DE2450813C2 - Antibiotic FR-02A - Google Patents
Antibiotic FR-02AInfo
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Description
;£·!* =320 ;£Jl =180;; £! * = 320 ; £ Jl = 180;
einem inerten Träger in einem wachstumsfördernden Mittel für ΉεΓε.an inert carrier in a growth promoting agent for ΉεΓε.
h) Rf=0,M4 bei der Dünnschichtchromatographie auf einer Kieselsäuregelplatte unter Entwickeln mit einem Lösungsmittelsystem aus 80% Chloroform, 20% Methanol und 1% konzentriertem Ammoniumhydioxid;h) Rf = 0. M4 in thin layer chromatography on a silica gel plate while developing with a solvent system of 80% Chloroform, 20% methanol, and 1% concentrated ammonium dioxide;
i) Rf=0,9 bei der Papierchromatographie unter Entwicklung in dem Lösungsmittelsystem aus 70% Isopropanol und 30% Phosphatpufferlösung (0,01 molar), pH 6,0;i) Rf = 0.9 on paper chromatography below Development in the solvent system of 70% isopropanol and 30% phosphate buffer solution (0.01 molar), pH 6.0;
j) kernmagnetisches Resonanzspektrum mit einem Dubleti bei 1,21,131 und 4,63 τ und einem Singulett bei 4,87 τ, j) nuclear magnetic resonance spectrum with a doublet at 1.21, 131 and 4.63 τ and a singlet at 4.87 τ,
sowie die pharmazeutisch unbedenklichen, nicht-toxischen Salze davon.as well as the pharmaceutically acceptable, non-toxic salts thereof.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums FR-02A gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 aerob in einem wäßrigen Nährmedium züchtet, worauf man das gebildete Antibiotikum FR-02A2. Process for the preparation of the antibiotic FR-02A according to claim 1, characterized in that Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 is grown aerobically in an aqueous nutrient medium, whereupon the antibiotic formed FR-02A
a) aus der gesamten Fermentationsflüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel odera) from the entire fermentation liquid with a water-immiscible polar organic solvents or
b) aus der Fermentationsflüssigkeit, von der die Feststoffe abgetrennt worden sind, mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel oderb) from the fermentation liquid from which the solids have been separated with a water-immiscible polar organic solvents or
ς) aus den von der Fermentationsflüssigkeit abgetrennten Feststoffen mit einem polaren £>o organischen Lösungsmittelς) from the solids separated from the fermentation liquid with a polar £> o organic solvents
extrahiert.extracted.
3. Verwendung des Antibiotikums FR-02A oder eines pharmazeutisch unbedenklichen, nicht-toxi- f>5 sehen Salzes davon zusammen mit einem nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Streckmittel3. Use of the antibiotic FR-02A or a pharmaceutically safe, non-toxic f> 5 see salt thereof along with a non-toxic, pharmaceutically acceptable excipient in einem therapeutischen Mittel oder zusammen mitin a therapeutic agent or together with Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch 1 angegebene Antibioticum, das im Anspruch '·£ genannte Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums und die Verwendung dieses Antibiotikums, wie sie der Patentanspruch 3 nenntThe invention relates to the method defined in claim 1 antibiotic, said in claim '· £ process for producing this antibiotic and the use of this antibiotic, as she calls the patent claim 3
FR-02A ist ein Antibioticum, das sowohl gegen gram-positive als auch gegen gram-negative Bakterien wirkt und infolgedessen zur Behandlung der verschiedensten Infektionen von Tieren verwendet werden kann, insbesondere wirkt FR-02A gegen PPLO bei Hühnern, Schweinen und Rindern. Es ist auüh wirksam gegen die Mäusecoccidiose und gegen die vorwiegendsten Arten der Hühnercoccidiose. Ferner wirkt das Antibioticum subkutan gegen durch M. gallisepticum verursachte Luftsacculitis bei Hühnern und oral bei Mäusen gegen durch Bordetella bronchiseptica verursachte Systeminfektionen. Weiterhin kann FR-02A als wuchsförderndes Mittel bei Tieren, wie Hühnern, Schweinen und Rindern, verwendet werden.FR-02A is an antibiotic that is effective against both gram-positive and gram-negative bacteria acts and as a result are used to treat a wide variety of animal infections can, in particular, FR-02A is effective against PPLO in chickens, pigs and cattle. It is also effective against mouse coccidiosis and against the most prevalent types of chicken coccidiosis. It also works Antibiotic subcutaneously against air suculitis caused by M. gallisepticum in chickens and orally in Mice against systemic infections caused by Bordetella bronchiseptica. Furthermore, FR-02A can be used as growth-promoting agents can be used in animals such as chickens, pigs and cattle.
Das Antibioticum FR-02A wird durch Züchten des bereits bekannten Mikroorganismus Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 unter gesteuerten Bedingungen in einer Fermentationsflüssigkeit und Extrahieren der ganzen Fermentationsflüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel gewonnen. Die Fermentation kann in Medien, die suspendierte Nährstoffe enthalten, oder in vorwiegend klaren Medien durchgeführt werden, die praktisch frei von suspendierten Nährstoffen sind.The antibiotic FR-02A is obtained by cultivating the already known microorganism Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 under controlled conditions in a fermentation liquid and extracting the whole fermentation liquid obtained with a water-immiscible polar organic solvent. The fermentation can take place in media that contain suspended nutrients, or be carried out in predominantly clear media that are practically free of suspended nutrients.
Wenn die Fermentation in Medien durchgeführt wird, die suspendierte Nährstoffe enthalten, findet sich das Antibioticum sowohl in den Fesl; !offen des Mycels und der suspendierten Nährstoffe sowie in der Fermentationsflüssigkeit. Das Antibioticum wird aus den Feststoffen isoliert, indem man die Feststoffe von der Fermentationsflüssigkeit durch Filtrieren, Zentrifugiren oder auf andere Weise trennt und den Feststoffkuchen mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem polaren organischen Lösungsmittel, extrahiert. Das Antibioticum, das in der Flüssigkeit hinterblieben ist, von der die Feststoffe zuvor abgegrennt worden sind, wird aus der Flüssigkeit durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel isoliert. Es ist zu beachten, daß durch verzögertes Abernten die Gesamtfeststoffmenge in der Fermentationsflüssigkeit vermindert wird und eine geringere Menge des Antibioticums sich in den von der Flüssigkeit gewonnenen Feststoffen findetIf the fermentation is carried out in media containing suspended nutrients, this will be found Antibiotic both in the fesl; ! open of the mycelium and the suspended nutrients as well as in the fermentation liquid. The antibiotic is isolated from the solids by removing the solids from the The fermentation liquid is separated by filtration, centrifugation or in some other way and the solid cake extracted with an organic solvent, preferably a polar organic solvent. The antibiotic that was left in the liquid from which the solids were previously separated is isolated from the liquid by extraction with a water-immiscible polar organic solvent. It should be noted that the total amount of solids in the fermentation liquid is reduced by delayed harvesting, and a lesser amount of the antibiotic is found in the solids recovered from the liquid
Bei Fermentationsmedien, die keine suspendierten Nährstoffe enthalten, findet sich der größte Teil des FR-02A in der vorwiegend klaren Fermentationsflüssigkeit. In diesen Fällen wird die gesamte Flüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, extrahiert, um das Antibioticum zu gewinnen. Man kann aber auch etwaige Feststoffe, wie Mycel, von der Fermentationsflüssigkeit abtrennen, bevor man die letztere mit dem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Ferner wird, um alles restliche FR-02A zu gewinnen, das von der Fermentationsflüssigkeit abgetrennte Mycel mit einem geeigneten polaren organischen Lösungsmittel extrahiert.Fermentation media that do not contain suspended nutrients contain most of the FR-02A in the predominantly clear fermentation liquid. In these cases, all of the liquid is used a water-immiscible polar organic solvent, such as chloroform, extracted to the Win antibiotic. But you can also remove any solids, such as mycelium, from the fermentation liquid separate before the latter with the water-immiscible polar organic solvent extracted. Further, in order to recover any remaining FR-02A, the mycelium separated from the fermentation liquor is extracted with a suitable polar organic solvent.
Das bevorzugte Verfahren zur Gewinnung des Antibioticums gemäß der Erfmdung.ist das Züchten des bekannten Mikroorganismus Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 runter gesteuerte^ Be^^ einem Medium, das suspendierte Feststoffe enthält^ oder. in einem klaren Medium, das frei von; suspendierten Feststoffen ist, und Extrahieren der gesamten; Flüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren* polaren organischen Lösungsmittel. Die Extraktion srfolgt durch Einstellen ides pH-Wertes der Flüssigkeit auf "> einen sauren Bereich und Zusatz des Lösungsmittels zu der Flüssigkeit Wach dem Vermischen werden die Feststoffe von der Flüssigkeit abgetrennt Man läßt^die Flüssigkeit stehet bis sich die. Löstingsmitt.elschicht abgeschieden hai Die Lösungsmittelschicht wird abgezogen, mit Wjasser gewaschen, mit einem geeigneten Trockenmittel getrocknet und im Vakuum eingedampft Der Rückstand wird mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel, wie Petroläther oder Hexan, gewaschen und an der Luft getrocknet So erhält man das Antibioticum FR-02A. "r The preferred method for obtaining the antibiotic according to the invention is the cultivation of the known microorganism Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 down controlled ^ Be ^^ a medium which contains suspended solids ^ or. in a clear medium that is free from; suspended solids is, and extracting the whole; Liquid with a water-immiscible * polar organic solvent. The extraction is carried out by adjusting the pH of the liquid to an acidic range and adding the solvent to the liquid. After mixing, the solids are separated from the liquid. The liquid is left to stand until the solvent layer has separated out The solvent layer is stripped off, washed with water, dried with a suitable drying agent and evaporated in vacuo. The residue is washed with a non-polar organic solvent, such as petroleum ether or hexane, and air-dried. This gives the antibiotic FR-02A. " R
Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung des Antibioticums FR-02A ist die Züchtung des bekannten Mikroorganismus: Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 unter gesteuerten Bedingungen in einem Medium, welches suspendierte Nährstoffe enthält Die Feststoffe einschließlich des Mycels und der suspendierten Nährstoffe werden von der Fermentationsflüssigkeit abfiltriert Nachdem der Filterkuchen so trocken wie möglich geblasen worden ist, wird er in ein polares » organisches Lösungsmittel eingerührt und wieder abfiltriert Nach <3em Waschen des Filterkuchens mit weiterem Lösungsmittel werden die vereinigten Lösungsmittelextraktie und Waschflüssigkeiten im Vakuum eingedampft, wobei ein wäßrige Aufschlämmung hinterbleibt Der pH-Wert wird auf einen sauren Bereich eingestellt Die wäßrige Aufschlämmung wird mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel, wie Petroläther, Hexan und dergleichen, gewaschen, bis die Waschflüssigkeit»!! farblos sind. Dann wird die wäßrige Aufschlämmung mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert Der Lösungsmittelexcrakt wird getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft, wobei das Antibioticum FR-02A als Rückstand hinterbleibt Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung kann man z. B. das Antibioticum FR-02A ίίι etwa 40- bis 50prozeiitig reiner Form erhalten.A preferred method for obtaining the antibiotic FR-02A is to cultivate the known one Microorganism: Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 under controlled conditions in one Medium Containing Suspended Nutrients The solids including the mycelium and suspended nutrients are filtered off from the fermentation liquor after the filter cake is so dry has been blown as possible, it will turn into a polar » Stir in organic solvent and filter off again. After washing the filter cake 3 times with The combined solvent extracts and washing liquids are further solvent in vacuo evaporated, leaving an aqueous slurry. The pH value becomes acidic Range adjusted The aqueous slurry is made with a non-polar organic solvent such as Petroleum ether, hexane and the like, washed until the washing liquid »!! are colorless. Then the aqueous Slurry extracted with a polar organic solvent. The solvent extract is extracted dried, filtered and evaporated in vacuo, the antibiotic FR-02A remaining as a residue According to the method according to the invention, for. B. the antibiotic FR-02A ίίι about 40 to Preserved 50 percent pure form.
