DE2026595A1 - Verfahren zur Herstellung von Antibiotika - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLOPSCH

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 27. Mai 1970 Kl/Re

Takeda Chemical Industries, Ltd.

27, Doshomachl 2-chome, Higashi-ku, Osaka, Japan

Verfahren zur Herstellung von Antibiotika

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika Rifamycin B und O.

Rifamycin B wird durch Züchtung von Streptomyces mediterrane! und Rifamycin 0 durch Oxydation von Rifamycin B unter milden Bedingungen erhalten (P. Sensi et al., Pharmaco Editione Scientifica, 15, 228 (i960)).

Auch Nocardia C-521 kann Rifamycin 0 direkt in einer Kulturbrühe erzeugen (S. Umezawa, japanische Patentanmeldung 15 518/196'β).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Auffindung eines Verfahrens zur Herstellung dieser Antibiotika mit verbesserter Ausbeute in kommerziellem Maßstab. Diese Aufgabe wurde auf Grund folgender Untersuchungsergebnisse gelöst!

1. Ein bestimmter Mikroorganismus, dessen Eigenschaften weiter unten angegeben sind, vermag gleichzeitig Rifamycin B und 0 zu erzeugen;

2. Dieser Mikroorganismus gehört zur Gattung Streptomyces;

3. Wenn dieser Mikroorganismus und seine Mutanten in Gegenwart einer Eisenverbindung gezüchtet werden,

ORIGINAL INSPECTED ·

sammeln sich Rifamycin B und O in viel größerer Menge als bei den bekannten Züchtungsverfahren an» Der oben genannte Mikroorganismus und ein daraus durch Ultraviolettbestrahlung erhaltener Mutant wurden mit Streptomyces B-2847 und Streptomyces B-2847 gelber Mutant, nachfolgend abgekürzt als B-2847 und B-284.7 gelber Mutant, bezeichnet»

Die morphologischen Eigenschaften und die Kultureigenschaften der zwei Mikroorganismen sind nachfolgend aufgeführt« Wenn nichts' anderes erwähnt ist, beziehen sich die Kuli"¹ "Eigenschaften auf Züchtung in herkömmlicher Weise während 14 Tagen'bei 28°C. In der nachfolgenden Beschreibung bedeutet Rdg«, die entsprechende Parbbezeichnung aus Ridgeway "color Standards and Nomenclature".

B-2847

1) (Morphologische Eigenschaften)

Die Sporophoren sind entweder gerade oder gewellt und haben weder Spiralen noch Wirbel» Das Luftmycei bildet auf Glukose-Hefe-Extrakt-Malz-Extrakt-Agarf oder Glycerin-Asparagln-Agar Sclerotien von unterschiedlicher Größe von 4 bis 2OyU₀ Das Konidium ist ellipsenförmig von 0,8 bis 1,1u·1,5 bis 2,3 η mit glatter ebener Oberfläche»

2) Eigenschaften der Kultur;
a) Czapeks-Agar:

Wachstum: reichlich, faltig und erhaben, mit ausgedehnter gezackter Oberfläche an der Wachstumskante. Helles orange-gelb (Rdg„XIl, 17-d) bis tief Chrom (Rdg.III* 17-b)

Luftmycei:gut, weiß

Rückseite:(nachstehend als R bezeichnet) Buff Yellow (Rdg.IV ; 19-d) bis helles orange-gelb (Rdg.m, 17-d) BAD_0RraiNAL

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lösliches Pigment: blasses orange-gelb (Rdg. III, 17-f)

bis Ochraceous-Buff (Rdg.XV₉ IS'-b).

b) Glukose-Czapek-Agar:

Wachstum: stärker gefaltet als auf Czapek-Agar,

die Bildung von Luftmycel, löslichen. Pigment und Farbe oder R sind die gleichen wie auf Czapek-Agar,

c) Glycerin-Czapek-Agar:

Wachstum: reichlich,aber weniger gefaltet als

auf Medium a) oder b), nahezu gleich in den anderen Merkmalen wie Medium a) und b).

d) Glukose-Asparagin-Agar:

Wachstum: gut, helles orange-gelb, dringt in

das Agar ein,

Luftmycel: schlecht bis mäßig, dünn und weiß, R: helles orange-gelb

lösliches Pigment: keins

e) NährbrUhe:

Wachstum: an der Oberfläche kleine Kolonien,

die auf der Oberfläche schwimmen,

Luftmycel: weiß bis Pallid Mouse Gray (Rdg.LI,

lösliches Pigment: keins

f) Nähr-Agar:

Wachstum: schlecht bis mäßig, farblos, Luftmycel: .schlecht, dünn, weiß bis Pallid

Mouse Gray .

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20265?

lösliches Pigment? keins

Rs farblos bis blasses orange-gelb*

g) Glukose-Nahrmediums ■

Wachstum? reichlich,, sich zuerst auf der Oberfläche entwickelnd,, später flocken= bildend,,

Luftmycels schlecht bzw_o schwach^ dünn,, weiß bis

Capucine Buff (Rdg.lII, lj-f)

lösliches Pigments blaßgelb

h) Glukose-Mähr=Agars Wachstum: reichlich» faltig und erhaben_p farblos

bis Mars Yellow (Rdg₀ III, 15-i)

Luftmycel: mäßige dünn und WeIB₁, Rg Mars Vellow,

lösliches Pigments gelblich-braun

i) Glycerin-Nähr-Agari Wachstums reichlich und faltigi Sudan Brown

:. in, i5-fc)_fl

Luftmyeeli schwach bzw, schlecht, w©i@ an den

Wachstumskanten,

lösliches Pigments gelblich-braun

j) Stärke-Agars

Wachstums farblos, mäßig,

Luftmyeels dünn und weiß,

flüssiges Pigments keins_p

R: farblos

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k) ganzes Ei:

Wachstum: mäßig, gefaltet, Deep Chrome (Rdg.IXI,

17-b),

Luftmycel: keins, lösliches Pigment: keins,

1) Hefe-Extrakt-Agar:

Wachstum: reichlich, runzlig,

Luftmycel: dünn, an der Wachsturasgrenze weiß,

R: Mars Yellow,

lösliches Pigment: Mars Yellow bis orange-gelb,

m) Kartoffelstücke:

Wachstum: schlecht bzw. schwach,blaß gelblichbraun bis blaß-braun, Luftmycel: dünn und weiß, flüssiges Pigment: keins,

n) Möhrenstücke:

Wachstum: schwach bis mäßig, keine Veränderung

■in der Möhrenfarbe, Luftmycel: weiß

o) Lackmusmilch (57°C): langsame Peptonisierung ohne

Koagulation lösliches Pigment: rötlich-braun

p) Gelatine (25°C): wird rasch verflüssigt, weißes Luftmycel wird gebildet, lösliches Pigment: gelblich-braun

q) Löffler^fs-Serum O7°C):

Wachstum: dünn, schwach, orange-gelb, schwache

Verflüssigung Luftmycel: keins

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r) Cellulose;

Wachstum: farblos^ allmählich in orange-gelb

übergehend

Luftmydels lueiß, baumwollartig Cellulose; wird nicht zersetzt

s) Calciummaleat-Agars

Wachstum; mäßige blasses orange-gelb_? dringt in

das Agar ein

Luftmycels dünn,, weiß R; blasses orange-gelb bis Ochraceous-Buff

■ (Bdg_e XV, 15'-b) lösliches Pigment? keins oder Chamois (Rdg.XXX, 19"-b),

t) Tyrosin-Agars

Wachstum? mäßig, farblos bis gelb

Luftmycel: schwach, weiß

R; farblos

lösliches Pigments keins

u) Pepton»Agar;

Wachstum; schwach, mäßig

Luftmycel; schwache dünn und weiß

Rs farblos

lösliches Pigment; keins

Physiologische Eigenschaften

a) Optimaler p„-Wert:

etwas Wachstum zwischen p„ 4,0 und 10,0s optimales Wachstum bei einem p„ zwischen 6,0 und 8^0«,

b) Optimale Temperatur;

Wachstum tritt auf . bei Temperaturen von etwa 20° bis 4,5 bei einer optimalen Temperatur von 28 C unter aeroben Bedingungen.

QÖ98SÖ/202? OPtGWAi WSFECTED

c) Stärke-Hydrolyse: keine

d) Beduktion von Nitraten: positiv

e) Chromogenizität: keine

Bei Züchtung auf synthetischen Medien zeigt B-2847 ein Wachstum von Buff Yellow bis zu hellem orange-gelb unter Erzeugung eines löslichen Pigmsnts von blassem orange-gelb bis gelblich-braun. Das Luftmycel ist weiß. Obwohl gelblich-braunes lösliches Pigment auf pro te inlial tigern Medium erzeugt wird, gehört der Mikroorganismus nicht zum chromogenen Typ. Der Mikroorganismus hydrolysiert Stärke nicht, verflüssigt dagegen Gelatin und reduziert Nitrate. Tabelle 1 zeigt die an verschiedenen Kohlenstoffquellen erhaltenen Ergebnisse, ermittelt nach der Methode von Pridham & Gottlieb nach 10 Tagen bei 28°C.

	■ι	+	Tabelle	1	D-Galaetose	4.	bis
Erythrit	+		D-Glucose		h
Adonit	++	-	D-Fructose	+-I	μ+
D-Sorbit		-	Rhamnose	+H	l·
i-Inosit		■++	Melibiose	•H
D-Mannit	-H	bis ++	Maltose		H-
Dulcit	+	bis ++	Saccharose	+	bis
D-XyIose	-	bis +++	Lactose	+	bis
L-Arabinose		h+	Raffinose	+·	bis
L-Sorbose	+	+	Natriumsuccinat	+-	h
Trehalose	+	H-	D-Mannose	+	bis
Salic in	bis ++	Stärke	+-	§-
Esculin	bis +	Glycerin	-
Inulin		Vergleich
Natriumacetat	bis ++
Natriumeitrat	bis ++

+++ Reichliches Wachstum, ++ + mäßiges Wachstum, + kaum

gutes Wachstum,

Wachstum, - kein Wachstum

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BAD ORIGINAL

02659

Zu den Kohlenstoffquellen, die/B-2847 verwertet werden können* gehören i-lnosit, Mannit, DuIcIt₁, D-Xylose, L-Arablnose, L=Sorbose_s D-Glactose, D-Glucose_fi D~Fructose, Rhamnose,, Mellbiose, Maltose, Saccharose, Lactose, Raffinose,, Trehalose, Saliein, Inulin, Natriumacetat, Natriumcitrat, Natriumsuccinat, D-Mannose, Stärke,-Glycerin usw₀ Zu den nicht verwerteten Kohlenstoffquellen gehören Ery-thrit, Adonit, D-Sorbit, Esculin und ähnliche ο

Hinsichtlich morphologischer Merkmale und Eigenschaften der Kultur scheint nach einem Vergleich mit SoAo. Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2, 152(1961) und ToG«. Pridham, Applied Microbiology, 6, 52 (1958) B-2847 ein Mikroorganismus zu sein^, der Streptomyces globisporus, Streptoinyces autotrophicus, Streptomyces orientalis, Streptomyces lcimberi und Streptomyces aburaviensis weitgehend ähnlich Iste

