DE2319097A1 - Verfahren zur bestimmung der enzymatischen aktivitaet von monoamin-oxydase - Google Patents
Verfahren zur bestimmung der enzymatischen aktivitaet von monoamin-oxydaseInfo
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Description
PA1JENTANWaLTE . Λ; Λ <t Q Λ A μ
DR. ψ, KINZEBACH — DIPL.-ING. O. HEH1EBRAND
S München so 16. April 1973
Telefon! 0811/4 70 50 34
Telegramme: Hekipat (München)
CASE; WAKO-50549
WAKG BDBE GSEMICAL IHDUSiERIES, LID.
10, Doshomachi-3-chome, Higashi-ku,
Osaka» Japan
Verfahren zur Bestimmung der enzymatisehen Aktivität von Monoamin-Oxydase.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen
Aktivität von Monoamin-Oxydase (nachfolgend als
"IiAO" bezeichnet). Die Erfindung betrifft insbesondere eine
neue Methode zur Bestimmung der enzymati sehen Aktivität von
in Körpergewebe befindlichem MAO mit Hilfe einer optischen Methode. . ·
MAO ist ein Enzym, das am Aminstoffwechsel im Organismus teilnimmt
und die öxydative Deaminierungsreaktion der Amine katalysiert, die nach folgender Reaktionsgleichung abläuft:
ArCH2NH2 + O2 + Η£0 >
ArCHO + M5 + H2O2
worin Ar für eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe
steht.
309845A0856
231 SOS?
WAKO-3Q349
Aufgrund neuerer MO-Untersuchtingen ist "bericntet worden, daß
MAO in den meisten Fällen von Leberzirrhose und in einigen !fallen,
von chronischem Herzversagen, Diabetes mellitus oder Hyper-·
thyreoidismus abnormale Aktivitätsspiegel aufweist. ■
Bisher wurde bei der klinischen Untersuchung der Leber eine
Nadel-Biopsie oder eine Nadel-Biopsie unter laparoskopi scher-Beobachtung
als Methode für den genauen Nachweis, von Fibröse
in der Leber verwendet. Von diesen Untersuchungsmethoden kann
jedoch nicht viel erwartet werden, da die Menge von erhältlichem
Untersuchungsmaterial beschränkt ist und eine häufigere
Probeentnahme aus dem Organismus schwierig ist. Alternativ hat man Anstrengungen unternommen, chemische Substanzen oder
die Aktivität der Enzyme, die am Stoffwechsel dieser ehemischen
Substanzen teilnehmen, in den Körperflüssigkeiten, wie im Serum oder Urin oder in einem Bindegewebe zu bestimmen, um
den Krankheitszustand herauszufinden. Als Ergebnis vieler Bestimmungen fand man, daß die Bestimmung der MAQ-Aktivität im
Blut eine- wirksame diagnostische Hilfsmethode bei Leberfibrose
ist /Ken-ich Itο et al., "Saikin Igaku", Band 25, Hr. 11, Seite
2342 (1970)7. ■ ' ~* ' -
; Bisher hat man als Methode zur Bestimmung der MAO-Aktivität
: in einer Organprobe eine Methode vorgeschlagen, bei der eine
; chemische Substanz bestimmt wird, die bei der Reaktion einer MAO-haltigen Körperprobe unter Verwendung von Benzylamin als
Substrat gebildet wird. Beispielweise beschreibt Charles M.
\ McEwen, Journal of Biological Chemistry, Band 240, Seiten
2003 - 2010 (1965), eine Methode, bei der das UV-Absorptions-"
j Spektrum von Benzaldehyd spektrophotometrisch ermittelt wird,
das heißt man bestimmt die Absorption bei 250 nm (nm = Nanometer, 10" m), um die gebildete Benzaldehydmenge herauszufinden
und dadurch die MAO-Aktivität in der Probe zu finden« \ Diese Methode ist recht zuverlässig. Da jedoch die Untersu-
: chung des UY-Absorptionsspektrums durch anders χ$ der Probe
onoo/. C/fiRSR
3 " WAKO-30349
enthaltene. Materialien gestört wird, die eine Absorption im
W-Gebiet aufweisen, z.B. Proteine, Nucleinsäuren, Bilirubin
und Vitamine, ist die Durchführung mühsam· und es sollte bei jeder Bestimmung ein Leertest mit der Probe durchgeführt werden.
Außerdem hat die Bestimmung der Absorption im UV-Gebiet
die Verbreitung dieser Diagnosemethode in herkömmlichen Laboratorien
behindert.
Obgleich die Entwicklung einer colorimetrisehen Methode für
die Bestimmung von gebildetem Benzaldehyd mit Hilfe geeigneter Reagenzien ebenfalls versucht worden ist, konnte kein
exakter Wert erhalten werden, weswegen die Methode nicht befriedigt.
-.
Außerdem ist die Tatsache, daß für die enzymatische Reaktion,
bei der Benzylamin als Substrat verwendet wird, relativ viel Zeit benötigt, ein weiterer Nachteil der obigen Bestimmungsmethode .
Eine Methode, bei der ein anderes Produkt, nämlich Ammoniak,
bestimmt wird, wird durch Ammoniak und flüchtige Amine, die ursprünglich in der Probe enthalten sind, gestört und die
exakte Bestimmung der MAO-Aktivität kann nicht mit Hilfe dieser
Methode erreicht werden.