Nach der anderen Methode kann die Fermentation in einem Medium durchgeführt werden, welches praktisch frei von suspendierten Nährstoffen ist Das Mycel wird von der Fermeni:ationsflüssigkeit abfiltriert und mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Der Extrakt wird getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel, wie Petroläther, Hexan und dergleichen, geschüttelt Das organische Lösungsmittel wird dekantiert, nachdem man den Rückstand durch 2Leritrifugieren zum Absitzen gebracht hat. Der Rückstand wird an der Luft getrocknet, und man erhält das Antibioticum FR-02A. -The other method can be fermentation in a medium which is practically free of suspended nutrients. The mycelium will be carried out filtered off from the fermeni: ation liquid and with extracted with a polar organic solvent. The extract is dried and in vacuo to Evaporated to dryness. The residue is shaken with a non-polar organic solvent such as petroleum ether, hexane and the like. The organic solvent is decanted after the Residue brought to settling by 2Leritrifugation Has. The residue is air-dried and the antibiotic FR-02A is obtained. -
Eine noch bessere Methode zur Gewinnung des Antibioticums gemäß der Erfindung ist die Züchtung des Mikroorganismus Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 unter gesteuerten Bedingungen in einem Fermentationsmedium und Extraktion des Mediums nach dem Abtrennen der Feststoffe, nämlich des Mycels oder des Mycels und der suspendierten Nährstoffe. Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird auf denAn even better method for obtaining the antibiotic according to the invention is to cultivate the Microorganism Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 under controlled conditions in one Fermentation medium and extraction of the medium after separating the solids, namely the mycelium or the mycelium and suspended nutrients. The pH of the fermentation liquid is adjusted to the sauren Bereich eingestellt und die Feststoffe, nämlich entweder nur Mycel oder Mycel und suspendierte Nährstoffe, werden abgetrennt Die von "Feststoffen freie Fermentationsflüssigkeit wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel gemischt Nach dem Mischen läßt man die Schichten sich voneinander trennen. Die organische Schicht wird abgezogen, mit einem geeingeten Trockenmittel getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel, wie Petroläther oder Hexan, gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei das Antibioticum FR-02A hinterbleibtacidic area set and the solids, namely either just mycelium or mycelium and suspended Nutrients are separated The fermentation liquid, which is free of solids, is mixed with a Water immiscible polar organic solvent mixed. After mixing, the Layers separate from each other. The organic layer is peeled off, dried with a suitable desiccant and dried to dryness in vacuo evaporated The residue is with a non-polar organic solvent such as petroleum ether or Hexane, washed and air dried, being the antibiotic FR-02A remains
Wenn die Extraktionen bei den oben beschriebenen Verfahren mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, kann man Lösungsmittel, wie Alkylester von niederne Alkancarbonsäuren, wie Methylformiat, Äthylformiat, Methylacetat, Äthylacetat, n-Butylacetat Isobutylacetat, Äthylpropionat, Ketone, wh Cyclohexanon, oder niedere Halogenkohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylenchlorid, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylendichlorid, l-Chlor^-dimethylpropan, Tetrachloräthylen oder Bromoform, verwenden.If the extractions in the procedures described above use a water immiscible polar organic solvents are carried out, one can use solvents such as alkyl esters of lower alkanecarboxylic acids, such as methyl formate, ethyl formate, methyl acetate, ethyl acetate, n-butyl acetate, isobutyl acetate, ethyl propionate, ketones, wh cyclohexanone, or lower halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, ethylene dichloride, l-chloro ^ -dimethylpropane, tetrachlorethylene or bromoform.
Wenn die oben beschriebenen Extraktionsverfahren mit einem polaren organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, kann man Lösungsmittel, wie niedere Alkylester von niederen Alkancarbonsäuren, wie Methylformiat Äthylformiat Methylacetfit, Äthylacetat n-Butylacetat, Isobutylacetat, Äthylpropionat, Ketone, wie Aceton, Methyläthylketon oder Cyclohexanon, oder niedere Halogenkohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylenchlorid, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylendichlorid, 1 -Chlor^-dimethylpropan, Tetrachlorethylen oder Bromoform, verwenden.When the above-described extraction processes are carried out with a polar organic solvent, solvents such as lower Alkyl esters of lower alkanecarboxylic acids, such as methyl formate, ethyl formate, methylacetate, ethyl acetate n-butyl acetate, isobutyl acetate, ethyl propionate, ketones, such as acetone, methyl ethyl ketone or cyclohexanone, or lower halogenated hydrocarbons such as chloroform, Methylene chloride, carbon tetrachloride, ethylene dichloride, 1 -Chlor ^ -dimethylpropane, tetrachlorethylene or Bromoform.
Der Mikroorganismus erzeugt nicht nur FR-02A, sondern, wie aus dem Schrifttum bekannt ist, erzeugt Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 das Antihioticum Cephamycine (vgl »Antimicrobial Agents and Chemotherapy«, September 1972, Seite 122—131, Band 2 Ni 3, »Cephamycins, a New Family of ^-Lactam Antibiotics«, sowie BE-PS 7 64 160). Da FR-02A-,in mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln stark löslich ist, während Cephamycin C in mit Wasser nicht mischbaren organischen I^ösungsrmtteln so gut wie unlöslich ist, lassen sich diese beiden Stoffe leicht voneinander trennen, und man erhält durch Extraktion der Fermentationsflüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel jedes der beiden Antibiotica in einer von dem anderen Antibioticum nicht verunreinigten Form.The microorganism not only produces FR-02A, but, as is known from the literature, produces Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 the antihioticum cephamycine (see »Antimicrobial Agents and Chemotherapy ", September 1972, pp. 122-131, Vol. 2 Ni 3," Cephamycins, a New Family of ^ -Lactam Antibiotics ", as well as BE-PS 7 64 160). Since FR-02A-, in with Water-immiscible organic solvents are highly soluble, while Cephamycin C is in with water Immiscible organic solvents are as good as insoluble, these two substances can easily be separated separate from each other, and obtained by extracting the fermentation liquid with one with water immiscible solvents of either antibiotic in one of the other antibiotic not contaminated form.
Das aus der Fermentationsflüssigkeit isolierte Antibioticum FR-02A wird selbstverständlich weiter durch Chromatographie an einem Molekularsieb und anschließende Chromatographie an einem oberflächenaktiven Adsorptionsmittel gereinigt. Ein hierfür geeignetes Molekularsieb ist ein vernetztes Dextran, wie das Molekularsieb »Sephadex LH-20«. FR-02A kann aus diesem Molekularsieb mit einem niederen Alkanol. wie Methanol, eluiert werden. Ein geeignetes oberflächenaktives Adsorptionsmittel ist ein hydrophobes, nichtionogenes, makroporöses, mit Divinylbenzc-I vernetztes Copolymerisat des Styrols, das unter den Bezeichnungen »Amberlite XAD-I bis XAD-12« im Handel ist. Ein für die Reinigung von FR-02A bevorzugtes Harz ist »XAD-2«. Zum Eluieren des adsorbierten FR-02A geeignete Lösungsmittel sind wäßrige Lösungen von niederen Alkanolen, z. B. wäßrige Lösungen vonThe antibiotic FR-02A isolated from the fermentation liquid is of course carried out further Chromatography on a molecular sieve and subsequent chromatography on a surface-active one Adsorbent cleaned. A suitable molecular sieve for this is a cross-linked dextran like that Molecular sieve »Sephadex LH-20«. FR-02A can be made from this molecular sieve with a lower alkanol. how Methanol. A suitable surface-active adsorbent is a hydrophobic, nonionic, macroporous, crosslinked with divinylbenzc-I Copolymer of styrene which is commercially available under the names "Amberlite XAD-I to XAD-12". A Preferred resin for purification of FR-02A is "XAD-2". To elute the adsorbed FR-02A suitable solvents are aqueous solutions of lower alkanols, e.g. B. aqueous solutions of
Methanol, Äthanol, Isopropanol, Butanol und dergleichen. Das bevorzugte Lösungsmittel zum Eluieren von FR-02A aus dem »XAD-2«-Harz ist eine 50prozentige Lösung von Isopropanol in Wasser.Methanol, ethanol, isopropanol, butanol and the like. The preferred solvent for eluting FR-02A made from "XAD-2" resin is a 50 percent solution of isopropanol in water.
Der Mikroorganismus, der FR-02A erzeugt, ist der s bereits bekannte Stamm Streptomyces lactamdurans NRLL 3802. Er wurde aus einer Bodenprobe isoliert und bei der Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture ίο (früher Northern Regional Research Laboratories), Peoria, Illinois 61604, für die Dauer ohne Beschränkungen der Zugänglichkeit niedergelegt und steht der Öffentlichkeit unter der Kulturnummer NRRL 3802 zur Verfügung. isThe microorganism that produces FR-02A is the already known strain Streptomyces lactamdurans NRLL 3802. It was isolated from a soil sample and placed in the Northern Utilization Culture Collection Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture ίο (formerly Northern Regional Research Laboratories), Peoria, Illinois 61604, for the duration without restrictions on accessibility and is available to the Available to the public under culture number NRRL 3802. is
Vollständige taxonomische und morphologische Studien über Streptomyces lactamdurans finden sich in der BE-PS 7 64 ίδΟ. Aiii Grund νυϊι cäxünüriiisciieri Untersuchungen wurde Streptomyces lactamdurans als neuer Actonomycet identifiziert. Es wurde gefunden, daß er dem Genus Streptomyces angehört und viele Merkmale der bekannter. Species Streptomyces fradiae aufweist Biochemisch stimmen die beiden nahezu vollständig überein; morphologisch sind aber wichtige Unterschiede vorhanden. So ist z. B. die Farbe des Luftmycels von S. fradiae meermuschelrosa, wohingegen S. lactamdurans rahmfarbig ist Auf Grund dieses Unterschiedes und anderer charakteristischer Merkmale wurde dem Mikroorganismus der Speciesname Streptomyces lactamdurans gegeben.Full taxonomic and morphological studies of Streptomyces lactamdurans can be found in the BE-PS 7 64 ίδΟ. Aiii reason νυϊι cäxünüriiisciieri Research has identified Streptomyces lactamdurans as a new Actonomycete. It was found, that it belongs to the genus Streptomyces and has many characteristics of the well-known. Species Streptomyces fradiae exhibits biochemically the two almost completely agree; morphologically, however, are important Differences exist. So is z. B. the color of the aerial mycelium of S. fradiae sea mussel pink, whereas S. lactamdurans is creamy due to this Different and other characteristic features became the species name of the microorganism Streptomyces lactamdurans given.
