DE2319097A1 - Verfahren zur bestimmung der enzymatischen aktivitaet von monoamin-oxydase - Google Patents

Description

PA¹JENTANWaLTE . Λ; Λ <t Q Λ A μ

DR. ψ, KINZEBACH — DIPL.-ING. O. HEH₁EBRAND

S München so 16. April 1973

Telefon! 0811/4 70 50 34 Telegramme: Hekipat (München)

CASE; WAKO-50549

WAKG BDBE GSEMICAL IHDUSiERIES, LID. 10, Doshomachi-3-chome, Higashi-ku, Osaka» Japan

Verfahren zur Bestimmung der enzymatisehen Aktivität von Monoamin-Oxydase.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Monoamin-Oxydase (nachfolgend als "IiAO" bezeichnet). Die Erfindung betrifft insbesondere eine neue Methode zur Bestimmung der enzymati sehen Aktivität von in Körpergewebe befindlichem MAO mit Hilfe einer optischen Methode. . ·

MAO ist ein Enzym, das am Aminstoffwechsel im Organismus teilnimmt und die öxydative Deaminierungsreaktion der Amine katalysiert, die nach folgender Reaktionsgleichung abläuft:

ArCH₂NH₂ + O₂ + Η_£0 > ArCHO + M₅ + H₂O₂

worin Ar für eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe steht.

309845A0856

231 SOS?

WAKO-3Q349

Aufgrund neuerer MO-Untersuchtingen ist "bericntet worden, daß MAO in den meisten Fällen von Leberzirrhose und in einigen !fallen, von chronischem Herzversagen, Diabetes mellitus oder Hyper-· thyreoidismus abnormale Aktivitätsspiegel aufweist. ■

Bisher wurde bei der klinischen Untersuchung der Leber eine Nadel-Biopsie oder eine Nadel-Biopsie unter laparoskopi scher-Beobachtung als Methode für den genauen Nachweis, von Fibröse in der Leber verwendet. Von diesen Untersuchungsmethoden kann jedoch nicht viel erwartet werden, da die Menge von erhältlichem Untersuchungsmaterial beschränkt ist und eine häufigere Probeentnahme aus dem Organismus schwierig ist. Alternativ hat man Anstrengungen unternommen, chemische Substanzen oder die Aktivität der Enzyme, die am Stoffwechsel dieser ehemischen Substanzen teilnehmen, in den Körperflüssigkeiten, wie im Serum oder Urin oder in einem Bindegewebe zu bestimmen, um den Krankheitszustand herauszufinden. Als Ergebnis vieler Bestimmungen fand man, daß die Bestimmung der MAQ-Aktivität im Blut eine- wirksame diagnostische Hilfsmethode bei Leberfibrose ist /Ken-ich Itο et al., "Saikin Igaku", Band 25, Hr. 11, Seite 2342 (1970)7. ■ ' ~* ' -

; Bisher hat man als Methode zur Bestimmung der MAO-Aktivität : in einer Organprobe eine Methode vorgeschlagen, bei der eine ; chemische Substanz bestimmt wird, die bei der Reaktion einer MAO-haltigen Körperprobe unter Verwendung von Benzylamin als

Substrat gebildet wird. Beispielweise beschreibt Charles M. \ McEwen, Journal of Biological Chemistry, Band 240, Seiten

2003 - 2010 (1965), eine Methode, bei der das UV-Absorptions-" j Spektrum von Benzaldehyd spektrophotometrisch ermittelt wird, das heißt man bestimmt die Absorption bei 250 nm (nm = Nanometer, 10" m), um die gebildete Benzaldehydmenge herauszufinden und dadurch die MAO-Aktivität in der Probe zu finden« \ Diese Methode ist recht zuverlässig. Da jedoch die Untersu- : chung des UY-Absorptionsspektrums durch anders χ$ der Probe

onoo/. C/fiRSR

3 " WAKO-30349

enthaltene. Materialien gestört wird, die eine Absorption im W-Gebiet aufweisen, z.B. Proteine, Nucleinsäuren, Bilirubin und Vitamine, ist die Durchführung mühsam· und es sollte bei jeder Bestimmung ein Leertest mit der Probe durchgeführt werden. Außerdem hat die Bestimmung der Absorption im UV-Gebiet die Verbreitung dieser Diagnosemethode in herkömmlichen Laboratorien behindert.

Obgleich die Entwicklung einer colorimetrisehen Methode für die Bestimmung von gebildetem Benzaldehyd mit Hilfe geeigneter Reagenzien ebenfalls versucht worden ist, konnte kein exakter Wert erhalten werden, weswegen die Methode nicht befriedigt. -.

Außerdem ist die Tatsache, daß für die enzymatische Reaktion, bei der Benzylamin als Substrat verwendet wird, relativ viel Zeit benötigt, ein weiterer Nachteil der obigen Bestimmungsmethode .

Eine Methode, bei der ein anderes Produkt, nämlich Ammoniak, bestimmt wird, wird durch Ammoniak und flüchtige Amine, die ursprünglich in der Probe enthalten sind, gestört und die exakte Bestimmung der MAO-Aktivität kann nicht mit Hilfe dieser Methode erreicht werden.

Eine weitere Methode, bei der gebildetes Wasserstoffperoxyd sowohl mit Hilfe von Catalase als auch mit Hilfe einer reaktiven Farbe bestimmt wird, um so die MAO-Aktivität zu ermitteln, liefert keine exakten Ergebnisse, da die reaktive Farbe sich während der Bestimmungsoperation ändert, was Fehler verursacht.

