter
Verwendung eines neuen Mikroorganismus sowie die Verwendung der neuen Antibiotika. Zum Gegenstand der Erfindung
gehört schließlich auch der neue Mikroorganismus selbst, der für die fermentative Herstellung der Istamycine
verwendet wird.
Eine große Zahl verschiedener pathogener Mikroorganismen wie Bakterien und Fungi ist die Ursache für das Auftreten
von Krankheiten bei Menschen, bei Tieren und Pflanzen. Obwohl eine Anzahl von Antibiotika entwickelt
worden ist, von denen einige eine hohe antimlkrobielle
Eingesandte Modelle werden nactt 2 Monaten, falls nicht zurückgefordert, vernichtet. Mündliche Abreden, Insbesondere durch Fernsprecher, bedürfen schriftlicher
Bestätigung. — Die in Rechnung gestellten Kosten sind mit Redinungsdatum ohne Abzug fällig. — Bei verspäteter Zahlung werden Bankzinsen berechnet.
1 O]JlJI Λ«O JW
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Wirkung gegen die verschiedenen pathogenen Mikroorganismen aufweisen, besteht nach wie vor ein Bedarf an
stärker wirksamen therapeutischen Mitteln, mit denen von pathogenen Mikroorganismen beim Menschen, bei
Tieren und Pflanzen hervorgerufene Krankheiten bekämpft werden können.
Die Erfindung macht es sich zur Aufgabe, neue Antibiotika bereitzustellen, die als antibakterielle Mittel
bei der therapeutischen Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren und/oder zur
Sterilisation chirurgischen Materiales und chirurgischer Instrumente verwendet werden können. Eine weitere Aufgabe
der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur fermentativen Herstellung der neuen Antibiotika vorzuschlagen.
Im Zusammenhang mit der Gewinnung der neuen Antibiotika hat die Anmelderin umfangreiche Forschungen durchgeführt.
Das Ergebnis dieser Forschungen besteht unter anderem in der Auffindung eines neuen Stammes der Gattung
Streptomyces, welcher aus einer Bodenprobe isoliert werden konnte, die im Seeboden der Küste der Halbinsel
Miura in Kanagawa Prefecture, Japan gefunden wurde. Diese Probe erhielt die Laboratoriumsbezeichnung Stamm-Nummer
SS-939 und wurde in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Bei der Züchtung wurden
vier verschiedene Substanzen erzeugt, die eine antibakterielle Wirkung gegen eine große Zahl verschiedener
Bakterien aufweisen. Diese antibakteriellen Substanzen konnten aus der Kulturbrühe isoliert und gereinigt
werden. Aus den chemischen, physikalischen und mikrobiologischen Untersuchungen der isolierten Substanzen
ergab sich, daß es sich bei jeder der isolierten Substanzen um ein neues Aminoglycosid-Antibiotikum handelt,
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welches sich durch eine geringe Toxizität auszeichnet
und welches klar von den bekannten Antibiotika unterschieden ist. Die vier neuen Antibiotika sind als
Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A und Istamycin B
bezeichnet worden.
(a) Istamycin A entspricht der Summenformal C^H^eNcOc.
Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine
O-Methy1gruppe im Molekül. Sie zeigt nur eine Endabsorption
im Ultraviolett-Absorptionsspektrum in Wasser.
Die Verbindung ist löslich in Wasser und Methanol, kaum
löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gewöhnlichen organischen Lösungsmitteln. Sie gibt eine positive
Reaktion mit Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz und ihr Rf-Wert bei der Zellulose-Dünnschichtchromatographie
beträgt 0,22, wenn zum Entwickeln n-Butanol-· Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:4)
verwendet wird. Das Istamycin-A-Hemicarbonat liegt in Form eines farblosen Pulvers vor, welches keinen definierten
Schmelzpunkt besitzt und sich bei 102 bis 1080C
zersetzt. Die spezifische optische Drehung beträgt (ac)jp = + 155° ( c 0,4, Wasser).
(b) Istamycin B entspricht der Summenformel ^1 γΗ,,-Ν,-Ο,-.
Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine O-Methylgruppe im Molekül. Sie zeigt nur eine Endabsorption
im Ultraviolett-Absorptionsspektrum in Wasser. Die Verbindung ist löslich in Wasser und Methanol,
kaum oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen
organischen Lösungsmitteln. Sie gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz. Der
Rf-Wert bei der Zellulose-Dünnschichtchromatographie liegt bei 0,25, wenn zum Entwickeln ein Gemisch aus
n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis
6:4:2:4) verwendet wird. Das Istamycin-B-Hemicarbonat
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stellt ein farbloses Pulver dar, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, sondern sich bei 112 bis
1140C zersetzt und eine spezifische optische Drehung
von (a)jp = +165° (c 0,4, Wasser) aufweist.
(c) Istamycin AQ entspricht der Summenformel C15H32^4°4
Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine
O-Methylgruppe im Molekül. Im Ultraviolett-Spektrum
zeigt die Verbindung in Wasser nur eine Endabsorption. Istamycin A ist in Wasser und Methanol kaum löslich,
in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln unlöslich. Die Verbindung gibt eine
positive Reaktion mit Ninhydrin und Rydon-Smith-Reagenz; ihr Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie
an Silikagel liegt bei 0,36, wenn zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-17#igem
wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) verwendet wird. Das Istamycin A0-Hemicarbonat bildet
ein farbloses kristallines Pulver, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, sondern sich bei
111 bis 1140C zersetzt und eine spezifische optische
Drehung von (a)^2 » +76° (c 0,56, Wasser) aufweist.
(d) Istamycin BQ entspricht der Summenformel C-|5H32N4°4·
Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine O-Methylgruppe im Molekül. Im Ultraviolett-Absorptions-Spektrum
zeigt Istamycin BQ in Wasser nur eine Endabsorption. Die Verbindung ist in Wasser und Methanol
kaum löslich, in anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln und Äthanol unlöslich. Die Reaktion
gegenüber Ninhydrin und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv; bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel liegt
der Rf-Wert der Verbindung bei 0,14, wenn zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-
17#igem wässrigem Ammoniak (Volumenverhältnis
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2:1:1) verwendet wird. Das Istamycin Bo-Hemicarbonat
liegt in Form eines farblosen kristallinen Pulvers vor, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt.
Die spezifische optische Drehung liegt bei (a)ß6 = +160° (c 1,0 Wasser).
Wenn im Folgenden von Istamycin die Rede ist, so ist damit entweder Istamycin A, Istamycin B, Istamycin AQ
oder Istamycin BQ oder aber eine Mischung dieser Substanzen
gemeint, soweit im Einzelfall nicht etwas anderes angegeben ist. Unter dem Ausdruck Istamycin-Komplex
wird eine Mischung aus zwei, drei oder allen Istamycinen A, B, A0 und B verstanden, soweit nichts
anderes angegeben ist. Die vorliegende Erfindung umfaßt also Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A und
Istamycin BQf entweder allein oder in Mischung von
wenigstens zwei der genannten Substanzen, die in verdünnter Lösung, als Rohkonzentrat oder als feste
Rohsubstanz, jedoch auch als gereinigte feste Substanz in Form der freien Base oder in Form von Säureanlagerungssalzen
mit anorganischen oder organischen Säuren vorliegen können.
Die physiko-chemischen Eigenschaften von Istamycin,
einschließlich der bereits erwähnten Eigenschaften werden im Folgenden im einzelnen beschrieben.
Istamycin A ist eine basische Verbindung; es läßt sich als Carbonat in Form eines farblosen Pulvers isolieren,
welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, eich vielmehr bei 102 bis 108°C zersetzt und eine spezifische
optische Drehung von (a)|5 » +155° (c 0,4, Wasser)
besitzt. Die Gewichtsanalyse stimmt mit den theoretischen Werten für die Summenformel C^yH^cNcOc. 1/2 H2CO,
(C 49,99 %; H 8,63 %; N 16,65 %; 0 24,73 %) überein.
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Die Sununenformel konnte durch die Massenspektrometrie
(gefunden: m/e 389,2588; berechnet für C-|7H35N5°5!
m/e 389,2635) bestätigt werden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum
von Istamycin-A-Hemicarbonat in Kaliumbromid-Tablette ist in Figur 1 der beigefügten
Zeichnungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Istamycin-A-Hemicarbonat in Wasser zeigt
nur eine Endabsorption. Beim kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrum
- Proton ( H) - äußerer Standard: TMS, pD 5,4 - von Istamycin-A- Hemicarbonat
in Deuterowasser finden sich charakteristische Signale bei e 3,20 (s, N-CH5), 3,57 (s, N-CH3), 3,89 (s, 0-CH3),
4,50 (s, CH2). und 5,80 (d, J=3,5 Hz,CH). Istamycin A
ist löslich in Wasser und Methanol, schwach löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen
organischen Lösungsmitteln und seine Reaktion gegenüber Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv.
Istamycin A gibt einen Einzelfleck bei Rf 0,22 bei ^n
der Dünnschicht Chromatographie an Zellulose (Avicel^,
ein Produkt der Firma Funakoshi Yakuhin Co.), wenn zum Entwickeln ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(Volumenverhältnis 6:4:2:4) verwendet wird. Istamycin A unterscheidet sich so von
Istamycin B, welches einen Einzelfleck bei derselben Dünnschichtchromatographie an Zellulose bei Rf 0,25
gibt. Bei der Hochspannungspapierelektrophorese (3300 Volt, 15 Minuten) unter Verwendung von Ameisensäure-Essigsäure-Wasser
(Volumenverhältnis 25:75:900) ist die Mobilität von Istamycin A und Istamycin B
gleich groß und liegt bei 2,15, wenn die Mobilität von Alanin als Standardsubstanz mit 1,0 angenommen wird.
