DE69818482T2

DE69818482T2 - Physiologisch aktive substanzen tkr2449, verfahren zu ihrer herstellung und mikroorganismen

Info

Publication number: DE69818482T2
Application number: DE69818482T
Authority: DE
Inventors: Kazutoh Otsu-shi TAKESAKO; Mitsuhiro Kusatsu-shi UENO; Naoyuki Kusatsu-shi AWAZU; Yoko Otsu-shi UNO; Ikunoshin Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-06-09
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2018-06-10
Also published as: AU7552098A; EP1002793B1; DE69818482D1; ES2209140T3; JP4091130B2; EP1002793A1; WO1998056755A1; EP1002793A4; US6303350B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Analogon/Analoga der biologisch aktiven Substanzen TKR2449, welche für ein therapeutisches Mittel für Pilzinfektionskrankheiten und Immunstörungen von Nutzen sind, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Mikroorganismen, die in der Lage sind, die biologisch aktiven Substanzen TKR2449 herzustellen.
HINTERGRUND DES FACHGEBIETS
Es ist bekannt, dass Pilze verschiedene Infektionskrankheiten beim Menschen, bei Tieren und Pflanzen hervorrufen. Beim Menschen verursachen sie zum Beispiel eine oberflächliche Mykose, die die Haut, die Mundhöhle, etc. beeinträchtigt, sowie eine systemische Mykose, die die Eingeweide, das Gehirn etc. beeinträchtigt. Diese verursachen bei Haus- und Nutztieren ebenfalls ähnliche Infektionen. Des Weiteren haben Pilze verschiedene schädliche Auswirkungen auf Pflanzen wie Obstbäume und Gemüsepflanzen.
Als hauptsächliche pathogene Pilze, die eine systemische Mykose beim Menschen hervorrufen, sind unter anderem jene der Gattung Candida, Cryptotoccus und Aspergillus bekannt. Was die oberflächliche Mykose betrifft, werden die Gattung Candida, die die Haut, die Mundhöhle und Vagina befällt und Trichophyton, die die Haut der Extremitäten infiziert, als die hauptpathogenen Pilze betrachtet. Außer diesen Pilzen gibt es in der Umgebung viele andere Pilze und es wird vermutet, dass sie die Tiere und Pflanzen kontaminieren.
Seit kurzem nehmen allergische Beschwerden, einschließlich Asthma, atopische Dermatitis und allergische Rhinitis rapide zu. Es gibt viele allergische Beschwerden, bei welchen verschiedene Substanzen in der Umgebung, wie Milben und alle Arten von Pollen, oder Antigene, die in der Nahrung enthalten sind, als Allergene wirken. Es gibt auch viele allergische Beschwerden, die durch Pilze verursacht werden sowie Allergene, die von Candida, Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Malassezia, Penicillium, etc. abgeleitet werden und durch sie verursacht werden. Des Weiteren sind abgesehen von allergischen Beschwerden viele Immunkrankheiten, bei denen Immunantworten verstärkt werden, bekannt.
Als Antimykotika zur Verwendung bei der Prävention und Behandlung derartiger Pilzinfektionen und Kontaminierungen, sind heutzutage nur sehr wenige bekannt. Von diesen können als therapeutische Wirkstoffe für die systemische Mykose bei Tieren, vor allem einschließlich des Menschen, zum Beispiel Amphotericin B, Flucytosin, Miconazol, und Fluconazol erwähnt werden. Diese Verbindungen sind jedoch hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, ihres toxischen Potenzials oder ihres antifungalen Spektrums nicht völlig zufriedenstellend, da sie als therapeutische Wirkstoffe nicht unfehlbar sind.
Obwohl es für Immunkrankheiten, einschließlich allergischer Beschwerden, eine Vielzahl an Arzneimitteln gibt, können sie verschiedene Immunkrankheiten nicht ausreichend behandeln. Im Besonderen gibt es nur wenige Wirkstoffe, die mehrere gute Funktionen wie eine Aktivität zur Kontrolle von Immunkrankheiten und eine antifungale Aktivität haben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In Anbetracht der vorstehend erwähnten Einführung in das Fachgebiet hat die vorliegende Endung zum Ziel, neue biologisch aktive Substanzen bereitzustellen, die als therapeutisches Mittel bei Pilzinfektionen und Immunstörungen wertvoll sind.
Auf der Suche nach einer neuen biologisch aktiven Substanz isolierten die Erfinder eine große Anzahl an Mikroorganismen aus der Natur, isolierten die biologisch aktiven Substanzen, die diese herstellten und untersuchten ihre biologischen Eigenschaften. Als Ergebnis entdeckten sie, dass die Kulturbrühe eines Mikroorganismenstammes, der zur Gattung Aureobasidium gehört, eine biologische aktive Substanz enthält, die antifungale Aktivität gegen pathogene Pilze einschließlich Candida albicans und Cryptococcus neoformans hat. Dementsprechend isolierten die Erfinder diese biologisch aktive Substanz und untersuchten ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften. Als Ergebnis entdeckten sie, dass die vorstehende Substanz eine neue Substanz ist, die verschiedene physikalischchemische Eigenschaften hat, welche zuvor noch nicht in der Literatur erwähnt wurden, und nannten sie TKR2449. Des Weiteren entdeckten sie, dass TKR2449 eine biologisch aktive Wirkung auf ein Immunsystem zeigt und vervollständigten die vorliegende Erfindung.