Da MAO bei der oben geschilderten enzymatischen Reaktion Sauerstoff verbraucht, gibt_es auch eine Methode, die die verbrauchte Sauerstoff menge mit einem Manometer bestimmt. Diese Methode ist jedoch für klinische Tests, bei denen eine winzige Menge

-- 3 309846/0856

If WAKO-30349

einer Körperprobe verwendet wird, wegen der geringen Empfindlichkeit nicht "brauchbar. Alle bisherigen Methoden zur Bestimmung der MAO-Aktivität haben somit viele Nachteile, die diese Methoden ungeeignet erscheinen-lassen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur genauen und raschen Bestimmung der MAO-Aktivität durch Bestimmung des enzymatischen Reaktionsproduktes mit Hilfe des sichtbaren Absorptionsspektrums. Die für die enzymatisch^ Reaktion erforderliche Zeit soll ebenfalls verkürzt werden und die Methode soll sich für die Bestimmung der j MAO-Aktivität in-Laboratorien eignen.

j Die Erfindung schafft nun ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von MAO, die in einer Probe des Organismus enthalten ist, das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß e,ine Subs tr at lösung, die als Substrat ein Benzy^Lamin-azoderivat der !Formel I:

CH₂NH₂

(D

=NR

; worin R für eine Gruppe steht, die zusammen mit der benachbarteri -N=N-Gruppe zur Bildung einer chromophoren Gruppe be-ί fähigt ist, oder ihr Säureadditionssalz enthält, mit der j Organismusprobe enzymatisch umgesetzt wird, das resultierende Benzaldehyd-azoderivat der Formel II:

CHO

(II)

N=NR

- 4 309845/0856

S VAKO-30349

worin R die oben genannte Bedeutung hat, aus der Reaktionsmischung abgetrennt und bei einer geeigneten Wellenlänge optisch bestimmt wird.

Die vorliegende Erfindung schafft somit eine Methode zur colorimetrischen, spektrophotometrisehen oder visuellen Bestimmung eines Benzaldehyd-azoderivates, das durch die folgende enzymatische Reaktion gebildet wird:

CJH₂M₂

CHO

H₂O Γ Π . + HH₅ + H₂O₂

(H) worin R die oben genannte Bedeutung besitzt.

Der Rest R in der allgemeinen Formel (I) der Benzylamin-razoderivate, die als Substrate in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bedeutet z.B. eine unsubstituierte Phenylgruppe, eine unsubstituierte Naphthylgruppe oder eine substituierte Phenyl- oder substituierte Naphthylgruppe. Beispiele für Substituenten in den Phenyl- oder Naphthylgruppen sind eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Carbonylgruppe, eine Niedrigalkylgruppe, eine Mono-riiedrigalkylaminogruppe, eine Di-niedrigalkylaminogruppe und ein Halogenatom. Das Symbol R kann auch für eine Pyrazolongruppe der allgemeinen lOrmel:

0 = C-N - R²

-HQ

1 2
stehen, worin R und R unabhängig voneinander ein Wasserstoff-

- 5 -09345/0856

{■-■■■■ WAKO-30349

atom, eine Alkylgruppe,- eine substituierte Alkylgruppe, eine Cycloalkylgruppe, eine substituierte Cyoloalkylgruppe, eine Aralkylgruppe, eine substituierte Aralkylgruppe, eine Phenylgruppe öder eine substituierte Phenylgruppe bedeuten.

Bei den Benzylaminazoderivaten (I) handelt es sich um neue in der Literatur nicht beschriebene Verbindungen und sie weisen alle einen charakteristischen Absorptionspeak im sichtbaren Gebiet auf. Diese Behzylaminazoderivate (I). werden hergestellt, indem man Aminobenzylamin (oder ein Aminobenzylamin, das mit einer leicht von der Benzylaminogruppe entfernbaren Gruppe geschützt ist) auf übliche Weise unter Bildung einer Diazoverbindung diazotiert und anschließend die Diazoverbindung mit einer Kupplungskomponente umsetzt, die dem Substituenten R entspricht. Die Strukturen dieser Benzylamin-Azoderivate und ihre physikalischen Eigenschaften sind in der nachfolgenden Eabelle I zusammengefaßt.

30 9Ö4S /

WAKO-30349

Ilabelle 1.1

CH₂NH₂-HCl CH₂NH₂. HCl

=N-

y>

N=N-

' Substrat-Verbindung	Ausbeute	Schmelzpunkt (0C)	> 300	λ max in Wasser (mn)
! OH			>300
XhQhh	60	275 - 277	216 - 218	384
OH		--'
	55	218 - 219	374
i f\TT Ζ-/~Λ-0Η	50		370
; CH, . ■ / 3 X-/~V0H	61	> 300	357
: CH3
	78	>300	356 j
: OH3
■ - ,^H2-HCl	46	450 ;
' NH2'HC1
y-/~Vnh2*hci	50	453 :

- 7 - . 30 984 5/08 56

ffabelle 1,1 - Fortsetzung

WAKO-30349

HGl

OH

(CH,)

3'2

OH

OH

y //

C ■; i- „

54

57

60

76

30

23

15 175 - 177 148 - 151 246 - 247 220 - 222 233 - 236 205 - 207

175 - 177

180 - 185

452

,45.4

458

460

330

374

372

370

- 8 309 84 5 /085 6

tabelle 1,1 - Fortsetzung

WAKO-30349

X-f VOH

73

50

88

76

80 - 235

- 237

>300

>3OO - 276

- 245

77 >

- 9 -309845/0856 485

484

480

480

472

475

490

40

Tabelle 1,1 - Fortsetzung

WAKO-30349

HCOOH

ι

X—„HG N
N₀/.

