DE2319097C3 - Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Mono-Amin-Oxydase - Google Patents

Description

CH₂NH₂

(I)

N = NR

worin R eine Gruppe darstellt, die zusammen mit der benachbarten — N = N-Gruppe zur Bildung einer chromophoren Gruppe befähigt ist, oder dessen Säureadditionssalz enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe mit wenigstens einer Hydroxygruppe, Aminogruppe, Niedrigalkylgruppe oder Di-niedrigalkylaminogruppe darstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dab R eine Naphthylgruppe oder eine substituierte Naphthylgruppe mit wenigstens einer Hydroxygruppe, Carboxygruppe, Aminogruppe oder Alkylgruppe bedeutet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Pyrazolongruppe der allgemeinen Formel

O = C N-R²

HC

R¹

bedeutet, worin R¹ eine Niedrigalkyl-, Niedrigcycloalkyl- oder eine Nitro-substituierte Niedrigalkylgruppe und R² eine Phenyl-, Niedrigcycloalkyl-, Tolyl- oder eine Styrylgruppe darstellt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat l-(4'-Aminomethylphenylazo)-2-naphtho!-hydrochlorid verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat l-(3'-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydrochlorid verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-■eichnet, daß man als Bcnzylamino-Azoderival 4 - (3' - Aminomethylphenylazo) - N.N - dimcthyl-•nilin-dihydrochlorid verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennteichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4 - (4' - Aminomethylphenylazo) - 3 - hydroxy-N,N - dimethylanilin - hydrochlorid verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4 - <y - Aminomethylphenylazo) - 3 - hydroxy-Ν,Ν-dimethylanilin-hydrochlorid verwendet
.10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 2 - (4' - Aminomethylphtnylazo) - ρ - cresolhydrochlorid verwendet

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge-,o kennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1 -(4'- Aminomethylphenylazo) -mphthalinhydrochlorid verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4 - (4' - Aminomethylphenylazo) - 1 - phenyl-3 - methyl - 5 - pyrazolon - hydrochlorid verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung des gebildeten Benzaldehyd-Azoderivates durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, ausgewählt unter η-Hexan, Cyclohexan, Decalin. Xylol, Äthylacetat, Isopropylacetat. Äthyläther und Methyl-butylketon, durchführt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in Anwesenheit eines neutralen Salzes durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13. dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in Anwesenheit einer Säure durchgefühn wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die optische Bestimmung des Benzaldehyd-Azoderivates in einem organischen Lösungsmittel erfolgt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von in einer Organismusprobe enthaltener Monoamin-Oxydase (»MAO«) durch Umsetzung der Organismusprobe mit einer Substrallösung, die als Substrat eine Benzylaminverbindung enthält. Abtrennen der gebildeten Benzaldehydverbindung von der Reaktionsmischung und Bestimmung der optischen Absorption der gebildeten Benzaldehydverbindung bei einer geeigneten Wellenlänge.

MAO ist ein Enzym, das am Aminstoffwechsel im Organismus teilnimmt und die oxydative Deaminierungsreaktion der Amine katalysiert, die nach folgender Reaktionsgleichung abläuft:

ArCH₂NH₂ + O₂ + H,O

-ArCHO + NH, + H₂O₃

worin Ar für eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe steht.

Auf Grund neuerer MAO-Untersuchungen is! berichtet würden, daß MAO in den meisten Fällen vor Leberzirrhose und in einigen Fällen von chronischen' Herzversagen. Diabetes mellitus oder Hyperthyrcoi dismus abnormale Aktivitätsspiegcl aufweist.

Bisher wurde bei der klinischen Untersuchung dei Leber eine Nadel-Biopsie oder eine Nadel-Biopsii unter laparoskopischer Beobachtung als Methode fü:

den genauen Nachweis von Fibröse in der Leber ver wendet. Von diesen Untersuchungsmcthoden kam jedoch nicht viel erwartet werden, da die Menge voi erhältlichem Untcrsuchungsmatcrial beschränkt is

und eine häufigere Probeentnahme aus dem Organismus schwierig ist. Alternativ hat man Anstrengungen unternommen, chemische Substanzen oder die Aktivität der Enzyme, die am StolTwechsel dieser chemischen Substanzen teilnehmen, in d<*n Körperflüssigkeiten, wie im Serum oder Urin oder in einem Bindegewebe zu bestimmen, um den Krankheitszustand herauszufinden. Als Ergebnis vieler Bestimmungen fand man, daß die Bestimmung der MAO-Aktivität im Blut eine wirksame diagnostische Hilfsmethode bei Leberfibrose ist (Ken-ich 11 ο et al. »Saikin Igaku«, Bd. 25, Nr. 11, S. 2342 [1970]).