Die vorliegende Erfindung ist deshalb auf ein Analogon/Analoga der biologisch aktiven Substanz TKR2449, die durch die folgende allgemeine Formel (A) dargestellt ist, ausgerichtet;
(In der Formel sind R₁, R₂ und R₃ gleich oder unterscheiden sich voneinander, und jeder stellt Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit der Kohlenstoffanzahl von 2–4 dar. R₄ ist eine lineare oder eine verzweigte Alkyl- oder Alkenylgruppe mit der Kohlenstoffanzahl 1 bis 8.)
Die vorliegende Erfindung ist des Weiteren auf ein Verfahren zur Herstellung der biologisch aktiven Substanz TKR2449 ausgerichtet, was die Züchtung eines Mikroorganismemstammes umfasst, der zur Gattung Aureobasidium gehört und der in der Lage ist, die biologisch aktiven Substanz TKR2449 herzustellen und die Isolierung der Zielsubstanz von der entstehenden Kulturbrühe.
Zusätzlich ist die vorliegende Erfindung auf einen Mikroorganismus, der zur Gattung Aureobasidium gehört, und der in der Lage ist, die biologisch aktive Substanz TKR2449 herzustellen, ausgerichtet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das das ultraviolette Absorptionsspektrum der biologisch aktiven Substanz TKR2449 zeigt, worin die Ordinate die Absorption und die Abszisse die Wellenlänge (nm) darstellt.
2 ist ein Diagramm, das das infrarote Absorptionsspektrum der biologisch aktiven Substanz TKR2449 zeigt, worin die Ordinate die Transmission (%) und die Abszisse die Wellenanzahl (cm^–1) darstellt.
3 ist ein Diagramm, das das ¹H-NMR-Spektrum der biologisch aktiven Substanz TKR2449 zeigt, worin die Ordinate die Signalintensität und die Abszisse die chemische Verschiebung (ppm) darstellt.
4 ist ein Diagramm, das das ¹³C-NMR-Spektrum der biologisch aktiven Substanz TKR2449 zeigt, worin die Ordinate die Signalintensität und die Abszisse die chemische Verschiebung (ppm) darstellt.
5 ist ein HPLC-Diagramm der biologisch aktiven Substanz TKR2449, die ihre Elutionsposition zeigt, worin die Ordinate die relative UV-Intensität und die Abszisse die Retentionszeit (Min) darstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Analogon/die Analoga der biologisch aktiven Substanzen TKR2449, die durch die vorstehend beschriebene allgemeine Formel (A) dargestellt wird.
In der vorstehend beschriebenen allgemeinen Formel (A) sind R₁, R₂ und R₃ gleich oder unterscheiden sich voneinander, und jeder stellt Wasserstoff oder eine verzweigte Alkylgruppe mit der Kohlenstoffanzahl 1 bis 4 dar. Die Alkylgruppe mit der Kohlenstoffanzahl 1 bis 4 ist nicht auf sie beschränkt, aber umfasst Methyl-, Ehtyl-, Propyl-, n-Butyl- und i-Butylgruppen. Vorzugsweise sind R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff.
In der vorstehend beschriebenen allgemeinen Formel (A) ist R₄ eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenylgruppe, die eine Kohlenstoffanzahl von 1 bis 8 hat. Die lineare oder verzweigte Alkylgruppe, die eine Kohlenstoffanzahl von 1 bis 8 hat, ist nicht auf sie beschränkt, aber umfasst Methyl-, Ehtyl-, Propyl-, n-Butyl- und i-Butylgruppen. Die lineare oder verzweigte Alkenylgruppe, die eine Kohlenstoffanzahl von 1 bis 8 hat, ist nicht auf sie beschränkt, aber umfasst Vinyl- und Allylgruppen. Bevorzugt ist R₄ -CH₂-CH=C-(CH₃)₂. In der vorstehend beschriebenen allgemeinen Formel (A) ist die Substanz, die Wasserstoff als R₁, R₂ und R₃ und -CH₂-CH=C-(CH₃)₂ als R₄ hat, die biologisch aktive Substanz TKR2449, dargestellt durch die folgende Formel (I).
Die vorstehend beschriebene biologisch aktive Substanz TKR2449 hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften (1), (2), (3), (4), und (5).

(1) Massenspektrum durch FAB-MS ergibt einen Peak bei m/z 660 ([M + H]⁺
(2) Die Kohlenstoffanzahl ist 36 und die Stickstoffanzahl ist eins.
(3) Das UV-Spektrum in Methanol zeigt, dass die Haupt-Absorptions-Wellenlängen (nm) 226 nm und 277 nm sind und ihr E ^1%1 cm 73 beziehungsweise 10 sind.