Di© Luftrayoele dieser Arten sind unveränderlich gerade oder gewellt und weiß gefärbt» B-2847 unterscheidet sich Jeöoch von Streptomyces globisporus durch ein orange-gelbes Wachstum auf synthetischem Agar, Bildung eines weißen Luftmyeels auf Kartoffelstücken und Wachstum auf Cellulose, während Streptomyces globisporus farbloses Wachstum' auf synthetischem Agar zeigt, auf Kartoffelstücken ein grilnlich-gelbes Luftmycel bildet und nicht auf Cellulose wächst»

B-2847 unterscheidet sich auch von Streptomyces autotrophicus durch mäßiges Wachstum auf Stärke-Agar, rasche Verflüssigung von Gelatine und Reduktion von Nitraten zu Nitriten₉ während Streptomyces autotrophicus nur schlecht auf Stärke-Agar wächst, Gelatine nicht verflüssigt und Nitrate nicht reduziert. Streptomyces orientalis ist ebenfalls von B-2847 verschieden. Es wächst weder stark auf· Czapek's-Agar noch erzeugt es ein lösliches Pigment auf

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Gelatine. Wegen der Fähigkeit von Streptomyces orientalis, gut auf Cellulose zu wachsen, seheint dieser Mikroorganismus dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus jedoch weitgehend ähnlich zu sein.

Das Konidium des erfindungsgemäßen Mikroorganismus ist ellipsoidj erzeugt ein gelblich-braunes lösliches Pigment auf Gelatine und koaguliert Milch nicht, in dieser Hinsicht unterscheidet sich der erfindungsgemäße Mikroorganismus von Streptomyces kimberi, welches schmale sphäri- i sehe Konidieh bildet, kein lösliches Pigment auf Gelatine erzeugt und Milch koaguliert. Streptomyces aburaviensis unterscheidet sich vom erfindungsgemäßen Mikroorganismus durch die Bildung eines gelblich-braunen löslichen Pigments auf Glucose-Asparagin-Agar und eines löslichen Pigments auf Calcium-Maleat-Agar. Beide Organismen unterscheiden sich außerdem voneinander in den Typen der Kohlenstoff quellen, die sie verwerten.

Nach L. Ettlinger et al (Archiv für Mikrobiologie Bd. 31, 326 (1958)) gehört B-2847 zu B. Sporen glatt, II Luftmycel niveus. Unter den erwähnten Arten (Streptomyces rubrireticuli, Streptomyces niveoruber, Streptomyces "

fulvissimus und Streptomyces phaeochromogenus unterscheiden sich jedoch die zwei erstgenannten Mikroorganismen erheblich von B-2847 dadurch, daß sie Wirbel bzw. quirlförmige oder spiralförmige Sporophoren aufweisen. Streptomyces fulvissimus bildet ein leuchtend goldenes bis orange gefärbtes lösliches Pigment auf Czapek-Agar oder auf Glucose-Asparagin-Agar und wächst tief rötlich-braun auf Nähr-Agar und unterscheidet sich hierin stark vom erfindungsgemäßen Mikroorganismus.

Streptomyces phaeochromogenusist vom chromogenen Typ und unterscheidet sich aus diesem Grund klar von B-2847.

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ίο -■

über die Bildung von sklerotischen Granulen wird berichtet bei Chainia (M»J_O Thiruraalachar,, Nature 176, 934 (1955))i bei Streptomyees griseus (MoL. Gattani* Nature ■l80_, 1293 (1957)) uswo Während jedoch die skierotischen Granulen dieser Organismen unveränderlich sich aus dem Substratmycel entwickeln,, stammen die skierotischen Granulen von B-2847 von dessen Luftnjycel, nicht jedoch von seinem Substratmycel„

In diesem morphologischen Merkmal gleicht der erfindungsgemäße Mikroorganismus Streptomyces aerocolonigenesp unterscheidet sich jedoch dadurch* daß B-2847 ein reichliches Luftmyeel auf Glyeerin-Czapek-Agar unter Bildung eines schwach gelbliehen löslichen Pigments liefert, kein lösliches Pigment auf Glucose-Asparagin-Ägar bildet und farblos auf Stärke-Agar wächst*

Außerdem liefert der Mikroorganismus negative Tyrosinase- und Diastase-Reaktionen und verwertet Rhamnose gut und. Raffinose mittelmäßig. Streptomyces aerocoionigenes bildet nur ein dünnes bzw«, verstreutes Luf-tmycel, erzeugt ein bräunliches lösliches Pigment ai$f Glyeerin-Czapek-Agar und ein blaßgelbes lösliches Pigment, auf Glucbse-Asparagin-Agar und zeigt ferner ein aprikosengelbes Wachstum auf Stärke-Agar. Streptomyces aerocolonigenes gibt positive Tyro-sinase- und Diastase-Reaktionen,/ist nicht imstande Raffinose und Rharanose zu verwerten.' Es gibt auch bekannte rifamycinbildende Organismen* wie Streptomyces mediterranei (P, Margalith & G. Beretta_s Mycopathol_o et Mycolü Appl.j 13, 321 (i960)), Streptomyces 4lO7Ä₂ (S. Sugawara, J. Antibiotics Ser_o A₉ XVIII (I)₂, S9 (1964)) und Streptomyces albovinaeeus_/ (E. BoBa¥ick_c ü»S» -»Patent 2 999 048)/imstande sein sollte, Naneimyein zu produzieren, ein Antibiotikum, das später als Rifamycin B identifiziert wurde. *

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- ii -

Ein Vergleich dieser Stämme rait.B-2847 zeigt, daß Streptomyces mediterranei beispielsweise sieh von B-2847 dadurch unterscheidet, daß es keine skierotischen Granulen bildet, ein rosa-welßes konidienbildendes Mycel auf synthetischen Medien und Nähr-Agar bildet_f kein lösliches Pigment auf Czapek-Saccharose-Agar und Hefe~Extrakt-Glucose-Agar liefert. Die beiden Organismen unterscheiden sich ferner voneinander in der Nitratreduktion, Peptonisierung von Milch und in der Verwertung von Kohlenstoffquellen. Wie Streptomyces mediterranei ist auch bei Strep- | tomyces 41OYA₂ die Bildung von skierotischen Granulen nicht beschrieben; sein konidienblldendes Mycel gehört zur Reihe der rosa- bis orange-farbenen. Abgesehen von diesen Unterschieden unterscheidet sich Streptomyces 4lo7A₂ stark von B-28^7 in den Eigenschaften der Kultur auf Czapek-Saccharose-Agar, Nähr-Agar und Hefe-Extrakt-Agar. Weiter unterscheiden sich die beiden Organismen in der Verwertung von Kohlenstoffquellen.