FR-02A wird bei der aeroben Fermentation eines geeigneten wäßrigen Nährmedium.«; unter gesteuerten Bedingungen durch Beimpfung mit dem Organismus Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 erzeugt. Wäßrige Medien, wie sie für die Erzeugung anderer Antibiotics verwendet werden* eignen sich auch für die Herstellung des Antibioticums FR-02A. Solche Medien enthalten durch den Mikroorganismus assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze. Die Wahl des Mediums ist nicht ausschlaggebend, und die Fermentation kann in Medien durchgeführt werden, die suspendierte Nährstoffe enthalten oder in solchen, die vorwiegend klar und praktisch frei von suspendierten Nährstoffen sind.FR-02A is used in the aerobic fermentation of a suitable aqueous nutrient medium. «; under controlled Conditions created by inoculation with the organism Streptomyces lactamdurans NRRL 3802. Aqueous media such as those used for the generation of others Antibiotics used * are also suitable for the manufacture of the antibiotic FR-02A. Such media contain sources of carbon, nitrogen and inorganic sources that can be assimilated by the microorganism Salts. The choice of medium is not critical and the fermentation can be carried out in media that contain suspended nutrients or those that are predominantly clear and practically free of suspended nutrients.
Im allgemeinen können Kohlehydrate, wie Zucker, z. B. Dextrose, Glucose, Arabinose, Maltose, Raffinose, Xylose, Mannit und dergleichen, und Stärken, wie Korn, ζ. B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, in dem Nährmedium entweder für sich allein oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlen- so stoff verwendet werden. Die genaue Menge der Kohlehydratquelle oder -quellen in dem Medium hängt zum Teil von den anderen Bestandteilen des Mediums ab; im allgemeinen variiert jedoch die Kohlehydratmenge zwischen etwa I und 6 Gewichtsprozent des Mediums. Als C-Quelle kann ein einzelner Stoff verwendet werden, oder man kann mehre C-Quellen in dem Medium miteinander kombinieren. Als N-Quellen bei dem Fermentationsprozeß können viele Proteinstoffe verwendet werden. Geeignete N-Quellen sind z. B. Nährbrühe, Hefeextrakt, Hefehydrolysate, Primärhefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsaaünehl, Caseinhydrolysate, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile oder Tomatenbrei und dergleichen. Die N-Quellen können entweder für sich allein oder m Kombination miteinan- 6S der in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gewichtsprozent des wäßrigen Mediums angewandt werden.In general, carbohydrates such as sugars, e.g. B. dextrose, glucose, arabinose, maltose, raffinose, xylose, mannitol and the like, and starches such as grain, ζ. B. oats, rye, corn starch, corn flour and the like, in the nutrient medium either alone or in combination as sources for assimilable carbon so are used. The exact amount of the carbohydrate source or sources in the medium will depend in part on the other components of the medium; however, in general the amount of carbohydrate will vary between about 1 and 6 percent by weight of the medium. A single substance can be used as the C source, or several C sources can be combined with one another in the medium. Many protein substances can be used as N sources in the fermentation process. Suitable N sources are e.g. B. nutrient broth, yeast extract, yeast hydrolyzates, primary yeast, soybean meal, cottonseed meal, casein hydrolyzates, corn steep liquor, soluble pulp ingredients or tomato paste and the like. The nitrogen sources may be used either alone or m combination with one another the S 6 are applied in amounts of from about 0.2 to 6 weight percent of the aqueous medium.
medien dienen nur zur Erläuterung der Vielzahl der verschiedenen möglichen Medien.media are only used to explain the multitude of different possible media.
Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen von etwa 20 bis 37"C; zur Erzielung der günstigsten Ergebnisse wird die Fermentation jedoch vorzugsweise bei Temperaturen von 24 bis 32° C durchgeführt. Der pH-Wert des Nährmediums für die Züchtung der Kultur von Streptomyces lactamdurans und für die Erzeugung des Antibioticums FR-02A soll im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 liegen.The fermentation takes place at temperatures of about 20 to 37 "C; for the best results however, the fermentation is preferably carried out at temperatures of 24 to 32 ° C. Of the pH of the nutrient medium for growing and producing the culture of Streptomyces lactamdurans of the antibiotic FR-02A is said to be in the range of about 6.0 to 8.0.
Im kleinen Maßstab wird die Fermentation des Antibioticums zweckmäßig durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit der das Antibioticum erzeugenden Kultur beimpft und nach der Übertragung auf das Produktionsmedium die Fermentation mehrere Tage in der Schüttelmaschine bei konstanter Temperatur von etwa 28" C ablaufen läßt Am Ende der iiikuuaiiuiiszcii können das fviycei und die suspendierten Nährstoffe abzentrifugiert oder abfiltriert und mit einem Lösungsmittel extrahiert werden, oder man kann die gesamte Flüssigkeit mit Chloroform oder mit mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeiten extrahieren. Man kann aber auch die Fermentationsflüssigkeit extrahieren, nachdem man die Feststoffe, bestehend aus Mycel oder aus Mycel und suspendierten Nährstoffen, von derselben abgetrennt hat.On a small scale, fermentation of the antibiotic is conveniently carried out by inoculate a suitable nutrient medium with the culture producing the antibiotic and after the transfer on the production medium the fermentation is allowed to proceed for several days in the shaking machine at a constant temperature of about 28 "C. At the end of the iiikuuaiiuiiszcii, the fviycei and the suspended nutrients can be centrifuged or filtered off and with a solvent can be extracted, or the entire liquid can be extracted with chloroform or with Extract water immiscible liquids. But you can also use the fermentation liquid extract after having the solids consisting of mycelium or of mycelium and suspended nutrients, has separated from the same.
Dk- Fermentation wird in kleinem Maßstab in einem sterilisierten Kolben durch einstufige, zweistufige, dreistufige oder vierstufige Impfgutentwicklung durchgeführt. Als Nährmedium für die Impfstufe kann man jede geeignete Kombiantion von C- und N-Quellen verwenden. Der Impfkolben wird 1 bis 2 Tage in einer Kamme- von konstanter Temperatur bei etwa 28" C geschüttelt, und etwas von der erhaltenen Zucht wird zur Beirr, pfung entweder eines zweitstufigen Impf mediums oder des Produktksnsmediums verwendet Wenn man mit Zwischenstufen-1mpfgutentwicklungskolben arbeitet so wird das Impfgut in diesen im wesentlichen in der gleichen Weise entwickelt; d.h., ein Teil des Kolbeninhalts wird zum Beimpfen des Produktionsmediums verwendet Die beimpften Kolben werden mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt, und am Ende der Inkubationszeit wird das Antibioticum FR-02A, wie bereits beschrieben, isoliertDk fermentation is carried out on a small scale in a sterilized flask by one-step, two-step, three-step or four-step inoculum development. Any suitable combination of C and N sources can be used as the nutrient medium for the vaccination stage. The inoculation flask is shaken in a constant temperature chamber at about 28 "C for 1 to 2 days, and some of the culture obtained is used to test either a second-stage inoculation medium or the product medium the inoculum developed in these essentially in the same way; that is, part of the contents of the flask is used for inoculating the production medium.The inoculated flasks are shaken for several days at constant temperature, and at the end of the incubation period the antibiotic FR-02A, as already described , isolated
Im großen Maßstab wird die Fermentation vorzugsweise in geeigneten Fermentern durchgeführt die mit einem Rührer und Einrichtungen zum Belüften des Fermentationsmediums ausgestattet sind. Nach dieser Methode wird das Nährmedium in dem Fermenter zubereitet und durch Erhitzen auf Temperaturen bis etwa 120°C sterilisiert Nach dem Kühlen wird das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezüchteten Impfgut der Zuchtkultur beimpft und die Fermentation mehrere Tage, z.B. 2 bis 4 Tage, unter Bewegung und/oder Belüftung des Nährmedhims und Innehaltung einer Temperatur von etwa 28° C durchgeführt Die Ausbeute an FR-02A beträgt im allgemeinen 20 bis 200 mg je Liter Zuchtvolumen, bestimmt durch Bioanalyse.On a large scale, the fermentation is preferably carried out in suitable fermenters with a stirrer and devices for aerating the fermentation medium are equipped. After this Method, the nutrient medium is prepared in the fermenter and heated to temperatures up to about 120 ° C sterilized After cooling, the sterilized medium is cultured with a previously Inoculate the culture culture inoculated and fermentation for several days, e.g. 2 to 4 days, with movement and / or aeration of the nutrient medium and pause carried out at a temperature of about 28 ° C. The yield of FR-02A is generally from 20 to 200 mg per liter of cultivation volume, determined by bioanalysis.
Die Analysen werden nach derTestblättchen-PIattenmethode unter Verwendung von 9,5-mm-Filterpapierblättchen durchgeführt Die Analysenplatten werden mit Difco-Nähragar und 2,0 g Difco-Hefeextrakt je Liter in einer Menge von 10 ml je Platte hergestellt Eine über Nacht entwickelte Zucht des Testorganismus Vibrio percolans (American Type Culture CollectionAnalyzes are carried out by the test disc plate method using 9.5 mm filter paper discs. The analysis plates are carried out with Difco nutrient agar and 2.0 g Difco yeast extract each Liter made in an amount of 10 ml per plate Cultivation of the test organism Vibrio percolans (American Type Culture Collection
ATCC 8461) in Nährbrühe mit einem Gehalt von 0,2% Hefeextrakt wird in steriler Kochsalzlösung zu einer Suspension mit einer Durchlässigkeit von 40% bei einer Wellenlänge von böO πιμ verdünnt. Vor dem Begießen der Platten wird diese Suspension zu dem Medium in einer Menge von 20 ml je Liter zugesetzt.ATCC 8461) in nutrient broth with a content of 0.2% yeast extract becomes a Diluted suspension with a permeability of 40% at a wavelength of böO πιμ. Before watering this suspension is added to the medium in an amount of 20 ml per liter of the plates.