CH

80

84

84

85

80

90

85 >3Ö0

- 257

- 240

- 217

- 200.

- 155

>300

- 10 309845/0856 486

512

500

470

478

390

480

tabelle 1,2

2319037

WAKO-30349

H₂SO₄

^γι

H₂SO₄

Substrat-Verbindung

Schmelzpunkt (⁰C)

O max in Wasser (mn)

^γι

.H SO *^H2^S04

HO

47

72

> 300 >300 >300

374

450

426

- 11 -

3 09 845/0 8B6

2313097

If WAKO-30349 '

ι ■ - ■ . ■

i . - ■

ι '., ■■■■■■■-■-.■■

j Zu den Amiriomethylphenylazopyrazolonderivaten, die als Substrat j in der vorliegenden Erfindung Terwendet werden können, gehören J die folgenden Verbindungenϊ

j 4-(4'~Aminomethylplienylazo)-1=--phen3rl~3™methyl~5--pyrazolon- : hydrochloride

j 4-( 3'-Aminomethylphenylazo)-1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon- ; hydrochloride

j 4~(2⁸~Aminomet3iylphenylazo)-=1-plienyl-3~inet3iyl-5-pyrazolon- \ hydrochlorid_P

j 4„(4«-Aminometliylphenylai3o)-.1:-cycloliexyl-3-propyl-5-pyrazoion-

i hydrochloride ' ■ ■

4- (3»-Aminomethylphenylazo ) -1 -cyclohexyl- 3-propyl-5-pyraz olon-

I- hydrochloridj

i 4-( 2^s -Aminomethylphenylazo)—1 -cyclohexyl-3~propyl-5-pyrazolon-

I ·

I hydrochlorid,

■ 4-(4⁸-Aminomethylphenylazo)-1-tolyl-3-cyclopentyl-5-pyrazolonj hydrochloride

j 4-=(3'"Aminomethylphenylazo )™1-tolyl-3-cyclopentyl-5-pyrazolon- ! hydrochlorid,

■ 4-(2'-Aminomethylphenylazo)-1-tolyl-3^ocyclopentyl-5-pyrazolonhydrochlorid,

j ■ 4_(41 -.Aminomethylphenylazο) -1 -styryl-3-nitromethyl-5-pyrazolon-I hydrochloridj ■ :..^; -■....

j 4-(3ⁱ~Aminomethylphenylazo)~1-styryl-3-nitromethyl-5-pyrasolonhydrochlorid, - ,.

j 4-(2^s-Aminomethylphenylaz ο)-1-styryl-3-nitromethyl-5-pyrazolon-I hydrochloride,

ί Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt j man die enzymatische Reaktion so durch, daß man eine bestimmte ! Menge Substrate sung, hergestellt durch Auflösen eines Über-

- 12 3 0 984570856

j 41 WAKO-30349

! Schusses von Benzylamin-Azoderivat (I) als Substrat in einer

• Pufferlösung mit einem pH von 6,0 - 8,0, vorzugsweise 7,0 - 7,2, ··! zusammen mit einer bestimmten Menge der MAO-haltigen Organis-

I musprobe bei einer !Temperatur von 10 bis 45 C, vorzugsweise

I 25bis 37°C, 0,3 Stunden bis 3,0 Stunden lang, vorzugsweise 0,5

\ bis 2,0 Stunden lang, in den Brutschrank stellt. Da mit dem

I Fortschreiten der enzymatischen Reaktion die Reaktionsmischung

j mit der Bildung eines Benzaldehyd-azoderivates (II) ihre Farbe

I ändert, läSt sieh ein Ende der Reaktion feststellen. Nach Be-

I endigung"der Reaktion gibt man ein organisches inertes Lösungs-

j mittel, in dem nur das Benzaldehyd-.azoderivat (II) löslich ist,

• das aber mit Wasser nicht mischbar ist, zur Reaktionsmischung, um das Benzaldehyd-azoderivat zu extrahieren. Als inertes

; Lösungsmittel verwendet man organische lösungsmittel, wie

; aliphatisehe Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasser-

■ stoffe, Ester, Äther und Ketone, z.B. Hexan, Cyclohexan,

I Decalin, Xylol, Ithylacetat, Isopropylacetat, Ithyläther und

; Methyl-butyJLketon.

Vorzugsweise trennt man die Lösungsmittelschicht, in dia das Benzaldehyd-Azoderivat (II) extrahiert worden ist, rasch von der wässrigen Schicht ab j z.B. mit Hilfe eines Zentrifugenverfahrens, wobei die Zugabe eines Neutralsalzes, z.B. Natriumsulfat oder ilatrinmdodeeylsulfat, die Abtrennung, erleichtert.

Man kann auch eine Säure als ein die enzymatisch^ Aktivität stoppendes Mittel nach der enzymatischen Reaktion zur Reaktionsmischung geben, falls erforderlich, um die Reaktionsflüssigkeit sauer zu machen und dann das Benzaldehyd-Azoderivat (II) mit dem Lösungsmittel extrahieren. In diesem Falle können anorganische Säuren, wie z.B. Chlorwasser stoff säure und Perchlorsäure oder organische Säuren, wie z.B. Irichloressigsäure und Essigsäure, erfolgreich als die enzymatische Aktivität stoppende Mittel verwendet werden, die Säurearten sind nicht speziell beschränkt.