Durch Hochspannungspapierelektrophorese läßt sich Istamycin A folglich nicht von Istamycin B unterscheiden.
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Istamycin B ist in seinen Eigenschaften dem Istamycin
A sehr ähnlich. Das Istamycin B ist ebenfalls eine basische Verbindung. Das als Carbonat in Form eines
farblosen Pulvers isolierte Istamycin B besitzt keinen definierten Schmelzpunkt, zersetzt sich vielmehr bei
112 bis 124°C und zeigt eine spezifische optische Drehung von (α)2,5 = +165° (c 0,4, Wasser). Die Werte
der Gewichtsanalyse stimmen mit den theoretischen Werten der Summenformel ci7H35N505· 1/2 H2C03
(C 49,99 %l H 8,63 %i N 16,65 %; 0 24,73 %) Uberein.
Diese Summenformel konnte durch die Werte der Massenspektrometrie mit hohem Auflösungsvermögen (gefunden:
m/e 389,2625; berechnet für C17H35N5O5: M/e 389,2635)
bestätigt werden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Istamycin B in Kaliumbromid-Tablette ist in Figur 2 der
beigefügten Zeichnungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum
von Istamycin-B-Hemicarbonat in Wasser zeigt nur eine Endabsorption. Im kernmagnetischen
Resonanz-Absorptionsspektrum - Proton ( H) - externer Standard: TMS, pD 5,4 - von Istamycin-B-Hemicarbonat in
Deuterowasser finden sich charakteristische Signale bei<f
3,26 (s, H-CH3), 3,59 (s, N-CH3), 3,95 (s, 0-CH3),
4,57 (s, CH2) und 5,96 (d, J-3,5 Hz, CH). Ähnlich wie Istamycin A ist Istamycin B in Wasser und Methanol
löslich, schwach löslich bis unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln, Eine
Reaktion gegenüber Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv. Wie bereits angegeben, ist Istamycin B
vom Istamycin A durch die DünnschichtChromatographie
Zellulose zu unterscheiden und zu trennen.
Istamycin AQ ist ebenfalls eine basische Verbindung.
Istamycin AQ läßt sich als Hemicarbonat in Form eines
farblosen kristallinen Pulvers isolieren; dieses Pulver besitzt keinen definierten Schmelzpunkt, zersetzt sich
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bei 111 bis 1140C und zeigt eine spezifische optische
Drehung von (a)^ = + 76° (c 0,56, Wasser). Die Werte
der Gewichtsanalyse stimmen mit den theoretischen Werten der Summenformel c-i5H32N4°4* ^2 H2^03
(C 51,22 %-, H 9,15 %,* N 15,42 %) überein. Die Summenformel
konnte durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung (gefunden: m/e 332.2414; berechnet für
C15H32N4°4: m^e 332,2420) bestätigt werden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum
von Istamycin-AQ-Hemicarbonat in Kaliumbromid-Tablette ist in Figur 3 der beigefügten
Zeichnungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptions- · Spektrum von Istamycin-AQ-Hemicarbonat in Wasser zeigt
nur eine Endabsorption. Im kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrum - Proton ( H) - externer Standard:
TMS, pD 5,0 - von Istamycin-AQ-Hemicarbonat in Deuterowasser
finden sich charakteristische Signale bei S3,23 (s, K-CH3), 3,28 (s, H-CH3), 3,94 (s, 0-CH3),
5,86 (df J=4 Hz, CH). Istamycin AQ ist löslich in Wasser
und Methanol, kaum löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln.
Seine Reaktion gegenüber Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz
ist positiv. Istamycin AQ gibt einen Einzelfleck bei der DünnschichtChromatographie an Silikagel bei
Rf 0,36, wenn zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-17#igem wässrigem
Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) verwendet wird. Bei der Hochspannungspapierelektrophorese (3300 Volt, 15
Minuten) beträgt die relative Mobilität von Istamycin AQ 2,35, wenn die Mobilität von Alanin mit 1,0 angenommen
wird und als Laufmittel ein Gemisch aus Ameisensäure,
Essigsäure und Wasser (Volumenverhältnis 1:3:36) verwendet wird.
030Ö46/0S3?
3Q12QK
-χ- /Ιζ 27.03.80
Istamycin B0 ist ebenfalls eine basische Verbindung.
In Form des Hemicarbonates kann die Verbindung als farbloses kristallines Pulver isoliert werden, welches
keinen definierten Schmelzpunkt zeigt. Die spezifische 5 optische Drehung liegt bei (a)jj = +160° (c 1, Wasser).
Die Werte der Gewichtsanalyse stimmen mit den theoretischen Werten für die Summenformel ci5H32N4°4· 1^2
H2CO3.1/2 H2O (C 49,98 %; H 9,20 %; N 15,04 %) überein.
Diese Summenformel konnte durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung (gefunden: m/e 332,2384; berechnet
für c-j5H32N4°4: m/e 332,2421) bestätigt werden.Das
Infrarot-Absorptionsspektrum von Istamycin B in Kaliumbromid-Tablette ist in Figur 4 der beigefügten
Zeichnungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Istamycin-Bo-Hemicarbonat in Wasser zeigt
nur eine Endabsorption. Im kernmagnetischen Resonanz-Absorptionsspektrum - Proton ( H) - externer Standard:
TMS, pD 5,2 - von Istamycin-BQ-Hemicarbonat in Deuterowasser
zeigen sich charakteristische Signale bei 6" 3,21 (s, N-CH3); 3,28 (s, N-CH3); 3,91 (s, 0-CH3);
5,92 (d, J=3,5 Hz, CH). Istamycin BQ ist löslich in Wasser und Methanol, jedoch kaum löslich oder unlöslich
in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln. Die Reaktion gegen Ninhydrin- und
Rydon-Smith-Reagenz ist positiv. Istamycin BQ ergibt
einen Einzelfleck bei der bereits beschriebenen Dünnschichtchromatographie an Silikagel bei Rf 0,14, wenn
zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-1596igem wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis
2:1:1) verwendet wird. Bei der Hochspannungspapierelektrophorese - durchgeführt wie für Istamycin
A beschrieben - ist Istamycin B nicht vom Istamycin AQ zu unterscheiden, weil die Mobilitäten beider Verbindungen
in gleicher Weise bei 2,35 liegen.
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30Ί2014
27.03.80
Aufgrund der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
durchgeführten Untersuchungen können die folgenden Strukturformeln für die erfindungsgemäßen
Istamycine als gesichert gelten:
Istamycin A
(D
Istamycin B
NH,
H2NCH2C
OCH,
(II)
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27.03.80
Istamycin A
CH2NHCH3
HO—-
OCH,
oder
CH^NHCH,
(IV)
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Bei den Untersuchungen zur chemischen Struktur des Istamycins A hat sich gezeigt, daß diese Verbindung
in wässriger Lösung bei höheren pH-Werten als dem Neutralwert eine Konfiguration annimmt, die der Formel
III entspricht, während sie in wässriger Lösung bei pH-Werten niedriger als der Neutralwert (protonenhaltige
Form) der Formel IV entspricht.
Istamycin B
CH2NHCH3
(V)
OCH,
Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A und Istamycin B lassen sich jeweils in Form der freien Base oder
als Hydrat oder Carbonat derselben erhalten; die Verbindungen können in pharmazeutisch akzeptable Säureanlagerungssalze
umgewandelt werden, indem man sie in bekannter Weise mit einer pharmazeutisch akzeptablen
Säure umsetzt. Die pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze des Istamycins lassen sich so beispielsweise
durch Umsetzen mit einer anorganischen Säure wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure,
Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, SuIfonsäure u.a. oder mit einer organischen Säure wie
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Essigsäure, Apfelsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Methaneulfonsäure u.a. gewinnen.
In den beigefügten Zeichnungen entsprechen die dargestellten Kurven den Infrarot-Absorptionsspektren von
Proben der Hemicarbonate - in Kaliumbromid-Tablettevon
Figur 1 Istamycin A,
Figur 2 Istamycin B, Figur 3 Istamycin AQ und
Figur 4 Istamycin BQ.
Istamycin A und Istamycin B gemäß vorliegender Erfindung zeigen eine starke antibakterielle Wirkung gegen
eine große Zahl gram-äegativer und gram-positiver Bakterien, was deutlich aus den Wirkungsspektren der
Substanzen in der folgenden Tabelle 1 hervorgeht. Istamycin A und Istamycin B inhibieren sowohl das
Wachstum von gram-negativen als auch gram-positiven Bakterien. Die Mindesihemmkonzentrationen (mcg/ml)
von Istamycin A und Istamycin B gegen verschiedene Bakterien wurden nach der seriellen Standard-Verdünnungsmethode
an Nähragarplatten bestimmt, die bei einer Temperatur von 37°C 17 Stunden bebrütet wurden.