Die Testplatten werden bis zur Verwendung (maximal 5 "Oge) auf 4° C gehalten. Nach dem Auflegen der mit dem Antibioticum gesättigten Testblättchen werden die Platten 16 bis 24 Stunden bei 280C inkubiert. Die ι ο Hemmungszonen werden in mm Durchmesser abgelesen und zur Bestimmung der relativen Stärke oder, wenn sie mit einer gereinigten Bezugsnorm verglichen werden, der Stärke in y/ml verwendet. Analysen des FR-02A in Fermentationsflüssigkeiten, Mycel und den von den Fermentaitonsflüssigkeiten abgetrennten suspendierten Nährstoffen sowie in den von Nährstoffen freien Fermentationsflüssigkeiten werden nach dem Extrahieren des FR-02A mit einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt. Die Analysen von Lösungen, die FR-02A in einer Konzentration von 200 y/ml enthalten, zeigen bei Verwendung von 9,5-mm-Blättchen Hemmungszonen von 16 mm. Wenn eine solche Analyse quantitativ durchgeführt wird, lassen sich 50 bis 100 y/ml Antibioticum nachweisen. 'The assay plates are (maximum 5 "Oge) maintained at 4 ° C until use. After laying the saturated with the antibiotic test discs, the plates are incubated for 16 to 24 hours at 28 0 C. The ι ο inhibition zones are read in mm diameter and to determine the relative strength or, if compared with a purified reference standard, the strength in y / ml. Analyzes of the FR-02A in fermentation fluids, mycelium and the suspended nutrients separated from the fermentation fluids as well as in the fermentation fluids free of nutrients are carried out according to After extracting the FR-02A with a suitable solvent, the analyzes of solutions containing FR-02A at a concentration of 200 μg / ml show zones of inhibition of 16 mm when using 9.5 mm discs Analysis is carried out quantitatively, 50 to 100 μg / ml antibiotic can be detected. '
FR-02A ist aktiv gegen gram-negative und gram-positive Bakterien, Coccidien und Species von Mycoplasma. In vitro ist FR-02A wirksam gegen E acervulina, Bordetella, Streptococcus faecalis. Streptococcus faecum, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Proteiij vulgaris, M. hyorhinis, M. synoviae, M. arthritidis, M. gallisepticum und Species von Pasteurella. Es wurde auch Aktivität gegen Vibrio percolans (ATCC 8461), Salmonella gallinarum (MB 1287). Escherichia coli (MB 1418), Klebsieila pneumoniae (MB 1264), Pseudomonas stutzen (MB 1231) und (MB 2765), Bacillus subtilis (MB 964) und (MB 7971 Staphylococcus aureus (MB 108), (MB 210) und (MB 703) sowie gegen Pseudomonas aeruginosa (MB 3210) festgestelltFR-02A is active against gram-negative and gram-positive bacteria, coccidia and species of Mycoplasma. In vitro FR-02A is effective against E acervulina, Bordetella, Streptococcus faecalis. Streptococcus faecum, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Proteiij vulgaris, M. hyorhinis, M. synoviae, M. arthritidis, M. gallisepticum and species of Pasteurella. There was also activity against Vibrio percolans (ATCC 8461), Salmonella gallinarum (MB 1287). Escherichia coli (MB 1418), Klebsieila pneumoniae (MB 1264), Pseudomonas stutzen (MB 1231) and (MB 2765), Bacillus subtilis (MB 964) and (MB 7971 Staphylococcus aureus (MB 108), (MB 210) and (MB 703) as well as against Pseudomonas aeruginosa (MB 3210)
FR-02A ist sowohl als Antibioticum als auch als wuchsförderndes Mittel für Tiere verwendbar.FR-02A can be used both as an antibiotic and as a growth-promoting agent for animals.
Wenn FR-02A als Antibioticum verwendet wird, ist die besondere Art der Darreichung an Tiere nicht besonders ausschlaggebend; alle gegenwärtig angewandten oder zur Behandlung von infizierten oder infektionsgefährdeten Tieren zur Verfugung stehenden Methoden sind zufriedenstellend.When FR-02A is used as an antibiotic, the particular way of administration to animals is not particularly crucial; all currently used or used to treat infected or Methods available to animals at risk of infection are satisfactory.
FR-02A kann als Antibioticum, z.B. in Form von pharmazeutischen Präparaten, verwendet werden, die außerdem ein organisches oder anorganisches, festes so oder flüssiges pharmazeutisches Streckmittel enthalten, das sich für die enterale, parenterale oder lokale Darreichung eignet Geeignete Streckmittel sind Stoffe, die mit dem Antibioticum nicht reagieren, z. B. Wasser, Gelatine, Lactose, Stärken, SfearylalkohoL Magnesium- ss stearat, Talkum, pflanzliche öle, Benzylalkohol, Harze, Propylenglykol, Polyalkylenglykole, weißes Petrolatum, Cholesterin oder andere bekannte medizinische Streckmittel. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Salben, Cremes oder Kapseln oder in flussiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Sie können sterilisent werden und/oder Hilfsmittel, wie Konservierungsmittel, Stabilisiermittel, Netz- oder Emulgiermittel, Lösungsvermittler, Salze zum Regeln des osmotischen Druckes oder Puffer, enthalten. -FR-02A can be used as an antibiotic, e.g. in the form of pharmaceutical preparations which also contain an organic or inorganic, solid or liquid pharmaceutical diluent, which is suitable for enteral, parenteral or local administration Suitable extenders are substances who do not react with the antibiotic, e.g. B. water, Gelatin, lactose, starches, sfearyl alcohol, magnesium ss stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohol, resins, Propylene glycol, polyalkylene glycols, white petrolatum, Cholesterol or other known medicinal excipients. The pharmaceutical preparations can, for. B. as Tablets, coated tablets, ointments, creams or capsules or in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. You can be sterilized and / or auxiliaries, such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solubilizers, salts for regulating the osmotic pressure or Buffer, included. -
Wenn das Antibioticum in trockener, fester Einheitsdosisform dargereicht werden sou, verwendet manIf the antibiotic is to be presented in dry, solid unit dose form, then one is used Kapseln, Pillen oder Tabletten, die die gewünschte Menge Antibioticum enthalten. Diese Dosisformen werden hergestellt, indem man den Wirkstoff innig und gleichmäßig mit geeigneten feinteiligen Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, zerfallsfördernden Mittein und/oder Bindemitteln, wie Stärke, Lactose, Talkum, Magnesiumstearat, Pflanzenharzen und dergleichen, mischt. Solche Einheitsdosisformulierungen können je nach Faktoren, wie der Art des zu behandelnden Wirtstieres, der Schwere und Art der Infektion und dem Gewicht des Wirtstieres, hinsichtlich ihres Gesamtgewichts und ihres Gehalts an FR-02A innerhalb weiter Grenzen schwanken. Das Antibioticum kann täglich in Mengen von etwa 5 bis 100 mg je kg Körpergewicht dargereicht werden.Capsules, pills or tablets that contain the desired amount of antibiotic. These dosage forms are prepared by intimately and uniformly the active ingredient with suitable finely divided diluents, fillers, disintegration-promoting agents and / or Binders such as starch, lactose, talc, magnesium stearate, vegetable resins and the like. Such Unit dose formulations may vary depending on factors such as the type of host animal being treated, the The severity and type of infection and the weight of the host animal, in terms of their total weight and theirs The content of FR-02A can vary within wide limits. The antibiotic can be used in amounts of about 5 to 100 mg per kg of body weight can be administered.
Die Erfindung umfaßt auch die nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Salze von FR-02A, z. B. die Alkali- und Erdalkalisalze, wie die Salze von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium, oder Salze mit organischen Basen, wie Triäthylamin, N-Äihyipiperidin und Dibenzyiäthylendiamin.The invention also includes the non-toxic, pharmaceutically acceptable salts of FR-02A, e.g. B. the alkali and alkaline earth salts, such as the salts of sodium, potassium, ammonium and calcium, or salts with organic bases such as triethylamine, N-Äihyipiperidin and Dibenzyiäthylendiamin.
Außer als Antibioticum kann das FR-02A auch als Futterzusatz verwendet werden, um den Wuchs von Tieren, wie Hühnern, Schafen und Rindern, zu beschleunigen. Durch die Anwendung von FR-02A wird die Zeit verkürzt, die erforderlich ist, damit die Tiere das für den Verkauf erforderliche Gewicht erreichen.In addition to being an antibiotic, the FR-02A can also be used as a feed additive to prevent the growth of To speed animals such as chickens, sheep and cattle. By using FR-02A, reduces the time it takes for animals to reach the weight required for sale.
Wenn FR-02A als wuchsförderndes Mittel für Tiere verwendet wird, kann es als Bestandteil des Futters oder in Lösung oder Suspension im Trinkwasser dargereicht werden.When FR-02A is used as a growth enhancer for animals, it can be used as part of feed or be given in solution or suspension in drinking water.
Wenn FR-02A als Bestandteil des Futters verwendet wird, wird es zunächst als Futterzusatz formuliert In solchen Futterzusätzen ist FR-02A in verhältnismäßig hohen Konzentrationen in inniger Verteilung in einem inerten Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Der Futterzusatz kann direkt zu dem Futter zugesetzt oder in einer Verdünnungs- oder Mischstufe zu einer Vormischung verarbeitet werden. Ein inerter Träger ist ein solcher, der mit dem Antibioticum nicht reagiert, und der den Tieren gefahrlos dargereicht werden kann. Vorzugsweise verwendet man einen Träger, der ein Bestandteil der Nahrung der Tiere ist oder sein kann. Typische Träger oder Verdünnungsmittel, die sich für solche Gemische eignen, sind z. B. getrocknete Brennereirückstände, Maismehl, Citrusmehl, Fermentationsrückstände, gemahlene Austernschalen, Weizenmüllereiabfall, lösliche Melassebestadnteile, Maiskolbenmehl, genießbare Bohnenmühlenbeschickung, Sojagrütze, zerkleinerter Kalkstein und dergleichen. Das Antibioticum wird nach Methoden, wie-Rühren, Vermählen oder Umwälzen, innig in dem Träger dispergiert Gemische, die das Antibioticum in Konzentrationen von etwa 5 bis 50 Gewichtsprozent enthalten, eignen sich besonders als Futterzusätze.When FR-02A is used as an ingredient in feed, it is first formulated as a feed additive In such feed additives is FR-02A in relatively high concentrations in an intimate distribution in one contain inert carriers or diluents. The feed additive can be added directly to the feed or be processed into a premix in a dilution or mixing stage. Is an inert carrier one that does not react with the antibiotic and that can be safely administered to the animals. A carrier is preferably used which is or can be a component of the diet of the animals. Typical carriers or diluents suitable for such mixtures are e.g. B. dried distillery residues, corn flour, citrus flour, fermentation residues, ground oyster shells, wheat milling waste, soluble molasses, corn on the cob flour, edible bean mill charge, soy groats, crushed limestone, and the like. The antibiotic is after methods such as stirring, grinding or Agitation, intimately dispersed in the vehicle, mixtures containing the antibiotic in concentrations of about 5 to Contain 50 percent by weight, are particularly suitable as feed additives.
Beispiele für typische Futterzusätze, die FR-02A in Dispersion in einem festen Träger enthalten, sind:Examples of typical feed additives that FR-02A in Dispersion contained in a solid carrier are:
Diese und ähnliche Futterzusätze werden durch gleichmäßiges Vermischen des Antibioticums mit dem Träger hergestelltThese and similar feed additives are made by evenly mixing the antibiotic with the Carrier made
Der Futterzusatz kann direkt zu dem Futter zugesetzt oder durch weiteres Verdünnen oder Mischen mit einemThe feed additive can be added directly to the feed or by further diluting or mixing with one
oral darreichbaren Träger zu einer Vormischung verarbeitet werden. Gemische, die das Antibioticum in Konzentrationen von 0,03 bis 5 Gewichtsprozent enthalten, eignen sich besonders als Vormischungen. Diese Vormischungen werden hergestellt, indem man das Antibioticum gleichmäßig mit einem oral darreichbaren Träger mischt.orally administrable carrier can be processed into a premix. Mixtures containing the antibiotic in Containing concentrations of 0.03 to 5 percent by weight are particularly suitable as premixes. These premixes are made by mixing the antibiotic evenly with an orally administered Carrier mixes.
Solche Zusätze oder Vormischungen werden dem Futter in solchen Mengen beigegeben, daß das fertige Futter das FR-02A in der für die Beschleunigung des ι ο Wachstums erwünschten Konzentration enthält. Für Hühner wird FR-02A in einer Endkonzentration von 50 bis 300 g je Tonne Futter dargereicht, um die gewünschte Beschleunigung des Wachstums zu erzielen. Im Falle von Schweinen, wozu auch mit M. hyorhinis infizierte Schweine gehören, kann FR-02A in dem Futter in ähnlichen Konzentrationen dargereicht werden.Such additives or premixes are added to the feed in such quantities that the finished Lining the FR-02A in for speeding up the ι ο Contains the desired concentration for growth. For chickens, FR-02A is used at a final concentration of 50 Up to 300 g per ton of feed is given in order to achieve the desired acceleration of growth. In the case of pigs, including pigs infected with M. hyorhinis, FR-02A can be used in the Food can be given in similar concentrations.