Eine weitere Methode, bei der gebildetes Wasserstoffperoxyd
sowohl mit Hilfe von Catalase als auch mit Hilfe einer reaktiven Farbe bestimmt wird, um so die MAO-Aktivität zu ermitteln,
liefert keine exakten Ergebnisse, da die reaktive Farbe sich während der Bestimmungsoperation ändert, was Fehler verursacht.
Da MAO bei der oben geschilderten enzymatischen Reaktion Sauerstoff
verbraucht, gibt_es auch eine Methode, die die verbrauchte
Sauerstoff menge mit einem Manometer bestimmt. Diese Methode ist jedoch für klinische Tests, bei denen eine winzige Menge
-- 3 309846/0856
If WAKO-30349
einer Körperprobe verwendet wird, wegen der geringen Empfindlichkeit
nicht "brauchbar. Alle bisherigen Methoden zur Bestimmung
der MAO-Aktivität haben somit viele Nachteile, die
diese Methoden ungeeignet erscheinen-lassen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur genauen und raschen Bestimmung der MAO-Aktivität
durch Bestimmung des enzymatischen Reaktionsproduktes mit Hilfe des sichtbaren Absorptionsspektrums. Die für die
enzymatisch^ Reaktion erforderliche Zeit soll ebenfalls verkürzt werden und die Methode soll sich für die Bestimmung der
j MAO-Aktivität in-Laboratorien eignen.
j Die Erfindung schafft nun ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von MAO, die in einer Probe des Organismus enthalten ist, das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß
e,ine Subs tr at lösung, die als Substrat ein Benzy^Lamin-azoderivat
der !Formel I:
CH2NH2
(D
=NR
; worin R für eine Gruppe steht, die zusammen mit der benachbarteri
-N=N-Gruppe zur Bildung einer chromophoren Gruppe be-ί
fähigt ist, oder ihr Säureadditionssalz enthält, mit der j Organismusprobe enzymatisch umgesetzt wird, das resultierende
Benzaldehyd-azoderivat der Formel II:
CHO
(II)
N=NR
- 4 309845/0856
S VAKO-30349
worin R die oben genannte Bedeutung hat, aus der Reaktionsmischung abgetrennt und bei einer geeigneten Wellenlänge
optisch bestimmt wird.
Die vorliegende Erfindung schafft somit eine Methode zur colorimetrischen,
spektrophotometrisehen oder visuellen Bestimmung eines Benzaldehyd-azoderivates, das durch die folgende enzymatische
Reaktion gebildet wird:
CJH2M2
CHO
H2O Γ Π . + HH5 + H2O2
(H) worin R die oben genannte Bedeutung besitzt.
Der Rest R in der allgemeinen Formel (I) der Benzylamin-razoderivate,
die als Substrate in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bedeutet z.B. eine unsubstituierte Phenylgruppe,
eine unsubstituierte Naphthylgruppe oder eine substituierte Phenyl- oder substituierte Naphthylgruppe. Beispiele für Substituenten
in den Phenyl- oder Naphthylgruppen sind eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, eine Carbonylgruppe, eine
Niedrigalkylgruppe, eine Mono-riiedrigalkylaminogruppe, eine
Di-niedrigalkylaminogruppe und ein Halogenatom. Das Symbol R
kann auch für eine Pyrazolongruppe der allgemeinen lOrmel:
0 = C-N - R2
-HQ
1 2
stehen, worin R und R unabhängig voneinander ein Wasserstoff-
stehen, worin R und R unabhängig voneinander ein Wasserstoff-
- 5 -09345/0856
{■-■■■■ WAKO-30349
atom, eine Alkylgruppe,- eine substituierte Alkylgruppe, eine Cycloalkylgruppe, eine substituierte Cyoloalkylgruppe, eine
Aralkylgruppe, eine substituierte Aralkylgruppe, eine Phenylgruppe
öder eine substituierte Phenylgruppe bedeuten.
Bei den Benzylaminazoderivaten (I) handelt es sich um neue in der
Literatur nicht beschriebene Verbindungen und sie weisen alle
einen charakteristischen Absorptionspeak im sichtbaren Gebiet
auf. Diese Behzylaminazoderivate (I). werden hergestellt, indem
man Aminobenzylamin (oder ein Aminobenzylamin, das mit einer
leicht von der Benzylaminogruppe entfernbaren Gruppe geschützt ist) auf übliche Weise unter Bildung einer Diazoverbindung
diazotiert und anschließend die Diazoverbindung mit einer Kupplungskomponente umsetzt, die dem Substituenten R entspricht.
Die Strukturen dieser Benzylamin-Azoderivate und
ihre physikalischen Eigenschaften sind in der nachfolgenden Eabelle I zusammengefaßt.
30 9Ö4S /
WAKO-30349
Ilabelle
1.1
CH2NH2-HCl CH2NH2. HCl
=N-
y>
N=N-
' Substrat-Verbindung | Ausbeute | Schmelzpunkt (0C) |
> 300 | λ max in Wasser (mn) |
! OH | >300 | |||
XhQhh | 60 | 275 - 277 | 216 - 218 | 384 |
OH | --' | |||
55 | 218 - 219 | 374 | ||
i f\TT Ζ-/~Λ-0Η |
50 | 370 | ||
; CH, . ■ / 3 X-/~V0H |
61 | > 300 | 357 | |
: CH3 | ||||
78 | >300 | 356 j | ||
: OH3 | ||||
■ - ,^H2-HCl | 46 | 450 ; | ||
' NH2'HC1 | ||||
y-/~Vnh2*hci | 50 | 453 : |
- 7 - . 30 984 5/08 56
ffabelle 1,1 - Fortsetzung
WAKO-30349
HGl
OH
(CH,)
3'2
OH
OH
y //
C ■; i- „
54
57
60
76
30
23
15 175 - 177 148 - 151 246 - 247 220 - 222
233 - 236 205 - 207
175 - 177
180 - 185
452
,45.4
458
460
330
374
372
370
- 8 309 84 5 /085 6
tabelle 1,1 - Fortsetzung
WAKO-30349
X-f VOH
73
50
88
76
80 - 235
- 237
>300
>3OO - 276
- 245
77 >
- 9 -309845/0856 485
484
480
480
472
475
490
40
WAKO-30349
HCOOH
ι
X—„HG N
N0/.