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Test-Mikroorganismus
Mindesthemmkonzentration (mcg/ml)
Istamycin A Istamycin B
Staphylococcus aureus 209P | 1,56 | 0,78 |
" " Smith | 0,39 | < 0/10 |
" " ApOl | 1,56 | 1,56 |
Staphylococcus epidermidis 109 | 1,56 | 1,56 . |
Micrococcus flavus FDA 16 | 25 | 6,25 |
Sarcina lutea PCI 1001 | 1,56 | 3,13 |
Bacillus anthracis | 0,78 | < 0,10 |
Bacillu subtilis PCI 219 | 0,39 | < 0,10 |
" » NRRLB-558 | 1,56 | < 0,10 |
Bacillus cereus ATCC 10702 | 6,25 | 3,13 |
Corynebacterium bovis 1810 | 3,13 | 1,56 |
Mycobacterium smeRmatis ATCC 607 | 1,56 | 0,78 |
Escherichia coli NIHJ | 3,13 | 1,56 |
« it κ-12 | 3,13 | 1,56 |
11 " K-12 R5 | 6,25 | 6,25 |
" " K-12 R388 | 3,13 | 1,56 |
" " K-12 J5R11-2 | 3,13 | 1,56 |
" " K-12 ML1629 | 3,13 | 3,13 |
11 " K-12 ML163O | 6,25 | 3,13 |
» " K-12 ML1410 | 12,5 | 3,13 |
« » K-12 ML1410 R81 | 6,25 | 3,13 |
» « K-12 LA290 R55 | 6,25 | 3,13 |
" " K-12 LA290 R56 | 3,13 | 1,56 |
030046/0637
. 9A 30120U
- W- Z" 27.03.80
Fortsetzung Tabelle 1
Escherichia coil K-12 LA29O R64
" " W677
" N JR66/W677 " " K-12 C600 R135
» " JR225 Klebsiella pneumoniae PCI602
« » 22#3038 Shigella dysenteriae JS1191O
Shigella flexneri 4B JS11811 Shigella sonnei JS11756
Salmonella typhi T-63
Salmonella enteritidis 1891 Proteus vulgaris 0X19
Proteus rettgeri GN311 " " GN466 Serratia marcescens Serratia SOU '
Salmonella enteritidis 1891 Proteus vulgaris 0X19
Proteus rettgeri GN311 " " GN466 Serratia marcescens Serratia SOU '
Serratia 4
Providenciä Pvl6
Provldencia 2991
Pseudomonas aeruginosa A3 ' » " No. 12 ;
Providenciä Pvl6
Provldencia 2991
Pseudomonas aeruginosa A3 ' » " No. 12 ;
3,13 | 1,56 |
3,13 | 1,56 |
6,25 | 6,25 |
50 | 25 |
3,13 | 1,56 |
6,25 | 3,13 |
12,5 | 12,5 |
12,5 | 6,25 |
12,5 | 12,5 |
12,5 | 12,5 |
1,56 | 12,5 |
3,13 | 3,13 |
1,56 | 0,78 |
25 | 12,5 |
6,25 | 6,25 |
25 | 12,5 |
50 | >25 |
50 | >25 |
50 | 12,5 |
50 | 25 |
50 | 12,5 |
50 | >25 |
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/ f7 30120H
- Λβί- 4/· 27.03.80
Die antibakterielle Wirkung von Istamycin A und Istamycin BQ wurde in derselben Weise nach derselben
Standard-Verdünnungsmethode an Nähragarplatten wie für Istamycin A und Istamycin B angegeben bestimmt.
Istamycin AQ und Istamycin BQ zeigen nur eine geringe
Wirkung. Es hat sich gezeigt, daß die antibakterielle Wirkung von Istamycin A0 nur etwa i/200stel von
Istamycin A und die antibakterielle Wirkung von Istamycin BQ nur etwa i/200stel der Wirkung von
Istamycin B betragen, wenn man als Test-Mikroorganismus Bacillus subtilis verwendet.
Mäuse vertrugen die intravenöse Verabreichung von 100 mg//Ug Istamycin A, Istamycin B, Istamycin AQ
oder Istamycin B .
Im Hinblick auf die vorstehend genannten Eigenschaften von Istamycin A und Istamycin B kann gesagt werden,
daß Istamycin A und Istamycin B in einigen Punkten dem Fortimicin A (R.Okachi et al, Journal of Antibiotics
Bd. 30, Seite 541 (1977) und Sporaricin
(T.Deushi et al, Journal of Antibiotics, Bd. 32, Seite 173 (1979)) ähnlich sind. Unzweifelhaft unterscheiden
sich Istamycin A und Istamycin B aber von den bekannten Antibiotika durch die Tatsache, daß sie keine
C-Methylgruppe, sondern vielmehr zwei N-Methylgruppen
im Molekül enthalten; die Istamycine A und B und ebenso die Istamycine AQ und BQ müssen daher als neue Antibiotika
angesehen werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, wie eingangs bereits gesagt, ein Verfahren zur Herstellung des
Istamycin-Komplexes, welches darin besteht, daß man einen Istamycin erzeugenden Stamm von Streptomyces unter
aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium züchtet,
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welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält.
Die Züchtung wird solange fortgesetzt, bis sich in dem Kulturmedium eine ausreichende Menge an Istamycin
gebildet und angesammelt hat. Der so gebildete Istamycin-Komplex wird dann aus der Kulturbrühe abgetrennt.
Als Istamycin-Komplex wird, worauf ebenfalls eingangs
bereits hingewiesen wurde, eine Mischung aus zwei, drei oder vier der Istamycine A, B, A und B verstanden.
In einer bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Istamycin
A, wobei ein Istamycin A erzeugender Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff-
und Stickstofffluellen enthaltenden Kulturmedium gezüchtet wird. Weitere bevorzugte Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Verfahrens dienen zur Erzeugung von Istamycin B, Istamycin AQ und Istamycin BQ jeweils
unter Verwendung entsprechender Istamycin B, Istamycin AQ bzw. Istamycin B0 erzeugender Stämme von Streptomyces.
Die Züchtungsbedingungen entsprechen jeweils den angegebenen. Nach Ansammlung einer entsprechenden
Menge des jeweiligen Mikroorganismus in der Kulturbrühe kann derselbe aus der Kulturbrühe isoliert und
gegebenenfalls gereinigt werden. Die jeweiligen Istamyeine lassen sich aber auch als Rohprodukte in Lösung
oder als feste Substanzen allein oder in Mischung untereinander gewinnen.
Ein Beispiel für einen Istamycin erzeugenden Stamm ist der bereits erwähnte Stamm von Actinomycetes, der
von den Erfindern aus einer Bodenprobe isoliert worden ist, die vom Seeboden der Küste der Halbinsel Miura
in Kanagawa Prefecture, Japan im August 1978 entnommen worden ist; der Stamm hat die Bezeichnung SS-939 erhalten.
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27.03.80 30 120 U
Dieser Stamm SS-939 weist folgende mikrobiologische Eigenschaften auf.
(a) Mikroskopische Morphologie
Bei gutem Wachstum in Agarmedium erzeugt das Mycel von SS-939 monopodiale Verzweigungen. Gerade oder
wenig gebogene Lufthyphen entwickeln sich vom Bodenmycel. Die reifen Lufthyphen tragen an den Spitzen
eine Kette mit 10 bis 50 Sporen. Die Gestalt der Sporen ist zylindrisch (1 Mikron breit und 4 bis 5
Mikron lang). Spiralige oder quirlförmige Verzweigungen wurden nicht beobachtet. Unter dem Elektronenmikroskop
erkennt man, daß die Oberfläche der Sporen glatt ist und keine flusige oder haarige Struktur aufweist.
Geißeln und Sporangien wurden nicht beobachtet. Der Stamm SS-939 ist folglich ein typischer Stamm von
Streptomyces.
(b) ZUchtungseigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien
(1) Auf Saccharose-Nitrat-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): schwaches farbloses Wachstum mit Lufthyphen,
welches zunächst weiß ist und sich allmählich in grau mit Blaustich verändert (17 ec, wasserblau, gemäß den
Farbangaben in dem "Color Harmony Manual", veröffentlicht von der Container Corporation of America; soweit
nichts anderes angegeben ist, beziehen sich die im Folgenden benutzten Farbbezeichnungen ebenfalls auf
dieses Standardwerk). Diffundierendes Pigment wird in dem Inkubations-Medium nicht in merklicher Menge
gebildet.
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30120Η
27.03.80
(2) Auf Glycerin-Asparagin-Agar-Medium (bebrütet
bei 27°C): die Ergebnisse sind im wesentlichen die gleichen wie bei Sacoharose-Nitrat-Agar-Medium unter
(1) angegeben, Jedoch werden kaum Lufthyphen erzeugt.
(3) Auf Stärke-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C):
im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie bei Saccharose-Nitrat-Agar-Medium unter (1); Lufthyphen
werden erzeugt. Die Stärke am Rand des Wachstums wird durchsichtig.
(4) Auf Tyrosin-Agar-Medium (bebrütet bei 370C):
die Kultureigenschaften sind im wesentlichen dieselben wie auf den Medien gemäß (1) und (2), jedoch wird ein
Melanoidpigment erzeugt.
(5) Auf Nähr-Agar-Medium (bebrütet bei 270C):
farbloses Wachstum, auf dem sich weißfarbene Lufthyphen bilden. Das Inkubationsmedium hat einen dunkelbraunen
Farbton.
(6) Auf Hefeextrakt-Ma lzextrakt-Medium (bebrütet bei 27°C): farbloses Wachstum mit Lufthyphen.
