Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren itir Herstellung eines neuen Antibiotikums benannt als S 151 durch aerobe Züchtung eines das Antibiotikum S 15-1 erzeugenden, zur Art Streptomyces gehördenden Stammes oder dessen Mutanten in einem für die Erzeugung des Antibiotikums geeigneten Kulturmedium und durch Gewinnung des so erzeugten Antibiotikums S 15-1 aus der Kultur.
Das erfindungsgemäss erzeugte Antibiotikum S 15-1 ist ein neues Antibiotikum mit weiter unten angeführten Eigenschaften und welches das Wachstum von grampositiven, gramnegativen und säurehaltbaren Bakterien verhindert. Wenn das Antibiotikum bei einer hohen Konzentration verwendet wird, verhindert es das Wachstum von Schimmel, Hefen und ähnlichen Pilzen. Im weiteren verhindert es das Wachstum von Viruskulturen in Geweben, wie die Newcastle-Viruskrankheit und ähnliche. Es wird deshalb angenommen, dass eine gründliche Prüfung genannten Antibiotikums S 15-1 für die Vorbeugung des menschlichen und tierischen Körpers vor Infektionen mit Bakterien und Viren nützlich ist.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums S 15-1 zu liefern.
Der im vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren verwendete Mikroorganismus ist ein Stamm der Gattung Streptomyces, welcher im Nährboden für dieselbe das Antibiotikum S 15-1 in einer zur Gewinnung genügenden Menge erzeugt. Als solcher Stamm der Gattung Streptomyces kann beispielsweise angesehen werden ein Mikroorganismus, welcher zuerst aus der Erde in den Vorstädten von Sendai City, Miyagi Prefecture, Japan, isoliert wurde. Dieser Mikroorganismus ist ein S 15-1 Stamm, welcher als zu Streptomyces griseocarneus gehörenden identifiziert werden konnte. Der Streptomyces griseocarneus S-15-1-Stamm hat die weiter unten angeführten mykologischen Eigenschaften. Er wurde hinterlegt im Fermentation Research Institute, Agency ofIndustrial Science and Technology, Chiba City, Japan unter der Bezeichnung FERM-P No.
706. Dieser Stamm wurde auch hinterlegt im United States Department of Agriculture, Northern Regional Research Laboratory, at Peoria, Illinois, United States of America unter der No. NRRL 5311; eine Probe dieses Mikroorganismus kann aus oben genannten Forschungslaboratorien erhalten werden. Die Hinterlegung in oben genannten Laboratorien wurde so vorgenommen, dass sämtliche Einschränkungen bezüglich der Zugänglichkeit sofort nach Erteilung des Patentes unwiderruflich entfernt werden.
I. Morphologische Charakteristiken:
Wachstum im Medium mit Hyphe, wie bei Actinomyceten im allgemeinen. Aeriales Mycelium, lang und faserförmig oder reichlich verzweigt, manchmal leicht hakenförmig; keine Gewinde und keine Spiralen. Zehn oder mehr Conidien in Ketten an der Spitze des aerialen Myceliums, ellipsoidal oder zylindrisch, 0,6 bis 0, 7 X bis 1,3 Mikronen, Sporen, glatte Oberfläche.
II. Verhalten gegenüber verschiedenen Kulturmedien: (1) Czapeks' Dox Agar Tafel (270C): Wachstum cremegefärbt, aeriales Mycelium gering, weiss; kein lösliches Pigment.
(2) Glucose-Asparagin-Agar-Tafel (270C): farbloses Wachstum; aeriales Mycelium weiss, pulvrig, spärlich. Kein lösliches Pigment.
(3) Stärke synthetische Abar-Tafel (27ob): farbloses Wachstum; weiss- bis aschgraues aeriales Mycelium,gut entwikkelt. Graues lösliches Pigment, spärlich. Stärke ist bedeutend hydrolysiert.
(4) Ca-Malat Agar Tafel (270C): farbloses Wachstum; aeriales Mycelium gering, weiss. Kein lösliches Pigment.
(5) 0,2% Natrium-Nitrat-einverleibtes Pepton-Wasser (300C) farbloses Wachstum in Massen am Boden. Kein lösliches Pigment. Nitrite erzeugt aus Nitraten.
(6) Schräg im Reagenzrohr angelegte Agabrühe (270C): Wachstum grau-gelb, mit Falten; aeriales Mycelium spärlich, weiss. Hellbraunes lösliches Pigment.
(7) Schräg im Reagenzrohr angelegte, Zucker enthaltende Agarbrühe; (270C): Wachstum grau-gelb, gefaltet; aeriales Mycelium Acant, weiss. Blassbraunes lösliches Pigment.
(8) Schräg im Reagenzrohr angelegtes koaguliertes Loeffler'sches Blutserum (270C): Grauweiss bis aschgrau; kein aeriales Mycelium. Lösliches Pigment grau bis grau-schwarz. Keine Verflüssigung. Kein Wachstum bei 37ob.
(9) Bennetts's Agar-Tafeln (27ob): Wachstum gelb; dickes aeriales Mycelium, rötlich-grau. Hellbraunes lösliches Pigment. Kein Wachstum bei 37.
10) Gelatine (120C): Wachstum farblos bis hellbraun; weisses, dickes aeriales Mycelium beim Stechen. Langsame Verflüssigung. Hellbraunes lösliches Pigment.