Auch Streptomyces albovinaceus bildet keine skierotischen Granulen. Es unterscheidet sich außerdem erheblich von B-28*l7 in seinen Eigenschaften der Kulturen auf Czapek-Dox-Agar und Sabouraud¹s-Agar und insbesondere im Färb- i

ton des konidienbildenden Mycels. Die zwei Organismen sind außerdem unterschiedlich in der Verwertung von Kohlenstoffquellen, insbesondere in der Verwertung von Arabinose, Dulcit und Inulin.

Die vorstehenden Vergleiche der verschiedenen Merkmale von B-2847 mit denjenigen bekannter Organismen fUhren zu dem Ergebnis, daß B-2847 zu einer neuen Spezies gehört, die mit Streptomyces tolypophorus noν. sp. bezeichnet wurde. Nachfolgend werden Merkmale der Kultur des gelben Mutanten von B-2847 aufgeführt.

0 0 9 8 5 0/2027 BAD

a) Czapek-Agar

Wachstum; mäßlg„ helles orange-gelb (Rdg-.Ill,

17-d)
Luftmyeels mäßig, blasses orange-gelb (Rdg.lll,

17-f) " Rj Orange Buff (Rdg.lll, 15-d) bis

Capucine Orange (Rdg.JH, 13-d) lösliches Pigment; keins oder blaß orange-gelb

(Rdg..iri, 15-f)

b) Glucose-Czapek-Agars

Wachstums mäßig«, faltiger in niederen Teilen

der Kultur, blaß orange-gelb, Luft mycel, lösliches Pigment und Farbe der Rückseite sind vergleichbar mit Czapek-Agar

c) Glycerin-Czapek-Agar;

Wachstum: Luftmycel und Rückseitenfarbe sind

vergleichbar mit Czapek-Agar

d) Glucose-Asparagin-Agarg

Wachstum; mäßig* faltig am Fuß der. Kultur,

blaß orange-gelb

Luftmycel: mäßig, blaß orange-gelb

Rj blaß orange-gelb bis hell orange

gelb

lösliches Pigment: keins

e) Nährbrühe:

Wachstums schwach bzw. schlecht bis mäßig,

das fleehtenähnliche Oberflächenwachstum taucht allmählich unter,, . hell orange-gelb

Luftmycel: keins
lösliches Pigment: keins

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-.15 -

f) Nähr-Agar '

Wachstum: mäßig, farblos bis zu hellem gelbbraun

Luftraycel: schwach, weiß R: Deep Chrome (Rdg.III, 17-b)

lösliches Pigment: keins oder hell-gelb

g) Glucose-Nähr-Agar:

Wachstum: reichlich, faltig, erhaben, braun ^

Luftmycel: blasses orange-gelb

R: Hazel (Rdg.XIV, 11 •-Ic) bis

. . Liver Brown (Rdg.XIV, 7'-m)

lösliches Pigment: Hay's Russet (Rdg.XIV, Ί'-k)

h) Glycerin-Nähr-Agar:

Wachstum: reichlich, faltig und erhaben,

οrange-braun

Luftmycel: reichlich, blasses orange-gelb

Rückseite und lösliches Pigment sind ähnlich wie auf Glucose-Nähr-• Agar

i) Ganzes Ei:

Wachstum? schwach, blasses orange-gelb bis

Orange Buff (Rdg.III, 15-d) Luftmycel; keins
lösliches Pigment: keins oder blasses gelb-braun

J) Hefe-Extrakt-Agar:

Wachstum: reichlich, faltig und erhaben Luftmycel: blaß orange-gelb

Farbe der Rückseite und lösliches ^ Pigment sind ähnlich wie bei . Glycerin-Nähr-Agar

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k) Kartoffelstück:

Wachstums mäßig, faltig, Deep. Chrome

17-b) Ms Mars Yellow

15-i) ■ .

Luftmyceli keins

Das Medium wird später grau-braun

1) MÖhrenstUcke;

Wachstums schwach^ blasses orange-gelb Luftmycel; keins

Farbe der Stücke unverändert

m) Lackmusmilch (37°C)s

Wachstums schwach^ in Ringen, allmählich

untertauchend, blasses orange-gelb, Das Medium wird schwach-sauer, langsame Peptisation ohne Koagulierung

n) Löffler^es Serum (37°C)s

Wachstum: kein Wachstum bis zum 14. Tag

o) Cellulose;

Wachstums schwach* farblos Luftmycel: sehwach,, weiß bis raais-gelb'

(Rdg.IV, 19-f) Cellulose: wird nicht zersetzt

p) Calcium-Maleat-Agars

Wachstum: schwach bis mäßig* blasses orangegelb

Luftmycels blasses orange-gelb R: blasses orange-gelb

lösliches Pigment: keins

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q) Tyrosin-Agar; Wachstum

Luftmycel: R:

- 15 mäßig, farblos bis helles orangegelb»

mäßig, puderförmig, blasses orangegelb
Raw Siennea (Rdg.III, 17-i)

lösliches Pigment: keins

r) Pepton-Agar: Wachstum: Luftmycel:

R:

lösliches Pigment; mäßig, blasses οrange-gelb schwach, wächst am Boden des Mediums, blasses orange-gelb blasses orange-gelb keins

Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften des gelben Mutanten von B-2847 sind denen des älteren Stamms ähnlich.