Die Lufthyphen sind weiß und bekommen allmählich eine graue Farbe mit blaugrünem Stich (19 de, wassergrün).
Das Medium wird dunkelbraun.
(7) Auf Hafermehl-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C):
farbloses Wachstum mit Lufthyphen, die eine weiße bis blaugraue Farbe aufweisen (17 ec, wasserblau).
(c) Physiologische Eigenschaften
(1) Temperatur für das Wachstum: Wachstum bei 20
bis 410C.
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^ ,, 30120H
- zy- Lb. 27.03.80
(2) Hydrolyse von Stärke: Stärke wird in Stärke-Agar-Medium
hydrolysiert.
(3) Koagulierung und Peptonisierung von Magermilch: im wesentlichen negativ.
(4) Bildung von Melanoid-Pigment: positiv auf
Tyrosin-Agar-Medium und auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium.
(d) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen für das Wachstum
(bestimmt in Pridham-Gottlieb-Medium)
Glukose und Inosit werden verwendet.
Arabinose, D-Xylose, Saccharose, Rhamnose, Raffinose
und D-Mannitol werden nicht ausgenutzt. Die Verwendung von D-Fructose ist zweifelhaft.
Faßt man die vorstehend angegebenen Charakteristika des Stammes SS-939 zusammen, so erkennt man, daß dieser
Stamm zur Gattung Streptomyces gehört und durch das Fehlen von Spiralen an den Lufthyphen und durch seine
Chromogenizität charakterisiert ist. Auf der Basis der
vorstehend genannten Eigenschaften kann der Stamm SS-939 mit bekannten Streptomycesarten verglichen werden,
wobei Bezug genommen wird auf die Beschreibungen in "International Streptomyces Project (ISP) und Bergeyfs
Determinative Bacteriology", 1974. Die charakteristischen Eigenschaften des Stammes SS-939 erinnern stark an
Streptomyces viridochromogenes. Der Stamm SS-939 unterscheidet sich jedoch von S. viridochromogenes insoweit,
daß SS-939 weder Spiralen produziert, noch Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fructose, Raffinose noch Mannitol
ausnutzt. Weitere Unterschiede bestehen in der Richtung, daß die Oberfläche der von dem Stamm SS-939 produzierten
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27.03.80
Sporen nicht flusig ist. Als nächstes hat Streptomyces
viridifaciens keine Chromogenizität und erzeugt Lufthyphen
in einer Farbe, die der des Stammes SS-939 ähnlich ist. Sie sind jedoch voneinander dadurch
unterscheidbar, daß der Stamm SS-939 weder Spiralen an den Lufthyphen produziert noch Fructose und Saccharose
als Kohlenstoffquellen für das Wachstum ausnutzt. Im übrigen gibt es keine bekannten Streptomycesarten,
die die Eigenschaft der Ausnutzung von Kohlenstoffquellen aufweisen, wie sie dem Stamm SS-939 eigen ist.
Der Stamm SS-939 unterscheidet sich folglich von den bekannten Stämmen soweit, daß er als eine neue Art zu
bezeichnen ist und folglich als Streptomyces tenjimariensis bezeichnet worden ist.
Der Stamm Streptomyces tenjimariensis SS-939 wurde bei
der öffentlichen japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute", Agency of Industrial
Science and Technology, Tsukuba-gun, Ibaragi Prefecture, Japan unter der Hinterlegungs-Nummer FERM-P 4932 am
21.April 1979 und ebenso bei der American Type Culture
Collection, Washington, D.C, U.S.A. unter der ATCC-Nummer 31603 hinterlegt.
Mutationen treten bei Actinomyceten häufig sowohl spontan als auch durch künstliche Beeinflussung auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft folglich die Verwendung des Stammes SS-939 auch in all dessen Varianten
und Mutanten, so lange diese Istamycin erzeugen.
Istamycin kann durch aerobe Züchtung von Sporen oder Mycel von Istamycin erzeugenden Stämmen von Streptomyces,
beispielsweise Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932 oder ATCC Nummer 31 603) gewonnen werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
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27.03.80
zur Erzeugung von Istamycin wird folglich eine bestimmte
Menge an Sporen oder Mycel eines Istamycin erzeugenden Stammes in ein geeignetes Kulturmedium
eingeimpft. Dieses Kulturmedium muß entsprechende Nährstoffquellen enthalten, die für den Stamm assimilierbar
sind. Das geimpfte Nährmedium wird dann unter aeroben Bedingungen bebrütet, bis sich in der Kulturbrühe
Istamycin, d.h. wenigstens eine der Substanzen Istamycin A, B, AQ oder BQ angesammelt hat. Nährstoffe
in dem Kulturmedium können alle üblicherweise für die Züchtung von Actinomyceten verwendeten Substanzen sein.
Geeignet sind beispielsweise im Handel erhältliches Sojabohnenmehl, Erdnußpulver, Baumwollsamenmehl, getrocknete
Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Casein, Maisweichwasser, Natriumnitrat, Ammoniumsulfat u.a. als
Stickstoffquellen. Die im Handel erhältlichen Kohlehydrate wie Saccharose, Stärke, Glycerin, Maltose, Dextrin,
Glukose, Lactose u.a. sowie Sojabohnenöl und Fette sind
als Kohlenstoffquellen geeignet. Gegebenenfalls können
der Kulturbrühe anorganische Salze wie Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid und
Phosphate sowie verschiedene Aminosäuren zugesetzt werden. Alle Nährstoffe, die für die Züchtung von
Actinomyceten bekannt sind, können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, solange sie von dem
Istamycin erzeugenden Stamm assimiliert werden können.
Für die Produktion von Istamycin in großem Maßstab eignet sich insbesondere die Züchtung in flüssigem Medium. Die
Züchtung kann bei beliebigen Temperaturen, bei welchen der Istamycin erzeugende Stamm zu wachsen und Istamycin
zu produzieren vermag, durchgeführt werden, vorzugsweise arbeitet man bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis
30°C. Die Züchtung wird im allgemeinen solange fortgesetzt, bis sich eine ausreichende Menge Istamycin in
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dem Kulturmedium angesammelt hat; dies erfordert im allgemeinen 2 bis 7 Tage.
Die Prüfung von Istamycin A und Istamycin B kann unter Verwendung von Bazillus subtilis PCI 219 als Test-Organismus
durchgeführt werden. Man arbeitet nach der Standard-Deckelplattenmethode, die au<5h üblicherweise
zur Prüfung bekannter Antibiotika angewendet wird. Eine reine Probe von Istamycin A, welches gemäß dem im Folgenden
beschriebenen Beispiel 3 erhalten worden ist, kann als authentisches Produkt verwendet werden, welches
eine Potenz von 1000 meg (Einheiten) pro mg aufweist. Eine reine Probe von Istamycin B, die ebenfalls gemäß
folgendem Beispiel 3 erhalten worden ist, zeigt eine Potenz von 3170 meg (Einheiten)/mg.
Die Prüfung von Istamycin A0 und Istamycin B kann
ebenfalls mit Bacillus subtilis PCI 219 als Test-Organismus unter Verwendung der Standard-Deckelplattenmethode
durchgeführt werden. Eine reine Probe von Istamycin A , welche gemäß der Erfindung erhalten
worden ist, weist eine Potenz von 5 meg (Einheiten)/mg und eine reine Probe von Istamycin B eine Potenz von
10 meg (Einheiten)/mg auf, wobei als Vergleich angesetzt ist, daß die reine authentische Probe von Istamycin
A eine Potenz von 1000 meg (Einheiten)/mg aufweist.
Istamycin A, Istamycin B, Istamycin AQ und Istamycin
B sowie ihre Säureanlagerungssalze sind leicht löslich in Wasser. Der Istamycin-Komplex ist in der Kulturbrühe
im wesentlichen in der flüssigen Phase der Lösung enthalten. Istamycine A und B sowie die Istamycine AQ
und B lassen sich aus wässriger Lösung mit organischen Lösungsmitteln wie Butanol, Butylacetat, Chloroform oder
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anderen mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln praktisch nicht extrahieren, so daß diese organischen
Lösungsmittel gut dazu verwendet werden können, um erforderlichenfalls Verunreinigungen aus der Kulturbrühe
zu extrahieren. Für die Abtrennung des Istamycin-Komplexes aus der Kulturbrühe oder aus einer wässrigen
Lösung kann die Kulturbrühe oder die wässrige Lösung mit verschiedenen Adsorbentien behandelt werden, an
denen sich das Istamycin anlagert. Verwendet man Aktivkohle als Adsorbenz, so kann das von dieser adsorbierte
Istamycin durch Behandlung mit schwach angesäuertem Wasser, schwach angesäuertem wässrigen Methanol, schwach
angesäuertem wässrigen Propanol, schwach angesäuertem wässrigen Aceton u.a. wieder extrahiert werden.