~ 13 3Q984S/08S8

m WAKO-30349

Die Absorption der mit dem Lösungsmittel extrahierten Lösung, die das gebildete und extrahierte Benzaldehyd-azoderivat (II) j enthält, wird bei der spektrophotometrisch günstigsten Wellenlänge im sichtbaren Gebiet, die für das Benzaldehyd-azoderivat (II) charakteristisch ist, bestimmt und die erhaltene Absorption ; wird als Absorption (A) bezeichnet. Bei der Bestimmung der j Absorption wird eine mit Lösungsmittel extrahierte Lösung, die ! durch Zugabe eines bestimmten Volumens destilliertes Wasser zu der Sub strati osuiig, anstelle der Organismusprobe^und durch j die gleiche Behandlung wie im Falle der Organismusprobe eri halten worden ist, als Eontrolle verwendet.

j Andererseits wird als Standard ein bestimmtes Volumen einer

wässrigen Lösung des Benzaldehyd-.azoderivates, die die vorge-I schriebene Konzentration hat, anstelle, der Organismusprobe j zur Substratlösung gegeben und die resultierende Lösung wird I-

j genauso wie die Organismusprobe behandelt, so daß man eine j mit Lösungsmittel extrahierte Lösung erhält und deren Ab-I sorption wird in der gleichen Weise bestimmt und diese Absorption wird als Absorption (B) bezeichnet* Die gebildete Benzaldehyd-azoderivat (Il)-Menge, M ( jug) wird wie folgt Ϊ berechnets

Benzaldehyd-.azoderivat (II) Menge (jag), die in der verwendeten Standardlösung enthalten ist

χ ■

Absorption Absorption

In der vorliegenden Erfindung entspricht die enzymatische Aktivität von MAO der Zahl der Mole (nyaMol = milli-micro-Mol) des pro ml der Serumprobe pro Stunde enzymatiseher Reaktionszeit gebildeten Benzaldehyd-azoderivates (II) und dieser Wert I wird als enzymatisehe Einheit (Su) ausgedrückt:

Bblekulargewicht des Benzaldehyda,aoderivates (II)_

TYerwendete Serum-1 TReäktionszeitl |j)robenmenge (ml) J [. (Stunde) J

309845/$8SS

WAEO-30349

Gemäß der Torliegenden Erfindung haben die Benaylamin-azoderi-Täte '(I) als Substrat eine höhere Anpassungsfähigkeit "bei der Reaktion mit MAO als das bekannte Substrat und es ist daher möglich,die für die enzymatische Reaktion erforderliche Zeit ' zu.verkürzen, verglichen mit der "bekannten Methode. Außerdem wird eine geringere Menge Organismusprobe„ das heißt nur ein Viertel der Menge, die bei der bekannten Methode benötigt wurde-, benötigt, somit kann die Organismusprobe und das dem Patienten entnommene Volumen kleiner sein, wodurch die Belastung des Patienten verringert wird.

Bin Vergleich der erfindungsgemäßen Methode mit der bekannten Methode ist in der folgenden Tabelle II dargestellt?

Tabelle II

^s. Substrat- ^vVerbindung	Bekannte Methode	Erfindungsgemäße Methode	4-(4'—Aminomethyl- phenylaso )-1-phenyl- 3-me thy1=5-pyrazo- lon-hydrochlorid
Bedingungen^^	Benzyl- amin	I-(4'-Aminomethyl- )henylazo)-2-naph- ;hol-hydrochlorid
Verwendetes Serum volumen (ml)	S, 1'2 (einschließ lich 0,6 ml für einen Leertest)	0,3	2
Brutzeit unter Schütteln bei 340G (Stunden)	3	2	395
Wellenlänge bei ' der die Bestim mung durchge führt wurde (nm)	242	480	36,5
Enzymatisch^ Aktivität von MAO (Eu)	- · - 25	36,5

- 15 309845/0856

j 4b · ^WAK°-3O349

! Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung ; der Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.

ι - ■

' Bezugsbeispiel 1 '.

' Man löst 2,0 g 4-AminObenzylamin-dihydrochlorid in einer Lösung

von 4 ml Chlorwasserstoff säure in 50 ml Wasser und gibt eine lösung von 0,7 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Kühlen ! hinzu. Nach Beendigung- der Piazotierungsrekation gibt man- eine ι lösung von 1,2 g p-Cresol, 4,0 g Natriumhydroxyd und 30 ml ι Wasser hinzu und rührt die Mischung eine Stunde lang. Man I säuert die Reaktionsmischung mit Chlorwasserstoffsäure an, I wobei Kristalle ausfallen, die ausgefallenen Kristalle werden I abfiltriert, getrocknet und aus Methanol umkristallisiert. ; Man erhält so 2,1 g (Ausbeute: 76$) kristallines 2-(4'-Amino- ; methylphenylazo)-p-cresol-hydrochlorid mit einem Schmelzpunkt i von 233 - 236⁰C (unter Zersetzung). ■

I Elementaranalyse für C₁.H₁₅N₅O · HCl:

i Berechnet: C, 60,48; H, 5,76; N, 15,12

j Gefunden: C, 60,22; H, 5,85; N, 15,31

ι ■ :

j K max 330 nm (in Wasser).