Verwertung von Kohlenstoffquellen durch den gelben Mutanten von B-2847.

Tabelle

Erythrit Adonit D-Sorbit DuIcit D-Xylose L-Arabinose L-Sorbose Trehalose Esculin Inulin

Natriumacetat Natriumeitrat

Natriumsuccinat

++ bis +++ D-Galactose

D-Glucose

D-Fructose

Saccharose

Lactose

Raffinose

D-Mannose

Stärke

Glycerin

Vergleich

+ bis ++ - bis +

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+++ Reichliches Wachstum, ++ gutes Wachstum, + mäßiges Wachstum, + kaum Wachstum, - kein Wachstum

Die beiden Stämme B-2847 und der gelbe Mutant von B-284? wurden beim Institut für Fermentation, Osaka, unter den Hinterlegungsnummern IPO-1255¹¹¹ und Ij5l51 hinterlegt.

Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird Streptom-yces B-2847 oder dessen gelber Mutant auf einem Medium gezüchtet, das eine Eisenverbindung enthält. Die Eisenverbindungen können entweder organisch oder anorganisch sein und sich sowohl vom zweiwertigen als auch vom dreiwertigen Eisen ableiten; bevorzugt sind jedoch solche anorganischen Eisenverbindungen wie Eisenchlorid, Eisensulfat, Eisennitrat, Eisenphosphat, Eisenjodid, Eisenoxyd und Eisenhydroxyd. Die Menge der Eisenverbindungen beträgt vorzugsweise 0,005 bis 0,2 %, das ist etwa 10 bis 4θΟ mal mehr als üblicherweise verwendet (etwa 0,0005 bis 0,001 %, bezogen auf das gesamte Medium). Bei Verwendung solcher großen Eisenmengen fällt Rifamycin B und 0 in der Kultvrbrühe in etwa der 2 bis 5-fachen Menge gegenüber herkömmlichen Medien an·.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B und 0, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces B-2847 (IPO-1255²*) oder den gelben Mutanten von B-2847 (lPO-1^151) in einem assimilierbaren Kohlenstoff und verträglichen stickstoffenthaltenden Nährmedium in Gegenwart von etwa 0,05 bis etwa 0,5 % einer anorganischen Eisenverbindung unter aeroben Bedingungen züchtet, bis sich die gewünschten Verbindungen in der Kulturbrühe angereichert haben und daß man anschließend das gebildete Rifamycin B und 0 aus der Kulturbrühe abtrennt«,

Die Ausbeute an Rifamycin B und 0 kann weiter, gesteigert werden, wenn man dem Medium zusätzlich zu der großen Menge

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an Eisenverbindungen weitere Komponenten, wie Mangansulfat, Magnesiumsulfat, Bariumsulfat und/oder Kaliumsulfat zusetzt. Diese anorganischen Salze sind im Medium vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,001 bis 0,005 % enthalten, was dem etwa 10-fachen der herkömmlichen Mengen bei der Züchtung von Mikroorganismen entspricht. Das Medium kann entweder flüssig oder fest sein, bevorzugt wird jedoch ein flüssiges Medium. In einem solchen Medium werden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen ebenso wie andere Bestandteile eingebracht. I

Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Inosit, Xylose, Galactose, Fructose, Saccharose, während die Stickstoffquellen aus verschiedenen organischen und

Stickstoff
anorganischen / enthaltenden Materialien, wie Peptonen, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Reiskleie, Harnstoff und Ammoniumsalzen,ausgewählt werden können. Zusätzlich zu diesen Nährstoffen können verschiedene anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Phosphate und verschiedene Metallsalze, wie Kalzium^, Zink-oder Mangansalze zugegeben werden. Falls erforderlich, kann auch ein Antischaummittel zugegeben, das ein tierisches öl sein kann oder pflanzlichen oder mineralischen Ursprungs " ist.

Für die Züchtung von B-2847 oder des gelben Mutanten von B-2847 ist die Verwendung eines flüssigen Mediums unter Belüftung und Rühren vorteilhaft, obwohl auch die Oberfl ächenzUchtung angewendet werden kann. Sowohl Inkubationstemperatur und -zeit als auch der p„ des Mediums

sollen so sein, daß maximales Wachstum des Organismus und maximale Ausbeuten an Rifamycin B und 0 erzielt werden; eine Schüttelkultur während etwa 2 bis 7 Tagen ist gewöhnlich vorteilhaft. Der p„-Wert des Mediums wird vorzugs-

weise nahe dem Neutralpunkt bis zu schwach sauer gehalten; die optimale Inkubationstemperatur liegt zwischen etwa