(11) Milch (3( > C):
Wachstum creme-gefärbte bis braune Ringe; kein aeriales Mycelium. Hellbraunes lösliches Pigment. Wird transparent vom oberen Schichtteil und hat eine schwache Peptonisationswirkung.
(12) Kartoffel (270C): Wachtum grau-gelb, gefaltet; weisses pulvriges Mycelium, spärlich. Lösliches Pigment grau-braun bis grau-schwarz.
(13) Schräg im Reagenzrohr angelegtes Tyrosin-Agar (27ob): Wachstum creme-gefärbt; schwarzes lösliches Pigment.
III. Biologische Eigenschaften: Tyrosinase-Bildungsreaktion: Positiv Nitrit-Bildungsreaktion: Positiv Magermilchkoagulationsreaktion: Negativ Magermilchpeptonisations- Positiv reaktion: (schwach) Stärke-Hydrolyse: Positiv (stark) Gelatine-Verflüssigungs- Positiv reakfion: (schwach) Löslichkeit von koaguliertem Loeffler'schem Blutserum: Negativ IV.
Verwendbarkeit von Kohlenstoffquellen: Arabinose + Dextrin + Fructose + Glucose + Glycerin + Maltose + Mannose + Xylose + Natriumacetat + Natriumcitrat + Natriumsuccinat + Inositol Inulin Lactose Mannitol Salicin
Raffinose (-)
Rhamnose (-)
Saccharose (-)
Trehalose (-)
Bemerkung: + verwendet - nicht verwendet (-) Verwendbarkeit zweifelhaft
Wie oben angeführt, bildet der S 15-1-Stamm ein aeriales Mycelium ohne Windungen oder Spiralen und erzeugt glatte Conidien; der Stamm ist einer vom chromogenen Typus, der ein aeriales Mycelium mit weisser bis hellroter Farbe ergibt, das später aschgrau wird.
Es zeigt ein creme-gefärbtes Wachstum auf Czapek's Agar und ein farbloses Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar, Stärke synthetisches Medium oder Ca Malat-Agar und es kann ein breites Spektrum von Kohlenstoffquellen verwendet werden.
Im Hinblick auf genannte Charakteristiken des S 15-1 Stammes können als homologe Stämme angesehen werden Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces bikiniensis, Streptomyces antibioticus und Streptomyces griseocarneus.
Unter diesen Stämmen unterscheidet sich Streptomyces cinnamonensis vom genannten S 15-1-Stamm darin, dass der erstere ein lachsrot-gefärbtes aeriales Mycelium auf Glucose Asparagin-Agar entwickelt, wo hingegen S-15-1-Stamm ein farbloses Wachstum aufweist. Streptomyces bikiniensis unterscheidet sich vom S 15-l-Stamm darin, dass das erstere ein bernstein-gefärbtes Pigment auf Glucose-Asparagin-Agar und ein hellbraunes Pigment auf einem synthetischen Medium erzeugt. Streptomyces antibioticus unterscheidet sich vom S
15-1-Stamm darin, dass es ein weisses Wachstum auf synthetischem Medium zeigt, entwickelt ein grünlich-graues aeriales Mycelium auf Milchmedium und bildet ein bläuliches Pigment und zeigt ein brauunes Wachstum auf einem Erdäpfelmedium.
Der bekannte Streptomyces griseocarneus unterscheidet sich mehr oder weniger vom S 15-1-Stamm in der Nitrat-Reduzierbarkeit, Saccharid-Assimilierbarkeit usw., aber stimmt mit dem letzteren in anderen Punkten überein. Aus oben angeführten Ergebnissen kann geschlossen werden, dass S 15
1-Stamm zum Streptomyces griseocarneus gehört und unterscheidet sich aber trotzdem vom S 15-1-Stamm vom bekannten Stamm, weshalb der letztere Streptomyces griseocarneus S 15
1-Stamm benannt wurde.
Die Eigenschaften vom Streptomyces griseocarneus S 15-1 sind oben angeführt. Die Eigenschaften dieses Stammes können aber variiert werden, wie bei anderen Stämmen des Genus Streptomyces ersichtlich ist, und zwar durch Variieren künstlicher Mittel, z. B. Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, radioaktive Strahlen oder chemischen Mittel.
Mit all diesen Mitteln können Varianten erhalten werden, die im vorliegenden Verfahren eingesetzt werden, so weit sie zum Streptomyces griseocarneus gehören und die Fähigkeit aufweisen, das Antibiotikum S 15-1- zu erzeugen.
Erfindungsgemäss wird das Verfahren zur Herstellung des genannten Antibiotikums S 15-1 so durchgeführt, dass man einen zum Genus Streptomyces gehörenden, ein Antibiotikum S 15-1 erzeugenden Stamm oder dessen Mutanten in ein für die Erzeugung des Antibiotikums S 15-1 geeignetes Kulturmedium impft, den Stamm unter aeroben Bedingungen züchtet, das Antibiotikum S 15-1 im Medium anhäuft und dann das Antibiotikum aus dem Medium gewinnt. Das Kulturmedium enthält mit Vorteil Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Salze. Als solche Nährquellen können bekannte
Quellen verwendet werden, welche bis jetzt für die Züchtung von Stämmen des Genus Streptomyces verwendet wurden.