J Bezugsbeispiel 2

i ■"..■■ - .- . . Man löst 18,0 g 4-Aminobenzylamin-dihydrochlorid in einer lösung von 36 ml Chlorwasserstoff säure in 100 ml Wasser und gibt · eine lösung von 6,3 Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Rühren ·· und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion gibt man eine lösung von 13,0 ß-Naphthol, 36 g Natriumhydroxyd und 300 ml Wasser hinzu. Man säuert die Reaktionsmischung mit Chlorwasserstoff säure an,' dabei fallen Kristalle aus, die man abfiltriert, trocknet und aus Methanol umkristallisiert. Man erhält so 21 g (Ausbeute: 73%) orangefarbenes kristallines i-^'-AminomethylphenylazoJ-p-naphthol-hydrochlorid mi^ einem Schmelzpunkt von 233 - 235⁰C (unter Zexrse-tzung).

- 16 »
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WAKO-30349

Elementaranalyse für C₁₇H₁CON* · HCl:

Berechnet: C₁ 65,10; H, 5,11; N, 13,08 Gefunden: C, 64,59; H, 4,86; N, 13,15

^max = 485 nm (in Wasser)

Bezugsbeispiel 3

Man löst 5*,0g N-(3'-Aminobenzyl)phthalimid in einer Lösung von 6,0 g Chlorwasserstoff säure in 300 ml Wasser und gibt eine Lösung von 1,4 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion gibt man eine Lösung von 2,6 g N-N-Dimethylanilin, 5 ml Chlorwasserstoffsäure und 50 ml Wasser hinzu und rührt die Reaktionsmischung eine Stunde lang, wobei man eine wässrige Lösung von Natriumacetat so zugibt, daß die Reaktionsmischung eine gelblich-grüne Farbe erhält. Schließlich gibt man eine wässrige Natriumcarbonatlösung hinzu, um die Reaktionsmischung alkalisch zu machen, filtriert die Reaktionsmischung und erhält 7,4 g (Ausbeute: 97$) gelbes kristallines N-(p~N,N-Dimethylaminobenzolazo-3-benzyl)-phthalimid.

Die oben erhaltenen Kristalle werden zusammen mit verdünntem Alkohol und Hydrazinhydrat bis zum Rückfluß erhitzt und nach Zugabe von Chlorwasserstoffsäure erneut zum Rückfluß erhitzt. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt, man gibt Wasser hinzu, filtriert die Mischung und erhält Phthalhydrazid. Man gibt eine wässrige Natriumcarbonatlösung zum Filtrat, um den pH-Wert auf 2 zu bringen und extrahiert dann eine lösliche Fraktion mit Cyclohexan, das man entfernt. Man gibt eine wässrige Natriumcarbonatlösung zur isolierten wässrigen Schicht,* um den pH-Wert auf 14 oder einen höheren Wert zu bringen und extrahiert mit Chloroform. Die Chloroformschicht wird mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Den Rückstand löst man in Aceton, gibt Chlorwasser-

- 17 309845/08S6

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stoffsäure hinzu und dampft die Mischung unter vermindertem Druck zur Trockene ein. Man erhält 3,5 g (Ausbeute: ■ 57$) bläulich-violetter Kristalle von 4-(3^t-Aminomethylphenylazo)-Ν,Ν-dimethylanilin-dihydrochlorid, mit einem Schmelzpunkt von 144 - 145⁰C (unter Zersetzung).

Elementaranalyse für Cj₁-H-IgN. . 2HCl:

Berechnet: C, 55,00; H, 6,11; N, 17,11 Gefunden: C, 55,H; H-, .6,04; N, 16,89...

^ max = 455 nm (in Wasser).

Bezugsbeispiel 4 ·

2,0 g 4-Aminobenzylamin-dihydrochlorid löst man in einer Lösung von 4 ml Chlorwasser stoff säure in 50 ml Wasser und gibt eine Lösung von 0,7 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diasotierungsreaktion wird die Lösung in eine wässrige Lösung von 1,9 g 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon, 2 g Natriumhydroxyd und 50 ml Wasser gegossen. Nach der Kupplungsreaktion wird die Reaktions mischung durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure sauer gemacht und ausgesalzt, wobei man rohe Kristalle erhält. Beim Umkristallisieren aus Methanol erhält man 3,4 g (Ausbeute: 90$) gelblich-oranger Kristalle von 4--(A^r ~Am±nome-thjl-phBnylB,zo 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon mit einem Schmelzpunkt von 153 - 155⁰C .

Elementaranalyse für C₁₇H

Berechnet: G, 61,91; H,. 5,50; N',' 16,99 Gefunden:' C, 61,50; H, 5,31; N, 16,76

Ä max == 390 nm (in Wasser)

- 18 3098457.0856

WAKO-30349

Beispiel 1

Man stellt eine Substrat-Pufferlösung her, indem man 1 mM 1-(4»-Aminomethylphenylazo)-2-naphthOl-hydrochlorid als Substrat in einer. 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Pufferlösung auflöst. 2,0 ml der Substrat-Pufferlösung gibt man in ein Zentrifugenröhrchen und erwärmt 3 Minuten lang bei 37⁰O, dann gibt man 0,3 ml einer Serumprobe hinzu und stellt die Mischung 2 Stunden lang bei 37⁰C in ein thermostatisiertes Gefäß. Man gibt 4 ml Cyclohexan hinzu, schüttelt und extra-' hiert die Mischung 30 Sekunden lang in einem Vibro-Mixer, zentrifugiert dann 10 Minuten lang bei 3000 Upm und isoliert die obere Schicht (eine Losungsmittel-Extraktschicht). Bei der Abtrennung gibt man 10 mg Natriumsulfat hinzu, um die Abtrennung der extrahierten Schicht zu erleichtern.