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20° und 45°C, vorzugsweise bei 25° bis 35°C. Die Züchtungsbedingungen, wie Zusammensetzung und ρ..-Wert des Mediums, Inkubationstemperatur, Ausmaß der'Bewegung, werden in Abhängigkeit .von dem Organismus und den äusseren Bedingungen so gewählt,, daß die besten Resultate erhalten werden. Die Gewinnung von Rifamycin B und 0 aus der Kulturbrühe erfolgt nach bekannten Methoden zur Gewinnung von Stoffwechselprodukten von Mikroorganismen. Beispielsweise können Methoden angewendet werden, die auf dsn Löslichkeitsunterschieden zwischen Rifamycin B,' 0 und Verunreinigungen, Unterschieden in der Adsorptionsaffinität und Unterschieden in der Ionenbindungsstärke beruhen, ebenso wie das Aussalzen, wobei die aktiven Fraktionen aus der Lösung ausgefällt werden sowie Dialyse und Gegenstromverteilung. Diese Methoden können entweder einzeln oder in geeigneter Kombination nötigenfalls auch wiederholt angewendet werden. Da die Antibiotika Rifamycin B und O fettlösliche saure und fettlösliche neutrale Substanzen sind und vorwiegend im flüssigen Teil der Kulturbrühe erscheinen, ist es vorteilhaft, zunächst die Kulturbrühe zu filtrieren und aus dem Piltrat die gewünschten Produkte zu gewinnen und zu reinigen. Wird das Piltrat schwach basisch gemacht und mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, wandert Rifamycin 0 in die organische Phase, während Rifamycin B in der wäßrigen Schicht zurückbleibt. Auf diese Weise können die zwei Antibiotika leicht voneinander getrennt werden. Anschließend können sie durch eine geeignete Kombination von Reinigungsverfahren, wie Verteilung, fraktionierte Fällung, Adsorption und Umkristallisieren, weiter gereinigt werden. Da die Mycele selbst eine antimikrobische Aktivität aufweisen, ist es möglich, die Antibiotika aus dem Mycel durch Extraktion mit Aceton oder Sthanol, Konzentration des Extrakts im Vakuum und nachfolgende Behandlung des Konzentrats in ähnlicher Weise wie das FiI-

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trat gewonnen werden. Rifamycin B, das in der wäßrigen Phase zurückbleibt, kann in die organische Phase durch Ansäuern der wäßrigen Lösung und Extraktion der Lösung mit einem organischen Lösungsmittel überführt werden. Geeignete Lösungsmittel für diese Extraktion sind organische Fettsäureester, wie Äthylacetat, Butylacetat, verschiedene Ketone, wie Methylisobutylketon, verschiedene Alkohole, wie N-Butanol, N-Amylalkohol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methandichlorid und verschiedene Ä'ther, wie Diäthyläther. Die so erhaltenen or- { ganischen Schichten werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter verminderten Druck eingeengt. Aus den Konzentraten können verunreinigte Kristalle direkt gewonnen werden. Statt dessen kann zu dem Konzentrat auch ein organisches Lösungsmittel mit niedriger Polarität, wie Petroläther, N-Hexan oder Cyclohexan, zugegeben werden, wobei ebenfalls verunreinigte Kristalle von Rifamycin O oder B ausfallen. Die gewünschten Substanzen können aus den Konzentraten auch unter Verwendung von Adsorbentien abgetrennt werden. Die rohen Kristalle können durch fraktionierte Fällung mit geeigneten organischen Lösungsmitteln gereinigt werden. Im Fall von Rifamycin O, das schwerlöslich in Diäthyläther ist, kann das Rohprodukt * durch Zugabe einer geeigneten Menge von Diäthyläther gereinigt werden, wobei die anderen löslichen Verbindungen durch Filtration abgetrennt werden. Zwecks Reinigung des Rohprodukts mit einem Adsorbens wird das aktive Material am Adsorbens adsorbiert und dieses dann mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert. Als Adsorbentien können Silikagel, mit Oxalsäure behandeltes Silikagel oder Aktivkohle verwendet werden.-Das Lösungsmittel ist vom Typ des Adsorbtionsmittels abhängig. Bei der Säulenchromatographie an Silikagel kann beispielsweise die aktive Fraktion eluiert werden, indem man zuerst die Verunreinigungen mit einem Lösungsmittel niedriger Polarität,

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"- '■'-■ BAD ORIGINAL

wie Benzol, Diäthyläther, desorbiert, und anschließend ein Lösungsmittel hoher Polarität, wie Kthylacetat, Aceton oder Äthanol oder eine geeignete Mischung solcher Lösungsmittel aufgibt. Falls die DUnnschichtchromatographie angewendet wird, wird zunächst das Chrpmatogramm entwickelt und anschließend die gewünschte Fraktion aus der aktiven Zone eluiert. Rifamycin 0 und B haben folgende physikalische und chemische Eigenschaften;

•Rifamycin 0 :
*· . · -

Blaßgelbe Prismen, Zersetzungspunkt l6o°C Elementaranalyse:

Gefunden: ^c'6x',94^{; H}' till* ⁿ'l'M^y OMe, 4,4o Berechnet für: C,g H^™ ^Noi4*

C, 62,14; H, 6,29; N, 1,86; OMe, 4,12

21
spezifische Drehung (a)£ + 68,7 (C=I,0, in Dioxan)

Ultraviolett-und Absorptionsspektrum im sichtbaren Bereich in Äthanol siehe Fig. 1

Infrarotabsorptionspektrum (in NuJoI) siehe Fig. 2.

Rifamycin B :

Gelbe Nadeln, Zersetzungspunkt 165⁰C Elementaranalyse:

Gefunden: C, 61,35; H* 6,49; N, 1,73 Berechnet für: C-^g H^q

C, 61,97; H, 6,53; N, 1,85 spezifische Drehung (α)« - 8,2° (C=I.in Methanol)

Ultraviolettspektrum und Absorptionsspektrum im sichtbaren Bereich in Äthanol siehe Fig. 3· Infrarotabsorptionsspek-

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trum (Kaliumbromid) siehe Pig. 4.

Zur Identifizierung wurde Rifamycin B zu Rifamycin O oxydiert oder der oxydativen Hydrolyse zu Rifamycin S unterworfen und die Elementaranalyse sowie spektroskopische Untersuchungen (Ultraviolettspektrum, sichtbares Spektrum und Infrarotabsorptionsspektrum) durchgeführt. Die Ergeb- . nisse bestätigen, daß die Produkte identisch mit authentischen Proben waren.
Antimicrobisches Spektrum.