(4) Das IR-Spektrum durch das KBr-Verfahren zeigt, dass die Haupt-Wellenlängenzahlen 3420 cm^–1, 2930 cm^–1, 2850 cm^–1, 1720 cm^–1, 1510 cm^–1, 1380 cm^–1, 1240 cm^–1, 1200 cm^–1, 1140 cm^–1, 1070 cm^–1, 840 cm^–1 und 720 cm^–1 sind.
(5) Löslich in Methanol und Chloroform und schwach löslich in Wasser und Hexan.

Die vorstehend erwähnte biologisch aktive Substanz TKR2449 hat das in 3 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum und das in 4 gezeigte ¹³C-NMR-Spektrum und solche Eigenschaften, dass sie in der Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an der in 5 angezeigten Position eluiert wird.
Die vorstehend erwähnte biologisch aktive Substanz TKR2449 kann durch Züchtung eines Mikroorganismenstammes, der zur Gattung Aureobasidium gehört und der in der Lage ist, die biologisch aktive Substanz TKR2449 herzustellen, und durch Isolieren der Substanz von der entstehenden Kulturbrühe produziert werden. Zusätzlich können TKR2449-Analoga, die durch die allgemeine Formel (A) dargestellt werden, von der vorstehend erwähnten biologisch aktiven Substanz TKR2449, die als Startermaterial durch die nachstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden, erhalten werden.
Zum Beispiel kann durch Behandlung der vorstehend erwähnten biologisch aktiven Substanz TKR2449 mit Trimethylsilyl-Diazomethan (TMSCHN₂) in einem Lösungsgemisch aus Benzen und Methanol ein Methylester-Derivat (R₁ = R₂ = R₃ = CH₃) erhalten werden. Das entsprechende Ester-Derivat (R₁ = R₂ = R₃ = CH₃) kann durch Reaktion desselben mit verschiedenen Alkoholen (R-OH) in Dimethyl-Formamid (DMF) in Gegenwart eines Kondensierungsmittels umfassend Dicyclohexyl-Carbodiimid (DCC) erhalten werden.
R₄ in der vorstehenden allgemeinen Formel (A) kann durch Behandlung mit einem Wasserstoffhalogenid einschließlich Wasserstoffiodid (HI) oder mit einer Base einschließlich Natrium-Methodxid (CH₃ONa) oder durch Behandlung mit Natriumiodid (NaI) und Tetrachlorsilan (SiCl₄) in einem Lösungsgemisch aus Dichlormethan und Aceton entfernt werden. Nach dem Entfernen kann durch Herstellen eines Methylesterderivats (R₁ = R₂ = R₃ = CH₃) das entsprechende Etherderivat (-O-R₄) durch Reaktion mit Natriumhydrid (NaH) und verschiedenen Alkylhalogeniden (R₄-X; X = I, Br, Cl) oder mit verschiedenen Alkyl-Trichloracetimidestern (R₄OC(=NH)CCl₃) erhalten werden. Danach werden -COOR₁, -COOR₂ und -COOR₃ entfernt, um zum Beispiel durch Behandlung mit Basen einschließlich NaOH in Methanol freie Carboxylgruppen zu erhalten.
Es gibt hinsichtlich des Mikroorganismenstammes, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, keine Beschränkung, es wird lediglich vorausgesetzt, dass er zur Gattung Aureobasidium gehört und das TKR2449 herstellen kann. Demnach kann zum Beispiel Aureobasidium sp. TKR2449 (im Folgenden als der Stamm TKR2449 bezeichnet) erwähnt werden.
Der vorstehend erwähnte Stamm TKR2449 ist ein neuer Stamm, der hierzuvor nicht in der Literatur beschrieben wurde und wurde erstmals durch die Erfinder isoliert und charakterisiert. Der Stamm hat die Eigenschaft TKR2449 vorteilhaft herzustellen. Die mykologischen Eigenschaften des vorstehend erwähnten Stammes TKR2449 werden nun detailliert beschrieben. Die Kolonienfarben des Stammes TKR2449 auf verschiedenen Medien sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Beschreibungen der Farben in der Tabelle basieren auf jenen, die in den japanischen Industriestandardverfahren (JIS Z 8102 (1985) vorgeschrieben sind und zeigen die Ergebnisse der Beobachtungen an den Tagen 4, 7 und 14 der Züchtung bei 25°C nach Inokulierung in den entsprechenden Medien. Der Durchmesser der Kolonien wurde nach 14 Tagen Züchtung gemessen.
Tabelle 1
Der vorstehende Stamm TKR2449 wächst mäßig auf Malzagar und YpSs-Agar etc. Seine Kolonie glitzert in der Mitte und ist im Allgemeinen viskos oder teigig, wird jedoch mit den Tagen der Züchtung manchmal ledrig. Rund um die Kolonien werden oft rhizoidähnliche Strukturen gebildet. Die Farbe der Kolonien ist am Anfang der Züchtung weiß und verändert sich dann stufenweise von blassgelb in elfenbeinfarben und wird dann im Verlauf der Zeit dunkelgrau-gelbgrün bis dunkelgrün-grau. Nach weiteren Tagen wird die Farbe der Kolonien braun bis dunkelbraun. Dieses Pigment ist unlöslich.