Bisher hat man als Methode zur Bestimmung der MAO-Aktivität in einer Organprobe eine Methode vorgeschlagen, bei der eine chemische Substanz bestimmt wird, die bei der Reaktion einer MAO-haltigen Körperprobe unter Verwendung von Benzylamin als Substrat gebildet wird. Beispielsweise beschreibt Charles M. McEwen, Journal of Biological Chemistry, Bd. 240. S. 2003 bis 2010 (1965). eine Methode, bei der das UV-Absorptionsspektrum von Benzaldehyd spektrophotometrisch ermittelt wird. d.h. man bestimmt die Absorption bei 250nm (nm = Nanometer, 10 ⁹m), um die gebildete Benzaldehydmenge herauszufinden und dadurch die MAO-Aktivität in der Probe zu finden. Diese Methode ist recht zuverlässig. Da jedoch die Untersuchung des UV-Absorptionsspektrums durch andere in der Probe enthaltene Materialien gestört wird, die eine Absorption im UV-Gebiet aufweisen, z. B. Proteine. Nucleinsäuren, Bilirubin und Vitamine, ist die Durchführung mühsam, und es sollte bei jeder Bestimmung ein Leertest mit der Probe durchgeführt werden. Außerdem hat die Bestimmung der Absorption im UV-Ciebiet die Verbreitung dieser Diagnosemethode in herkömmlichen Laboratorien behindert.

Obgleich die Entwicklung einer colorimetrischen Methode für die Bestimmung von gebildetem Benzaldehyd mit Hilfe geeigneter Reagenzien ebenfalls versucht worden ist, konnte kein exakter Wert erhalten werden, weswegen die Methode nicht befriedigt.

Außerdem ist die Tatsache, daß für die enzymatische Reaktion, bei der Benzylamin als Substrat verwendet wird, relativ viel Zeit benötigt, ein weiterer Nachteil der obigen Bestimmungsmethode.

Eine Methode, bei der ein anderes Produkt, nämlich Ammoniak, bestimmt wird, wird durch Ammoniak und flüchtige Amine, die ursprünglich in der Probe enthalten sind, gestört, und die exakte Bestimmung der MAO-Aktivität kann nicht mit Hilfe dieser Methode erreicht werden.

Eine weitere Methode, bei der gebildetes Wasserstoffperoxyd sowohl mit Hilfe von Catalase als auch mit Hilfe einer reaktiven Farbe bestimmt wird, um so di: MAO-Aktivität zu ermitteln, liefert keine exakten Ergebnisse, da die reaktive Farbe sich wählend der Bestimmungsoperation ändert, was Fehler verursacht.

Da MAO bei der oben geschilderten enzymatischen Reaktion Sauerstoff verbraucht, gibt es auch eine Methode, die die verbrauchte Sauerstoffmenge mit einem Manometer bestimmt. Diese Methode ist jedoch für klinische Tests, bei denen eine winzige Menge einer Körperprobe verwendet wird, wegen der geringen Empfindlichkeit nicht brauchbar. Alle bisherigen f>.s Methoden zur Bestimmung der MAO-Aklivitat haben somit viele Nachteile, die diese Methoden ungeeignet erscheinen lassen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur genauen imd raschen Bestimmung der MAO-Aktivität durch Bestimmung des enzymatischen Reaktionsproduktes mit Hilfe des sichtbaren Absorptionsspektrums. Die für die enzymatische Reaktion erforderliche Zeit soll ebenfalls verkürzt werden, und die Methode soll sich für die Bestimmung der MAO-Aktivität in Laboratorien eignen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von in einer Organismusprobe enthaltener Monoamin-Oxydase ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substratlösung verwendet, die als Substrat ein Benzylamin-azoderivat der Formel I

CH,NH,

= NR

worin R für eine Gruppe steht, die zusammen mit der benachbarten — N = N-Gruppe zur Bildung einer chromophoren Gruppe befähigt ist, oder ihr Säureadditionssalz enthält.

Die vorliegende Erfindung schafft somit eine Methode zur colorimetrischen. spektrophotometrischen oder visuellen Bestimmung eines Benzaldehyd-azoderivates, das durch die folgende enzymatische Reaktion gebildet wird:

CH₂NH₂

¹V.

4 O₂ + H₂O

N = NR

CHO

MAO

+ NH₃ + H₂O₂ (II)

N =■ NR

worin R die obengenannte Bedeutung besitzt.