Istamycin wird infolge seiner Basizität in wirksamer Weise von Kationenaustauscherharzen adsorbiert, von
welchen es mittels geeigneter Lösungsmittel wieder eluiert werden kann. Die Adsorption an einem Kationenaustauscherharz
ist der gangbarste und geeignetste Weg zur Abtrennung von Istamycin aus einer großen Menge
Kulturbrühe. Die Kationenaustauscher, die für diesen Zweck geeignet und erhältlich sind, können beispielsweise
die folgenden sein: Kationenaustauscherharze mit Carboxylfunktionen wie Amberlite IRC-50 ^ und Amber-
lite CG-50® (Produkte der Firma Rohm & Haas Co., USA), Lewatit CNP © (ein Produkt der Firma Bayer,
West-Deutschland), CM-Sephadex^ (ein Produkt der Firma Pharmacia Co., Schweden), und zwar sowohl in
ihren Η-Formen, Na-Formen und/oder NH^-Formen. Das
Istamycin, welches an dem Kationenaustauscherharz
adsorbiert ist, kann wieder eluiert werden, indem man mit angesäuertem Wasser, verdünntem wässrigem Ammoniak
oder einer wässrigen Lösung eines anorganischen Salzes behandelt. Für die genannte Eluierung eignen sich am
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besten 0,2n bis 1n Chlorwasserstoffsäure und 0,2n bis
1n wässriges Ammoniak. Da Istamycin A und Istamycin B ebenso wie Istamycin A0 und Istamycin B0 an Anionenaustauscherharzen
praktisch nicht adsorbiert werden, können Anionenaustauscherharze zum Neutralisieren der
wässrigen sauren Lösung von Istamycin oder zur Entfernung von sauren Verunreinigungen aus der Istamycinlösung
verwendet werden.
Um Istamycin A, Istamycin B, Istamycin AQ oder Istamyein
B getrennt aus dem so gewonnenen Istamycin-Komplex
zu erhalten, wird der Istamycin-Komplex einer Säulenchromatographie
an Silikagel unterworfen, wobei zum Entwickeln die untere Phase eines Lösungsmittelgemisches
aus Chloroform-Methanol-17%igem wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) oder andere analoge Lösungsmittelgemische
verwendet werden. Die Trennung ist möglich aufgrund der Tatsache, daß die vier Istamycine bei der
Dünnschichtchromatographie an Silikagel bei der Entwicklung mit der unteren Phase des Lösungsmittelgemisches
aus Chloroform-Methanol-17%igem wässrigen Ammoniak (2:1:1) Einzelflecken ergeben,und zwar das Istamycin A
einen Einzelfleck bei Rf 0,17, das Istamycin B einen
Einzelfleck bei Rf 0,11, das Istamycin A einen Einzelfleck bei Rf 0,36 und das Istamycin BQ einen Einzelfleck
bei Rf 0,14. Auf diese Weise sind die vier Istamycine voneinander trennbar. Um Istamycin A von Istamycin B zu
trennen kann eine Mischung dieser beiden Istamycine der chromatographischen Trennung an einer Cellulosekolonne
unterworfen werden, die mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis
6:4:2:4) oder einem analogen Lösungsmittelgemisch
entwickelt wird. Dies ist möglich aufgrund der Tatsache, daß bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose bei
Entwicklung mit dem genannten Lösungsmittelgemisch aus
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n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:2:4) Istamycin
A einen Einzelfleck bei Rf 0,22, Istamycin dagegen einen Einzelfleck bei Rf 0,25 ergibt. Die Prozeduren der
chromatographischen Trennung lassen sich infolgedessen für die Gewinnung der Istamycine ebenso wie für die
Reinigung von isoliertem Istamycin verwenden. Istamycin A, B, AQ oder BQ läßt sich in gereinigtem Zustand isolieren,
wenn man sowohl die beschriebenen Extraktionsmethoden als auch die chromatographische Isolierung in
kombinierter Form gegebenenfalls mehrfach wiederholt
anwendet.
Für die Abtrennung des Istamycin-Komplexes und für die Isolierung und Reinigung der einzelnen Istamycine wird
die folgende Prozedur bevorzugt:
Die Kulturbrühe des Istamycin erzeugenden Stammes wird durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert
von 2,0 eingestellt und anschließend filtriert. Man erhält so ein Brühenfiltrat, welches anschließend über eine
Kolonne mit einem Kationenaustauscherharz, z.B. Amber-
lite IRC-50<S)(NH^-Zyklus)geleitet, so daß das Istamycin
von dem Harz adsorbiert wird. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen und mit 1n wässrigem Ammoniak eluiert.
Die aktiven Fraktionen des Eluates werden vereinigt und
unter vermindertem Druck eingeengt, so daß man eine konzentrierte Lösung erhält, die dann über eine Kolonnemit
einem Kationenaustauscherharz, z.B. Amberlite CG-50^
geleitet wird. Das Istamycin wird an dem genannten Harz adsorbiert. Das Harz wird mit Wasser gewaschen und mit
0,2n wässrigem Ammoniak und danach mit 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert.
Mehrere aktive Fraktionen, die eine nennenswerte Menge an Istamycin B enthalten, werden vereinigt und im Vakuum
zur Trockne eingeengt. Man erhält so ein pulverförmiges
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Rohprodukt, welches Istamycin B darstellt. Dieses Rohprodukt
wird mehrfach der Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen, wodurch man Istamycin B in gereinigter
Form als farbloses Pulver gewinnt.
Mehrere aktive Fraktionen, die eine nennenswerte Menge an Istamycin A sowie Mengen an Istamycin AQ und BQ
enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhält so ein pulverförmiges Rohprodukt,
welches aus den Istamycinen A, A und B besteht. Dieses
pulverförmige Rohprodukt wird der Säulenchromatographie
an Silikagel unterworfen; die Kolonne wird mit der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5%igem
wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) entwickelt.
Die aktiven Fraktionen des Eluates, die allein Istamycin A enthalten, werden vereinigt und im Vakuum eingeengt.
Die so gewonnene konzentrierte Lösung wird über eine Kolonne mit einem Kationenaustauscherharz, z.B. Amberlite
CG-50® (NH^-Zyklus) geleitet; die Kolonne wird mit
0,5n wässrigem Ammoniak eluiert. Die so eluierten aktiven Fraktionen, die nur Istamycin A enthalten, werden vereinigt
und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhält auf diese Weise reines Istamycin A als farbloses
kristallines Pulver.
Die aktiven Fraktionen des Eluates der durchgeführten Säulenchromatographie, die Istamycin A enthalten, werden
ebenfalls vereinigt und im Vakuum eingeengt. Die so gewonnene konzentrierte Lösung wird wiederum der Säulenchromatographie
an Silikagel unterworfen, wobei die aktiven Fraktionen, die ausschließlich Istamycin A enthalten,
vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt werden. Man erhält so reines Istamycin A als farbloses
Pulver. Die aktiven Fraktionen der beschriebenen Säulen-
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Chromatographie an Silikagel schließlich, die nur Istamycin BQ enthalten, werden vereinigt und im Vakuum
eingeengt. Die entstandene konzentrierte Lösung wird wiederum der Säulenchromatographie an einem Kationenaustauscherharz
wie Amberlite CG-50^(NH^-Zyklus)
unterworfen, wobei zum Entwickeln 0,5n wässriges Ammoniak verwendet wird. Die Fraktionen des Eluates, die
allein Istamycin B0 enthalten, werden vereinigt und
im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhält auf diese Weise gereinigtes Istamycin BQ in Form eines farblosen
kristallinen Pulvers.
Aus den Strukturuntersuchungen an Istamycin A, B, AQ.
und BQ konnte geschlossen werden, daß Istamycin AQ ein
Deglycylderivat des Istamycin A und das Istamycin BQ ein Deglycylderivat des Istamycin B ist (vergleiche die
Formeln I und II mit den Formeln III, IV und V). Istamycin AQ und Istamycin BQ können infolgedessen in
Istamycin A bzw. Istamycin B umgewandelt werden, indem man in an sich bekannter Weise ein Glycinmolekül mit
der Iminogruppe, die in der Methylaminogruppe in 4-Stellung des Istamycin AQ bzw. Istamycin BQ vorhanden
ist, kondensiert. Diese Umwandlung stellt eine wertvolle Reaktion dar, weil Istamycin A und Istamycin B
eine höhere antibakterielle Aktivität aufweisen und stärker wirksame chemotherapeutische Mittel sind als
Istamycin A0 und Istamycin BQ.
Weiterhin konnte gefunden werden, daß Istamycin A und
Istamycin BQ gebildet werden, wenn man Istamycin A bzw.
Istamycin B unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert. Zum Gegenstand der Erfindung gehört infolgedessen auch
ein Verfahren zur Herstellung von Istamycin A aus Istamycin A bzw. Istamycin B aus Istamycin B, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß man Istamycin A oder
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27.O3.8O30120U
Istamycin B in wässriger Lösung unter alkalischen Bedingungen zu Istamycin A bzw. Istamycin B hydrolyliert.
Diese alkalische Hydrolyse von Istamycin A oder Istamycin B kann bei Temperaturen von 50 bis 1100C in
wässriger Lösung in Gegenwart von Alkalien wie Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxiden oder -carbonaten,
beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Bariumhydroxid u.a. durchgeführt werden. Das Alkalimetallhydroxid
oder die andere alkalische Verbindung kann in einer Konzentration von 0,1 bis 4m vorhanden
sein. Die Hydrolyse ist im allgemeinen in 1 bis 3 Stunden abgeschlossen. Die Hydrolyse von Istamycin A oder
Istamycin B kann vorzugsweise so durchgeführt werden, daß man die Verbindungen in Wasser, welches 4m Natriumhydroxid
enthält, eine Stunde auf 100°C erhitzt, Die Umsetzung kann auch in Wasser durchgeführt werden,
welches 0,5m Bariumhydroxid enthält; man erhitzt dann drei Stunden auf 1000C. Unter diesen Reaktionsbedingungen
kommt es nicht zu einem Aufbrechen der Glycosidbindungen des Istamycin A0 oder Istamycin B . Die alkalische Hydrolyse
kann auch in der Kulturbrühe oder dem Brühenfiltrat,
welches Istamycin A oder Istamycin B enthält, durchgeführt werden.