N0/.
CH
80
84
84
85
80
90
85 >3Ö0
- 257
- 240
- 217
- 200.
- 155
>300
- 10 309845/0856 486
512
500
470
478
390
480
2319037
WAKO-30349
H2SO4
γι
H2SO4
Substrat-Verbindung
Schmelzpunkt (0C)
O max in Wasser (mn)
γι
.H SO *H2S04
HO
47
72
> 300 >300 >300
374
450
426
- 11 -
3 09 845/0 8B6
2313097
If WAKO-30349 '
ι ■ - ■ . ■
i . - ■
ι '., ■■■■■■■-■-.■■
j Zu den Amiriomethylphenylazopyrazolonderivaten, die als Substrat
j in der vorliegenden Erfindung Terwendet werden können, gehören
J die folgenden Verbindungenϊ
j 4-(4'~Aminomethylplienylazo)-1=--phen3rl~3™methyl~5--pyrazolon-
: hydrochloride
j 4-( 3'-Aminomethylphenylazo)-1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon-
; hydrochloride
j 4~(28~Aminomet3iylphenylazo)-=1-plienyl-3~inet3iyl-5-pyrazolon-
\ hydrochloridP
j 4„(4«-Aminometliylphenylai3o)-.1:-cycloliexyl-3-propyl-5-pyrazoion-
i hydrochloride ' ■ ■
4- (3»-Aminomethylphenylazo ) -1 -cyclohexyl- 3-propyl-5-pyraz olon-
I- hydrochloridj
i 4-( 2s -Aminomethylphenylazo)—1 -cyclohexyl-3~propyl-5-pyrazolon-
I ·
I hydrochlorid,
■ 4-(48-Aminomethylphenylazo)-1-tolyl-3-cyclopentyl-5-pyrazolonj
hydrochloride
j 4-=(3'"Aminomethylphenylazo )™1-tolyl-3-cyclopentyl-5-pyrazolon-
! hydrochlorid,
■ 4-(2'-Aminomethylphenylazo)-1-tolyl-3ocyclopentyl-5-pyrazolonhydrochlorid,
j ■ 4_(41 -.Aminomethylphenylazο) -1 -styryl-3-nitromethyl-5-pyrazolon-I
hydrochloridj ■ :..; -■....
j 4-(3i~Aminomethylphenylazo)~1-styryl-3-nitromethyl-5-pyrasolonhydrochlorid,
- ,.
j 4-(2s-Aminomethylphenylaz ο)-1-styryl-3-nitromethyl-5-pyrazolon-I
hydrochloride,
ί Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt
j man die enzymatische Reaktion so durch, daß man eine bestimmte
! Menge Substrate sung, hergestellt durch Auflösen eines Über-
- 12 3 0 984570856
j 41 WAKO-30349
! Schusses von Benzylamin-Azoderivat (I) als Substrat in einer
• Pufferlösung mit einem pH von 6,0 - 8,0, vorzugsweise 7,0 - 7,2,
··! zusammen mit einer bestimmten Menge der MAO-haltigen Organis-
I musprobe bei einer !Temperatur von 10 bis 45 C, vorzugsweise
I 25bis 37°C, 0,3 Stunden bis 3,0 Stunden lang, vorzugsweise 0,5
\ bis 2,0 Stunden lang, in den Brutschrank stellt. Da mit dem
I Fortschreiten der enzymatischen Reaktion die Reaktionsmischung
j mit der Bildung eines Benzaldehyd-azoderivates (II) ihre Farbe
I ändert, läSt sieh ein Ende der Reaktion feststellen. Nach Be-
I endigung"der Reaktion gibt man ein organisches inertes Lösungs-
j mittel, in dem nur das Benzaldehyd-.azoderivat (II) löslich ist,
• das aber mit Wasser nicht mischbar ist, zur Reaktionsmischung,
um das Benzaldehyd-azoderivat zu extrahieren. Als inertes
; Lösungsmittel verwendet man organische lösungsmittel, wie
; aliphatisehe Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasser-
■ stoffe, Ester, Äther und Ketone, z.B. Hexan, Cyclohexan,
I Decalin, Xylol, Ithylacetat, Isopropylacetat, Ithyläther und
; Methyl-butyJLketon.
Vorzugsweise trennt man die Lösungsmittelschicht, in dia das
Benzaldehyd-Azoderivat (II) extrahiert worden ist, rasch von der wässrigen Schicht ab j z.B. mit Hilfe eines Zentrifugenverfahrens,
wobei die Zugabe eines Neutralsalzes, z.B. Natriumsulfat oder ilatrinmdodeeylsulfat, die Abtrennung, erleichtert.