Beispielsweise kann Glucose, Stärke, Dextrin, Glycerin oder ähnliches, als Kohlenstoffquelle, und Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat oder ähnliches können als Stickstoffquelle verwendet werden. Überdies können, falls notwendig, anorganische Salze, wie Kalziumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphat usw., und eine kleine Menge solcher organischer oder anorganischer Materialien zugesetzt' werden, die das Wachstum des Stammes beschleunigen und die Erzeugung des Antibiotikums S 15-1 fördern.
Als Züchtungsverfahren eignet sich ein flüssiges Züchtungsverfahren, insbesondere ein eingetauchtes Züchtungsverfahren in einem Behälterm ähnlich dem bei der Herstellung bekannter Antibiotika verwendeten, am besten. Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen und eine bevorzugte Temperatur für die Züchtung beträgt 20 bis 350C. Der pH für die Kultur beträgt vorzugsweise 5-9. In den meisten Fällen aber wird die Züchtung bei etwa 180C durchgeführt. Auf diese Weise kann die Menge des erzeugten Antibiotikums S 15-1 das Maximum in 2 bis 6 Tagen, und zwar entweder bei Verwendung von Schüttelzüchtung oder Behälterzüchtung, erreichen.
Das Antibiotikum S 15-1 weist weiter unten angeführte physikochemische Eigenschaften auf und kann deshalb aufgrund genannter Eigenschaften extrahiert und gereinigt werden. Das durch die Züchtung erzeugte Antibiotikum S 15-1 wird aus einem durch Filtrieren separierten Kulturfiltrat gewonnen, und es kann entweder in Form einer Base, in Form eines Salzes, in Form eines unreinen Produktes oder eines gereinigten Feststoffes erhalten werden. Die genannte Gewinnung erfolgt am besten auf folgende Weise. Das Kulturfiltrat (Bier) wird auf einem Kationenaustauschharz, wie Amberlite IRC-50 (H-Form), adsorbiert, mit Wasser gewaschen, mit verdünnter Salzsäure eluiert, von der überschüssigen Säure durch Verwendung von Amberlite IR-45 (OH-Form) befreit, eingeengt und dann durch Ausfrieren getrocknet.
Das sich ergebende Pulver wird dann mit Methanol extrahiert und der Extrakt wird eingeengt und in eine grosse Menge von Aceton gegeben, wobei das Antibiotikum S-15 in Form des Hydrochlorids als Niederschlag erhalten wird. Dieses Hydrochlorid wird einer chromatographischen Behandlung auf einer Zellulosesäule unterworfen und mit einem Essigsäure enthaltenden Lösungsmittel eluiert; der aktive Teil wird eingeengt und dann durch Ausfrieren getrocknet, wobei ein Acetat in Form eines Pulvers erhalten wird. Das so erhaltene Pulver wird in ein Hydrochlorid oder Sulfat durch Verwendung eines Ionenaustauschharzes in H-Form ungewandelt. Falls das oben genannte Acetat mit einem schwach basischen Ionenaustauschharz behandelt wird, wird das Antibiotikum als eine freie Base isoliert. Das auf obige Weise erhaltene Hydrochlorid, die Base und das Sulfat sind weisse Pulver.
Die physikochemischen Eigenschaften des Antibiotikums S 15-1 sind die folgenden.
Diese Substanz in Form der freien Base zersetzt sich bei 161-1620C unter Entwicklung einer gelben Farbe. Das Hydrochlorid der freien Base ist in Wasser und Methanol gut löslich, schwer löslich in Niederalkylalkoholen, wie Äthanol und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Äthylacetat, Chloroform. Äther, Benzol und ähnliche. Die Base und das Sulfat sind in Wasser gut löslich, aber schwer löslich in Methanol und unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln. Die optische Rotation des Hydrochlorids, gemessen in einer wässrigen Lösung desselben, beträgt (a)D - 260. Die Ultraviolettabsorptionskurve des Antibiotikums S 15-1 in Form des Hydrochlorids ist in Fig. 1 angeführt und die Infrarotabsorptionskurve in KBr-Tafeln in Fig. 2. Im Hinblick auf das Verhalten gegenüber Papierelektrophorese ist das Antibiotikum S 15-1 eine basische Substanz.
Das Antibiotikum S 15-1 zeigt folgende Farbreaktionen: es ist positiv in Ninhydrin, Fehlings'-, Elson-Morgan's-, Molisch-, Silberspiegel-, Anthron-, Sagaguchi's-, und Maltol-Reaktio nen und negativ in Biuret- und Orcinol-Reaktionen. Die Ergebnisse der Elementaranalyse der Base sind die folgenden:
C 43,32%, H 7,13%, N 17,29%
Molekulare Formel: C18H36N6O10
Molekulargewicht: 496
Die Rf-Werte des Antibiotikums S 15-1 gemessen gemäss in der Papierchromatographie verwendeten Methoden sind in folgender Tabelle angeführt.
Entwickler Rf-Wert (1) wässriges gesättigtes Butanol 0,0 (2) 3% wässrige Ammonium-chlorid
Lösung 0,95 (3) 50% Aceton-Wasser 0,10 (4) Phenol:Wasser (3:1) 0,35 (5) n-Butanol:Methanol:Wasser (4:1:2) 0,05 (6) Lösungsmittel (5) (70 mol)+
1,5 g Methylorange 0,35 (7) Benzol:Methanol (4:1) 0,0 (8) wässriges gesättigtes Butanol +2% p-Toluolsulfonsäure 0,15 (9) n-Propanol :Pyridin:Essigsäure:
Wasser (15:10:3:12) 0,35
Im Hinblick auf die oben genannten physikochemischen Eigenschaften, d. h. in Berücksichtigung der Tatsache, dass das Antibiotikum S 15-1 ein wasserlösliches Antibiotikum mit einer optischen Rotation von (-) ist und dessen Maltol-Reaktion positiv ist, wird das Antibiotikum S 15-1 als ein Antibiotikum vom Streptomycin-Typus angesehen.