Die Hyphen haben einen Durchmesser von 2 bis 3 mm und verlängern sich bei gutem Wachstum, sie bilden jedoch keine Luftmycele und verlängern sich in die Agarmedien. Oft werden vom Kopf oder von der Seite der Hyphen wie Fingerspitzen Blastokonidien mit einer Größe von 3–4 × 3–8 mm gebildet oder manchmal auch ballähnliche Cluster beobachtet. Junge vegetative Zellen sehen hefeähnlich aus, mit einer Größe von 2–4 × 5–14 mm, die Form ist ellipsenförmig oder zitronenförmig und sie wachsen durch polyblastische Knospung. Arthrosporen mit einer Größe von 4–6 × 8–10 mm und Chlamydosporen mit einer Größe von 4–8 × 8–16 mm werden gebildet, und Ascosporen werden nicht gebildet.
Von den mykologischen Eigenschaften des Stammes TKR2449 werden seine physiologischen Eigenschaften wie folgt beschrieben.
Temperaturbereich für Wachstum: Der Temperaturbereich für Wachstum ist 10 bis 30°C und der optimale Temperaturbereich ist etwa 25°C.
Der pH-Bereich für Wachstum: Der pH-Bereich für Wachstum ist pH 3 bis 8 und der optimale pH-Bereich ist pH 4 bis 7.
Wenn man die vorstehenden mykologischen Eigenschaften mit den Beschreibungen der Gattung Aureobasidium in W. B. Cooke, Mycopathologia et Mycologia Applicata, 17, 1– 43 (1962); J. A. von Arx, The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture, J. Cramer, Lehre; E. J. Hermanides-Nijhoff, Studies in Mycology, 15, 141–166, CBS, Baarn (1977); und anderer Literatur vergleicht, kann der Stamm TKR2449 als ein Stamm identifiziert werden, der zur Gattung Aureobasidium gehört.
Es hat jedoch kein Bericht einen Mikroorganismenstamm erwähnt, der zur Gattung Aureobasidium gehört und die Fähigkeit besitzt, TKR2449 herzustellen. Deshalb betrachteten die Erfinder ihn als einen neuen Stamm und nannten ihn Aureobasidium sp. TKR2449. Der Stamm wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology (Adresse, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan (Postleitzahl 305-8566) unter der Zugangsnummer FERM BP-6327 hinterlegt (Originaldatum der Hinterlegung: 4. Juni 1997, Datum der Nachfrage zum Transfer in eine internationale Hinterlegung: 20. April 1998).
Die vorliegende Endung kann nicht nur mit dem vorstehend erwähnten Stamm TKR2449 ausgeführt werden, sondern auch mit jeder spontanen oder künstlichen Mutante des Stammes TKR2449 oder jedem anderen Mikroorganismenstamm, der zur Gattung Aureobasidium gehört und die Fähigkeit besitzt, TKR2449 herzustellen.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird TKR2449 durch Inokulieren und Züchten eines TKR2449-herstellenden Stammes in einem Nährmedium hergestellt. Nährstoffe, die für das Medium verwendet werden können, umfassen verschiedene Kohlenstoffquellen wie Glucose, Fructose, Saccharose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Molassen, dicken Malzsirup, Öle und Fette und organische Säuren. Diese Stoffe können voneinander unabhängig oder in einer geeigneten Kombination davon verwendet werden.
Nährstoffe, welche für das Medium verwendet werden können, umfassen Stickstoffquellen, organische und anorganische Stickstoffverbindungen wie Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser, Kasein, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Weizenkeime, Harnstoff, Aminosäuren, Ammoniumsalze etc. Salze als Nährstoffe sind verschiedene anorganische Salze wie Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Phosphorsäuresalze, etc. Diese Stoffe können voneinander unabhängig oder in einer geeigneten Kombination davon verwendet werden.
Wo nötig kann das Nährstoffmedium mit Schwermetallsalzen wie Eisensalzen, Kupfersalzen, Zinksalzen, Kobaltsalzen etc. ergänzt werden, sowie mit Vitaminen wie Biotin, Vitamin B₁, etc., und anderen organischen und anorganischen Stoffen, die das Wachstum der Mikroorganismen unterstützen und die Herstellung von TKR2449 fördern könnten.
Zusätzlich zu den vorstehenden Nährstoffen können ein Antischaummittel und/oder ein Oberflächenmittel, zum Beispiel Silikonöl, Polyalkylen-Glycolether, etc. zu dem vorstehend erwähnten Nährstoffinedium zugesetzt werden.
Bei der Züchtung eines Mikroorganismenstammes, der in der Lage ist, TKR2449 in dem Nährstoffmedium herzustellen, können verschiedene Verfahren, die im Allgemeinen für die Herstellung von biologisch aktiven Substanzen durch die Züchtung von Mikroorganismen genutzt werden, verwendet werden. Unter diesen wird die Flüssigkultur, insbesondere die Schüttelkultur oder die aerobe Submerskultur bevorzugt.