In der vorstehenden Beschreibung der Erfindung ist in erster Linie auf feste Gemische Bezug genommen worden, bei denen das FR-02A in dem Futterzusatz, der sogenannten Vormischung oder in dem fertigen Futter im Gemisch mit einem genießbaren Träger vorliegt. Dieses ist die bevorzugte Methode zur Darreichung von FR-02A. Eine andere Methode besteht darin, das FR-02A im Trinkwasser der Tiere zu lösen oder zu suspendieren. Die Menge, die in dem Wasser ohne Gefahr eines zu starken Absetzens suspendiert werden kann, ist beschränkt. Man kann daher außerdem Emulgiermittel oder Tenside zusetzen.In the above description of the invention, reference is primarily made to solid mixtures where the FR-02A is in the feed additive, the so-called premix or in the finished feed is in admixture with an edible carrier. This is the preferred method of administering FR-02A. Another method is to dissolve or dissolve the FR-02A in the animals' drinking water suspend. The amount that will be suspended in the water without risk of excessive settling can is limited. You can therefore also add emulsifiers or surfactants.
Die Futterzusätze und fertigen Tierfuttermischungen, die FR-02A enthalten, können außerdem Vitamine, andere Antibiotica und wuchsfördernde Mittel oder andere Nährstoffe enthalten.The feed additives and finished animal feed mixes that contain FR-02A can also contain vitamins, Contain other antibiotics and growth-promoting agents or other nutrients.
FR-02A ist gegen Geflügel-PPLO in Mengen im Bereich von 5 bis 100 mg/kg wirksam. Ein bevorzugter Bereich für eine Einzeldosis beträgt 35 bis 45 mg/kg. Aus Gründen der Einfachheit besteht die bevorzugte Methode der Darreichung des Antibioticums zur Behandlung von PPLO darin, das FR-02A mit dem Tierfutter zu vermisdJen. Für die Bekämpfung von PPLO beträgt ein bevorzugter Bereich 0,0055 bis 0,02 Gewichtsprozent des Futters.FR-02A is against poultry PPLO in amounts in Effective range from 5 to 100 mg / kg. A preferred range for a single dose is 35 to 45 mg / kg. For the sake of simplicity, the preferred method of administering the antibiotic is for Treatment of PPLO in missing the FR-02A with the animal feed. For the fight against PPLO is a preferred range from 0.0055 to 0.02 Weight percent of the feed.
Zur Behandlung von Luftsacculitis bei Hühnern beträgt der ED50-Wert 40 bis 100 mg/kg. Dementsprechend kann die Dosis an FR-02A im Bereich von 10 bis 150 mg/kg variieren.For the treatment of aerial sacculitis in chickens, the ED 50 value is 40 to 100 mg / kg. Accordingly, the dose of FR-02A can vary in the range from 10 to 150 mg / kg.
Eine Lösung oder Suspension für die subkutane Injektion zur Behandlung von Luftsacculitis bei Hühnern kann folgendermaßen hergestellt werden:A solution or suspension for subcutaneous injection used to treat air suction Chickens can be made in the following ways:
Ampulle mit subkutan applizierbarer Lösung oder Suspension, die 20 mg FR-02A enthältAmpoule with subcutaneous solution or suspension containing 20 mg FR-02A
FR-02A 20 mg _5 FR-02A 20 mg _ 5
Verdünnungsmittel:Diluent:
steriles Wasser für die Injektion 2 cm3 sterile water for injection 2 cm 3
Die für die Behandlung von Coccidiose bevorzugte Methode besteht darin, daß man das FR-02A im Futter in einer Konzentration von etwa 0,05 bis 2 Gewichtsprozent des Futters darreichtThe preferred method for treating coccidiosis is to have the FR-02A in the feed in a concentration of about 0.05 to 2 percent by weight of the feed
Die darzureichende Dosis richtet sich natürlich weitgehend nach dem Zustand und dem Gewicht des Wirtstieres, und für die Behandlung von PPLO und Coccidiose wird die orale Darreichung bevorzugt Für die Verwendung als wuchsförderndes Mittel wird das FR-02A vorzugsweise im Gemisch mit dem Futter dargereichtThe correct dose depends largely on the condition and weight of the Host animal, and for the treatment of PPLO and coccidiosis, oral administration is preferred The FR-02A is preferably used as a growth-promoting agent in admixture with the feed presented
Herstellung des Antibioticums FR-02AManufacture of the antibiotic FR-02A
durch Schüttelkoibenfermentation von Streptomyces lactamdurans N RRL 3802by shaking bowl fermentation of Streptomyces lactamdurans N RRL 3802
Als Impfgut dient eine gefriergetrocknete Kultur.A freeze-dried culture is used as the inoculation material.
Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingegeben, der 40 ml erststufiges Impfmedium enthält:The freeze-dried culture is placed in a 250 ml Erlenmeyer flask fitted with three deflectors which contains 40 ml of first-stage inoculation medium:
Erststufiges ImpfmediumFirst stage inoculation medium
Primärhefe in destilliertem Wasser Einstellung des pH-Wertes
mit NaOH auf 7,0Primary yeast in distilled water to adjust the pH
with NaOH to 7.0
1%1%
Der erststufige Impfkolben sowie der darauffolgende zweitstufige Kolben und der Produktionskolben werden in einer mit 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine bei 280C inkubiert.The first stage seed flask and the subsequent second stage piston and the production flasks are incubated in a 220 U / min working shaker at 28 0 C.
Nach 2 Tagen in dem erststufigen Medium wird 1 ml des erststufigen Impfgutes zum Beimpfen von 40 ml des zweitstufigen Impfmediums in einem mit drei Umlenkorganen versehenen, 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet.After 2 days in the first-stage medium, 1 ml of the first-stage inoculum is used to inoculate 40 ml of the two-stage inoculation medium in a 250 ml Erlenmeyer flask equipped with three deflectors used.
Zweitstufiges ImpfmediumSecond stage inoculation medium
»Ardamine YEP« (99F) 1%»Ardamine YEP« (99F) 1%
in destilliertem Wasser;
pH-Wert mit NaOH auf 7,0
eingestellt.in distilled water;
pH to 7.0 with NaOH
set.
Der zweitstufige Impfkolben wird einen Tag inkubiert, worauf man zehn, nicht mit Umlenkorganen versehene 250 ml-Edenmeyerkolben, die je 40 ml Produktionsmedium enthalten, mit je 1 ml dieser Kultur beimpft.The second-stage inoculation flask is incubated for one day, after which ten, not with baffles equipped 250 ml Edenmeyer flasks, each 40 ml Production medium contained, inoculated with 1 ml of this culture each.
Durch Lösen von 12£g Na2S2O3 · 5 H2O in 100 ml destilliertem Wasser wird eine Natriumthiosulfatlösung hergestellt Diese Lösung wird filtersterilisiert, worauf man je 1 ml der Lösung zu den 10 Produktionskolben zusetztA sodium thiosulfate solution is prepared by dissolving 12 g of Na 2 S 2 O 3 · 5 H 2 O in 100 ml of distilled water. This solution is filter-sterilized, after which 1 ml of the solution is added to each of the 10 production flasks
Die 10 Kolben werden 4 Tage bei 28° C inkubiert und dann abgeerntetThe 10 flasks are incubated for 4 days at 28 ° C. and then harvested
Isolierung von FR-02AIsolation of FR-02A
Der pH-Wert von 400 ml der so erhaltenen Fermentationsflüssigkeit wird mit Salzsäure auf 5 eingestellt, worauf man 2 Raumteile Chloroform zu der Flüssigkeit zusetzt Nach gründlichem Vermischen wird die Flüssigkeit durch einen Filterpfropfen filtriert Zur Beschleunigung der Filtration wird Wasser zugesetzt Man läßt das Filtrat stehen, bis sich die Chloroformschicht abgetrennt hat Die Chloroformschicht wirdThe pH of 400 ml of the thus obtained Fermentation liquid is adjusted to 5 with hydrochloric acid, whereupon 2 parts by volume of chloroform are added Add liquid After thorough mixing, the liquid is filtered through a filter plug To accelerate the filtration, water is added. The filtrate is allowed to stand until the chloroform layer appears The chloroform layer has separated
abgezogen, zweimal mit je 500 mi Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird mit 500 ml Petroläther versetzt, abfiltriert, vnit 50 ml Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält 144 mg FR-02A. Das FR-02A wird in das Ammoniumsalz übergeführt, indem eine Lösung des FR-02A in 50 ml Wasser, welches mit Ammoniumhydroxid auf einen pH· Wert von 10 eingestellt worden ist, gefriergetrocknet wird. Nach dem Gefriertrocknen wiegt das Produkt 140 mg.stripped off, washed twice with 500 ml of water each time, dried over anhydrous magnesium sulfate and im Evaporated to dryness in vacuo. The solid residue is mixed with 500 ml of petroleum ether, filtered off, vnit Washed 50 ml of petroleum ether and air-dried. 144 mg of FR-02A are obtained. The FR-02A is built into the The ammonium salt is converted by a solution of the FR-02A in 50 ml of water, which is mixed with ammonium hydroxide has been adjusted to a pH of 10, is freeze-dried. After freeze drying the product weighs 140 mg.
Da FR-02A zusammen mit dem Mycel und den suspendierten Nährstoffen anfällt, kann man das Mycel und die suspendierten Nährstoffe zunächst von der Fermentationsflüssigkeit abfiltrieren und das FR-02A aus dem Filterkuchen mit einem polaren mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Aceton, extrahieren. Diese Methode der Isolierung von FR-02A wird folgendermaßen durchgeführt:Since FR-02A accumulates together with the mycelium and the suspended nutrients, the mycelium and first filter off the suspended nutrients from the fermentation liquid and remove the FR-02A from the filter cake with a polar, water-miscible organic solvent such as acetone, extract. This method of isolating FR-02A is carried out as follows:
Von 400 ml der bei der oben beschriebenen Fermentation erhaltenen gesamten Fermentationsflüssigkeit werden das Mycel und die suspendierten Nährstoffe abfiltriert. Der Filterkuchen wird 30 Minuten mit 40 ml Aceton verrührt und wieder filtriert. Der Kuchen wird dann mit 15 ml Aceton gewaschen. Die vereinigten Acetonextrakte und Waschflüssigkeiten werden im Vakuum bei 300C eingedampft, um das Aceton abzutreiben. Der Rückstand wird in 15 ml Wasser aufgenommen. Der pH-Wjrt wird mit Salzsäure au/ 4,0 eingestelltThe mycelium and the suspended nutrients are filtered off from 400 ml of the total fermentation liquid obtained in the fermentation described above. The filter cake is stirred with 40 ml of acetone for 30 minutes and filtered again. The cake is then washed with 15 ml of acetone. The combined acetone extracts and washings are evaporated in vacuo at 30 0 C to drive off the acetone. The residue is taken up in 15 ml of water. The pH is adjusted to 4.0 with hydrochloric acid
Man setzt ein gleiches Volumen Hexan zu und rührt 10 Minuten. Nach dem Absitzen wird das Hexan dekantiert und vei-worfen. Man extrahiert noch zweimal mit gleichen Volumenmengen an Hexan, wobei der letzte Extrakt farblos istAn equal volume of hexane is added and the mixture is stirred for 10 minutes. After settling, the hexane becomes decanted and thrown. Extract twice more with equal volumes of hexane, the last extract being colorless
Die wäßrige Aufschlämmung wird dann mit einem gleichen Volume« Chloroform extrahiert Dann extrahiert man noch einmal mit einem gleichen Volumen und vereinigt den zweiten Extrakt mit dem ersten. Die wäßrige Phase wird verworfen.The aqueous slurry is then extracted with an equal volume of chloroform. Then extracted one more time with an equal volume and combines the second extract with the first. the aqueous phase is discarded.