Als Probemedium wurde Nähr-Agar verwendet. Die hemmenden Mindestkonzentrationen wurden an Bakterien nach 20 Stunden bei 37° C bestimmt. Im Fall von säurefesten Bakterien wurde Glycerin-Nähr-Agar verwendet (37^oCi 48 Stunden) im Fall von Hefen und Pilzen Glucose-Nähr-Agar (28°C, 48 Stunden). Die Ergebnisse zeigt die nachfolgende Tabelle 1.

Tabelle 1

	IFO	3044	HMK	(mcg/ml)	>50
	IFO	3045	Rifamycin 0 Rifamycin B	>50
Escherichia coIi	IFO	3O8O	>50	>50
Proteus vulgaris	FOA	209P	>50	,2 0,5
Pseudomonas aeruginosa	PCI	219	>50	5
Staphylococcus aureus	IFO	3466	0,	20
Bacillus subtilis	IFO	3331	1	10
Bacillus cereus	IFO	3153	10	>50
Bacillus brevis	ATCC	607	1	>50
Mycobacterium avium	IFO	0583	>50	>50
Mycobacterium sp.	IFO	4o66	>50	>50
Candida albicans	IFO	3995	>50	10
Aspergillus niger		>50
Xanthomonas oryzae		10

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Rifamycin B und O sind wichtige Zwischenprodukte bei der Gewinnung des bekannten Antibiotikums Rifamycin SV und können in Rifamycin SV auf die in Arzneimittel-Forschung 8a 951 (I965) beschriebenen Weise überführt werden.

In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze auf Gewicht/Volumen, wobei sich Gewichtsteile zu Volum-teile verhalten wie Gramm zu Milliliter.

Beispiel 1

Zu einem Kulturmedium der weiter unten angegebenen Zusammensetzung wurde jeweils Eisen(II)Sulfat, Eisen(III)Sulfat, Eisen(II)Chlorid und Eisen(lII)Chlorid in Mengen von 0,01, 0,05* 0,1 und 0,5 % zugegeben. Jedes Medium wurde dann mit Streptomyces B-2847 (IFO-12554) geimpft und 4 Tage bei 28°C bebrütet. Die Gesamtausbeute an Rifamycin B und 0 im flüssigen Teil der erhaltenen Brühe wurde am 2,, und 4. Tag bestimmt, in der folgenden Tabelle bedeutet "Vergleich" das Ergebnis eines Versuchs mit einem eisen- * freien Vergleichsmedium. Die gesamte antimikrobische Aktivität von Rifamycin B und 0 wurde bestimmt nach der üblichen Papierscheibenprobe mit Staphylococcus aureus 209P als Versuchsorganismus.

Medium: 2 % Glucose, 2 % Glycerin» 0,5 % Hirsegelee,

1,5 % Sojabohnenmehl, 0,2 % Pepton, 0*1 % Maisquellwasser, 0,05 ^(NHg)₂CO, 0,05 % MnSO₄, 0,05 % MgSO₄, 0,05 % BaSO₄, 0,005 % KNO₃ und 1,0 % gefälltes CaCO₃ (p_H 7,0).

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Tabelle 4

	0,01 (O,OO4)	Ph	3 Tage
Eisensalz	0,05 (0,18)	η	Aktivität
{% Eisen)	ο,ι (0,037)	6,75	mcg/ml.
FeSOjj	0,5 (o,i84)	7,05	110
	0,01 (0,001)	7,75	210
	0,05 (0,007)	7,75	330
	0,1 (0,014)	6,95	300
Fe2(SO4),	0,5 (0,07	6,95	130
	0,01 (0,004)	7,4	190
	0,05 (0,023)	7,35	300
	0,1 (0,044)	6,9	275
FeCl2	0,5 (0,225)	7,45	145
	0,01 (0,003)	7,8	300
	0,05 (0,017)	7,45	300
	0,1 (0,034)	6,95	160
FeCl,	0,5 (0,172)	7,4	145
ψ	Vergleich	7,65 ■	300
		7,45	300
	6,7	275
	Beispiel 2	70

Ein Medium aus 5 % Glucose, 0,5 % Pepton, 1,0 % Maisquellwasser, 1,0 % Sojabohnenmehl, 0,05 % FeSO^, 0,3 % Natriumchlorid, 0,5 % gefälltem Calciumcarbonat, das mit Natronlauge auf einen p„ von 7,0 eingestellt wurde, wurde mit einer Kultur von Streptomyces B-2847 (lFO-12554) geimpft, nachdem das Medium vorher 15 Minuten bei 1,5 Atm. sterilisiert v/orden war. Das Medium wurde 72 Stunden bei 28°C bebrütet. Die KulturbrUhe enthielt zusammen 150 mcg/ml Rifamycin B und 0.. *

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Beispiel 3

Ein Fermenter eines Fassungsvermögens von 100 Volumteilen wurde mit 60 Volumteilen eines Mediums beschickt, das 2 % Glucose, 2 % Glycerin, 0,2 % Pepton, 1,5 % Sojabohnenmehl, 0,05 % FeSOjj, 0,05 % MgSO^ und 0,05 % gefälltes Calciumcarbonat, eingestellt mit Natronlauge auf einen

p„-Wert von 7,0, enthielt. Der Fermenter wurde unter den π

im Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen sterilisiert und anschließend mit dem gelben Mutanten von Streptomyces B-2847 (IFO 13151) geimpft und 66 Stunden bei 28⁰C bebrütet. Auf diese Weise wurde eine Kulturbrühe mit eim;m Gehalt von 300 mcg/ml Rifamycin B und 0 erhalten.