Das Istamycin A und Istamycin B gemäß vorliegender Erfindung zeichnen sich durch hohe bakterielle Wirkung
und eine niedrige Toxizität für Tiere aus. Istamycin A und B sind infolgedessen ebenso wie die bekannten Antibiotika
wertvolle antibakterielle Mittel und können in entsprechenden pharmazeutischen Verabreichungsformen
als solche Verwendung finden. Die Erfindung umfaßt daher auch pharmazeutische Mittel bzw. Arzneimittel, die eine
ausreichende Menge an wenigstens einer der Substanzen Istamycin A, Istamycin B und/oder einem Säureanlagerungssalz
dieser Verbindungen in Kombination mit einem phar-
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mazeutisch akzeptablen Trägermaterial enthalten.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen Istamycin A, Istamycin B
und/oder der Säureanlagerungssalze dieser Verbindungen in ausreichender Menge zur Unterdrückung und Bekämpfung
von Bakterienwachstum bei Tieren. Dabei muß in Betracht gezogen werden, daß die im Einzelfall zu verwendenden
Mengen an Istamycin je nach Art der Anwendung und dem betroffenen Organismus schwanken können. Viele Faktoren
können dabei eine Rolle spielen und die zu verwendende Menge des Arzneimittels beeinflussen. Solche Faktoren
sind beispielsweise das Alter, das Körpergewicht, das Geschlecht, mögliche Diäten, die Zeit der Verabreichung,
das Ausmaß der Ausscheidung, Kombinationen mit anderen Arzneimitteln, mögliche Sensibilitäten sowie die Schwere
des Falles. Optimale Mengen müssen von Fall zu Fall vom Fachmann festgesetzt werden.
Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932,
ATCC Nummer 31603) ist, wie weiter vorn bereits ausgeführt,
ein neuer Mikroorganismus, der ein neues Antibiotikum,
nämlich Istamycin, erzeugt und die weiter vorn aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften aufweist. Zum
Gegenstand der Erfindung gehört schließlich dieser neue Mikroorganismus Streptomyces tenjimariensis SS-939
in reiner · isolierter Form, der bei öffentlichen Hinterlegungsstellen als FERM-P 4932 bzw. ATCC 31603 hinterlegt
ist und durch folgende charakteristische Merkmale gekennzeichnet ist:
Produktion von Lufthyphen mit weißer Farbe, die sich allmählich ingrau mit blaugrünem Stich ändert, das Fehlen von Spiralen an den Lufthyphen, glatte Oberfläche der Sporen, Chromogenizität, Ausnutzung von Glucose und Inosit, jedoch Nicht-Verwendung von Arabinose, D-Xylose,
Produktion von Lufthyphen mit weißer Farbe, die sich allmählich ingrau mit blaugrünem Stich ändert, das Fehlen von Spiralen an den Lufthyphen, glatte Oberfläche der Sporen, Chromogenizität, Ausnutzung von Glucose und Inosit, jedoch Nicht-Verwendung von Arabinose, D-Xylose,
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Saccharose, Rhamnose, Raffinose und D-Mannitol als
Kohlenstoffquellen sowie Fähigkeit zur Bildung der Istamycine A, B, A0 und BQ. Der Stamm SS-939 wurde
isoliert durch Bebrüten einer Bodenprobe, die vom Seeboden der Küste der Halbinsel Miura in Kanagawa
Prefecture, Japan, entnommen worden ist auf einem MY-Kulturmedium, welches 1 % Maltose, 0,4 % Hefeextrakt,
1,5 % Agar (pH 7,2) sowie zusätzlich 10 mcg/ml Kanamycin A enthielt. Die Isolierung erfolgte nach der
Bebrütung auf dem vorstehend genannten Agarmedium bei 270C. während 3 Tagen durch Entnahme des Mycels und
der Sporen einer Kolonie, die sich auf dem genannten MY-Medium gebildet hatte. Das Mycel und die Sporen
wurden auf Platten mit Pridham-Gottlieb-Kulturmedium eingeimpft (das Testmedium diente zur Bestimmung der
Assimilierbarkeit verschiedener Kohlehydrate), von denen jede 1 % Glucose, Xylose, Arabinose, Rhamnose,
Raffinose oder Inosit enthielt. In einem Pridham-Gottlieb-Medium, welches Inosit enthielt, konnte ein
Stamm von S.tenjimariensis gewonnen werden, der die Fähigkeit zum Assimilieren von Inosit besaß.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Eine Schrägbodenkultur von Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932 bzw. ATCC Nummer 31603) wurde in
ein flüssiges Kulturmedium ( je T10 ml in Erlenmeyer-Kolben
mit einem Fassungsvermögen von 500 ml) eingeimpft; das Kulturmedium enthielt 1,0 % Stärke,
0,2 % Glukose, 1,0 % Sojabohnenmehl, 0,3 % Natriumchlorid, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1 %
Magnesiumsulfat . 7 H2O. Die Züchtung und Bebrütung
erfolgte unter Drehung und Schütteln bei 270C im Verlauf
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2 (. 03.8(7
von 48 Stunden. Die nach dieser Zeit vorliegende Saatkultur (220 ml) wurde in einen 30 1-Gärbehälter eingeimpft,
der 15 Liter eines flüssigen Produktionskulturmediums enthielt, welches 2,0 % Stärke, 0,2 % Glukose,
2,0 % Sojabohnenmehl, 0,3 % Natriumchlorid, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat
und 0,1 % Magnesiumsulfat . 7 HpO
aufwies. Die Gärung lief bei 27°C in 72 Stunden unter Belüftung (15 1 Luft pro Minute) und Rühren (300 Umdrehungen
pro Minute) ab.
Die Kulturbrühen aus sechs Gärbehältern wurden vereinigt, durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert
von 2,0 eingestellt und anschließend filtiert. Man erhielt auf diese Weise 90 1 Brühenfiltrat (Potenz 2,5
mcg/ml). Das Brühenfiltrat wurde durch eine Kolonne geleitet, welche 12 1 des Kationenaustauscherharzes
Amberlite IRC-50^ (NH^-Form) enthielt. Das Istamycin
wurde an dem Harz adsorbiert. Das Harz wurde anschliessend mit 24 1 Wasser gewaschen und danach mit 1n wässrigem
Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereinigt (3 1) und im Vakuum zur Trockne
eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 3,51 g eines pulverförmigen Rohproduktes (Potenz 61 mcg/mg).
Dieses pulverförmige Rohprodukt wurde in 100 ml Wasser
gelöst. Die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne mit einem Durchmesser von 40 mm geleitet, welche eine
einem Volumen von 300 ml entsprechende Menge des Anionenaustauscherharzes
Dowex 1-X4^(OH-Form) enthielt;
anschließend wurde die Kolonne mit Wasser entwickelt. Die zunächst ablaufenden Mengen (200 ml) des Eluates
wurden verworfen; die dann ablaufende Menge (880 ml) wurde aufgefangen und über eine andere Kolonne mit einem
Durchmesser von 25 mm geleitet, die eine einem Volumen von 150 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes
Amberlite CG-50^ (NH^-Form) enthielt, an welchem
0300A6/063?
-jr. St. 27.o3.8o 30120U
das Istamycin adsorbiert wurde. Die Kolonne mit dem
Kationenaustauscherharz wurde mit 300 ml Wasser gewaschen und anschließend zunächst mit 900 ml 0,2n
wässrigem Ammoniak und dann mit 900 ml 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen
aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. 66 bis 80 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur
Trockne eingedampft. Man erhielt auf diese Weise 210 mg eines weißen Pulvers (Potenz 460 mcg/mg), welches aus
den Istamycinen A und B bestand. Die Fraktionen Nr.
28 bis 65 wurden in entsprechender Weise aufgearbeitet, wobei man ein pulverförmiges Rohprodukt erhielt, welches
aus einigen nicht idenfizierten Antibiotika, bei denen es sich um andere als die Istamycine A, B, AQ und BQ
handelt, bestand.
Das Brühenfiltrat (150 Liter, gesammelt aus 10 Gärbehältern)
, welches bei der Fermentierung von Streptomyces tenjimariensis in derselben Weise wie in Beispiel 1
beschrieben gewonnen worden war, wurde durch eine Kolonne geleitet, die 20 Liter des Kationenaustauscherharzes
Amberlite IRC-50*·—) (NHL-Form) enthielt, an dem
das Istamycin adsorbiert werden konnte. Nach dem Waschen mit Wasser (40 Liter) wurde die Kolonne mit 1n wässrigem
Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne
eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 4,1 g eines pulverförmigen
Rohproduktes (Potenz 240 mcg/mg).
Dieses pulverförmige Rohprodukt wurde in 20 ml Wasser gelöst. Die so gewonnene wässrige Lösung wurde auf
eine Kolonne mit einem Durchmesser von 30 mm gegeben, die eine einem Volumen von 200 ml entsprechende Menge
des Anionenaustauscherharzes Dowex 1-X4^ (OH-Form)
030046/06 37
„ 30120U
- Ψ<ΰ. 27.03.80
enthielt. Die Kolonne wurde mit Wasser entwickelt. Die zunächst ablaufende Flüssigkeit (270 ml) wurde verworfen.