Der Chloroformextrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet filtriert und im Vakuum zu 106 mg FR-02A eingedampftThe chloroform extract is dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and added in vacuo 106 mg FR-02A evaporated
Durch Chromatographie des nach dem oben beschriebenen Fermentationsverfahrens gewonnenen Materials an »Sephadex LH-20« wird bestimmt daß die Molekulargewicht des FR-02A etwa 1000 beträgt Das von dieser Behandlung gewonnene Material wird nochmals, dieses Mal an »Amberlite XAD-2«, Chromatographien, um eine analysenreine Probe zu erhalten.Chromatography of the fermentation process described above Material on "Sephadex LH-20" is determined that the molecular weight of the FR-02A is about 1000 Das material obtained from this treatment is again, this time on »Amberlite XAD-2«, chromatographies, to get an analytically pure sample.
Chromatographie an »Sephadex LH-20«-GelChromatography on "Sephadex LH-20" gel
0,5 ml einer Methanollösung, die 106 mg des nach Beispiel 1 gewonnenen FR-02A enthält werden auf eine 75-ml-Schicht (1,25 cm Durchmesser und 56 cm Höhe) »Sephadex-LH-20«-Gel in Methanol aufgetragen. Die Kolonne wird mit Methanol entwickelt Der Eluatstrom wird mit Hilfe eines Differentialrefraktometers überwacht, und das so erhaltene Diagramm zeigt 3 Maxima. Fraktionen werden in 1- bis lOfacher Verdünnung mit 12,7-mm-Papierfalättchen auf Agar-Diffusionstestplatten analysiert, die mit Vibrio percolans beimpft sind. Es werden Hemmungszonen beobachtet, die dem festgestellten dritten Massenmaximum, (Kd = 0,3) entsprechen. Die dem dritten Massenmaximum entsprechenden Fraktionen werden miteinander vereinigt und eingedampftMan erhält 43 mg FR-02A-Wenn das Produkt nach der oben beschriebenen biologischen Agar-Diffusionsmethode mit Vibrio percolans analysiert wird, ergibt es eine Hemmungszone von 16 mm bei einer Konzentration von 200y/ml. Die Ultraviolettabsorption in einer Phosphatpufferlösung mit einem pH von 7,0 ergibt die folgenden Werte;0.5 ml of a methanol solution containing 106 mg of the FR-02A obtained according to Example 1 are applied to a 75 ml layer (1.25 cm in diameter and 56 cm in height) of “Sephadex-LH-20” gel in methanol . The column is developed with methanol. The eluate flow is monitored with the aid of a differential refractometer and the diagram thus obtained shows 3 maxima. Fractions are analyzed in a 1 to 10-fold dilution with 12.7 mm paper flakes on agar diffusion test plates inoculated with Vibrio percolans. Zones of inhibition are observed which correspond to the established third mass maximum (Kd = 0.3). The fractions corresponding to the third mass maximum are combined and evaporated to give 43 mg of FR-02A-If the product is analyzed with Vibrio percolans according to the biological agar diffusion method described above, it gives a zone of inhibition of 16 mm at a concentration of 200 μg / ml. The ultraviolet absorption in a phosphate buffer solution with a pH of 7.0 gives the following values;
λ™,. 327 nm; Ei* =216
Amat. 232 nm; E \ *m = 464λ ™ ,. 327 nm; Egg * = 216
A mat . 232 nm; E \ * m = 464
Wenn das nach Beispiel 1 erhaltene Produkt in ίο Wasser bei einem pH-Wert von 9 (der durch Zusatz von verdünnter Natronlauge eingestellt wird) gelöst, das unlösliche Material abfiltriert und das Filtrat gefriergetrocknet wird, kann man die Reinigung mit »Sephadex LH-20«-Gel fortlassen.If the product obtained according to Example 1 is in ίο water at a pH value of 9 (which is obtained by adding dilute sodium hydroxide solution is set), the insoluble material is filtered off and the filtrate is freeze-dried cleaning with "Sephadex LH-20" gel can be omitted.
Chromatographie an »Amberlite XAD-2«-HarzChromatography on Amberlite XAD-2 resin
Die bei der Reinigung mit »LH-20« gewonnenen 43 mg Produkt werden weiter durch ChromatographieThe 43 mg of product obtained in the purification with "LH-20" are further processed by chromatography
112 cm Höhe) »Amberlite XAD-2«-Harz in 50prozentigem Isopropanol in Wasser gereinigt. Das Ausgangsgut wird auf einen pH-Wert von 2 angesäuert, um es in die freie Säure umzuwandeln, bevor man es in die Kolonne einbringt. Die Kolonne wird mit Hilfe eines Differential-112 cm high) "Amberlite XAD-2" resin in 50 percent Isopropanol purified in water. The starting material is acidified to a pH value of 2 in order to convert it into the to convert free acid before it is introduced into the column. The column is driven with the help of a differential
refraktometers überwacht, und das dabei erhaltene Diagramm zeigt 2 Massenmaxima. Durch Agardiffusion mit 6,4-mm-Testblättchen unter Verwendung von Vibrio percolans durchgeführte biologische Analysen zeigen, daß die bei Kd 3,5 bis 4,0 zentriertenmonitored by a refractometer, and the diagram obtained shows 2 mass maxima. Biological analyzes performed by agar diffusion with 6.4 mm slides using Vibrio percolans show that those centered at Kd 3.5-4.0
Massenmaxima das Antibioticum enthalten. Die Fraktionen, die diesen Ko-Werten entsprechen, werden miteinander verienigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. So erhält man 16,4 mg des Antibioticums FR-02A. FR-02A wird als blaßgelber fester Stoff gewonnen, der gegen die normale Hantierung beständig ist und analytisch rein anfällt.Mass maxima contain the antibiotic. The fractions that correspond to these Ko-values will verienigt together and evaporated to dryness in vacuo. This gives 16.4 mg of the antibiotic FR-02A. FR-02A is obtained as a pale yellow solid material that is resistant to normal handling and is purely analytical.
Herstellung des AntiDioticums FR-02AManufacture of the anti-diotic FR-02A
durch Schüttelkolbenfermentation von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802by shake flask fermentation of Streptomyces lactamdurans NRRL 3802
Als Impfgut dient eine gefriergetrocknete Kulter. Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250-ml-Erl8nmeyerkoiben eingegeben, der 40 ml erststufiges Impfmedium der folgenden Zusammensetzung enthält:A freeze-dried cult is used as inoculation. The freeze-dried culture is put into one with three Deflection organs provided 250 ml Erl8nmeyerkoiben entered the 40 ml first-stage inoculation medium of the contains the following composition:
Erststufiges ImpfmediumFirst stage inoculation medium
Primärhefe in destilliertem Wasser, 1 % mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestelltPrimary yeast in distilled water, 1% with NaOH to pH set from 7.0
Der erststufige Impfkolben sowie der darauffolgende zweitstufige Kolben und der Produktionskolben werden in einer bei 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine bei 28°C inkubiertThe first-stage inoculation flask as well as the subsequent second-stage flask and the production flask become incubated in a shaker operating at 220 rpm at 28 ° C
Nach 2tätiger Inkubation in dem erststufigen MediumAfter 2 days of incubation in the first stage medium
wird 1 ml des erststufigen Impfgutes zum Beimpfen von 40 ml des zweitstufigen Impfmedhims in einem mit drei Umlenkorganen versehenen, 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet1 ml of the first-stage inoculum is used for inoculating 40 ml of the second stage vaccine medication in one with three Deflection organs provided, 250 ml Erlenmeyer flasks used
Zweitstufiges ImpfmediumSecond stage inoculation medium
»ArdamineYEP«(99F) 1%»ArdamineYEP« (99F) 1%
in destilliertem Wasser;
mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestelltin distilled water;
adjusted to pH 7.0 with NaOH
Der zweitstufige Impfkolben wird ehrcn Tag inkubiert, worauf man zehn, nicht mit Umlenkorganen versehene 250-ml-Erlenmeyerkolben, die je 4OmI Produktionsmedium enthalten, mh je 1 ml einer jeden Kultur beimpft öas Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:The second-stage inoculation flask is incubated for a day, after which ten, not with deflecting organs provided 250 ml Erlenmeyer flasks, each 40 ml Production medium included, mh per 1 ml of each Culture inoculates the production medium has the following composition:
»Proflo« 2,8 Gew.-%»Proflo« 2.8% by weight
Dimethylformamid l,4VoL-% in Leitungswasser, mit NaOH auf einen pH-Wert von 73 eingestelltDimethylformamide 1.4% by volume in tap water, with NaOH adjusted to a pH of 73
0,2% 1,0%0.2% 1.0%
Zu jedem Kolben wird vor der Autoklavbehandlung ein Tropfen Schaumverhütungsmittd (»P-2000«) zugesetztA drop of anti-foaming agent (»P-2000«) is added to each flask before being autoclaved
Durch Lösen von 6,25 g Na2S2Os - 5 H2O in 100 ml destilliertem Wasser wird eine Natriumthiosulfatiösung hergestellt Diese Lösung wird filtersteriliseirt, worauf man zu jedem der Produktionskolben nach der Autoklavbehandlung 0,5 ml dieser Natriumthiosuifatiösung zusetztA sodium thiosulfate solution is prepared by dissolving 6.25 g of Na 2 S 2 Os-5 H 2 O in 100 ml of distilled water. This solution is filter-sterilized, after which 0.5 ml of this sodium thiosulfate solution is added to each of the production flasks after the autoclave treatment
Die zehn Produktionskolben (insgesamt 400 ml) werden 5 Tage bei 28° C inkubiert und dann abgeerntetThe ten production flasks (400 ml in total) are incubated for 5 days at 28 ° C. and then harvested
Der Inhalt der zehn Kolben wird vereinigt, der pH-Wert mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt, worauf man 500 ml Chloroform zusetzt und das Gemisch </2 Stunde bei Raumtemperatur rührt Hierauf wird das Gemisch zentrifugiert, um die Phasen voneinander zu trennen, und die wäßrige Phase wird verworfen. Die Chloroformschicht wird Ober wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft Der Rückstand wird mit 30 ml Hexan geschüttelt Nach dem Abzentrifugieren des Rückstandes wird das Hexan dekantiert Der Rückstand wird mit 30 ml Wasser versetzt, die zuvor mit Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 10 eingestellt worden sind, wobei man eine etwas trübe Lösung erhält Für die biologische Analyse wird der pH-Wert sodann mit Salzsäure auf 83 vermindert und die Lösung mit Wasser von einem pH-Wert von 83 für die Analyse nach dem Blättchentest verdünnt Die biologische Analyse ergibt, daß die Ausbeute des Fermentationskolbens 327 γ FR-02A je ml Fermentationsflüssigkeit oder insgesamt 130 mg beträgtThe contents of the ten flasks are combined, the pH is adjusted to 5.5 with hydrochloric acid, whereupon 500 ml of chloroform are added and the mixture is stirred for </ 2 hours at room temperature. The mixture is then centrifuged to separate the phases and the aqueous phase is discarded. The chloroform layer is dried over anhydrous magnesium sulfate and the solvent is evaporated off in vacuo. The residue is shaken with 30 ml of hexane.After the residue is centrifuged off, the hexane is decanted for the biological analysis, the pH value is then reduced to 83 with hydrochloric acid and the solution is diluted with water at a pH value of 83 for the analysis after the disc test. that the yield of the fermentation flask 327 γ FR-02A per ml of fermentation liquid or a total of 130 mg
durch Schüttelkolbenfermentation von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802by shake flask fermentation from Streptomyces lactamdurans NRRL 3802
Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250 ml-Erlenmeyerkolben eingegeben, der 40 ml erststufiges Impf medium der folgenden Zusammensetzung enthält:The freeze-dried culture is placed in a 250 ml Erlenmeyer flask equipped with three deflectors entered, which contains 40 ml of first-stage inoculation medium of the following composition:
Primärhefe in destilliertem Wasser, 1 % mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestelltPrimary yeast in distilled water, 1% with NaOH to pH set from 7.0
Der erststufige Impfkolben sowie der darauffolgende Produktionskolben werden in einer bei 220 U/minThe first-stage inoculation flask and the subsequent production flask are in one at 220 rpm
arbeitenden Schüttelmaschine bei 28°CinkubierLworking shaker at 28 ° C
Nach 2tätiger Inkubation in dem erststufigen Impfmedium werden zehn nicht mit Umlenkorganen versehene 250-ml-Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Produktionsmedium enthalten, welches praktisch frei von suspendierten Nährstoffen ist, mit je ImI des erststufigen Impfmediums beimpft Das Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:After two days of incubation in the first-stage inoculation medium, ten do not have diverting organs equipped 250 ml Erlenmeyer flasks, each 40 ml Contain production medium, which is practically free of suspended nutrients, each with ImI des first-stage inoculation medium The production medium has the following composition:
DextroseDextrose
in destilliertem Wasser.in distilled water.