Als Antibiotika vom Streptomycin-Typus sind bis jetzt bekannt Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Hydroxystreptomycin, Mannosidostreptomycin und Glebomycin. Alle diese Antibiotika aber unterscheiden sich von dem Antibiotikum S 15-1 darin, dass sie in der optischen Rotation verschieden sind und dass ihre Ninhydrin-Reaktion negativ ist.
Das antimikrobielle Spektrum des Antibiotikums S 15-1 gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wird in der folgenden Tabelle angeführt.
testierter Mikroorganismus minimale Medi verhindern- um de Konzen tration mcg/ml
Bacillus subtilis PCI 219 0,78 1
Bacillus cereus IFO 3001 25,0 1
Staphylococcus aureus 209-P 0,78 1
Sarcina lutea PCI 1001 6,25 1
Corynebacterium equi 25,0 1
Escherichia coli K-12 3,13 1
Escherichia coli B (SM-R) 3,13 1
Serratia marcescens ATCC 9986 25,0 1
Aerobacter aerogenes ATCC 7256 6,25 1
Vibrio metschnikovii B-3-6 12,5 1
Mycobacterium 607 (SM-R) 6,25 1
Saccharomyces cerevisiae 100 II
Candida albicans IAM 4888 50,0 II
Cryptococcus neoformans IAM 4514 25,0 II
Aspergillus niger 50,
0 II
Penicillium chrysogenum FAT 917 100,0 II
SM-R: Streptomycin widerstandsfähiger Stamm Medium 1: Bouillon
Medium II: 2,0% Glucose enthaltendes Sabouraud's Medium
Aus der oben angeführten Tabelle ist klar ersichtlich, dass das Antibiotikum S 15-1 eine das Bakterienwachstum verhindernde Wirksamkeit gegenüber Gram-positiven, Gram-negativen und Säure-haltbaren Bakterien hat und bei Erhöhung in der Konzentration gegenüber Schimmel und Hefen wirksam ist.
Überdies wurde ein Newcastle-Viruswachstum-verhindernder Test in einer Gewebekultur von Hühnchen-Embryozellen, unter Verwendung eines Kulturmediums, in welchem 100 Eg/ ml Streptomycin und 100 E/ml Penicillin einverleibt wurden, durchgeführt; bei Einverleibung von 100 Eg/ml des Antibiotikums S 15-1 gelangt man zu einer vollständigen Wachstumsverhinderung des genannten Virus. Die Toxizität des Antibiotikums S 15-1 ist eine solche, dass eine Maus nicht stirbt, auch wenn 250 mg/ml des Antibiotikums intravenös injiziert werden.
Das oben beschriebene erfindungsgemässe Verfahren wird im weiteren durch einige Beispiele näher erörtert. Die prozentualen Angaben, soweit nicht anders angeführt, beziehen sich auf Gewicht per Volumen.
Beispiel I
Streptomyces griseocarneus S 15-1 (FERM-P No. 706; NRRL-5311) wurde in 40 Litern eines flüssigen Mediums bei pH 7,0. das 3,0% Stärke, 1,0% Polypepton, 0,4% Natriumnitrat, 0,2% sekundäres Kaliumphosphat, 0,14% Kaliumchlorid, 0,1% Magnesiumsulfat und 0,002% Ferrosulfat enthält, geimpft und aerob unter Schütteln in einem kugelförmigen Fermentationsgefäss bei 280C während 50 h gezüchtet. Die flüssige Brühe wurde bei pH 6,0 filtriert, und man erhielt 30 Liter eines Filtrats mit einer Produktionseinheit von 120 mcg/ ml.
Die filtrierte Brühe wurde bei pH 7,0 durch eine mit 2 Liter Amberlite IRC-50 in H-Form gefüllte Säule durchgeleitet, mit Wasser gewaschen und dann mit 0,1N Chlorwasserstoffsäure eluiert. Die aktive Fraktion von 3,0 Litern wurde mit Amberlite IR-45 in OH-Form neutralisiert, eingeengt und dann durch Ausfrieren getrocknet. Das so erhaltene rohe Pulver wurde mit 100 ml Methanol extrahiert und der Extrakt wurde mit 700 ml Aceton versetzt, wobei sich ein weisser Niederschlag von 3,5 g bildete. 1,0 g dieses Niederschlages wurde mit Hilfe der Cellulose-Säulenchromatographie, unter Verwendung einer mit 250 g Cellulosepulver gefüllten Säule, gereinigt. Als Entwickler wurde ein Lösungsmittel, bestehend aus n-Propanol, Pyndin, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 15:10:3:12 verwendet und die eluierten aktiven Fraktionen wurden gesammelt.