Die danach ablaufende Flüssigkeit (270 ml) wurde aufgefangen und über eine weitere Kolonne mit einem
Durchmesser von 25 mm geleitet, die eine einem Volumen von 150 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes
Amberlite CG-50 v-' (NH^-Form) zur Adsorption des
Istamycins enthielt. Die Kolonne wurde mit 150 ml Wasser gewaschen und dann zunächst mit 900 ml 0,2n
wässrigem Ammoniak und dann mit 900 ml 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen
aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 55 bis 90 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.
Man erhielt auf diese Weise 980 mg eines weißen Pulvers (Potenz 940 mcg/mg), welches aus den Istamycinen
A und B bestand.
Das gemäß Beispiel 2 erhaltene weiße Pulver (980 mg, Potenz 940 mcg/mg), welches aus den Istamycinen A und B
bestand, wurde in 15 ml einer Mischung aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(Volumenverhältnis 6:4:2:2) aufgenommen. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne
mit einem Durchmesser von 25 mm gegeben, welche 60 g Cellulosepulver (Avicel^—'von der Firma Funakoshi
Yakuhin Co., Japan) zur Adsorption des Istamcins enthielt. Die Cellulosekolonne wurde zunächst mit 1200 ml
des vorstehend angegebenen Lösungsmittelgemisches (Volumenverhältnis 6:4:2:2) und anschließend noch mit
600 ml des Lösungsgemisches aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(jedoch im Volumenverhältnis von 6:4:2:4) entwickelt. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen
aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 45 bis 74 enthielten nur Istamycin B, die Fraktionen Nr. 114 bis 154 enthielten
nur Istamycin A und die Fraktionen Nr. 75 bis
030046/063"?
27.O3.8O30120U
113 enthielten ein Gemisch aus den Istamycinen A und B.
Die Fraktionen Nr. 45 bis 74 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt
ein Pulver, welches in 5 ml Wasser gelöst wurde. Die so gewonnene wässrige Lösung von Istamycin B wurde über
eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 25 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes
Amberlite CG-50^ (NH^-Form) zur Adsorption des Istamycin
B enthielt. Nach dem Waschen mit 25 ml Wasser wurde die Harzkolonne mit 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert. Die
aktiven Fraktionen (insgesamt 40 ml) des Eluates wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt; man
erhielt so 15,3 mg reines pulverförmiges Istamycin B (Potenz 3170 mcg/mg).
Die Fraktionen Nr. 114 bis 154 wurden ebenfalls vereinigt
und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhielt auf diese Weise ein Pulver, welches
in 5 ml Wasser gelöst wurde. Die Lösung von Istamycin A in Wasser, die so erhalten worden war, wurde durch eine
Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 25 ml entsprechende
Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50^--' (NH^-Form) zur Adsorption von Istamycin A enthielt.
Nach dem Waschen mit 25 ml Wasser wurde die Kolonne mit 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven
Fraktionen (insgesamt 45 ml) des Eluates wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt
auf diese Weise 50 mg reines pulverförmiges Istamycin A (Potenz 1000 mcg/mg).
Eine Agar-Schrägbodenkultur von Streptomyces tenjimariensis
SS-939 (FERM-P 4932; ATCC Nr. 31603) wurde in je 110 ml eines flüssigen Kulturmediums eingeimpft,
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27.03.8C
welches sich in Erlenmeyer-Kolben mit einen Fassungsvermögen
von 500 ml befand und welches 1,0 % Stärke, 0,2 % Glukose, 1,0 % Sojabohnenmehl, 0,3 % Natriumchlorid,
0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat
. 7 H2O enthielt. Die Züchtung erfolgte
während 48 Stunden bei 270C unter Schütteln und Drehung.
Die so gewonnene Saatkultur (220 ml) wurde in 30 1-Gärbehälter
eingeimpft, die jeweils 15 1 eines flüssigen Produktionskulturmediums enthielten. Das Produktionskulturmedium
hatte einen Gehalt an 2,0 % Stärke, 0,2 % Glukose, 2,0 % Sojabohnenmehl, 0,2 % Natriumpalmitat,
0,3 % Natriumchlorid, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat
und 0,1 % Magnesiumsulfat . 7 H2O. Die Fermentierung
wurde 72 Stunden lang bei 27°C unter Belüftung (15 1 Luft pro Minute) und Bewegung (300 Umdrehungen pro
Minute) durchgeführt.
Die entstandene Kulturbrühe wurde aus den Gärbehältern entnommen, durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf
pH 2,0 eingestellt und filtriert. Man erhielt 150 1 eines Brühenfiltrates mit einer Potenz von 6 mcg/mg.
Dieses Brühenfiltrat wurde durch eine Kolonne geleitet, welche eine einem"Volumen von 12 1 entsprechende Menge
des Kationenaustauscherharzes IRC-50^ (NH^-Form) zur
Adsorption von Istamycin enthielt. Nach dem Waschen mit 24 1 Wasser wurde die Harzkolonne mit 1n wässrigem
Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen (ingesamt 5,6 1) des Eluates wurden vereinigt und unter vermindertem
Druck eingeengt. Die so gewonnene konzentrierte Lösung wurde auf eine Kolonne gegeben, die eine einem
Volumen von 200 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amber lite CG-50^—' (ML.- Form) enthielt.
Nach dem Waschen mit 200 ml Wasser wurde die Harzkolonne noch mit 1200 ml 0,2n wässrigem Ammoniak gewaschen
und dann mit 1200 ml 0,4n wässrigem Ammoniak eluiert.
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- 3//-fe. - - - 3012QH
27.03.80 Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen aufgefangen.
Die Fraktionen Nummer 80 bis 106 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.
Man erhielt auf diese Weise 240 mg rohes pulverförmiges Istamycin B (Potenz 380 mcg/mg). Dieses pulverförmige
Rohprodukt wurde mehrfach der Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen, wobei zur Entwicklung die
untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-8,5!#igem wässrigen Ammoniak (2:1:1) verwendet wurde,
bis reines weißes pulverförmiges Istamycin B mit einer Potenz von 1350 mcg/mg vorlag. Ausbeute 25 mg.
Die Fraktionen Nummer 107 bis 124 wurden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.
Man erhielt auf diese Weise 380 mg eines pulver-
.15 förmigen Rohproduktes (Potenz 180 mcg/mg), welches aus
den Istamycinen A, A und B bestand. Dieses pulverförmige
Rohprodukt wurde der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man eine Kolonne mit 38 g Silikagel
(60^; ein Handelsprodukt der Firma E.Merck Co.,
Deutschland) verwendete. Die Kolonne wurde mit der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5^igem
wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) entwickelt. Das Eluat von der Silikagelkolonne
wurde in 5 ml-Fraktionen aufgefangen.
Die Fraktionen Nr. 54 bis 61 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung
wurde auf eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 3 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes
Amberlite CG-50 ^(NH^-Form) zur Adsorption des Istamycins AQ enthielt. Die Kolonne mit dem Kationenaustauscherharz
wurde mit 0,5n wässrigem Ammoniak eluiert und die aktiven Fraktionen der ablaufenden Flüssigkeit
wurden unter vermindertem Druck zur Trockne einge-
030046/0637
27.03.80
engt. Man erhielt auf diese Weise reines Istamycin A
(Potenz 5 mcg/m
Ausbeute 25 mg.
Ausbeute 25 mg.
ο (Potenz 5 mcg/mg) als farbloses kristallines Pulver.
Die Fraktionen Nr. 65 bis 76 wurden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte
Lösung wurde der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man eine Kolonne mit 10 g Silikagel verwendete.
Zum Entwickeln wurde die untere Phase des Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wässrigen
Ammoniak (2:1:1) verwendet. Der Vorgang diente der Reinigung von Istamycin A. Auf diese Weise konnte reines
Istamycin A mit einer Potenz von 1000 mcg/mg als farbloses pulverförmiges Produkt in einer Menge von 23 mg
erhalten werden.
Die Fraktionen Nr. 77 bis 90 wurden auch vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte
Lösung wurde über eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 3 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes
Amberlite CG-50^ (NH/-Form) zur Adsorption
von Istamycin BQ enthielt. Diese Kolonne wurde mit 0,5n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen
des Eluates wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise reines
Istamycin B mit einer Potenz von 10 mcg/mg als farbloses kristallines Pulver. Ausbeute 18 mg.
Dieses Beispiel und die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Herstellung von Istamycin AQ oder B
aus Istamycin A oder Istamycin B durch alkalische Hydrolyse.
G30CU6/OS37
30120H
27.03.80
Eine Lösung von 20 mg Istamycin A in zwei ml Wasser wurde mit 300 mg Bariumhydroxid (Ba(OH)2.8H2O) vermischt.
Die Mischung wurde 3 Stunden in einem verschlossenen Rohr auf 1000C erhitzt, um die alkalische Hydrolyse
des Istamycins A durchzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch Zugabe von festem Kohlendioxid
neutralisiert und anschließend filtriert. Das Filtrat wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem
Volumen von 3ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50^ (NH^-Form) enthielt.
Die Kolonne wurde mit 0,5n wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden unter vermindertem
Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 16 mg reines Istamycin A als farbloses
kristallines Pulver.
Istamycin B (20 mg) wurde in der eben beschriebenen Weise ebenfalls der alkalischen Hydrolyse unterworfen. Man erhielt
farbloses kristallines pulverförmiges reines Istamycin BQ in einer Menge von 15 mg.