Der Rest R in der allgemeinen Formel I der Benzylamin-azoderivate, die als Substrate in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bedeutet bevorzugt eine unsubstituierte oder substituierte Phenyl- oder Naphthylgruppe, dabei kann die Phenylgruppe bevorzugt mit wenigstens einer Hydroxy-, Amino-. Niedrigalkyl- oder Di-niedrigaikylaminogruppe und die Naphthylgruppe mit wenigstens einer Hydroxy-, Carboxy-. Amino- oder Alkylgruppe substituiert sein. Das Symbol R kann auch für eine Pyrazolongruppe der allgemeinen Formel:

O= C

HC

R¹

stehen, worin R¹ eine Niedrigalkyl-, Niedrigcycloalkyl-oder eine Nitro-subsiituierleNiedrigalkylgiuppe

nd R² eine Phenyl-, Niedrigcycloaikyl-, 1 olyi- odei ine Styrylgruppe darstellt

Bei den Benzylamin-azoderivaten (1) handelt es ch um neue in der Literatur nicht beschriebene Verindungen, die alle einen charakteristischen Absorponspeak im sichtbaren Gebiet aufweisen. Diese enzylamin-azoderivate (I) können hergestellt werdep, idem man Aminobenzylamin (oder ein Aminobenzylamm das mit einer leicht von der Benzylaminogruppe entfernbaren Gruppe geschützt ist) auf übliche Weise unter Bildung einer Diazoverbindung diazotiert und anschließend die Diazoverbindung mit einer Kupplungskomponente umsetzt, die dem Substituenten R entspricht. Die Strukturen geeigneter Benzylamin-Azoderivate und ihre physikalischen Eigenschaften sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengefaßt.

X =

Substrat-Verbindung

Tabelle 1,1

Y =

Z =

N = N-

Ausbeule (%)	Schmelzpunkt I C)
60	ns—τη
55	>300
50	>300
61	216—218
78	218—219
46	>300
50	>300
54	175—177
57	148—151

in Wasser Inml

384

374

370

357

356

450

453 452 454

Substrat-Verbindung

OH

OH Y -<f V- N(CH₃I₂

OH

CH₃

Fortsetzung

Ausbeute

60

57

76

30

23

15

73

50

88

90

Schmelzpunkt
Cl

246-247

220-222

233-236

205-207

175—177

-185

233—235

236-237

>300

>300

in Wasser ι η ml

458

460

330

374

372

370

485

484

480

480

Subslral- Verbindung

OH

OH

HO-

OH

HO COOH

HO COOH

X—<f V-NH₂-HCl

Fortsetzung

Ausheule

76

80

77

80

84

84

85

80

10

Schmelzpunkt
( Cl

275—276

244-245

> 300

>300

250-257

240

217

200

inml

472

475

490

486

512

500

470

478

11

Substrat-Verbindung

Fortsetzung

Ausbeule

Schmelzpunkt
( C)

153—155

>300

. in Wasser (nm)

390

480

Tabelle 1,2 CH₂NH₂ · ¹Z₂ H₂SO₄ CH₂NH₂ · V₂H₂SO₄

X' =

N = N-

Y' =

N = N-

Substrat-Verbindung

Ausbeute

Schmelzpunkt
CC)

>300

>300

>30()

'•mm 'ⁿ Wasser (nm)

374

450

426

Weitere Aminomethylphenylazopyrazolonderivate. die als Substrat in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die folgenden Verbindungen:

4-(3 '-Aminomethylphenylazo)-1 - phenyl-3-methyl-5-pyrazolonhydrochlorid,

4-( 2 '-Aminomethylphenylazo)-1 -phenyl-

S-methyl-S-pyrazolonhydrochlorid, 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-1 -cydohexyl-

3-propyl-5-pyrazolonhydrochlorid, ^S'-AminomethylphenylazoJ-l'cyclohexyl-

S-propyl-S-pyrazolonhydrochlorid, ^l'-AminomethylphenylazoVl-cycloliexyl-3-propyl-S-pyrazolonhydrochlorid,

4-(4'-Aminomethylphenylazo)-1 -tolyl-3-cyclo-

pentyl-5-pyrazolonhydrochlorid,
4-(3'-Aminomcthylphenylazo)-l-toryl-3-cyclo-

pentyl-5-pyrazolonhydrochlorid,
4-(2'-Aminomethylphcnylazo)-l-tolyl-3-cyclo-

pentyl-S-pyrazolonhydrochlorid.
4-(4'-Aminomethylphenylazo)-l-styryl-3-nitro-

methyl-5-pyrazolonhydrochlorid,
4-(3'-Aminomethylphenylazo)-l-styryl-3-nitiO-

methyl-5-pyrazolonhydrochlorid, ι ο

4-(2'-Aminomethylphenylazo)-l-styryl-3-nitro-

methyl-5-pyrazolonhydrochlorid.