Beispiel 4

Ein Fermenter eines Fassungsvermögens von 2000 Volumteilen wurde mit 500 Volumteilen eines mit Natronlauge auf einen p„-Wert von 7*0 eingestellten Kulturmediums beschickt, das 3 % Glucose, 2 % Sojabohnenmehl und 0,5 # gefälltes Calciumcarbonat enthielt, 15 Minuten bei 1,5 Atm. sterilisiert und anschließend mit Streptomyces B-2847 (IFO I2554) geimpft. Das beimpfte Medium wurde 66 Stunden bei 28°C bebrütet;. Die erhaltene Kultur wurde in einer Menge von 3 % in einen Tank von 200.000 Volumenteilen Fassungsvermögen Uberlmpft, der 100.000 Volumteile eines Mediums aus 2 % Glucose, 3 % löslicher Stärke, 1 % Sojabohnenmehl, 1 % Maisquellwasser, 0,5 % Pepton, 0,05 % FeSO₁J (0,018 % berechnet als Eisen(ll)lon) 0,05 # MeSO^, 0,05 % MnSO₂J, 0,005 % KNO₃, 0,3 % NaCl und 0,5 % gefälltem Calciumcarbonat, das mit Natronlauge auf einen p„-Wert von 7,0 eingestellt worden war, enthielt. Der geimpfte Tank wurde 66 Stunden bei 28⁰C unter 100 % Belüftung und Rühren mit 200 UpM bebrütet. 84.000 Volumenteile der

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KulturbrUhe wurden auf einen p_H von 7,2 eingestellt und anschließend mit einem Drittel des Volumens Äthylacetat oder Chloroform extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde zweimal mit dem halben Volumen Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Zu dem Konzentrat wurden 2000 Volumteile einer Mischung aus Diäthyläther und Petroläther im Verhältnis 1:10 oder aus Diäthyläther und η-Hexan zugegeben, worauf 70 Gewichtsteile verunreinigtes Pulver erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde zweimal mit dem 50-fachen Volumen Diäthyläther extrahiert und die.unlöslichen Bestandteile durch Filtration gewonnen. 6o Gewichtsteile des erhaltenen Pulvers wurden in 1000 Volumteilen Aceton gelöst und an 300 Gewichtsteilen Aktivkohle für Chromatographiezwecke (hergestellt von der Firma Takeda Chemical Industries Ltd.) adsorbiert. Die Kohle wird mit Aceton eluiert, wobei etwa 14.000 Volumteile an gelben Fraktionen gesammelt wurden. Nach Einengen wurden durch Zugabe von Äthylacetat zu dem Konzentrat blaß-gelbe Kristalle in einer Ausbeute von 16,^ Gewichtsteilen erhalten. Die Mutterlauge wurde an 200 Gewichtsteilen Silikagel, das vorher mit Oxalsäure angesäuert wurde, chromatographiert und das Chromatogramm mit einem 1:1 Gemisch aus Benzol und 1 % Oxalsäure enthaltendem Äthylacetat eluiert. Die blaß-gelben Fraktionen wurden gesammelt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt, wobei 5,2 Gewichtsteile blasser gelblicher Kristalle von Rifamycin 0 erhalten wurden. Nach Einengung des Äthylacetat- oder Chloroform-Extrakt schied sich Rifamycin 0 manchmal in Kristallen ab. In diesem Fall wurden die Kristalle durch Filtration gesammelt und umkristallislert. Die Mutterlauge wurde durch Chromatographie an Silikagel gereinigt. Ausbeute: Etwa 30 Gewichtstei3 * -

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Beispiel 5

78.000 Volumenteile einer auf ähnliche Weise wie in Beispiel 4 hergestellten Kulturbrühe wurden durch Zugabe von 2n Natriumhydroxyd auf einen p„-Wert von 8 eingestellt und mit einen Drittel des Volumens Äthylacetat extrahiert. 80.OOO Volumenteile der wäßrigen Schicht wurden mit 2n Schwefelsäure auf einen p„-Wert von 2,5 eingestellt

und mit einem Drittel bis einem Fünftel des Volumens Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und zweimal mit der Hälfte des Volumens Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Nach Zugabe von Petroläther zum Konzentrat wurden 66 Gewichtsteile pulverförmiges Rifamycin B erhalten. 8 Gewichtsteile des pulverförmigen Rohprodukts wurden in 2000 Volumteilen Äthylacetat gslöst und die Lösung zweimal mit 1000 und 700 Volumteilen Phosphat puff er eines p__-Wertes von 7» 2 extrahiert. Die

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wäßrigen Schichten wurden vereinigte mit Äthylacetat gewaschen und auf einen p„-Wert von 3*0 gebracht. Die Lö-

sung wurde zweimal mit jeweils 400 Volumteilen Äthylacetat extrahiert, der Extrakt mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt„ Nach Zugabe von η-Hexan zum Konzentrat wurden 3*8 Gewichtsteile eines gelben Pulvers erhalten. Dieses Pulver wurde in 450 Volumteilen eines Isl-Gemisehs aus Äthylacetat und Aceton gelöst und die Lösung wurde kaltgestellt. Dabei wurden 0,36 Gewichtsteile Rifamycin B in gelben Nadeln erhalten.

QGSS

Claims (2)

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B und O, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces B-2847 (lFO-1255^) oder den gelben Mutanten von B-2847 (IFO-I315I) in einem assimilierbaren Kohlenstoff und verdaulichen Stickstoff enthaltenden NShrmedium in Anwesenheit von etwa 0,05 bis 0,5 % anorganischen Eisenverbindungen unter aeroben Bedingungen bis zur Anreicherung der gewünschten Verbindungen im Kulturmedium züchtet und dann das gebildete Rifamycin B und 0 daraus gewinnt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Bebrütungstemperaturen von etwa 20° bis 45°C arbeitet.

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