Die Züchtung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 25°C durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums kann im Bereich von pH 3 bis 8 liegen und liegt vorzugsweise etwa bei pH 5. In Anbetracht der Inkubationszeit kann im Allgemeinen bei einer Züchtungszeit von 3 bis 15 Tagen ein ausreichender Ertrag der Substanz erwartet werden.
Durch die vorstehend erwähnte Züchtung ist TKR2449 sowohl intrazellulär als auch extrazellulär enthalten und wird in der Kulturbrühe angereichert. In der vorliegenden Erfindung kann das in der Kulturbrühe angereicherte TKR2449 aus der Brühe durch [solierung unter Ausnutzung seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften und, wenn notwendig, durch weitere Reinigung gewonnen werden.
Die vorstehend erwähnte Isolierung kann durch Extraktion der gesamten Brühe mit einem nicht-hydrophilen organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat, Butylacetat, Chloroform, Butanol, Methyl-Isobutyl oder Ähnliche erreicht werden. Als Alternative ist es möglich, die Brühe einer Zentrifugation oder Filtration zu unterziehen, um in Medium und Zellen zu trennen und die biologisch aktiven Substanzen jeweils vom Medium und den Zellen zu isolieren.
Das TKR2449 kann von dem getrennten Medium nicht nur durch das Extraktionsverfahren, bei dem das vorstehend erwähnte nicht-hydrophile organische Lösungsmittel verwendet wird, sondern auch durch das Verfahren, das ein Inkontaktbringen des Mediums mit einem Adsorbens umfasst, um das TKR2449 an das Adsorbens adsorbieren zu lassen und Eluieren mit einem Lösungsmittel isoliert werden. Das Adsorbens umfasst, zum Beispiel, aktivierten Kohlenstoff, Cellulosepulver und Adsorptionsharze. Als das vorstehend erwähnte Lösungsmittel können gemäß der Art und Eigenschaften des Adsorbens verschiedene Lösungsmittel entweder einzeln oder in Kombination selektiv verwendet werden. Demnach kann eine geeignete Kombination einer wässrigen Lösung aus wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln wie wässrigem Aceton, wässrigem Alkohol etc. verwendet werden.
Für die Isolierung von TKR2449 von den getrennten Mikroorganismen, kann das Extraktionsverfahren, das ein hydrophiles organisches Lösungsmittel wie Aceton verwendet, verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung kann, wenn nötig, dem Rohextrakt von TKR2449 ein Reinigungsverfahren angeschlossen werden. Die Reinigung kann mit den Verfahren, die im Allgemeinen zur Isolierung und Reinigung von fettlöslichen biologisch aktiven Substanzen verwendet werden, durchgeführt werden. Als solche Verfahren können die Säulenchromatographie, oder die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Säule, die mit einer stationären Phase wie Siliciumgel, aktivierter Tonerde, Aktivkohle, Adsorptionsharz etc. gepackt ist, erwähnt werden. Das Elutionsmittel, welches für die Siliciumgel-Säulenchromatographie verwendet werden kann, umfasst Chloroform, Ethylacetat, Methanol, Aceton, Wasser, etc. Sie können in Kombination von zweien oder mehreren davon verwendet werden.
Das Harz für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie umfasst chemisch abgeleitetes Siliciumgel wie Siliciumgel-Derivate mit Octadecyl- Octyl- oder Phenylgruppen; und poröse Polystyrol-Polymergele, wohingegen die mobile Phase, die verwendet werden kann, wässrige Lösungen von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln wie wässriges Methanol, wässriges Acetonitril, etc. umfasst. TKR2449-Analoga der vorliegenden Erfindung können jeweils als solche oder in der Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes in medizinischen Anwendungen in Verwendung gebracht werden. Es gibt keine bestimmte Begrenzung hinsichtlich des Salzes, vorausgesetzt, es ist ein pharmazeutisch verträgliches Salz. Demnach umfasst das Salz Salze von mineralischen Säuren wie salzsaurer Säure, schwefelsaurer Säure, salpetrischer Säure, phophorsaurer Säure, fluorwasserstoffsaurer Säure, bromwasserstoffsaurer Säure, etc.; Salze von organischen Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Weinsteinsäure, Milchsäure, Zitronensäue, Fumarsäure, Maleinsäure, Sukzinsäure, Methan-Sulfonsäure, Ethan-Sulfonsäure, Benzen-Sulfonsäure, Toluen-Sulfonsäure, Naphthalen-Sulfonsäure, Kampher-Sulfonsäure, etc.; und Salz von Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen wie Natrium, Kalium, Calcium, etc.
Für die Verabreichung der TKR-Analoga oder seinem pharmakologisch verträglichen Salz als Wirkstoff, kann ein TKR2449-Analogum/können TKR2449-Analoga oder sein/ihr pharmakologisch verträgliches Salz entweder als solches oder in Form eines Arzneimittels, welches typischerweise 0,1 bis 99,5%, vorzugsweise 0,5 bis 90% davon in einem pharmazeutisch verträglichen, nicht toxischen und inerten Träger enthält, an Tiere einschließlich des Menschen verabreicht werden.