Das Fraktionsgemisch wurde bei niedriger Temperatur (30ob), zwecks Entfernung des Lösungsmittels, eingeengt und die so sich ergebende wässrige Schicht wurde gefriergetrocknet unter Bildung eines feuchtigkeitsabsorbierten Pulvers. Dieses Pulver wurde in Wasser gelöst, durch Amberlite IR-45 in OH-Form, zwecks vollständiger Entfernung der Essigsäure, durchgeleitet, mit Chlorwasserstoffsäure neutralisiert und dann einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei 120 mg (Titer 1,000 mcg/ml) der gewünschten Substanz in Form eines weissen Pulvers erhalten wurden.
Beispiel 2
Streptomyces griseocarneus S 15-1 (FERM-P Nr. 706; NRRL-5311) wurde in 20 Liter eines flüssigen Mediums mit pH 7,0, das 3.0% Dextrin, 3,0% Maisquellwasser, 0,4% Natriumnitrat, 0,2% sekundäres Kaliumphosphat, 0,1% Kaliumchlorid und 0,1% Magnesiumsulfat enthält, geimpft und aerob unter Schütteln in einem kugelförmigen Fermentationsgefäss bei 27"C während 50 h gezüchtet. Die flüssige Brühe wurde dann bei pH 6,0 filtriert, wobei 15 Liter eines Filtrats, Produktionseinheit 60 mcg/ml, erhalten wurden.
Die filtrierte Brühe wurde auf einer Säule von Inhalt 1,0 Liter Amberlite IRC-50 in H-Form absorbiert, mit Wasser gewaschen und dann mit 0,1N Chlorwasserstoffsäure eluiert.
Die aktive Fraktion von 1,5 Litern wurde mit gesättigter Natriumhydroxidlösung neutralisiert und dann, gemäss der Aktivkohle-Chromatographie-Technik, unter Verwendung einer mit einem Gemisch von 150 g Aktivkohle und 150 g Celite-545 gefüllten Säule entsalzen und gereinigt. Nach Adsorption wurde die Säule mit Wasser gewaschen und mit 50%igem Gew./Gew. Methanol und mit 50% Gew./Gew. Methanol enthaltender 0,1% Gew./Gew. Chlorwasserstoffsäure eluiert, und die eluierten aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Das Fraktionsgemisch wurde bei einer niedrigen Temperatur von 300C eingeengt, um das Methanol zu entfernen und sie so erhaltene wässrige Lösung wurde gefriergetrocknet, unter Bildung von 300 mg eines rohen Pulvers. Dieses Pulver wurde mit Hilfe der Cellulose-Säulenchromatographie-Technik, unter Verwendung einer mit 100 g Cellulose gefüllten Säule gereinigt.
Als Entwickler wurde ein Lösungsmittel, bestehend aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 2:1:1, verwendet und die eluierten aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Das aktive Fraktionsgemisch wurd bei einer niedrigen Temperatur (300C) eingeengt, um das Lösungsmittel zu entfernen und die so erhaltene wässrige Schicht wurde gefriergetrocknet, unter Bildung eines feuchtigkeitsabsorbierten Pulvers. Dieses Pulver wurde in Wasser gelöst, auf ein pH von 7,0 eingestellt, durch eine mit 30 g Aktivkohle gefüllte Säule, zwecks Entfernung der Essigsäure, geleitet, mit Wasser gewaschen und dann mit 80% Gew./Gew. Methanol enthaltender 0,1% Gew./Gew. Chlorwasserstoffsäure eluiert und die eluierten aktiven Fraktionen wurden gesammelt.
Das aktive Fraktionsgemisch wurde bei einer niedrigen Temperatur (300C) eingeengt, zwecks Entfernung des Methanols, und die wässrige Schicht wurde gefriergetrocknet, wobei 100 mg (Titer 1,000 mcg/ml) der gewünschten Substanz, in Form eines weissen Pulvers, erhalten wurden.
The present invention relates to a process for the production of a new antibiotic named S 151 by aerobic cultivation of a strain belonging to the species Streptomyces which produces the antibiotic S 15-1 or its mutants in a culture medium suitable for producing the antibiotic and by obtaining the same produced antibiotic S 15-1 from the culture.
The antibiotic S 15-1 produced according to the invention is a new antibiotic with the properties listed below and which prevents the growth of gram-positive, gram-negative and acid-resistant bacteria. If the antibiotic is used at a high concentration, it will prevent the growth of mold, yeast and similar fungi. It also prevents the growth of virus cultures in tissues such as Newcastle virus disease and the like. It is therefore believed that thorough testing called antibiotic S 15-1 is useful for preventing the human and animal body from infections with bacteria and viruses.
The aim of the present invention is thus to provide a process for the production of the new antibiotic S 15-1.
The microorganism used in the present inventive method is a strain of the genus Streptomyces, which produces the antibiotic S 15-1 in the nutrient medium for the same in an amount sufficient for extraction. Such a strain of the genus Streptomyces can for example be regarded as a microorganism which was first isolated from the earth in the suburbs of Sendai City, Miyagi Prefecture, Japan. This microorganism is an S 15-1 strain which could be identified as belonging to Streptomyces griseocarneus. The Streptomyces griseocarneus S-15-1 strain has the mycological properties listed below. It has been deposited with the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba City, Japan under the designation FERM-P No.
706. This strain has also been deposited with the United States Department of Agriculture, Northern Regional Research Laboratory, at Peoria, Illinois, United States of America under no. NRRL 5311; a sample of this microorganism can be obtained from the research laboratories mentioned above. The deposit in the above-mentioned laboratories was carried out in such a way that all restrictions on accessibility are irrevocably removed immediately after the patent has been granted.