Man kann auch eine Säure als ein die enzymatisch^ Aktivität
stoppendes Mittel nach der enzymatischen Reaktion zur Reaktionsmischung geben, falls erforderlich, um die Reaktionsflüssigkeit
sauer zu machen und dann das Benzaldehyd-Azoderivat (II) mit dem Lösungsmittel extrahieren. In diesem Falle können anorganische
Säuren, wie z.B. Chlorwasser stoff säure und Perchlorsäure oder organische Säuren, wie z.B. Irichloressigsäure
und Essigsäure, erfolgreich als die enzymatische Aktivität stoppende Mittel verwendet werden, die Säurearten sind nicht
speziell beschränkt.
~ 13 3Q984S/08S8
m WAKO-30349
Die Absorption der mit dem Lösungsmittel extrahierten Lösung,
die das gebildete und extrahierte Benzaldehyd-azoderivat (II) j enthält, wird bei der spektrophotometrisch günstigsten Wellenlänge
im sichtbaren Gebiet, die für das Benzaldehyd-azoderivat (II) charakteristisch ist, bestimmt und die erhaltene Absorption
; wird als Absorption (A) bezeichnet. Bei der Bestimmung der j Absorption wird eine mit Lösungsmittel extrahierte Lösung, die
! durch Zugabe eines bestimmten Volumens destilliertes Wasser zu der Sub strati osuiig, anstelle der Organismusprobe^und durch
j die gleiche Behandlung wie im Falle der Organismusprobe eri
halten worden ist, als Eontrolle verwendet.
j Andererseits wird als Standard ein bestimmtes Volumen einer
wässrigen Lösung des Benzaldehyd-.azoderivates, die die vorge-I
schriebene Konzentration hat, anstelle, der Organismusprobe
j zur Substratlösung gegeben und die resultierende Lösung wird
I-
j genauso wie die Organismusprobe behandelt, so daß man eine
j mit Lösungsmittel extrahierte Lösung erhält und deren Ab-I sorption wird in der gleichen Weise bestimmt und diese Absorption wird als Absorption (B) bezeichnet* Die gebildete
Benzaldehyd-azoderivat (Il)-Menge, M ( jug) wird wie folgt
Ϊ berechnets
Benzaldehyd-.azoderivat (II) Menge (jag), die in der verwendeten
Standardlösung enthalten ist
χ ■
Absorption Absorption
In der vorliegenden Erfindung entspricht die enzymatische Aktivität
von MAO der Zahl der Mole (nyaMol = milli-micro-Mol)
des pro ml der Serumprobe pro Stunde enzymatiseher Reaktionszeit gebildeten Benzaldehyd-azoderivates (II) und dieser Wert
I wird als enzymatisehe Einheit (Su) ausgedrückt:
Bblekulargewicht
des Benzaldehyda,aoderivates (II)_
TYerwendete Serum-1 TReäktionszeitl
|j)robenmenge (ml) J [. (Stunde) J
309845/$8SS
WAEO-30349
Gemäß der Torliegenden Erfindung haben die Benaylamin-azoderi-Täte
'(I) als Substrat eine höhere Anpassungsfähigkeit "bei der
Reaktion mit MAO als das bekannte Substrat und es ist daher möglich,die für die enzymatische Reaktion erforderliche Zeit '
zu.verkürzen, verglichen mit der "bekannten Methode. Außerdem
wird eine geringere Menge Organismusprobe„ das heißt nur ein
Viertel der Menge, die bei der bekannten Methode benötigt wurde-,
benötigt, somit kann die Organismusprobe und das dem Patienten entnommene Volumen kleiner sein, wodurch die Belastung des
Patienten verringert wird.
Bin Vergleich der erfindungsgemäßen Methode mit der bekannten
Methode ist in der folgenden Tabelle II dargestellt?
^s. Substrat- ^vVerbindung |
Bekannte Methode |
Erfindungsgemäße Methode | 4-(4'—Aminomethyl- phenylaso )-1-phenyl- 3-me thy1=5-pyrazo- lon-hydrochlorid |
Bedingungen^^ | Benzyl- amin |
I-(4'-Aminomethyl- )henylazo)-2-naph- ;hol-hydrochlorid |
|
Verwendetes Serum volumen (ml) |
S, 1'2 (einschließ lich 0,6 ml für einen Leertest) |
0,3 | 2 |
Brutzeit unter Schütteln bei 340G (Stunden) |
3 | 2 | 395 |
Wellenlänge bei ' der die Bestim mung durchge führt wurde (nm) |
242 | 480 | 36,5 |
Enzymatisch^ Aktivität von MAO (Eu) |
- · - 25 |
36,5 |
- 15 309845/0856
j 4b · WAK°-3O349
! Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung
; der Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.
ι - ■
' Bezugsbeispiel 1 '.
' Man löst 2,0 g 4-AminObenzylamin-dihydrochlorid in einer Lösung
von 4 ml Chlorwasserstoff säure in 50 ml Wasser und gibt eine
lösung von 0,7 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Kühlen
! hinzu. Nach Beendigung- der Piazotierungsrekation gibt man- eine
ι lösung von 1,2 g p-Cresol, 4,0 g Natriumhydroxyd und 30 ml
ι Wasser hinzu und rührt die Mischung eine Stunde lang. Man
I säuert die Reaktionsmischung mit Chlorwasserstoffsäure an,
I wobei Kristalle ausfallen, die ausgefallenen Kristalle werden I abfiltriert, getrocknet und aus Methanol umkristallisiert.