Der vorstehend erwähnte Träger umfasst feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllmaterialien, andere Formulierungs-Hilfsmittel, etc. und solche Träger können allein oder in Kombination verwendet werden.
Das vorstehend erwähnte Arzneimittel wird vorzugsweise in Form von Einheitsdosierungen angewendet und kann oral, parenteral, topisch (z. B. transdermal) oder rektal verabreicht werden. Natürlich sollten diese Arzneimittel in Dosierungsformen verabreicht werden, die für den jeweiligen Anwendungsweg passend sind.
Für die Verabreichung der TKR-Analoga der vorliegenden Erfindung oder sein pharmakologisch verträgliches Salz als Wirkstoff wird die Dosis als antifungales Mittel vorzugsweise mit Hinblick auf Patientenfaktoren wie Alter und Körpergewicht, Anwendungsweg, An und Schwere der Krankheit, etc. ausgewählt. Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis des aktiven Bestandteils für einen erwachsenen Patienten jedoch üblicherweise 10 bis 2000 mg. Während in manchen Fällen eine tägliche Dosis, die unter dem vorstehend erwähnten Bereich liegt, ausreichend sein kann, kann in anderen Fällen eine Dosis, die über dem vorstehend erwähnten Bereich liegt, erforderlich sein. Wird eine hohe Dosis verwendet, so wird die tägliche Dosierung vorzugsweise in mehreren getrennten Dosen verabreicht.
Die orale Verabreichung kann unter Verwendung von festen, pulvrigen oder flüssigen Einheitsdosierungsformen durchgeführt werden und es können zum Beispiel Grob-Pulver, Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropfen, sublinguale Tabletten und andere Dosierungsformen verwendet werden.
Für die parenterale Verabreichung können flüssige Einheitsdosierungsformen für die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung, typischerweise Lösungen und Suspensionen, verwendet werden. Diese Präparate können durch Suspension oder Lösen einer vorher bestimmten Menge an TKR2449-Analog(a) der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon in einem nicht-toxischen flüssigen Träger, der geeignet ist für die Injektion, zum Beispiel als wässriges Medium oder als öliges Medium und durch Sterilisieren der entstandenen Suspension oder Lösung hergestellt werden.
Die topische Verabreichung (z. B. transdermale Verabreichung) kann unter Verwendung topischer Verwendungsformen wie Flüssigkeiten, Cremes, Pulvern, Pasten, Gelen und Salben durchgeführt werden. Diese Dosierungsformen können unter Verwendung einer vorher bestimmten Menge an TKR2449-Analog(a) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon in Kombination mit einem oder mehreren aus entweder Parfum, Färbemittel, Füllmaterial, Oberflächenmittel, Feuchthaltemittel, erweichendes Mittel, Geliermittel, Träger, Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, etc., welches für externe Dosierungsformulierungen von Nutzen ist, hergestellt werden.
Die rektale Verabreichung, welche vorstehend erwähnt wurde, kann zum Beispiel unter Verwendung von Zäpfchen durchgeführt werden, wobei in jedem eine vorher bestimmte Menge an TKR2449-Analog(a) oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon mit einer bei niedrigen Temperaturen schmelzenden festen Base wie höheren Estern, z. B. Myristyl-Palmitat, Polyethylengylcol, Kakaobutter oder ein Gemisch davon vermischt ist.
DIE BESTE ART, DIE ERFINDUNG AUSZUFÜHREN
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter, sind jedoch hinsichtlich des Ziels der Erfindung auf keine Weise limitierend.
Beispiel 1
Eine Öse voll mit dem Stamm TKR2449 (FERM BP-6327) von einer Schräg-Kultur wurde verwendet, um in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben, der 100 ml Flüssigmedium (Difco Kartoffel-Dextrose-Brühe, 1,4% (Gew.-%)) enthielt, zu inokulieren und 3 Tage bei 25°C auf einem Schüttler inkubiert, um eine Impfkultur herzustellen. 1,0 ml dieser Impfkultur wurde auf 8 Erlenmeyer-Kolben von jeweils 500 ml Kapazität überführt, welche 125 ml desselben Flüssigmediums wie vorstehend erwähnt enthielten und 12 Tage bei 25°C (unter Schütteln bei 220 UpM) inkubiert. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert und der Überstand wurde von den Zellen getrennt. Der Überstand wurde auf eine Säule (0,5 1) von Diaion HP20 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.) aufgebracht, die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit 2 l 80%igem Methanol eluiert, um eine aktive Fraktion zu erhalten. Die Fraktion wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 205 mg eines Restes zu erhalten.
Der Rest wurde in 0,8 ml Methanol gelöst und einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie unterzogen, um eine aktive Fraktion bereitzustellen. Die Fraktion wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 6,8 mg als Weißpulver zu erhalten. Die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie wurde unter der folgenden Bedingungen durchgeführt.