I. Morphological characteristics:
Growth in medium with hypha, as in actinomycetes in general. Aeriales mycelium, long and fibrous or richly branched, sometimes slightly hooked; no threads and no spirals. Ten or more conidia in chains at the tip of the aerial mycelium, ellipsoidal or cylindrical, 0.6 to 0.7 X to 1.3 microns, spores, smooth surface.
II. Behavior in relation to different culture media: (1) Czapeks' Dox agar plate (270C): growth cream colored, aeriales mycelium slight, white; no soluble pigment.
(2) Glucose-Asparagine-Agar Plate (270C): colorless growth; aeriales mycelium white, powdery, sparse. No soluble pigment.
(3) Starch synthetic Abar board (27ob): colorless growth; white to ash gray aeriales mycelium, well developed. Gray soluble pigment, sparse. Starch is significantly hydrolyzed.
(4) Ca-Malate Agar panel (270C): colorless growth; aeriales mycelium small, white. No soluble pigment.
(5) 0.2% sodium nitrate-incorporated peptone-water (300C) colorless growth in bulk on the bottom. No soluble pigment. Nitrites generated from nitrates.
(6) Aga broth (270C) placed at an angle in the reagent tube: growth gray-yellow, with folds; aeriales mycelium sparse, white. Light brown soluble pigment.
(7) Sugar-containing agar broth placed at an angle in the reagent tube; (270C): growth gray-yellow, folded; aeriales Mycelium Acant, white. Pale brown soluble pigment.
(8) Loeffler's coagulated blood serum placed at an angle in the reagent tube (270C): gray-white to ash-gray; no aeriales mycelium. Soluble pigment gray to gray-black. No liquefaction. No growth at 37ob.
(9) Bennett's agar plates (27ob): growth yellow; thick aeriales mycelium, reddish gray. Light brown soluble pigment. No growth at 37.
10) Gelatin (120C): growth colorless to light brown; white, thick aeriales mycelium when stinging. Slow liquefaction. Light brown soluble pigment.
(11) Milk (3 (> C):
Growth cream-colored to brown rings; no aeriales mycelium. Light brown soluble pigment. Becomes transparent from the upper part of the layer and has a weak peptonization effect.
(12) Potato (270C): growth gray-yellow, folded; white powdery mycelium, scanty. Soluble pigment gray-brown to gray-black.
(13) tyrosine agar placed at an angle in the reagent tube (27ob): growth cream-colored; black soluble pigment.
III. Biological properties: tyrosinase formation reaction: positive nitrite formation reaction: positive skim milk coagulation reaction: negative skimmed milk peptonization positive reaction: (weak) starch hydrolysis: positive (strong) gelatin liquefaction positive reaction: (weak) solubility of coagulated Loeffler's blood serum: Negative IV.
Usability of carbon sources: arabinose + dextrin + fructose + glucose + glycerin + maltose + mannose + xylose + sodium acetate + sodium citrate + sodium succinate + inositol + inulin lactose mannitol salicin
Raffinose (-)
Rhamnose (-)
Sucrose (-)
Trehalose (-)
Comment: + used - not used (-) usability doubtful
As stated above, the S 15-1 strain forms an aeriales mycelium with no turns or spirals and produces smooth conidia; the trunk is of the chromogenic type, which gives an aeriales mycelium with a white to light red color which later turns ash gray.
It shows cream-colored growth on Czapek's agar and colorless growth on glucose-asparagine agar, starch synthetic medium or Ca malate agar, and a wide range of carbon sources can be used.
With regard to the characteristics of the S 15-1 strain mentioned, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces bikiniensis, Streptomyces antibioticus and Streptomyces griseocarneus can be regarded as homologous strains.
Among these strains, Streptomyces cinnamonensis differs from the aforementioned S 15-1 strain in that the former develops a salmon-red colored aeriales mycelium on glucose asparagine agar, whereas the S-15-1 strain shows colorless growth. Streptomyces bikiniensis differs from the S 15-l strain in that the former produces an amber-colored pigment on glucose-asparagine agar and a light brown pigment on a synthetic medium. Streptomyces antibioticus differs from the S.
15-1 strain in that it shows white growth on synthetic medium, develops greenish-gray aeriales mycelium on milk medium and forms bluish pigment and shows brownish growth on potato medium.
The well-known Streptomyces griseocarneus differs more or less from the S 15-1 strain in terms of its nitrate reducibility, saccharide assimilability, etc., but agrees with the latter in other points. From the above results it can be concluded that S 15
1 strain belongs to Streptomyces griseocarneus and nevertheless differs from the S 15-1 strain from the known strain, which is why the latter Streptomyces griseocarneus S 15
1 strain was named.
The properties of Streptomyces griseocarneus S 15-1 are listed above. The properties of this strain can, however, be varied, as can be seen with other strains of the genus Streptomyces, by varying artificial means, e.g. B. ultraviolet rays, X-rays, radioactive rays or chemical agents.
With all of these agents it is possible to obtain variants which are used in the present process insofar as they belong to Streptomyces griseocarneus and have the ability to produce the antibiotic S 15-1-.
According to the invention, the method for producing the said antibiotic S 15-1 is carried out in such a way that a strain belonging to the genus Streptomyces and producing an antibiotic S 15-1 or its mutants is inoculated into a culture medium suitable for producing the antibiotic S 15-1, grow the strain under aerobic conditions, accumulate the antibiotic S 15-1 in the medium, and then recover the antibiotic from the medium. The culture medium advantageously contains carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts. As such nutrient sources can be known
Sources are used which have hitherto been used for the cultivation of strains of the genus Streptomyces.