Zu jedem Kolben wird vor der Autoklavbehandlung ein Tropfen Scbaumverhütnngsmittel (»P-2000«) zugesetztA drop of tree preventive agent (»P-2000«) is added to each flask before being autoclaved
Dann werden die zehn Produktionskolben 5 Tage bei 28° C inkubiert und abgeerntetThe ten production flasks are then incubated for 5 days at 28 ° C. and harvested
Der Inhalt der zehn Produktionskolben (insgesamt 400 ml) wird vereinigt, der pH-Wert mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt und die Fermentationsflüssigkeit filtriert, um das Mycel zu entfernea Das klare Filtrat wird mit 500 ml Chloroform gemischt und '/2 Stunde gerührt Dann wird das Gemisch zentrifugiert, um die Phasen zu trennen, und die wäßrige Phase wird verworfen. Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit 30 ml Hexan gewaschen, worauf man durch Trocknen an der Luft das Antibioticum FR-02A erhältThe contents of the ten production flasks (a total of 400 ml) are combined and the pH value is increased with hydrochloric acid 5.5 adjusted and the fermentation liquid filtered, to remove the mycelia a The clear filtrate is with 500 ml of chloroform mixed and stirred for 1/2 hour. Then the mixture is centrifuged to lock the phases separate and the aqueous phase is discarded. The chloroform layer is dried over anhydrous magnesium sulfate and in vacuo to dryness evaporated. The residue is washed with 30 ml of hexane, whereupon the Receives antibiotic FR-02A
durch Schüttelkolbenfermentation von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802by shake flask fermentation from Streptomyces lactamdurans NRRL 3802
Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingegeben, der 40 ml erststufiges Impfmedium der folgenden Zusammensetzung enthält:The freeze-dried culture is placed in a 250 ml Erlenmeyer flask fitted with three deflectors which contains 40 ml of first-stage inoculation medium of the following composition:
mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestelltwith NaOH to pH set from 7.0
Der erststufige Impfkolben sowie der darauffolgende Produktionskolben werden in einer bei 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine bei 28s C inkubiertThe first-stage inoculation flask and the subsequent production flask are incubated at 28 s C in a shaking machine operating at 220 rpm
Nach 2tätiger Inkubation in dem erststufigen Impfmedium werden zehn nicht mit Umlenkorganen versehene 250-ml-Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Produktionsmedium enthalten, welches praktisch frei von suspendierten Nährstoffen ist, mit je 1 ml des erststufigen Impfmediums beimpft Das Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:After two days of incubation in the first-stage inoculation medium, ten do not have diverting organs equipped 250 ml Erlenmeyer flasks, each containing 40 ml production medium, which is practically free of suspended nutrients is inoculated with 1 ml each of the first-stage inoculation medium.The production medium has the following composition:
DextroseDextrose
in destilliertem Wasser.in distilled water.
0,8% 0,2% 1,0%0.8% 0.2% 1.0%
Zu jedem Kolben wird vor der Autoklavbehandlung ein Tropfen Schaumverhütungsmittel (»P-2000«) zugesetztA drop of anti-foaming agent (»P-2000«) is added to each flask before being autoclaved
Dann werden die zehn Produktionskolben 5 Tage bei 28oCmkubiert und abgeerntetThen the ten production flasks are harvested 5 days at 28 o Cmkubiert and
Der Inhalt der zehn Produktionskolben (insgesamt 400 ml) wird vereinigt, der pH-Wert mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt und das Gemisch filtriert um das Mycel zu gewinnen. Das Mycel wird mit 500 ml Chloroform extrahiert Der Chloroformextrakt wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit 30 ml Hexan gewaschen, und durch Trocknen an der Luft erhält man das Antibioticum FR-02A.The contents of the ten production flasks (a total of 400 ml) are combined and the pH value is increased with hydrochloric acid 5.5 adjusted and the mixture filtered to win the mycelium. The mycelium is mixed with 500 ml of chloroform extracted The chloroform extract is dried over anhydrous magnesium sulfate and in vacuo to Evaporated to dryness. The residue is washed with 30 ml of hexane, and dried in air the antibiotic FR-02A is obtained.
durch Schüttelkolbenfermentation von Streptonsyces !actsmdurans NRRL3802by shake flask fermentation by Streptonsyces! actsmdurans NRRL3802
Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250 ml-Erlenmeyerkolben eingegeben, der 4OmI erststufiges Impfmedium der folgenden Zusammensetzung enthält:The freeze-dried culture is put into one with three 250 ml Erlenmeyer flasks fitted with deflection organs entered, the 4OmI first-stage inoculation medium of the contains the following composition:
Primärhefe in destilliertem Wasser, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestelltPrimary yeast in distilled water, with NaOH to pH set from 7.0
1%1%
DextroseDextrose
in destilliertem Wasser.in distilled water.
03% 0,2% 1,0%03% 0.2% 1.0%
durch Schüttelkolbenfermentation . vonStreptomyceslactamdüransNRRL3802by shake flask fermentation . by Streptomyces lactam durans NRRL3802
Als Impfgut dient eme gefriergetrocknete Kultur. Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250-mI-ErIenmeyerköIben eingegeben, der 40 ml erststufiges Impfmedium der ίο folgenden Zusammensetzung enthält:A freeze-dried culture is used as the inoculation material. The freeze-dried culture is placed in a 250 ml ErIenmeyer flask equipped with three deflectors entered, which contains 40 ml first-stage inoculation medium of the following composition:
1515th
Primärhefe in destilliertem Wasser, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestelltPrimary yeast in distilled water, with NaOH to pH set from 7.0
1%1%
Der erststufige Impfkolben sowie der darauffolgende zweitstufige Kolben und der Produktionskolben v^xlen in einer bei 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine bei 28°C inkubiertThe first-stage inoculation flask and the following one second stage piston and the production piston v ^ xlen incubated in a shaker operating at 220 rpm at 28 ° C
einem mit drei Umlenkorganen versehenen, 250 mlone with three deflectors, 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendetErlenmeyer flask used
3030th
Der .ratstufige Impfkolben sowie die darauffolgenden Produktionskolben werden in einer bei 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine bei 280C inkubiertThe .ratstufige seed flask and the subsequent production flasks are incubated in a 220 U / min working shaker at 28 0 C
Nach 2tägiger Inkubation in dem erststufigen Impfmediuin werden zehn nicht mit Umlenkorganen versehene 250-mI-ErIenmeyerkolben, die je 40 ml Produktionsmedium enthalten, welches praktisch frei <o von suspendierten Nährstoffen ist, mit je 1 ml des erststufigen Impfmediums beimpft Das Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:After 2 days of incubation in the first stage Impfmediuin be ten not provided with deflection members 250 mI-Erlenmeyer flask containing 40 ml of production medium which is substantially free <o suspended nutrients ml with 1 of the first stage seed medium inoculated The production medium has the following composition :
Zu jedem Kolben wird vor der Autoklavbehandlung ein Tropfen Schaumverhütungsmittel (»P-2000«) zugesetztEach flask is used before autoclaving a drop of anti-foaming agent (»P-2000«) added
Dann werden die zehn Produktionskolben 5 Tage bei 28° C inkubiert und abgeerntet.Then the ten production flasks are at for 5 days Incubated at 28 ° C and harvested.
Der Inhalt der zehn Produktionskolben (ingesamt 400 ml) wird vereinigt und der pH-Wert mit Sahsäure auf 54 eingestellt Nach Zusatz von 500 ml Chloroform wird das Gemisch '/2 Stunde bei Raumtemperatur gerührt Dann wird das Gemisch zentrifugiert, um die Phasen voneinander zu trennen, und die wäßrige Phase wird verworfen. Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 30 ml Hexan gewaschen und an der Luft getrocknet. So erhält man das Antibioticum FR-02A.The contents of the ten production flasks (in total 400 ml) is combined and the pH value is adjusted to 54 with acidic acid. After the addition of 500 ml of chloroform the mixture is 1/2 hour at room temperature then the mixture is centrifuged to separate the phases and the aqueous phase is discarded. The chloroform layer is dried over anhydrous magnesium sulfate and im Evaporated to dryness in vacuo. The residue is washed with 30 ml of hexane and air-dried. This is how you get the antibiotic FR-02A.