Gerät: LC-8A (Shimadzu)
Säule: YMCPack C 18 (2,0 cm × 25 cm) (YMC)
Mobile Phase: 70% (Vol./Vol.) Acetonitril/Wasser, das 0,05% trifluorsaure Säure enthielt.
Physikalisch-chemische Eigenschaften
Durch einen JMS-DX302-Massenspektrometer (Jeol. Ltd.) wurde eine Massenspektrometrie durchgeführt. ¹H-NMR (in deuteriertem Methanol, mit Tetramethylsilan als Bezugspunkt) und ¹³C-NMR (in deuteriertem Methanol, mit Tetramethylsilan als Bezugspunkt) wurden durch einen nuklearen JNM-A500 Resonanzspektrometer (Jeol. Ltd.) durchgeführt. Eine Ultraviolett-Spektrometrie (in Methanol) wurde durch einen selbst aufnehmenden UV-250 Spektrophotometer (Shimadzu) durchgeführt, und eine Infrarot-Absorptions-Sptektrometrie (KBr-Verfahren) wurde durch einen 270–30-Infrarot-Spektrophotometer (Hitachi) durchgeführt. Die physikalischchemischen Eigenschaften der Substanz TKR2449 werden im Folgenden beschrieben.
(1) Massenspektrometrie
Es wurde durch FAB-MS-Massenspektrometrie herausgefunden, dass das gereinigte weiße pulverige Produkt, das durch Vakuumkonzentration der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie erhalten wurde, eine Substanz mit m/z 660 [M + H]⁺ ist.
(2) Anzahl an Kohlenstoffen und Stickstoffen
Es wurde durch ¹H-NMR und ¹³C-NMR und ihre Analysen herausgefunden, dass die Kohlenstoffanzahl des gereinigten weißen pulverigen Produkts, welches durch Vakuumkonzentration der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie erhalten wurde, 36 ist und die Stickstoffanzahl 1 ist. Das ¹H-NMR- und ¹³C-NMR-Spektrum dieses Produkts sind in 3 beziehungsweise 4 gezeigt.
(3) Ultraviolettes Absorptionsspektrum
Die UV-Absorption in Methanol des gereinigten weißen pulverigen Produkts, welches durch Vakuumkonzentration der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie erhalten wurde, ergab folgendes:
(UV (nm)(E 1%/1 cm): 226(73), 277(10)
Das UV- Absorptionsspektrum ist in 1 gezeigt.
(4) Infrarot-Absorptionsspektrum
Das Ergebnis der IR-Absorptionsspektrophotometrie durch das KBr-Verfahren des gereinigten weißen pulverigen Produkts, welches durch Vakuumkonzentration der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie erhalten wurde, wurde im Folgenden erwähnt.
IR (Kbr) (cm^–1): 3420, 2930, 2850, 1720, 1510, 1380, 1240, 1200, 1140, 1070, 840, 720.
Das IR-Absorptionsspektrum ist in 2 gezeigt.
Was die Löslichkeit des erhaltenen TKR2449 in verschiedenen Lösungsmitteln betrifft, es war löslich in Methanol und Chloroform, jedoch schwach löslich in Hexan und Wasser.
Basierend auf der vorstehenden Analyse wurde das gereinigte weiße pulverige Produkt, welches durch Vakuumkonzentration der aktiven Fraktion in der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie erhalten wurde, als TKR2449 identifiziert.
Das vorstehende TKR2449 wurde durch Umkehrphasen-Verteilungs-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) unter Verwendung einer LC-10A-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (Shimadzu) analysiert. Diese HPLC-Analyse wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
Säule: CAPCELL Pak C₁₈(6 mm × 150 mm) (Shiseido)
Mobile Phase: 70% (Vol./Vol.) Acetonitril/Wasser, welches 0,05% trifluorsaure Säure enthielt.
Säulentemperatur: 40°C
Nachweis der UV-Wellenlänge: 220 nm
Als Ergebnis wurde das vorstehende TKR2449 in der Position eluiert, die in 5 angegeben ist.
Biologische Eigenschaften
(1) Antifungale Aktivität
Die antifungalen Spektren des vorstehenden TKR2449 gegen verschiedene Mikroorganismen wurden bestimmt. Unter Verwendung des Flüssigmedium- Verdünnungsverfahrens wurde die Konzentration, die eine im Wesentlichen vollständige Hemmung des fungalen Wachstums verursacht, als die minimale inhibitorische Konzentration (μg/ml) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die minimale Konzentration, die eine partielle Hemmung des fungalen Wachstums verursacht, wurde als sub-inhibitorische Konzentration (μg/ml) bestimmt und wird in Klammern in Tabelle 2 gezeigt. In der Tabelle steht YNBG für ein YNBG-Medium, das 0,67% einer Hefe-Stickstoffbase (Difco) und 1,0% Glucose enthält.
Tabelle 2
Aus Tabelle 2 wird ersichtlich, dass die biologisch aktive Substanz TKR2449 gemäß der vorliegenden Erfindung gegen pathogene Pilze wie Candida albicans, Candida kefyr Cryptococcus neoformans etc. aktiv ist.