For example, glucose, starch, dextrin, glycerin or the like can be used as the carbon source, and soybean meal, meat extract, peptone, corn steep liquor, ammonium sulfate, sodium nitrate or the like can be used as the nitrogen source. Moreover, if necessary, inorganic salts such as calcium carbonate, sodium chloride, potassium chloride, phosphate, etc., and a small amount of such organic or inorganic materials as can accelerate the growth of the stem and promote the production of the antibiotic S 15-1 can be added.
As the cultivation process, a liquid cultivation process, in particular, an immersed cultivation process in a container similar to that used in the production of known antibiotics, is best suited. The cultivation is carried out under aerobic conditions, and a preferred temperature for the cultivation is 20 to 350 ° C. The pH for the culture is preferably 5-9. In most cases, however, the cultivation is carried out at around 180C. In this way, the amount of antibiotic S 15-1 produced can reach the maximum in 2 to 6 days using either shake cultivation or container cultivation.
The antibiotic S 15-1 has the physicochemical properties listed below and can therefore be extracted and purified based on the properties mentioned. The antibiotic S 15-1 produced by the cultivation is obtained from a culture filtrate separated by filtration, and it can be obtained either in the form of a base, in the form of a salt, in the form of an impure product or a purified solid. The above recovery is best done in the following way. The culture filtrate (beer) is adsorbed on a cation exchange resin, such as Amberlite IRC-50 (H-form), washed with water, eluted with dilute hydrochloric acid, freed from the excess acid by using Amberlite IR-45 (OH-form), concentrated and then dried by freezing out.
The resulting powder is then extracted with methanol and the extract is concentrated and poured into a large amount of acetone to obtain antibiotic S-15 in the form of hydrochloride as a precipitate. This hydrochloride is subjected to chromatographic treatment on a cellulose column and eluted with a solvent containing acetic acid; the active part is concentrated and then dried by freezing to obtain an acetate in the form of a powder. The powder thus obtained is converted into a hydrochloride or sulfate by using an ion exchange resin in H form. If the above acetate is treated with a weakly basic ion exchange resin, the antibiotic is isolated as a free base. The hydrochloride, base and sulfate obtained in the above manner are white powders.
The physicochemical properties of antibiotic S 15-1 are as follows.
This substance in the form of the free base decomposes at 161-1620C with the development of a yellow color. The hydrochloride of the free base is readily soluble in water and methanol, sparingly soluble in lower alkyl alcohols such as ethanol and insoluble in organic solvents such as acetone, ethyl acetate and chloroform. Ether, benzene and the like. The base and the sulfate are readily soluble in water, but sparingly soluble in methanol and insoluble in other organic solvents. The optical rotation of the hydrochloride, measured in an aqueous solution thereof, is (a) D - 260. The ultraviolet absorption curve of the antibiotic S 15-1 in the form of the hydrochloride is shown in FIG. 1 and the infrared absorption curve in KBr tables is shown in FIG With regard to the behavior towards paper electrophoresis, the antibiotic S 15-1 is a basic substance.
The antibiotic S 15-1 shows the following color reactions: it is positive in ninhydrin, Fehlings', Elson-Morgan's, Molisch, Silberspiegel, Anthron, Sagaguchi's, and maltol reactions and negative in biuret and orcinol reactions. Reactions. The results of the elemental analysis of the base are as follows:
C 43.32%, H 7.13%, N 17.29%
Molecular Formula: C18H36N6O10
Molecular weight: 496
The Rf values of the antibiotic S 15-1 measured in accordance with the methods used in paper chromatography are listed in the following table.
Developer Rf value (1) aqueous saturated butanol 0.0 (2) 3% aqueous ammonium chloride
Solution 0.95 (3) 50% acetone-water 0.10 (4) phenol: water (3: 1) 0.35 (5) n-butanol: methanol: water (4: 1: 2) 0.05 ( 6) Solvent (5) (70 mol) +
1.5 g methyl orange 0.35 (7) benzene: methanol (4: 1) 0.0 (8) aqueous saturated butanol + 2% p-toluenesulfonic acid 0.15 (9) n-propanol: pyridine: acetic acid:
Water (15: 10: 3: 12) 0.35
With regard to the physicochemical properties mentioned above, i. H. In consideration of the fact that the antibiotic S 15-1 is a water-soluble antibiotic having an optical rotation of (-) and its maltol reaction is positive, the antibiotic S 15-1 is regarded as a streptomycin type antibiotic.
As the streptomycin type antibiotics, streptomycin, dihydrostreptomycin, hydroxystreptomycin, mannosidostreptomycin and glebomycin are known so far. However, all these antibiotics differ from antibiotic S 15-1 in that they differ in their optical rotation and that their ninhydrin reaction is negative.
The antimicrobial spectrum of antibiotic S 15-1 against various microorganisms is shown in the following table.