»Ardamine YEP« (99F) in destilliertem Wasser, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt»Ardamine YEP« (99F) in distilled water, with NaOH to pH set from 7.0
1%1%
4545
5050
Der zweitstufige Impfkolben wird einen Tag inkubiert, worauf man zehn nicht mit Umlenkorganen versehene 250 ml-Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Produktionsmediumenthalten, mit je 1 ml einer jeden Kultur beimpft Das Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:The second-stage inoculation flask is incubated for one day, after which you do not have to do ten with deflectors equipped 250 ml Erlenmeyer flasks, each containing 40 ml of production medium, with 1 ml of each Culture inoculated The production medium has the following composition:
»Proflo« 2fi Gew.-%"Proflo" 2fi % by weight
Dimethylformamid 1,4 Vol.-% in Leitungswasser, mit NaOH auf einen pH- Wert von 73 eingestelltDimethylformamide 1.4% by volume in tap water, with NaOH adjusted to a pH of 73
Zu jedem Kolben wird vor der Autoklavbehandlung ein Tropfen Schaumverhütungsmittel (»Ρ>~·800«) zugesetztA drop of anti-foaming agent (»Ρ> ~ · 800«) is added to each flask before being autoclaved
Durch Lösen von 6,25 g NaiS^ · 5 H2O in 100 ml destilliertem Wasser wird eine Natriumthiosulfatlösung hergestellt Diese Lösung wird filtersterilisiert, worauf man zu jedem der Produktionskolben nach der Autoklavbehandlung 04 ml dieser Natriumthiosulfatlösung zusetztBy dissolving 6.25 g NaiS ^ · 5 H 2 O in 100 ml distilled water, a sodium thiosulfate solution is prepared This solution is filter sterilized, followed by adding to each of the production flask by autoclaving 04 ml of sodium thiosulfate solution
Die zehn Produktionskolben (insgesamt 400 ml) werden 5 Tage bei 28" C inkubiert und dann abgeerntetThe ten production flasks (a total of 400 ml) are incubated for 5 days at 28 ° C. and then harvested
Der Inhalt der zehn Kolben wird vereinigt, der pH-Wert mit Salzsäure auf 54 eingestellt, und das Mycel sowie die suspendierten Nährstoffe werden von der Fermentationsflüssigkeit abfiltriert Das Filtrat wird mit 500 ml Chloroform gemischt und '/j Stunde gerührt. Das Gemisch wird zentrifugiert, um die Phasen zu trennen, worauf man die wäßrige Phase verwirft. DieThe contents of the ten flasks are combined, the pH adjusted to 54 with hydrochloric acid, and the mycelium and the suspended nutrients are filtered off from the fermentation liquid. The filtrate is with 500 ml of chloroform mixed and stirred for an hour. The mixture is centrifuged to lock the phases separate, whereupon the aqueous phase is discarded. the
Chloroformschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgetrieben. Der Rückstand wird nut 30 ml Hexan gewaschen. Durch Lufttrocknen erhält man das Antibioticum FR-02A.The chloroform layer is dried over anhydrous magnesium sulfate and the solvent is dried in vacuo aborted. The residue is only 30 ml of hexane washed. The antibiotic FR-02A is obtained by air drying.
Die Elementaranalyse des FR-02A liefert das folgende Ergebnis:The elemental analysis of the FR-02A provides the following result:
C = 60,98%, H = 7,60%, N = 2,60%.C = 60.98%, H = 7.60%, N = 2.60%.
1515th
Die empirische Formel ist C59H90—95N2O21. Dies steht in Obereinstimmung mit dem durch Massenspektrometrie bestimmten Molekulargewicht von 1168.The empirical formula is C59H90-95N2O21. This stands in agreement with the molecular weight of 1168 as determined by mass spectrometry.
In Form seoes Ammoniumsalzes ist das FR-02A in 20 Tabelle I AjIr0I20! und iB Chloroform löslich. Bei pH-Werten von 7,0 oder mehr ist es mäßig löslich in Wasser. Das Ultraviolettspektrum des Ammoniumsalzes in Wasser zeigt die folgenden Kennwerte:In the form of its ammonium salt, the FR-02A is shown in Table 20 I AjIr 0 I 20 ! and iB chloroform soluble. At pH 7.0 or more, it is sparingly soluble in water. The ultraviolet spectrum of the ammonium salt in water shows the following characteristics:
Xn^ 233 nm;£}L =320 = 180 X n ^ 233 nm; £} L = 320 = 180
Das FR-02A ist ein praktisch reines Material, da es bei der Dünnschichtchromatographie nur einen einzigen Fleck liefert und bei der Überwachung der Analyse in der »LH-20«-Kolonne lind in der »XAD-2«-Kolonne mit dem Refraktometer ein einziges Profil von Gaußseher Form ergibt ■■The FR-02A is a practically pure material because it is at thin layer chromatography only provides a single spot and when monitoring the analysis in the "LH-20" column is in the "XAD-2" column with the refractometer a single profile of Gaussian shape gives ■■
. Um das FR-02A weiter in vitro zu kennzeichnen, werden ssine Aktivitätsdaten unter Verwendung eines Profils des antibiotischen Spektrums bestüvmt Zur Durchführung dieses Tests wird ein Tropfen des Antibioticums von etwa 0,015 ml Inhalt auf die Oberfläche von beimpften Komplex-Agarplatten aufgebracht Das FR-02A liegt dabei in Lösung in lOprozentigem Methanol vor, welches für allem keine Hemmzone erzeugt Die Ergebnisse finden sich in Tabelle I als Hemmzonen in Millimeter.. To further characterize the FR-02A in vitro, ssine activity data are collected using a Profile of the antibiotic spectrum bestüvmt Zur To carry out this test, a drop of approximately 0.015 ml of the antibiotic is placed on the Surface of inoculated complex agar plates applied. The FR-02A is in solution in 10 percent methanol, which does not create any inhibition zone for anything. The results can be found in Table I as inhibition zones in millimeters.
Profile des antibiotischen Spektrums von FR-02 A beim Agar-DiffusionstestProfiles of the antibiotic spectrum of FR-02 A at Agar diffusion test
Das kernmagnetische Resonanzspektrum des Antibioticums FR-C2A wird bei 100 MHz in CDCI3 als Lösungsmittel mit Tetramethylsilan (TMS) als innerem Standard aufgenommen. Repräsentative Merkmale des Spektrums sind Dublette bti J ,21,1.31 und 4,63 τ und ein Singulettbei4,87T.The nuclear magnetic resonance spectrum of the antibiotic FR-C2A is recorded at 100 MHz in CDCI 3 as the solvent with tetramethylsilane (TMS) as the internal standard. Representative features of the spectrum are doublets bti J, 21.1.31 and 4.63 τ and a singlet at 4.87T.
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibioticums FR-02A in Nujol ist in der Fig. 1 dargestellt FR-02A zeigt eine charkaterisitsche Absorption im Infrarot des Spektrums bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm-':The infrared absorption spectrum of the antibiotic FR-02A in Nujol is shown in Fig. 1 FR-02A shows a characteristic absorption in the infrared of the spectrum at the following wavelengths, expressed in cm- ':
starke Banden bei 1640,1460,1380,1080 und 1020,strong bands at 1640, 1460, 1380, 1080 and 1020, vorspringende Banden bei 1550, 1505, 1240, 1195,protruding bands at 1550, 1505, 1240, 1195, 940,860,720,620.940,860,720,620.
FR-02A wurde nach verschiedenen Analysenmethoden mit den folgenden Ergebnissen untersucht:FR-02A was examined by various analytical methods with the following results:
1. »LH-20«-Kolonne in
Methylalkohol1. "LH-20" column in
Methyl alcohol
(aufgegeben als NH„+-Salze) /CD=0302(abandoned as NH " + salts) / C D = 0302
2. »XAD-2«-Kolonne;
50prozentiges lsopropanol
in Wasser2. "XAD-2"column;
50 percent isopropanol
in water
(als freie Säure aufgegeben);(abandoned as a free acid);
Austreten bei DV.=3,5 bis 4,0Exit at DV. = 3.5 to 4.0
3. Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel, eluiert mit
einem Gemisch aus3. Thin layer chromatography on silica gel, eluted with
a mixture of
80 Teilen Chloroform,80 parts of chloroform,
20 Teilen Methylalkohol und20 parts of methyl alcohol and
1 Teil konzentriertem NH4OH Rf=0,3441 part concentrated NH 4 OH R f = 0.344
4. Papierchromatographie
mit einem Gemisch aus
70 Teilen lsopropanol und
30 Teilen Phosphatpuffer4. Paper chromatography
with a mixture of
70 parts isopropanol and
30 parts of phosphate buffer
(pH =6,0; 0,01-molar) Rr=0,9(pH = 6.0; 0.01 molar) Rr = 0.9
Durchmesser der Hemmzonen, mmDiameter of the zones of inhibition, mm
FR-02A 1 rag/mlFR-02A 1 rag / ml
30 Bacillus sp. 633
Proteus vulgarus 1012
Pseudomonas aeruginosa 979
Serratia marcescens 252 30 Bacillus sp. 633
Proteus vulgarus 1012
Pseudomonas aeruginosa 979
Serratia marcescens 252
Staphylococcus aureus 108
Bacillus substilis 964
Sarcina lutea 1101
Staphylococcus aureus 698*)
Streptococcus faecalis 753Staphylococcus aureus 108
Bacillus substilis 964
Sarcina lutea 1101
Staphylococcus aureus 698 *)
Streptococcus faecalis 753
Alcaligenes faecalis 10
Brucella bronchiseptica 965
Salmonella gallinarum 1287
Vibrio percolans 1272
Xanthomonas vesicatoria 815
Escherichia coli 1418
Ps. stutzen 1231
Klebsieila pneumoniae 1264
Aerobacter aerogenes 835
Erwinia atroseptica 1159
Corynebact. pseudodipht. 261
S. aureus 3032
S. aureus 2756
Strep, faecium 2820
Proteus vulgaris 838
E. coli 60Alcaligenes faecalis 10
Brucella bronchiseptica 965
Salmonella gallinarum 1287
Vibrio percolans 1272
Xanthomonas vesicatoria 815
Escherichia coli 1418
Ps. Stutzen 1231
Klebsieila pneumoniae 1264
Aerobacter aerogenes 835
Erwinia atroseptica 1159
Corynebact. pseudodipht. 261
S. aureus 3032
S. aureus 2756
Strep, faecium 2820
Proteus vulgaris 838
E. coli 60
4545
5050
5555
6060
S. aureus (res. Erythromycin) 1909S. aureus (res. Erythromycin) 1909
1818th
1010
Ϊ0ΗΪ0Η
1OH1OH
1111th
1919th
2828
12H12H
1111th
1919th
1818th
1313th
2121
1313th
1515th
1010
1616
1313th
1212th
2727
1212th
2323
2020th
1818th
1010
1616
*)Resistent gegen Streptomycin, Streptothricin, Neomycin und Viomycin.*) Resistant to streptomycin, streptothricin, neomycin and viomycin.
Bei der Untersuchung an Mäusen zeigt das Antibioticum FR-02A in vivo eine geringere Toxizität und ein breites Spektrum der antibakteriellen Aktivität. Je ein Beispiel der Ergebnisse für ein gram-negatives und ein gram-positives Bakterium sind in Tabelle II zusammengefaßt. When examined on mice, the antibiotic FR-02A shows a lower toxicity and in vivo a wide range of antibacterial activity. An example of the results for a gram-negative and a a gram-positive bacterium are summarized in Table II.
I- ■ ■ ;!§§ Strep, pyogenes J
I- ■ ■ ; !
*) Die. Werte der ti jjigen T?iibelle sind in mg je Versuchstier ausgedruckt Sowohl die Infektion als auch die Darreichung der therapeutischen Do«; j;c von FR-02 A erfolgt introperitoneaL FR-02 A wird einmal zum Zeitpunkt der Infektion und dann nochmals nach 6 Stundeini dargerefc&t.*) The. Values in the current table are expressed in mg per test animal. Both the infection and the administration of the therapeutic Do"; j; c of FR-02 A occurs introperitoneaL FR-02 A occurs once at the time of infection and then again after 6 hours.
**) Die Toxiritätstitiitersuchungen mit FR-02 A an nicht infizierten Mäusen ergeben, daß zwei Dosen zu je 2,5 mg je Versuchstier, die in eiaeiin Zeitabstaad von 6 Stunden dargereicht werden, von den Tieren vertragen werden, höhere Dosen, nämlich 5 bis 10 mg je Versuchstier, jedoch toxisch sind.**) The toxicity tests with FR-02 A on uninfected mice show that two doses of 2.5 mg per test animal, which are administered every 6 hours, are tolerated by the animals, higher doses, namely 5 to 10 mg per test animal, but are toxic.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings
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