0,3 ml einer wässrigen Lösung von 1-(4'-Benzaldehydazo)-2-naphthol mit einer Konzentration von 50^gZmI - als Standardlösung - und 0,3 ml destilliertes Wasser - als Kontrolle gibt man in verschiedene Zentrifugenrohre und behandelt sie genauso wie die Serumprobe, so daß man eine Lösungsmittel-Extrakt schicht erhält.

Die Absorption (A) der mit der Serumprobe erhaltenen Lösungsmittel-Extraktschicht und die Absorption (B) der mit der Standardlösung erhaltenen Lösungsmittel-Extrakt schicht werden bei dem Farb-Peak von 1-(4^l-Benzaldehydazo)-2-naphthol, das heißt bei 480 nm, gemessen, wobei die mit destilliertem Wasser erhaltene Lösungsmittel-Extraktschicht als Kontrolle verwendet wird. Man erhält die folgenden Ergebnisse: Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.

Aus diesen Werten wird die durch die Einwirkung von MAO in der Serumprobe gebildete 1-(4^f-Benzaldehydazo)-2-naphthol-Menge wie folgt berechnet:

- 19 309845/0856¹

WAKO-30349

und die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:

1,0 (ml) 1 _ „. .

¹ Beispiel 2

r .

: Man verwendet 4-(4^l-Aminomethylphenylazo)-N,N-dimethylanilin-

I dihydrochlorid und 4-(4^f-Benzaldehydazo)-lT,N-dimethylaniiin-

hydröchlorid anstelle von dem in Beispiel⁵1 verwendeten 1-*(4'-

■ Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydrochlorid bzw. dem 1-(4·-

• Benzaldehydazo)-2-naphthol und führt die Umsetzung wie in B.ei-

; spiel 1 durch. Die Absorption wird beim Farb-Peak des 4-(4^f-

I BenzaldehydazoJ-NjE-dimethylanilin-hydrochlorid, das heißt

j bei 430 nm, gemessen.

j Absorption (A) =0,050, Absorption (B) = 0,125.

^: Die Benzaldehyd-Azoderivatmenge (M), gebildet durch Einwir*

; kung von MAO in der Serumprobe, wird wie folgt berechnet:

50 .

χ 0,3 (ml) x = 6,0 (jag)

Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet: ■

Eu jjlg ^^g) ι
- " 2895

jjlg ^ ι lg W x » ), , -ZA Z 289,5 0,3 (ml) - 2 (hx) ?*t?

j Beispiel 3

j Man verwendet η-Hexan anstelle von dem in Beispiel 1 als Ιοί sungsmittel verwendeten Cyclohexan und führt die Umsetzung ! in gleicher Weise wie. in Beispiel 1 durch. Die erhaltenen Er-

j gebnisse sind folgende:

- 20 309845/0856 ·

2319037

WAK0-30349

Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) =0,130.

j Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe: Eu = 36,4.

ι Beispiel 4

^: Eine Substrat-Pufferlösung und eine Standardlösung werden wie j in Beispiel 1 hergestellt. Man gibt 2,0 ml der Substrat-Puffer- ^: lösung in ein Zentrifugenrohr und erwärmt 3 Minuten bei 37 G, '■ dann gibt man 0,3 ml der Serumprobe hinzu und die Mischung : wird in einem thermostatisierten Gefäß 2 Stunden lang bei 37⁰C inkubiert. Man macht-die Reaktionsmischung sauer, indem man einen Tropfen Chlorwasser stoff säure, die als die enzymatische Aktivität beseitigendes Mittel dient, zugibt und setzt 4 ml Cyclohexan als Lösungsmittel zu, danach wird die Operation : wie in Beispiel 1 ausgeführt. Man erhält folgende Ergebnisse: Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) =0,130.

Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe: ; Eu = 36,5. .

! Beispiel 5 '

Man verwendet Perchlorsäure anstelle der in Beispiel 4 als die enzymatische Aktivität stoppendes Mittel verwendeten Chlorwasserstoff säure und führt danach die Operation so wie in Beispiel 4 durch. Man erhält folgende Ergebnisse:

Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130

Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe:

Eu = 36,4. "

Beispiel 6

Man gibt 0,5 ml der Serumprobe zu 1,0 ml einer Substratlösung von 1-(3^l-Aminomethylphenylazo)-1-naphthol-hydrochlorid in einer 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl (pH 7,2)-Puffer-

- 21 - .

3098^5/0856

WAKO-30349

lösung (mit einer Konzentration von 1mM) und erwärmt die Mischung 60 Minuten lang bei 37°C, säuert sie dann durch Zugabe von 1 Tropfen Perchlorsäure an und extrahiert unter Schütteln mit 5 ml Cyclohexan. Nach der Extraktion wird die⁴" Absorption bei 480 nm gemessen und die MAO-Aktivität durch Vergleich mit der Standardlösung, die 1-(3^I-Benzaldehydazo)-2-naphthol (50 jug/ml) enthält, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind folgede:

Absorption (A) =0,030, Absorption (B) = 0,120

Die 1-(3'-Benzaldehydazo)-2-naphthol-Menge (M), gebildet durch die Wirkung von MAO in der Serumprobe, wird wie folgt berechnet:

M = ?°_f ^(m^ χ 0 5 (ml) χ 9'?;° = 6 25 (ng) ^x 1 (ml; ^{x U}'^{D Kmxj x} 0,120 ' ° Ψ&'

Die enzymatisch^ Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe wird j wie folgt berechnet:

276 ^x 0,5 (ml) ^45>

Beispiel 7

Man gibt 0,5 ml einer Serumprobe zu 1 ml einer Substratlösung (mit einer Konzentration von 0,01 g/ml), hergestellt durch Auflösen von 4-(4^l-Aminomethylphenylazo)-1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon in einer 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)~aminomethan-H01-Pufferlösung und erwärmt die Mischung und läßt sie bei 37°C 60 Minuten lang reagieren. Dann gibt man einen Tropfen Perchlorsäure hinzu, um die Reaktionsmischung sauer zu machen und,.extrahiert unter Schütteln mit 4,0 ml Cyclohexan. Nach der Extraktion wird die Absorption des Extraktes bei 395 nm gemessen. Die MAO-Aktivität bestimmt man durch Vergleich mit der Absorption einer Standardlösung, die 50 /ig/ml 4-(4'-Benzaldehydazo)-1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon enthält. Man erhält folgende Ergebnisse:

- 22 30 9845/0856

WAKO-30349

Absorption (A) = 0,095, Absorption (B) = 0,215

Die 4- (4' -Benzaldehydazo)-1 -phenyl^-methyi-S-pyrazolon-Menge (M), gebildet durch die Wirkung von MAO in der Serumprobe, errechnet sich wie folgt:

_ 50,(ref) χ η 5 (ml) χ 9'9?³ =110 ~ 1 (ml) ' Ö,215 »

Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:

543" ^x 0,5 (ml

Beispiel 8

Eine Vielzahl von Substraten und die entsprechenden Benzaldehyd-Azoderivate werden als Standardsubstanzen anstelle von 1-(3^I-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydrochlorid und dem in Beispiel 6 verwendeten 1-(3'-Benzaldehydazo)~2-naphthol verwendet und die Absorption wird bei der in der nachfolgenden labelle III angegebenen Wellenlänge im sichtbaren Gebiet gemessen, daraus wird die MAO-Aktivität bestimmt·

- 23 30984570856

WAKO-30349

IaT)eile III.1

CH₂MH₂-HCl

Y =

N=N-

Z =

=N-

=N-

Substrat-Verbindung Wellenlänge des Part»-
Peaks des entsprechen
den Benzaldehvd-Azoderivates (nm)

MAO-Aktivität (Eu)

QH
Χ-<^ΥθΗ

OH

OH

JlH

3 OH

CH

NHo-HCl m~f VHH_n-HOl

NHo'HCl

lIH₂-HOl 380

375

320

360

350

460

450

- 24 3 09 8k5/ 0 85 42,5

43,2

46,5

46,3

47i2

42,8

43,5

Tabelle III.1 - Portsetzung

wAKo-30349

3'2

CH,

OH

460

460

450

350

375

370

365

470

- 25 5/0856 44,2 46,4 47,2 44,5 46,0

45,0

44,0

42,3

Λ* . " ■ WAKO-30349

Tabelle 111,1 - Fortsetzung °

X-

OH

HO COOH

475

475

475

490

490

510

500

- 26 9845^0856

42,9

46,5

45,4

42,8

43,8

46,5

47,2

t
Tabelle III..-1 - Fortsetzung

WAKO-30349

	470	44,5
Τ-/~Λ-1ΙΗ2·Η01	480	45,8
O
CH, Χ-/Λ-ΟΗ	472	40,0
O

- 27 309845/0856

WAKO-30349

tabelle III.2

H₂SO₄

H₂SO₄

H=N-

Substrat-Verbindung Wellenlänge des ParTs-Peaks des entsprechenden Benzaldehvd-Azoderivates (ran) -

MAO-Aktivität (Eu)

Υ'

ΟΗ

HSO -^H2^S04 375

460

490

43,2

43,9

41,5

- 28 -

309845/0856

¥AKO-3O349

Beispiel

Man verwendet 1-(4^r-Aininomethylphenylazo)-2-naphthol (die freie Form) anstelle von dem in Beispiel 1 "benutzten 1-(4'-Äminoraetiiylphenylazo)-2-napnthol-hydrocnlorid und führt die Umsetzung und die Operationen wie in Beispiel 1 durch. Man erhält folgende Ergebnisse:

Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.

Die enzymatische Einheit (Eu) von HAO in der Serumprobe errechnet sich zu: Eu = 36,4* '

- 29 30984"5/085e'

Claims (37)

1. 2319Ό97 SO

   CASE: ¥ΑΚ0-3Ο?49

   Il IAIiSPR If C H E

   Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von in einer Organismusprobe enthaltener Honoaminoxydase, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substratlösung, die als Substrat ein Benzylamino-azoderivat der Formel I:

   (D

   ! K=HR

   j worin R eine Gruppe darstellt, die zusammen mit der benach-

   ; barten -K=F-Grruppe zur Bildung einer chromophoren. G-ruppe be

   ι fähigt ist, oder dessen Säureadditionssalz enthält, mit der

   ι Organismusprobe enzymologisch umsetzt, das gebildete Benz-

   i aldehyd-azoderivat der Formel II:

   i CHO

   I worin R die o/ben genannte Bedeutung hat, VOn₁ der Reaktions-

   - 30 309845/0856

   31 WAXO-30349

   mischung abtrennt und die optische Absorption des gebildeten Benzaldehyd-Azoderivates bei einer geeigneten Wellenlänge bestimmt .
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe mit wenigstens einer Hydroxygruppe, Niedrigalkylgruppe oder
   Di-niedrigalkylaminogruppe darstellt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Naphthylgruppe oder eine substituierte Uaphthylgruppe mit wenigstens einer Hydroxygruppe, Carboxygruppe, Aminogruppe oder Alkylgruppe bedeutet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Pyrazolongruppe der allgemeinen Pormel:

   • - 1 R¹ O=C
   ι — N— R²
   I worin -HC
   > I
   N
   ·/ bedeutet, eine Ni edi •igalk

   Hiedrigcycloalkyl- oder

   eine ITitro-substituierte Niedrigalkylgruppe darstellt;
   R² eine Phenyl-,
   gruppe bedeutet.

   R² eine Phenyl-, Niedrigcycloalkyl-, lolyl- oder eine Styryl-
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzalamino-Azoderivat T-(4' -Aminomethylphenyiazo)· 2-naphthol-hydrochlorid verwendet.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4'-Aminomethylphenyiazo)· Η,υ-dimethylanilin-dihydrochlorid verwendet.

   -31--■3098^5/0856

   ' λ/ WAKO- 30349
7. 7. Verfahren nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(3'-AminomethylphenylazQ)-2-naphthol-hydrochlorid verwendet.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(4^I-Aminomethylphenylazo)-2,4-dihydroxy'benzol-hydrochlorid verwendet.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(3'-Aminomethyiphenylazo)-2,4-dihydroxybenzol-hydrochlorid verwendet.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(2'-Aminomethylphenylazo)-2,4-dihydroxybenzol-hydrochlorid verwendet.
11. 11." Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4^ri-Aminomethylphenylazo)-2,6-dimethylphenol-hydrochlorid verwendet.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(3'-Aminomehtylphenylazo)-2,6-dimethylphenol-r-hydrochlorid verwendet.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4^I-Aminomethylphenylazo)-3-aminoanilin-trihydrochlorid verwendet.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(3^l-Aminomehtylphenylazo)-3-aminoanilin-trihydrochlorid verwendet.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet_r daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(3'-Aminomethylphenylazo)-Ν,Ν-dimethylanilin-dihydrochlorid verwendet.

    - 32 30 9 8 A S / 0 85 6

    S3 ....-.' WAKO-30349
16. 16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-3-hydroxy-li,N-dimethylanilin-hydrochlorid verwendet.
17. 17. Verfahren nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(3'-Aminomethylphenylazo)-3-hydroxy-N,N-dimethylanilin-hydrochlorid verwendet.
18. 18. " Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 2-(4'-Aminomethylphenylazo)-p-cresol-hydrochlorid verwendet.
19. 19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(4^I-Aminomethylphenylazo)-naphthalin-hydrochlorid verwendet.
20. 20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(3'-Aminomethylphenylazo)~· naphthalin-hydrochlorid verwendet.
21. 21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(2'-Aminomethylphenylazo)-naphthalin-hydrochlorid verwendet.
22. 22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4'-Aminomethylphenylazo)· 1-naphthol-hydrochlorid verwendet.
23. 23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(3'-Aminomethylphenylazo)-1-naphthol-hydrochlorid verwendet.
24. 24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(4^I-Aminomethylphenylazo)-2,7-dihydroxynaphthalin-hydrochlorid verwendet.

    - 33 309845/0856

    WAKO-30349
25. 25. · Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzaylamino-Azoderivat 1-(3'-Aminomethylphenylazo)-2,7-dlhydroxynaphthalin-hydrochlorid verwendet.
26. 26. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 2-(4^l-Aminomethylphenylazo)-1,5-dihydroxynaphthalin-hydrοchlorid verwendet.
27. 27. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 2-(3'-Aminomethylphenylazo)-1,5-dihydroxynaphthalin-hydrochlorid verwendet.
28. 28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(4'-Aminomethylphenylazo)-Z-hydroxy-S-naphthoesäure-hydrochlorid verwendet.
29. 29. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß. man als Benzylamino-Az oderivat 1-(3'-Aminomethylphenylazo)-2-hydroxy-3-naphthoesäure-hydrochlorid verwendet.
30. 30. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(4^I-Aminomethylphenylazo)-4-aminonaphthalin-dihydrochlorid verwendet.
31. 31. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gkennzeichnet,

    daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(3'-Aminomethylphenylazo)-4-aminonaphthalin-dihydrochlorid verwendet.
32. 32. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4^l-Aminomethylphenylazo)-1-phenyl-3-methyl-5~pyrazolon-hydrochlorid verwendet.
33. 33. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymology sehe Reaktion bei einem pH im Bereich von 6,0 bis 8,0 und bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 45⁰C durchgeführt wird. ^l

    3 0 9845/0856

    3? WAKO 30349
34. 34. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung des Benzaldehyd-Azoderivates durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, ausgewählt . unter η-Hexan, Cyclohexan, Decalin, Xylol, Äthylacetat, Isopropylacetat, Xthyläther und Methyl-butylketon, durchführt.
35. 35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in Anwesenheit eines neutralen Salzes durchgeführt wird.
36. 36. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in Anwesenheit einer Säure durchgeführt wird.
37. 37. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Bestimmung des Benzaldehyd-AzoderiYates in einem organischen Lösungsmittel erfolgt.

    - 35 -309845/0856