Eine Agar-Schrägbodenkultur von Streptomyces ten^imariensis
SS-939 (FERM-P 4932) wurde in ein flüssiges Kulturmedium (50 1) eingeimpft, welches 1,0 % Stärke,
0,2 % Glukose, 1,0 % Sojabohnenmehl., 0,3 % Natrium-Chlorid,
0,1 % Dikaliumhydrοgenphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat
. 7 H2O (pH 7,0) enthielt. Das beschriebene flüssige Kulturmedium wurde in einem Gärbehälter aus
rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 100 1 gegeben, in dem die Fermentierung dann bei 280C in
24 Stunden unter Belüftung (50 1 Luft pro Minute) und Bewegung (200 Umdrehungen pro Minute) durchgeführt wurde.
Ein Teil (20 1) der so gewonnenen Saatkultur wurde in einen Gärbehälter aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungs-
030046/0637
27.03.80
vermögen von 2 t eingeimpft, welcher 1000 1 eines flüssigen Kulturmediums enthielt, das einen Gehalt von
4,0 % Stärke, 0,4 % Glukose, 5,0 % Weizenkeime, 0,6 %
Calciumcarbonat und 0,3 % Natriumchlorid (pH 7,0) aufwies. Die Fermentierung wurde bei 28°C in 108 Stunden
unter Belüftung (800 1 Luft pro Minute) und Rühren (280 Umdrehungen pro Minute) durchgeführt.
Die so gewonnene Gärbrühe (pH 7,3) wurde durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 eingestellt und
dann filtriert. Das Filtrat wurde durch Zugabe von wässrigem Natriumhydroxid neutralisiert. Man erhielt
auf diese Weise 850 1 Brühenfiltrat (pH 6,2; Potenz 105 mcg/ml). Dieses Brühenfiltrat wurde über eine
Kolonne geleitet, welche eine einem Volumen von 55 entsprechende Menge eines Kationenaustauscherharzes,
und zwar Amberlite IRC-50^-' (NH^-Form), zur Adsorption
von Istamycin enthielt. Nach dem Waschen mit 300 1 Wasser wurde die Kolonne mit 1,1η wässrigem Ammoniak
eluiert. Die zunächst ablaufende Flüssigkeit (38 l) wurde verworfen. Die danach ablaufende Menge (188 l)
wurde aufgefangen und auf ein Volumen von 2,8 1 unter vermindertem Druck eingeengt.
Die so gewonnene konzentrierte Lösung wurde mit 475,2 g Bariumhydroxid (Ba(OHJg.8HgO) vermischt; die Mischung
wurde 3 Stunden bei 1100C zum Rückfluß erhitzt, um so
die alkalische Hydrolyse der Istamycine A und B durchzuführen. Das Reaktionsgemisch wurde neutralisiert
(auf pH 7,2), und zwar durch Zugabe von 1960 ml 2n Schwefelsäure. Anschließend wurde die Mischung filtriert.
Das Filtrat wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 15 1 entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes
Amberlite CG-50 ^(NH^-Form) zur Adsorption von Istamycin enthielt. Nach dem Waschen mit
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/ .,, 30120H
- kf - 7 r ' 27.03.80
45 1 Wasser wurde die Kolonne nacheinander mit wässrigen Lösungen von Ammoniak unterschiedlicher Konzentrationen
- wie nachstehend angegeben - eluiert, wobei das Eluat in 3 1-Fraktionen aufgefangen wurde.
Fraktionen Nr. 1 - 20 mit 60 1 0,1On wässrigem Ammoniak
Fraktionen Nr. 21-40 mit 60 1 0,15n wässrigem Ammoniak
Fraktionen Nr. 41-60 mit 60 1 0,19n wässrigem Ammoniak
Fraktionen Nr. 61-80 mit 60 1 0,26n wässrigem Ammoniak Fraktionen Nr. 81-100 mit 60 1 0,27n wässrigem Ammoniak
Fraktionen Nr.101-120 mit 60 1 0,32n wässrigem Ammoniak
Fraktionen Nr.121-140 mit 60 1 O,35n wässrigem Ammoniak
Fraktionen Nr.141-160 mit 60 1 0,43n wässrigem Ammoniak
Fraktionen Nr.i6i-180 mit 30 1 1,0On wässrigem Ammoniak.
Die Fraktionen Nr. 82-104 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf
diese Weise 38,05 g Istamycin AQ als pulverförmiges Rohprodukt.
Die Fraktionen Nr. 105-134 wurden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.
Hierbei erhielt man 19,19 g Istamycin BQ als pulverförmiges
Rohprodukt.
Das pulverförmige Rohprodukt, welches aus Istamycin AQ
bestand und in einer Menge von 2,0 g gemäß Beispiel 6 erhalten worden war, wurde mit Hilfe der Säulenchromatographie
gereinigt. Es wurde eine Säule mit 180 g Silikagel verwendet, die mit der unteren Phase eines
Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wässrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) entwickelt
wurde. Das Eluat wurde in 25 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. 65 bis 104 wurden vereinigt
und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise reines Istamycin A als farb-
030046/0637
30120H
27.03.80 loses kristallines Pulver. Ausbeute 586 mg.
Das pulverförmige rohe Istamycin BQ (2,0 g), welches
gemäß Beispiel 6 erhalten worden war, wurde ebenfalls durch Säulenchromatographie an Silikagel in der vorstehend
angegebenen Weise gereinigt; die einzige Ausnahme dabei war, daß das Eluat in 23 ml-Fraktionen
aufgefangen wurde. Die aktiven Fraktionen Nr. 73 bis 170 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur
Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise reines
Istamycin B0 als farbloses kristallines Pulver in einer
Menge von 1369 mg.
030046/0637
Claims (19)
- .S.27.03.80Patentansprüche\ 1)/lstamycinkomplex, umfassend Istamycin A der Formel H3CNHNH,(D,H2NCH2CONCH,Istamycin B der FormelNH,(II),H2NCH2CON0CH030046/0837ORIGINAL INSPECTED27.03.8030Ί20ΗIstamycin A der FormelCH2NHCH3
0(III)OCH.oder der FormelCH2NHCH3(IV)OCH,030046/063727.03.803012QHund Istamycin B der Formel
CH2NHCH5(ν)einschließlich der Säureanlagerungssalze derselben. - 2) Verbindung gemäß Anspruch 1, nämlich Istamycin A oder ein Säureanlagerungssalz derselben.
- 3) Verbindung gemäß Anspruch 1, nämlich Istamycin B oder ein Säureanlagerungssalz derselben.
- 4) Verbindung gemäß Anspruch 1, nämlich Istamycin A oder ein Säureanlagerungssalz derselben.
- 5) Verbindung gemäß Anspruch 1, nämlich Istamycin B oder ein Säureanlagerungssalz derselben.
- 6) Verfahren zur Herstellung des als Antibiotikum wirksamen Istamycin-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Istamycin erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, bis sich eine ausreichende Menge Istamycin in demselben angesammelt hat.030046/063727.03.80
- 7) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet; daß man den Istamycin-Komplex aus dem Kulturmedium abtrennt.
- 8) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Istamycin erzeugenden Stamm Streptomyces tenjimariensis SS-939, welcher durch die Hinterlegungsnummern FERM-P 4932 bzw. ATCC 31603 gekennzeichnet ist, verwendet.
- 9) Verfahren zur Herstellung von Istamycin A, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Istamycin A erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, bis sich eine ausreichende Menge an Istamycin A in dem Kulturmedium angesammelt hat.
- 10) Verfahren zur Herstellung von Istamycin B, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Istamycin B erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, bis sich eine ausreichende Menge an Istamycin B in dem Kulturmedium angesammelt hat.
- 11) Verfahren zur Herstellung Istamycin AQ, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Istamycin A erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, bis sich eine ausreichende Menge an Istamycin AQ in dem Kulturmedium angesammelt hat.030046/0637-5 27.03.8030120U
- 12) Verfahren zur Herstellung von Istamycin BQ, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Istamycin B erzeugenden Stamm von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet, bis sich eine ausreichende Menge an Istamycin B in dem Kulturmedium angesammelt hat.
- 13) Verfahren nach den Ansprüchen 9,10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Züchtung den Stamm Streptomyces tenjimariensis SS-939 verwendet.
- 14) Verfahren nach Anspruch 9, 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils Istamycin A, Istamycin B, Istamycin AQ oder Istamycin B aus dem Medium abtrennt.
- 15) Verfahren zur Herstellung von Istamycin A aus Istamycin A, dadurch gekennzeichnet, daß man Istamycin A unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert.
- 16) Verfahren zur Herstellung von Istamycin BQ aus Istamycin B, dadurch gekennzeichnet, daß man Istamycin B unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert.
- 17) Arzneimittel, enthaltend eine antibakteriell wirksame Menge an wenigstens einer der Verbindungen Istamycin A, Istamycin B oder einem pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalz derselben in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial.
- 18) Verwendung des Arzneimittels gemäß Anspruch 17 zur Verhinderung des Bakterienwachstums bei Tieren.030046/0637- 4^ -Jb 27.03.80
- 19) Neuer Mikroorganismus, nämlich Streptomyces tenjimariensis SS-939, gekennzeichnet durch die Hinterlegungsnummern FERM-P 4932 und ATCC Nr. 31603.030046/0637
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