Man führt das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise so durch, daß man eine bestimmte Menge Substratlösung, hergestellt durch Auflösen eines Überschusses von Benzylamin-Azoderivat (1) als Substrat in einer Pufferlösung mit einem pH von 6,0 bis 8.0, vorzugsweise 7,0 bis 7,2, zusammen mit einer bestimmten Menge der MAO-haltigen Organismusprobe bei einer Temperatur von 10 bis 45° C, vorzugsweise 25 bis 37° C, 0,3 Stunden bei 3,0 Stunden lang, vorzugsweise 0,5 bis 2,0 Stunden lang, in den Brutschrank stellt. Da mit dem Fortschreiten der enzymatischen Reaktion die Reaktionsmischung mit der Bildungeines Benzaldehyd-azoderivates (11) ihre Farbe ändert, läßt sich ein Ende der Reaktion feststellen. Im Anschluß an die Inkubation gibt man ein organisches inertes Lösungsmittel, in dem nur das Benzaldehyd-azoderivat(Il) löslich ist. das aber mit Wasser nicht mischbar ist, zur Reaktionsmischung, um das Benzaldehyd-azoderivat zu extrahieren. Als inertes Lösungsmittel verwendet man organische Lösungsmittel, wie aliphatische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, Ester, Äther und Ketone, bevorzugt η-Hexan, Cyclohexan, Decalin,Xylol, Äthylacetat, Isopropylacetat, Äthyläther und Methyl-butylketon.

Vorzugsweise trennt man die Lösungsmittelschicht, in die das Benzaldehyd-Azoderivat(ll) extrahiert worden ist, rasch von der wäßrigen Schicht ab. z. B. mit Hilfe eines Zentrifugenverfahrens, wobei die Zugabe eines Neutralsalzes, z. B. Natriumsulfat oder Natriumdodecylsulfat, die Abtrennung erleichtert.

Man kann auch eine Säure als ein die enzymatische Aktivität stoppendes Mittel nach der enzymatischen Reaktion zur Reaktionsmischung geben, falls erforderlich, um die Reaktionsflüssigkeit sauer zu machen und dann das Benzaldehyd-Azoderivat(ll) mit dem Lösungsmittel extrahieren. In diesem Falle können anorganische Säuren, wie z. B. Chlorwasserstoffsäure und Perchlorsäure oder organische Säuren, wie z. B. Trichloressigsäure und Essigsäure, erfolgreich als die enzymatische Aktivität stoppende Mittel verwendet werden.

Die Absorption der mit dem Lösungsmittel extrahierten Lösung, die das gebildete und extrahierte Benzaldehyd-azoderivat (II) enthält, wird bei der spektrophotometrisch günstigsten Wellenlänge im sichtbaren Gebiet, die für das Benzaldehyd-azoderivat (II) charakteristisch ist, bestimmt, und die erhaltene Absorption wird als Absorption (A) bezeichnet. Bei der Bestimmung der Absorption wird eine mit Lösungsmittel extrahierte Lösung, die durch Zugabe eines bestimmten Volumens destilliertes Wasser zu der Substratlösung, anstelle der Organismusprobe, und durch die gleiche Behandlung wie im Falle der Organismusprobe erhalten worden ist, als Kontrolle verwendet.

Andererseits wird als Standard ein bestimmtes Volumen einer wäßrigen Lösung des Benzaldehydazoderivates, die die vorgeschriebene Konzentration hat, an Stelle der Organismusprobe zur Substratlösung gegeben, und die resultierende Lösung wird genauso wie die Organismusprobe behandelt, so daß man eine mit Lösungsmittel extrahierte Lösung erhält, und deren Absorption wird in der gleichen Weise bestimmt, und diese Absorption wird als Absorption (B) bezeichnet. Die gebildete Benzaldehyd-azoderivat-(Il)-Menge. M ^g) wird wie folgt berechnet:

~ L

Menge (ag) des Benzaldehyd-azoderivatsfll). die in der verwendeten Standardlösung enthalten Absorption (A)
Absorption (B)

In der vorliegenden Erfindung entspricht die enzymatische Aktivität von MAO der Zahl der Mole (mM = milli-micro-Mol) des pro Milliliter der Serumprobe pro Stunde enzymatischer Reaktionszeit gebildeten Benzaldehyd-azoderivates (II). und dieser Wert wird als enzymatische Einheit (Eu) ausgedrückt:

Eu =

Lde<

Molekulargewicht Ί

des Benzaldehyd-azoderivates (H)J

rVerwendete Serumprobenmengel
L (ml) J

1

["Reaktionszeit]
L (Stunde) J

Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Benzylamin-azoderivate(I) haben als Substrat eine höhere Anpassungsfähigkeit bei der Reaktion mit MAO als das bekannte Substrat, und es ist daher möglich, die für die enzymatische Reaktion erforderliehe Zeit, verglichen mit der bekannten Methode, zu verkürzen. Außerdem wird eine geringere Menge Organismusprobe, d.h. nur ein Viertel der Menge, die bei der bekannten Methode benötigt wurde, be nötigt, somit kann die Orgauismusprobe und das der Patienten entnommene Volumen kleiner sein, wc durch die Belastung des Patienten verringert win Ein Vergleich der erfindungsgemäßen Methode m der bekannten Methode ist in der folgenden Tabelle 1 dargestellt:

Tabelle II

	Substrat-Verbindung	Erfindungsgemäße Methode	4-(4'-Aminc-
	Bekannte Methode		methyl-
		M4'-Amino-	phenylazo}-
		methyl-	1-phenyl-
Bedingungen		phenylazo)-	3-methyl-
	Benzyl-	2-naphlhol-	5-pyrazolon-
	arnin	hydro-	hydro-
		chlorid	chlorid
Verwendetes			0,3
Serumvolumen		03
(ml)	1,2
	ein
	schließ
	lich
	0,6 ml
	für einen
	Leertest)
Brutzeit unter			2
Schütteln bei		2
34° C (Stunden)	3
Wellenlänge, bei
der die Be
stimmung			395
durchgeführt		480
wurde (nm)	242
Enzymatische			36.5
Aktivität von		36,5
MAO(Eu) ...	25

35

Beispiel 1

Man löst 2,0 g 4-Aminobenzylamin-dihydrochlorid in einer Lösung von 4 ml Chlorwasserstoffsäure in 50 ml Wasser und gibt eine Lösung von 0,7 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion gibt man eine Lösung von 1,2 g p-Cresol, 4,0 g Natriumhydroxyd und 30 ml Wasser hinzu und rührt die Mischung 1 Stunde lang. Man säuert die Reaktionsmischung mit Chlorwasserstoffsäure an, wobei Kristalle ausfallen, die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, getrocknet und aus Methanol umkristallisiert. Man erhält so 2,1 g (Ausbeute: 76%) kristallines 2-(4'-Aminomethylphenylazo)-p-cresol-hydrochlorid mit einem Schmelzpunkt von 233 bis 236° C (unter Zersetzung).

Elementaranalyse für C₁₄H₁₅N₃O · HCl: Berechnet ... C 60,48, H 5,76, N 15,12;
gefunden .... C 60,22, H 5,85, N 15,31.

λ_ηαχ 330 nm (in Wasser).

Beispiel 2

Man löst 18,0 g4-Aminobenzylamin-dihydrochlorid in einer Lösung von 36 ml Chlorwasserstoffsäure in 100 ml Wasser und gibt eine Lösung von 6,3 Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion gibt man eine Lösung von 13,0/f-Naphthol. 36 g Natriumhydroxyd und 300 ml Wasser hinzu. Man säuert die Reaktionsmischung mit Chlorwasserstoffsäure an, dabei fallen Kristalle aus, die man abfiltriert, trocknet und aus Methanol umkristallisiert. Man erhält so 21 g (Ausbeute: 73%) orangefarbenes kristallines 1 -(4'-Aminomethylphenylazo)-/i-naphthol-hy-

drochlorid mit einem Schmelzpunkt von 233 bis 235° C (unter Zersetzung).

Elementaranalyse für C_nH₁₅ON₃ · HCI:
Berechnet ... C 65,10, H 5,11, N 13,08;
gefunden .... C 64,59, H 4,86, N 13,15.

'me* = 485 nm (in Wasser).

Beispiel 3

Man löst 5,0 g N-(3'-Aminobenzyl)phthalimid in einer Lösung von 6,0 g Chlorwasserstoffsäure in 300 ml Wasser und gibt eine Lösung von 1,4 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion gibt man eine Lösung von 2,6 g N,N-Dimethylanilin, 5 ml Chlorwasserstoffsäure und 50 ml Wasser hinzu und rührt die Reaktionsmischung 1 Stunde lang, wobei man eine wäßrige Lösung von Natriumacetat so zugibt, daß die Reaktionsmischung eine gelblichgrüne Farbe erhält. Schließlich gibt man eine wäßrige Natriumcarbonatlösung hinzu, um die Reaktionsmischung alkalisch zu machen, filtriert die Reakttonsmischung und erhäh 7.4 g (Ausbeute 97%) gelbes kristallines N - (p - N.N - Dimethylaminobenzolazo-3-benzyl (-phthalimid.