; Man erhält so 2,1 g (Ausbeute: 76$) kristallines 2-(4'-Amino-
; methylphenylazo)-p-cresol-hydrochlorid mit einem Schmelzpunkt
i von 233 - 2360C (unter Zersetzung). ■
I Elementaranalyse für C1.H15N5O · HCl:
i Berechnet: C, 60,48; H, 5,76; N, 15,12
j Gefunden: C, 60,22; H, 5,85; N, 15,31
ι ■ :
j K max 330 nm (in Wasser).
J Bezugsbeispiel 2
i ■"..■■ - .- . . Man löst 18,0 g 4-Aminobenzylamin-dihydrochlorid in einer lösung
von 36 ml Chlorwasserstoff säure in 100 ml Wasser und gibt ·
eine lösung von 6,3 Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Rühren ··
und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion
gibt man eine lösung von 13,0 ß-Naphthol, 36 g Natriumhydroxyd und 300 ml Wasser hinzu. Man säuert die Reaktionsmischung mit
Chlorwasserstoff säure an,' dabei fallen Kristalle aus, die man abfiltriert, trocknet und aus Methanol umkristallisiert. Man
erhält so 21 g (Ausbeute: 73%) orangefarbenes kristallines
i-^'-AminomethylphenylazoJ-p-naphthol-hydrochlorid mi^ einem
Schmelzpunkt von 233 - 2350C (unter Zexrse-tzung).
- 16 »
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30 9845/08 56
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Elementaranalyse für C17H1CON* · HCl:
Berechnet: C1 65,10; H, 5,11; N, 13,08
Gefunden: C, 64,59; H, 4,86; N, 13,15
^max = 485 nm (in Wasser)
Man löst 5*,0g N-(3'-Aminobenzyl)phthalimid in einer Lösung
von 6,0 g Chlorwasserstoff säure in 300 ml Wasser und gibt eine Lösung von 1,4 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter
Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion gibt man eine Lösung von 2,6 g N-N-Dimethylanilin, 5 ml
Chlorwasserstoffsäure und 50 ml Wasser hinzu und rührt die Reaktionsmischung eine Stunde lang, wobei man eine wässrige
Lösung von Natriumacetat so zugibt, daß die Reaktionsmischung eine gelblich-grüne Farbe erhält. Schließlich gibt man eine
wässrige Natriumcarbonatlösung hinzu, um die Reaktionsmischung
alkalisch zu machen, filtriert die Reaktionsmischung und erhält 7,4 g (Ausbeute: 97$) gelbes kristallines N-(p~N,N-Dimethylaminobenzolazo-3-benzyl)-phthalimid.
Die oben erhaltenen Kristalle werden zusammen mit verdünntem
Alkohol und Hydrazinhydrat bis zum Rückfluß erhitzt und nach
Zugabe von Chlorwasserstoffsäure erneut zum Rückfluß erhitzt. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung unter vermindertem
Druck eingeengt, man gibt Wasser hinzu, filtriert die Mischung und erhält Phthalhydrazid. Man gibt eine wässrige
Natriumcarbonatlösung zum Filtrat, um den pH-Wert auf 2 zu bringen und extrahiert dann eine lösliche Fraktion mit Cyclohexan,
das man entfernt. Man gibt eine wässrige Natriumcarbonatlösung zur isolierten wässrigen Schicht,* um den pH-Wert
auf 14 oder einen höheren Wert zu bringen und extrahiert mit
Chloroform. Die Chloroformschicht wird mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und dann unter vermindertem Druck
eingeengt. Den Rückstand löst man in Aceton, gibt Chlorwasser-
- 17 309845/08S6
WAKQ-3Q349
stoffsäure hinzu und dampft die Mischung unter vermindertem Druck zur Trockene ein. Man erhält 3,5 g (Ausbeute: ■ 57$)
bläulich-violetter Kristalle von 4-(3t-Aminomethylphenylazo)-Ν,Ν-dimethylanilin-dihydrochlorid,
mit einem Schmelzpunkt von 144 - 1450C (unter Zersetzung).
Elementaranalyse für Cj1-H-IgN. . 2HCl:
Berechnet: C, 55,00; H, 6,11; N, 17,11
Gefunden: C, 55,H; H-, .6,04; N, 16,89...
^ max = 455 nm (in Wasser).
Bezugsbeispiel 4 ·
2,0 g 4-Aminobenzylamin-dihydrochlorid löst man in einer Lösung
von 4 ml Chlorwasser stoff säure in 50 ml Wasser und gibt
eine Lösung von 0,7 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter
Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diasotierungsreaktion
wird die Lösung in eine wässrige Lösung von 1,9 g
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon, 2 g Natriumhydroxyd und 50 ml
Wasser gegossen. Nach der Kupplungsreaktion wird die Reaktions mischung durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure sauer gemacht
und ausgesalzt, wobei man rohe Kristalle erhält. Beim
Umkristallisieren aus Methanol erhält man 3,4 g (Ausbeute:
90$) gelblich-oranger Kristalle von 4--(Ar ~Am±nome-thjl-phBnylB,zo
1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon mit einem Schmelzpunkt von
153 - 1550C .