Tested microorganism minimal medication preventing de concentration mcg / ml
Bacillus subtilis PCI 219 0.78 1
Bacillus cereus IFO 3001 25.0 1
Staphylococcus aureus 209-P 0.78 1
Sarcina lutea PCI 1001 6.25 1
Corynebacterium equi 25.0 1
Escherichia coli K-12 3.13 1
Escherichia coli B (SM-R) 3.13 1
Serratia marcescens ATCC 9986 25.0 1
Aerobacter aerogenes ATCC 7256 6.25 1
Vibrio metschnikovii B-3-6 12.5 1
Mycobacterium 607 (SM-R) 6.25 1
Saccharomyces cerevisiae 100 II
Candida albicans IAM 4888 50.0 II
Cryptococcus neoformans IAM 4514 25.0 II
Aspergillus niger 50,
0 II
Penicillium chrysogenum FAT 917 100.0 II
SM-R: Streptomycin Resistant Strain Medium 1: Broth
Medium II: Sabouraud's medium containing 2.0% glucose
It can be clearly seen from the table above that the antibiotic S 15-1 has a bacterial growth preventing activity against Gram-positive, Gram-negative and acid-stable bacteria and is effective against mold and yeast when the concentration is increased.
In addition, a Newcastle virus growth-preventing test was carried out in a tissue culture of chicken embryo cells using a culture medium in which 100 Eg / ml streptomycin and 100 U / ml penicillin were incorporated; with the incorporation of 100 Eg / ml of the antibiotic S 15-1 one arrives at a complete growth prevention of the mentioned virus. The toxicity of the antibiotic S 15-1 is such that a mouse does not die even if 250 mg / ml of the antibiotic is injected intravenously.
The above-described method according to the invention is explained in more detail below by means of a few examples. Unless otherwise stated, the percentages relate to weight per volume.
Example I.
Streptomyces griseocarneus S 15-1 (FERM-P No. 706; NRRL-5311) was in 40 liters of a liquid medium at pH 7.0. containing 3.0% starch, 1.0% polypeptone, 0.4% sodium nitrate, 0.2% secondary potassium phosphate, 0.14% potassium chloride, 0.1% magnesium sulfate and 0.002% ferrous sulfate, inoculated and aerobic with shaking in one spherical fermentation vessel at 280C for 50 h. The liquid broth was filtered at pH 6.0 and 30 liters of a filtrate with a production unit of 120 mcg / ml were obtained.
The filtered broth was passed through a column filled with 2 liters of Amberlite IRC-50 in H-form at pH 7.0, washed with water and then eluted with 0.1N hydrochloric acid. The active fraction of 3.0 liters was neutralized with Amberlite IR-45 in OH form, concentrated and then dried by freezing. The crude powder thus obtained was extracted with 100 ml of methanol and 700 ml of acetone were added to the extract, a white precipitate of 3.5 g being formed. 1.0 g of this precipitate was purified with the aid of cellulose column chromatography using a column filled with 250 g of cellulose powder. As a developer, a solvent composed of n-propanol, pyndine, acetic acid and water in a ratio of 15: 10: 3: 12 was used, and the eluted active fractions were collected.
The fraction mixture was concentrated at a low temperature (30ob) to remove the solvent, and the resulting aqueous layer was freeze-dried to give a moisture-absorbent powder. This powder was dissolved in water, passed through Amberlite IR-45 in OH form to completely remove acetic acid, neutralized with hydrochloric acid and then subjected to freeze-drying, yielding 120 mg (titer 1,000 mcg / ml) of the desired substance in the form of a white powder were obtained.
Example 2
Streptomyces griseocarneus S 15-1 (FERM-P No. 706; NRRL-5311) was in 20 liters of a liquid medium with pH 7.0, 3.0% dextrin, 3.0% corn steep liquor, 0.4% sodium nitrate, 0, Contains 2% secondary potassium phosphate, 0.1% potassium chloride and 0.1% magnesium sulfate, inoculated and grown aerobically with shaking in a spherical fermentation vessel at 27 "C for 50 h. The liquid broth was then filtered at pH 6.0, with 15 Liters of a filtrate, production unit 60 mcg / ml, were obtained.
The filtered broth was absorbed in H form on a column of 1.0 liter of Amberlite IRC-50, washed with water and then eluted with 0.1N hydrochloric acid.
The active fraction of 1.5 liters was neutralized with saturated sodium hydroxide solution and then desalted and purified according to the activated carbon chromatography technique using a column filled with a mixture of 150 g activated carbon and 150 g Celite-545. After adsorption, the column was washed with water and treated with 50% w / w. Methanol and with 50% w / w. 0.1% w / w methanol containing Hydrochloric acid eluted and the eluted active fractions were collected. The fraction mixture was concentrated at a low temperature of 30 ° C. to remove the methanol, and the aqueous solution thus obtained was freeze-dried to give 300 mg of a crude powder. This powder was purified by the cellulose column chromatography technique using a column filled with 100 g of cellulose.
As a developer, a solvent composed of n-butanol, acetic acid and water in a ratio of 2: 1: 1 was used, and the eluted active fractions were collected. The active fraction mixture was concentrated at a low temperature (300C) to remove the solvent, and the aqueous layer thus obtained was freeze-dried to give a moisture-absorbent powder. This powder was dissolved in water, adjusted to a pH of 7.0, passed through a column filled with 30 g of activated carbon in order to remove the acetic acid, washed with water and then with 80% w / w. 0.1% w / w methanol containing Hydrochloric acid eluted and the eluted active fractions were collected.
The active fraction mixture was concentrated at a low temperature (300C) to remove the methanol, and the aqueous layer was freeze-dried to give 100 mg (titre 1,000 mcg / ml) of the desired substance in the form of a white powder.