(2) Inhibitorische Aktivität der gemischten Lymphocyten-Reaktion (MLR)
Die Milz von C57BL/6-Mäusen und BALB/c-Mäusen wurden jeweils genommen und in einem Medium homogenisiert, so dass eine Zellsuspension entstand. Die Zellsuspension der C57BL/6-Mäuse wurde durch eine Nylonwoll-Säule passiert, wodurch ein Präparat, das reich an T-Zellen (Responderzellen) war, entstand. Die Zellsuspension der BALB/c-Mäuse wurde durch Röntgenstrahlen bestrahlt und als Stimulatorzellen verwendet. Die Responderzellen und die Stimulatorzellen wurden in einem Verhältnis von 1 : 1 vermischt und in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Nach 4-tägiger Inkubierung wurde ³H-Thymidin zugesetzt. Nach weiterer Inkubierung von einem Tag wurden die Zellen geerntet. Die Menge an eingeschlossenem ³H-Thymidin wurde gemessen. Testproben, die durch Verdünnung einer Lesung in Dimethylsulfoxid hergestellt wurden, so dass Lösungen von 500, 125, 31,2 und 7,8 μg/ml mit Kulturmedium entstanden, wurden zu 0,5% zusgesetzt, wenn die Responderzellen und die Stimulatorzellen vermischt wurden, und die Endkonzentrationen lagen bei 25 bis 0,039 μg/ml. Die inhibitorische Aktivität wurde im Vergleich mit der Menge, die ohne Testprobe eingeschlossen wurde, berechnet. TKR2449 zeigte eine dosisabhängige inhibitorische Aktivität von MLR und die Konzentration, die eine 50%ige Inhibition zeigte, lag bei 0,15 μg/ml, was zeigt, dass es eine inhibitorische Wirkung auf die Immunantwort hat.
Die intraperitoneale Verabreichung des vorstehend erhaltenen TKR2449 in einer Dosis von 50 mg/kg an ICR-Mäuse verursachte keine Anzeichen einer Toxizität.
Beispiel 2. Herstellung eines methylierten TKR2449 (R₁ = R₂ = R₃ = CH₃)
TKR2449 (5,0 mg, 7,6 μMol) wurde in Methanolbenzen (2 : 8, 50 μl) gelöst. Zu der Lösung wurde Trimethyl-Diazomethan (10%ige Lösung in Hexan, 50 μl, 44 μMol) wurde bei Raumtemperatur zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2,5 Stunden gerührt und 10% Essigsäure wurde zugesetzt, bis es klar wurde und das Trimethyl-Diazomethan sich zersetzte. Danach wurde das Gemisch unter reduziertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde in 400 μl Methanol gelöst und einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterzogen. Die Fraktion, die das methylierte TKR2449 enthielt, wurde unter reduziertem Druck konzentriert und erbrachte 1,9 mg einer gereinigten Substanz als weißes Pulver. Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
Gerät: LC-8A (Shimadzu)
Säule: CAPCELL PAK C₁₈(10 mm × 250 mm) (Shiseido)
Mobile Phase: 70% (Vol./Vol.) Acetonitril/Wasser, welches 0,05% trifluorsaure Säure enthielt.
FAB-MS: m/z 701 [M + H]⁺
INDUSTRIELLE VERWENDBARKEIT
Die vorliegende Erfindung stellt das Analogon/die Analoga der biologisch aktiven Substanzen TKR2449 zur Verfügung, welche in der klinischen Medizin von Nutzen sind, zum Beispiel bei der Therapie von fungalen Infektionskrankheiten oder Immunstörungen und ein Verfahren zur Herstellung davon.

Claims

Analogon der biologisch aktiven Substanz TKR2449, das durch die folgende allgemeine Formel (A) dargestellt ist;
(wobei in der Formel R₁, R₂ und R₃ gleich oder verschieden voneinander sind und jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen; R₄ ein linearer oder verzweigter Alkyl- oder Alkenylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist).
Analogon der biologisch aktiven Substanz TKR2449 nach Anspruch 1, wobei R₁, R₂ und R₃ ein Wasserstoffatom darstellen und R₄ ein Rest der Formel -CH₂-CH=C-(CH₃)₂ ist.
Verfahren zur Herstellung der biologisch aktiven Substanz TKR2449, wobei das Verfahren das Züchten eines Mikroorganismusstammes, der zur Gattung Aureobasidium gehört und eine biologisch aktive Substanz TKR2449 wie in Anspruch 1 definiert produzieren kann, und das Isolieren der Substanz von der resultierenden Kulturbrühe umfasst.
Mikroorganismus, der zur Gattung Aureobasidium gehört und eine biologisch aktive Substanz TKR2449 wie in Anspruch 1 definiert produzieren kann.
Verwendung einer biologisch aktiven Substanz nach Anspruch 5 für die Herstellung eines therapeutischen Mittels gegen Immunstörungen.
Mikroorganismus nach Anspruch 4, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem TKR2449-Stamm, spontanen Mutanten davon und künstlichen Mutanten davon.