Elementaranalyse für C17H
Berechnet: G, 61,91; H,. 5,50; N',' 16,99
Gefunden:' C, 61,50; H, 5,31; N, 16,76
Ä max == 390 nm (in Wasser)
- 18 3098457.0856
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Beispiel 1
Man stellt eine Substrat-Pufferlösung her, indem man 1 mM
1-(4»-Aminomethylphenylazo)-2-naphthOl-hydrochlorid als
Substrat in einer. 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Pufferlösung
auflöst. 2,0 ml der Substrat-Pufferlösung gibt man in ein Zentrifugenröhrchen und erwärmt 3 Minuten lang bei
370O, dann gibt man 0,3 ml einer Serumprobe hinzu und stellt
die Mischung 2 Stunden lang bei 370C in ein thermostatisiertes
Gefäß. Man gibt 4 ml Cyclohexan hinzu, schüttelt und extra-' hiert die Mischung 30 Sekunden lang in einem Vibro-Mixer,
zentrifugiert dann 10 Minuten lang bei 3000 Upm und isoliert
die obere Schicht (eine Losungsmittel-Extraktschicht). Bei der
Abtrennung gibt man 10 mg Natriumsulfat hinzu, um die Abtrennung der extrahierten Schicht zu erleichtern.
0,3 ml einer wässrigen Lösung von 1-(4'-Benzaldehydazo)-2-naphthol
mit einer Konzentration von 50^gZmI - als Standardlösung
- und 0,3 ml destilliertes Wasser - als Kontrolle gibt
man in verschiedene Zentrifugenrohre und behandelt sie genauso wie die Serumprobe, so daß man eine Lösungsmittel-Extrakt
schicht erhält.
Die Absorption (A) der mit der Serumprobe erhaltenen Lösungsmittel-Extraktschicht
und die Absorption (B) der mit der Standardlösung erhaltenen Lösungsmittel-Extrakt schicht werden
bei dem Farb-Peak von 1-(4l-Benzaldehydazo)-2-naphthol, das
heißt bei 480 nm, gemessen, wobei die mit destilliertem Wasser erhaltene Lösungsmittel-Extraktschicht als Kontrolle verwendet
wird. Man erhält die folgenden Ergebnisse: Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.
Aus diesen Werten wird die durch die Einwirkung von MAO in der Serumprobe gebildete 1-(4f-Benzaldehydazo)-2-naphthol-Menge
wie folgt berechnet:
- 19 309845/08561
WAKO-30349
und die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe
wird wie folgt berechnet:
1,0 (ml) 1 _ „. .
1
Beispiel 2
r .
: Man verwendet 4-(4l-Aminomethylphenylazo)-N,N-dimethylanilin-
I dihydrochlorid und 4-(4f-Benzaldehydazo)-lT,N-dimethylaniiin-
hydröchlorid anstelle von dem in Beispiel51 verwendeten 1-*(4'-
■ Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydrochlorid bzw. dem 1-(4·-
• Benzaldehydazo)-2-naphthol und führt die Umsetzung wie in B.ei-
; spiel 1 durch. Die Absorption wird beim Farb-Peak des 4-(4f-
I BenzaldehydazoJ-NjE-dimethylanilin-hydrochlorid, das heißt
j bei 430 nm, gemessen.
j Absorption (A) =0,050, Absorption (B) = 0,125.
: Die Benzaldehyd-Azoderivatmenge (M), gebildet durch Einwir*
; kung von MAO in der Serumprobe, wird wie folgt berechnet:
50
.
χ 0,3 (ml) x = 6,0 (jag)
Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe wird
wie folgt berechnet: ■
Eu jjlg ^g) ι
- " 2895
- " 2895
jjlg ^ ι lg W x » ), , -ZA Z
289,5 0,3 (ml) - 2 (hx) ?*t?
j Beispiel 3
j Man verwendet η-Hexan anstelle von dem in Beispiel 1 als Ιοί sungsmittel verwendeten Cyclohexan und führt die Umsetzung
! in gleicher Weise wie. in Beispiel 1 durch. Die erhaltenen Er-
j gebnisse sind folgende:
- 20 309845/0856 ·
2319037
WAK0-30349
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) =0,130.
j Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe:
Eu = 36,4.
ι Beispiel 4
: Eine Substrat-Pufferlösung und eine Standardlösung werden wie
j in Beispiel 1 hergestellt. Man gibt 2,0 ml der Substrat-Puffer-
: lösung in ein Zentrifugenrohr und erwärmt 3 Minuten bei 37 G,
'■ dann gibt man 0,3 ml der Serumprobe hinzu und die Mischung
: wird in einem thermostatisierten Gefäß 2 Stunden lang bei 370C
inkubiert. Man macht-die Reaktionsmischung sauer, indem man
einen Tropfen Chlorwasser stoff säure, die als die enzymatische Aktivität beseitigendes Mittel dient, zugibt und setzt 4 ml
Cyclohexan als Lösungsmittel zu, danach wird die Operation : wie in Beispiel 1 ausgeführt. Man erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) =0,130.
Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe: ; Eu = 36,5. .
! Beispiel 5 '
Man verwendet Perchlorsäure anstelle der in Beispiel 4 als
die enzymatische Aktivität stoppendes Mittel verwendeten Chlorwasserstoff säure und führt danach die Operation so wie in
Beispiel 4 durch. Man erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130
Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe:
Eu = 36,4. "
Man gibt 0,5 ml der Serumprobe zu 1,0 ml einer Substratlösung
von 1-(3l-Aminomethylphenylazo)-1-naphthol-hydrochlorid in
einer 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl (pH 7,2)-Puffer-
- 21 - .