Die oben erhaltenen Kristalle werden zusammen mit verdünntem Alkohol und Hydrazinhydrat bis zum Rückfluß erhitzt und nach Zugabe von Chlorwasserstoffsäure erneut zum Rückfluß erhitzt. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt, man gibt Wasser hinzu, filtriert die Mischung und erhält Phthalhydrazid. Man gibt eine wäßrige Natriumcarbonatlösung zum Filtrat, um den pH-Wert auf 2 zu bringen und extrahiert dann eine lösliche Fraktion mit Cyclohexan, das man entfernt. Man gibt eine wäßrige Natriumcarbonatlösung zur isolierten wäßrigen Schicht, um den pH-Wert auf 14 oder einen höheren Wert zu bringen, und extrahiert mit Chloroform. Die Chloroformschicht wird mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Den Rückstand löst man in Aceton, gibt Chlorwasserstoffsäure hinzu und dampft die Mischung unter vermindertem Druck zur Trockene ein. Man erhält 3,5 g (Ausbeute: 57%) bläulichvioletter Kristalle von 4-(3'-Aminomethylphenylazo)-N,N-dimethylanilin-dihydrochlorid, mit einem Schmelzpunkt von 144 bis 145°C (unter Zersetzung).

Elemenlaranalyse für C₁₅H₁₈N₄ · 2HCl:
Berechnet ... C 55,00 H 6.11, N 17,11;
gefunden .... C 55,14. H 6.04, N 16,89.

/,_MJ = 455 nm (in Wasser).

Beispiel 4

2,0 g 4-Aminobenzylamin-dihydrochlorid löst man in einer Lösung von 4 ml Chlorwasserstoffsäure in 50 ml Wasser und gibt eine Lösung von 0,7 g Natriumnilrit in 50 m! Wasser unter Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion wird die Lösung in eine wäßrige Lösung von 1,9 g 1 -Phenyl-S-methyl-S-pyrazolon, 2 g Natriumhydroxyd und 50 ml Wasser gegossen. Nach der Kupplungsrcaktion wird die Reaktionsmischung durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure sauer gemacht und ausgesalzt, wobei man rohe Kristalle erhält. Beim Um-

kristallisieren aus Methanol erhält man 3,4 g (Ausbeute: 90%) gelblichoranger Kristalle von 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon mit einem Schmelzpunkt von 153 bis 155° C.

Elementaranalyse für C₁₇H₁₈N₅OCl:

Berechnet ... C 61,91, H 5,50, N 16,99;
gefunden .... C 61,50, H 5,31, N 16,76.

■W = 390 nm (in Wasser).

IO

Beispiel 5

Man stellt eine Substrat-Pufferlösung her, indem man 1 mM l-(4'-Aminomethylphenylazo)-2-naphtholhydrochloric", hergestellt im Beispiel 2, als Substrat in einer 0,1-m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Pufferlösung auflöst 2,0 nil der Substrat-Pufferlösung gibt man in ein Zentrifugenröhrchen und erwärmt 3 Minuten lang bei 37^C C, dann gibt man 0,3 ml einer Serumprobe hinzu und stellt die Mischung 2 Stunden lang bei 37 C in ein thermostatisiertes Gefäß. Man gibt 4 ml Cyclohexan hinzu, schüttelt und extrahiert die Mischung 30 Sekunden lang in einem Vibio-Mixer, zentrifugiert dann 10 Minuten'25 lang bei 3000 Upm und isoliert die obere Schicht (eine Lösungsmittel-Extraktschicht). Bei der Abtrennung gibt man 10 mg Natriumsulfat hinzu, um die Abtrennung der extrahierten Schicht zu erleichtern.

0,3 ml einer wäßrigen Lösung von 1-(4'-Benz-30 aldehydazo)-2-naphthol mit einer Konzentralion von 50 μg/ml — als Standardlösung — und 0,3 ml destilliertes Wasser — als Kontrolle - - gibt man in verschiedene Zentrifugenrohre und behandelt sie genauso wie die Serumprobe, so daß man eine Lösungsmittel-Extraktschicht erhält.