3098^5/0856
WAKO-30349
lösung (mit einer Konzentration von 1mM) und erwärmt die
Mischung 60 Minuten lang bei 37°C, säuert sie dann durch Zugabe von 1 Tropfen Perchlorsäure an und extrahiert unter
Schütteln mit 5 ml Cyclohexan. Nach der Extraktion wird die4"
Absorption bei 480 nm gemessen und die MAO-Aktivität durch Vergleich mit der Standardlösung, die 1-(3I-Benzaldehydazo)-2-naphthol
(50 jug/ml) enthält, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse
sind folgede:
Absorption (A) =0,030, Absorption (B) = 0,120
Die 1-(3'-Benzaldehydazo)-2-naphthol-Menge (M), gebildet durch
die Wirkung von MAO in der Serumprobe, wird wie folgt berechnet:
M = ?°f (m^ χ 0 5 (ml) χ 9'?;° = 6 25 (ng) x 1 (ml; x U'D Kmxj x 0,120 ' ° Ψ&'
Die enzymatisch^ Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe wird
j wie folgt berechnet:
276 x 0,5 (ml) 45>
Beispiel 7
Man gibt 0,5 ml einer Serumprobe zu 1 ml einer Substratlösung
(mit einer Konzentration von 0,01 g/ml), hergestellt durch Auflösen von 4-(4l-Aminomethylphenylazo)-1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon
in einer 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)~aminomethan-H01-Pufferlösung
und erwärmt die Mischung und läßt sie bei 37°C 60 Minuten lang reagieren. Dann gibt man einen Tropfen Perchlorsäure
hinzu, um die Reaktionsmischung sauer zu machen und,.extrahiert unter Schütteln mit 4,0 ml Cyclohexan. Nach
der Extraktion wird die Absorption des Extraktes bei 395 nm gemessen. Die MAO-Aktivität bestimmt man durch Vergleich mit
der Absorption einer Standardlösung, die 50 /ig/ml 4-(4'-Benzaldehydazo)-1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon
enthält. Man erhält folgende Ergebnisse:
- 22 30 9845/0856
WAKO-30349
Absorption (A) = 0,095, Absorption (B) = 0,215
Die 4- (4' -Benzaldehydazo)-1 -phenyl^-methyi-S-pyrazolon-Menge
(M), gebildet durch die Wirkung von MAO in der Serumprobe,
errechnet sich wie folgt:
_ 50,(ref) χ η 5 (ml) χ 9'9?3 =110
~ 1 (ml) ' Ö,215 »
Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:
543" x 0,5 (ml
Eine Vielzahl von Substraten und die entsprechenden Benzaldehyd-Azoderivate
werden als Standardsubstanzen anstelle von 1-(3I-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydrochlorid und dem
in Beispiel 6 verwendeten 1-(3'-Benzaldehydazo)~2-naphthol
verwendet und die Absorption wird bei der in der nachfolgenden labelle III angegebenen Wellenlänge im sichtbaren Gebiet gemessen, daraus wird die MAO-Aktivität bestimmt·
- 23 30984570856
WAKO-30349
IaT)eile III.1
CH2MH2-HCl
Y =
N=N-
Z =
=N-
=N-
Substrat-Verbindung Wellenlänge des Part»-
Peaks des entsprechen
den Benzaldehvd-Azoderivates (nm)
Peaks des entsprechen
den Benzaldehvd-Azoderivates (nm)
MAO-Aktivität
(Eu)
QH
Χ-<^ΥθΗ
Χ-<^ΥθΗ
OH
OH
JlH
3 OH
CH
NHo-HCl m~f VHHn-HOl
NHo'HCl
lIH2-HOl 380
375
320
360
350
460
450
- 24 3 09 8k5/ 0 85
42,5
43,2
46,5
46,3
47i2
42,8
43,5
wAKo-30349
3'2
CH,
OH
460
460
450
350
375
370
365
470
- 25 5/0856 44,2 46,4 47,2 44,5 46,0
45,0
44,0
42,3
Λ* . " ■ WAKO-30349
Tabelle 111,1 - Fortsetzung °
X-
OH
HO COOH
475
475
475
490
490
510
500
- 26 9845^0856
42,9
46,5
45,4
42,8
43,8
46,5
47,2
t
Tabelle III..-1 - Fortsetzung
Tabelle III..-1 - Fortsetzung
WAKO-30349
470 | 44,5 | |
Τ-/~Λ-1ΙΗ2·Η01 | 480 | 45,8 |
O | ||
CH, Χ-/Λ-ΟΗ |
472 | 40,0 |
O |
- 27 309845/0856
WAKO-30349
tabelle III.2
H2SO4
H2SO4
H=N-
Substrat-Verbindung Wellenlänge des ParTs-Peaks
des entsprechenden Benzaldehvd-Azoderivates
(ran) -
MAO-Aktivität
(Eu)
Υ'
ΟΗ
HSO -H2S04
375
460
490
43,2
43,9
41,5
- 28 -
309845/0856
¥AKO-3O349
Man verwendet 1-(4r-Aininomethylphenylazo)-2-naphthol (die
freie Form) anstelle von dem in Beispiel 1 "benutzten 1-(4'-Äminoraetiiylphenylazo)-2-napnthol-hydrocnlorid
und führt die Umsetzung und die Operationen wie in Beispiel 1 durch. Man
erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.