Die Absorption (A) der mit der Seruroprobe erhaltenen Lösungsmittel-Extraktschicht und die Absorption (B) der mit der Standardiösung erhaltenen Lösungsmittel-Extraktschicht werden bei dem Färb-Peak von l-(4'-Benzaldehydazo)-2-naphthol, d. h. bei 480 nm, gemessen, wobei die mit destilliertem Wasser erhaltene Lösungsmittel-Extraktschicht als Kontrolle verwendet wird. Man erhält die folgenden Ergebnisse: Absorption (A) = 0,052. Absorption (B) = 0,130.

Aus diesen Werten wird die durch die Einwirkung von MAO in der Serumprobe gebildete l-(4'-Benzaldehydazo)-2-naphthol-Menge wie folgt berechnet:

wird beim Farb-Peak des 4-(4'-Bcnzaldehydazo)-Ν,Ν-dimethylanilin-bydrochlorid, d h. bei 430 nm,

gemessen.

Absorption (A) = 0,050, Absorption (B) = 0,125.

Die Benzaldehyd-Azoderivatmenge(Ai), gebildet durch Einwirkung von MAO in der Serumprobe, wird wie folgt berechnet:

M =

M =

1 (ml)

- ■ 0.3 (ml)

0.052
0,130

und die enzymatische Einheit (£w) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:

Eu =

6.0 (ug)
276

1.0 (ml)
0.3 (ml)

Beispiel 6

1
2(hr)

55

= 36.4.

60

Man verwendet 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-N. N-dimethylanilindihydrochlorid mit 4-(4'-Benzaldehydazo)-N,N-dimethylanilinhydrochlorid an Stelle von dem im Beispiel 1 verwendeten l-(4'-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydrochlorid bzw. dem l-(4'-Benzaldehydazo)-2-naphthol und führt die Umsetzung wie im Beispiel 1 durch. Die Absorption

65 \ (ml)

0,125

Die enzymatische Einheit (Eu) von MaO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:

Eu = -

6,0

289,5

1,0 (ml)
" ' ~0,3 (ml)

Beispiel 7

2(hr)

= 34.5.

Man verwendet η-Hexan an Stelle von dem im Beispiel 1 als Lösungsmittel verwendeten Cyclohexan und führt die Umsetzung in gleicher Weise wie im Beispiel 1 durch. Die erhaltenen Ergebnisse sind folgende :
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0.130.

Die enzymatische Einheit (Ew) von MAO in der Serumprobe: Eu = 36.4.

Beispiel 8

Eine Substrat-Pufferlösung und eine Standardlösung werden wie im Beispiel 1 hergestellt. Man gibt 2,0 ml der Substrat-Pufferlösung in ein Zentrifugenrohr und erwärmt 3 Minuten bei 37⁼C, dann gibt man 0,3 ml der Serumprobe hinzu, und die Mischung wird in einem thermostatisierten Gefäß 2 Stunden lang bei 37⁰C inkubiert. Man macht die Reaktionsmischung sauer, indem man einen Tropfen Chlorwasserstoffsäure, die als die enzymatische Aktivität beseitigendes Mittel dient, zugibt und setzt 4 ml Cyclohexan als Lösungsmittel zu, danach wird die Operation wie im Beispiel 1 ausgeführt. Man erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.

Die enzymatische Einheit (Ew) von MAO in der Serumprobe: Eu = 36.5.

Beispiel 9

Man verwendet Perchlorsäure an Stelle der im Beispiel 4 als die enzymatische Aktivität stoppendes Mittel verwendeten Chlorwasserstoffsäure und führt danach die Operation so wie im Beispiel 4 durch. Man erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,052. Absorption (B) - 0,130.

Die enzymatische Einheit[Eu) von MAO in der Serumprobe: Eu = 36,4.

Beispiel 10

Man gibt 0.5 ml der Serumprobe zu 1.0 ml einer Substratlösung von 1 -(3' - Aminomethylphenylazo)-1-naphthol-hydrochlorid in einer 0.1 -m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl (pH 7.2)-Pufferlösung (mit

einer Konzentration von 1 mM) und erwärmt die Mischung 60 Minuten lang bei 37" C, säuert sie dann durch Zugabe von 1 Tropfen Perchlorsäure an und extrahiert unter Schütteln mit 5 ml Cyclohexan. Nach der Extraktion wird die Absorption bei 480 nm gemessen und die MAO-Aktivität durch Vergleich mit der Standardlösung, die l-(3'-Benzaldehydazo)-2-naphthol (50μg/ml) enthält, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind folgende:
Absorption (A) = 0,030, Absorption (B) = 0,120.

Die 1 -(3'- Benzaldehydazo)- 2-naphthol - Menge (M), gebildet durch die Wirkung von MAO in der Serumprobe. wird wie folgt berechnet:

mn

= 6,25(.Ag).

Die eiizymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:

X =

'5

Eu =

6,25 ^g) 1,0 (ml)

276

0,5 (ml)

^r- = 45.4.

γ =

B e i s ρ i e 1 11 _2S

Man gibt 0,5 ml einer Serumprobe zu 1 ml einer Substratlösung (mit einer Konzentration von 0,01 g. ml), hergestellt durch Auflösen von 4-(4'-Aminomethylphenylazo) -1 - phenyl - 3 - methyl - 5 - pyrazolon, hergestellt im Beispiel 4, in einer 0,1-m Tris-(hydroxymethyl) - aminomethan - HCl - Pufferlösung und erwärmt die Mischung und läßt sie bei 37 C 60 Minuten lang reagieren. Dann gibt man einen Tropfen Perchlorsäure hinzu, um die Reaktionsmischung sauer zu machen und extrahiert unter Schütteln mit 4,0 ml Cyclohexan. Nach der Extraktion wird die Absorption des Extraktes bei 395 nm gemessen. Die MAO-Aktivität bestimmt man durch Vergleich mit der Absorption einer Standardlösung, die 50 μ&τη\ 4-(4'-Benzaldehydazo)-l-phenyl-3-methyl-S-pyrazolon enthält. Man erhält folgende Ergebnisse: Absorption (A) = 0,095, Absorption (B) = 0,215.

Die 4 - (4' - Benzaldehydazo) -1 - phenyl - 3 - methyl-5-pyrazolon-Menge (M), gebildet durch die Wirkung von MAO in der Serumprobe, errechnet sich wie folgt:

Substrat-Verbindung

Wellenlänge des

Farb-Peaks des

entsprechen den Benzaldehyd-

Azoderivates

(nm)

MAO-Akti vität

(Eu)

Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:

Eu =

343

1,0 (ml) 0,5 (ml)

= 64.

Beispiel 12

Eine Vielzahl von Substraten und die entsprechenden Benzaldehyd-Azodcrivate werden als Standardsubstanzen an Stelle von l-(3'-Aminomethylphen>lazo)-2-naphthol-hydrochlorid und dem im Beispiel 6 verwendeten 1 - (3' - Benzaldehydazo) - 2 - naphthol verwendet, und die Absorption wird bei der in der ^₅ nachfolgenden Tabelle Hl angegebenen Wellenlänge im sichtbaren Gebiet gemessen, daraus wird die MAO-Aktivität bestimmt.

380

375

320

360

42.5

43.2

46.5

46,3

350

460

21

22

Forlsetzung

Substrat-Verbindung

-N(CH₃J₂- HC!

N(CH₃),

OH

OH

Wellenlänge des

Farb-Peaks des

entsprechen den Benzaldehyd-

Azo-Genvates

(nm)

450

460

460

450

350

375

370

365

470

475

475 MAO-Aktivilät

Substrat-Verbindung

IO

43,5 '5

46.0

45,0

44,0

42,3

42,9

40

45

55

6o

46.5

NH₂-HCI

NH,-HCl

X-^~\— OH

Wellenlänge des

Farb-Peaks des

entsprechen den Benzaldehyd-

Azoderi vales

(nml

490

510

500

470

480

472

475 ! 45.4

490 42.8

40,0

X' =

Y' =

24

Substrat-Verbindung

N = N-

Substrat-Verbindung

OH

Wellenlänge des Farb-Peaks des entsprechen den Benzaldehyd-

Azoderivates

(nm)

375

NH₂ H₂SO₄

HO

Wellenlänge des
Farb-Peaks
des entsprechen
den Benzaldehyd-

Azoderivates

(nm)

MAO-Aktivität

460

490

Aktivität r> · · ι ι ->

Beispiel 13

Man verwendet 1 - (4' - Aminomethylphenylazo)-2-naphthol (die freie Form) an Stelle von dem im Bei-(£„) spiel 1 benutzten 1 - (4' - Aminomethylphenylazo)-

- naphthol - hydrochlorid und führt die Umsetzung und die Operationen wie im Beispiel 1 durch. Man erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130. Die enzymatische Einheit(Em) von MAO in der Serumprobe errechnet sich zu: Em = 36,4.

109641/239

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von in einer Organismusprobe enthaltener Monoaminoxydase durch Umsetzung der Organismusprobe mit einer Substratlösung, die als Substrat eine Benzylaminverbindung enthält, Abtrennen der gebildeten Benzaldehydverbindung von der Reaktionsmischung und Bestimmung der optischen Absorption der gebildeten Benzaldehydverbindung bei einer geeigneten Wellenlänge, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substratlösung verwendet, die als Substrat ein Benzylamin-azoderivat der Formel 1