Die enzymatische Einheit (Eu) von HAO in der Serumprobe errechnet sich zu: Eu = 36,4* '
- 29 30984"5/085e'
Claims (37)
- 2319Ό97 SOCASE: ¥ΑΚ0-3Ο?49Il IAIiSPR If C H EVerfahren zur Bestimmung der Aktivität von in einer Organismusprobe enthaltener Honoaminoxydase, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substratlösung, die als Substrat ein Benzylamino-azoderivat der Formel I:(D! K=HRj worin R eine Gruppe darstellt, die zusammen mit der benach-; barten -K=F-Grruppe zur Bildung einer chromophoren. G-ruppe beι fähigt ist, oder dessen Säureadditionssalz enthält, mit derι Organismusprobe enzymologisch umsetzt, das gebildete Benz-i aldehyd-azoderivat der Formel II:i CHOI worin R die o/ben genannte Bedeutung hat, VOn1 der Reaktions-- 30 309845/085631 WAXO-30349mischung abtrennt und die optische Absorption des gebildeten Benzaldehyd-Azoderivates bei einer geeigneten Wellenlänge bestimmt .
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe mit wenigstens einer Hydroxygruppe, Niedrigalkylgruppe oder
Di-niedrigalkylaminogruppe darstellt. - 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Naphthylgruppe oder eine substituierte Uaphthylgruppe mit wenigstens einer Hydroxygruppe, Carboxygruppe, Aminogruppe oder Alkylgruppe bedeutet.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Pyrazolongruppe der allgemeinen Pormel:
• - 1 R1 O=C
ι— N— R2
Iworin -HC
>I
N
·/bedeutet, eine Ni edi •igalk Hiedrigcycloalkyl- odereine ITitro-substituierte Niedrigalkylgruppe darstellt;
R2 eine Phenyl-,
gruppe bedeutet.R2 eine Phenyl-, Niedrigcycloalkyl-, lolyl- oder eine Styryl- - 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzalamino-Azoderivat T-(4' -Aminomethylphenyiazo)· 2-naphthol-hydrochlorid verwendet.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4'-Aminomethylphenyiazo)· Η,υ-dimethylanilin-dihydrochlorid verwendet.-31--■3098^5/0856' λ/ WAKO- 30349
- 7. Verfahren nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(3'-AminomethylphenylazQ)-2-naphthol-hydrochlorid verwendet.
- 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(4I-Aminomethylphenylazo)-2,4-dihydroxy'benzol-hydrochlorid verwendet.
- 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(3'-Aminomethyiphenylazo)-2,4-dihydroxybenzol-hydrochlorid verwendet.
- 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(2'-Aminomethylphenylazo)-2,4-dihydroxybenzol-hydrochlorid verwendet.
- 11." Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4ri-Aminomethylphenylazo)-2,6-dimethylphenol-hydrochlorid verwendet.
- 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(3'-Aminomehtylphenylazo)-2,6-dimethylphenol-r-hydrochlorid verwendet.
- 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4I-Aminomethylphenylazo)-3-aminoanilin-trihydrochlorid verwendet.
- 14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(3l-Aminomehtylphenylazo)-3-aminoanilin-trihydrochlorid verwendet.
- 15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnetr daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(3'-Aminomethylphenylazo)-Ν,Ν-dimethylanilin-dihydrochlorid verwendet.- 32 30 9 8 A S / 0 85 6S3 ....-.' WAKO-30349
- 16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-3-hydroxy-li,N-dimethylanilin-hydrochlorid verwendet.
- 17. Verfahren nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(3'-Aminomethylphenylazo)-3-hydroxy-N,N-dimethylanilin-hydrochlorid verwendet.
- 18. " Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 2-(4'-Aminomethylphenylazo)-p-cresol-hydrochlorid verwendet.
- 19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(4I-Aminomethylphenylazo)-naphthalin-hydrochlorid verwendet.
- 20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(3'-Aminomethylphenylazo)~· naphthalin-hydrochlorid verwendet.
- 21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(2'-Aminomethylphenylazo)-naphthalin-hydrochlorid verwendet.
- 22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4'-Aminomethylphenylazo)· 1-naphthol-hydrochlorid verwendet.
- 23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(3'-Aminomethylphenylazo)-1-naphthol-hydrochlorid verwendet.
- 24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(4I-Aminomethylphenylazo)-2,7-dihydroxynaphthalin-hydrochlorid verwendet.- 33 309845/0856WAKO-30349
- 25. · Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzaylamino-Azoderivat 1-(3'-Aminomethylphenylazo)-2,7-dlhydroxynaphthalin-hydrochlorid verwendet.
- 26. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 2-(4l-Aminomethylphenylazo)-1,5-dihydroxynaphthalin-hydrοchlorid verwendet.
- 27. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 2-(3'-Aminomethylphenylazo)-1,5-dihydroxynaphthalin-hydrochlorid verwendet.
- 28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(4'-Aminomethylphenylazo)-Z-hydroxy-S-naphthoesäure-hydrochlorid verwendet.
- 29. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß. man als Benzylamino-Az oderivat 1-(3'-Aminomethylphenylazo)-2-hydroxy-3-naphthoesäure-hydrochlorid verwendet.
- 30. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(4I-Aminomethylphenylazo)-4-aminonaphthalin-dihydrochlorid verwendet.
- 31. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gkennzeichnet,daß man als Benzylamino-Azoderivat 1-(3'-Aminomethylphenylazo)-4-aminonaphthalin-dihydrochlorid verwendet.
- 32. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4-(4l-Aminomethylphenylazo)-1-phenyl-3-methyl-5~pyrazolon-hydrochlorid verwendet.
- 33. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymology sehe Reaktion bei einem pH im Bereich von 6,0 bis 8,0 und bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 450C durchgeführt wird. l3 0 9845/08563? WAKO 30349
- 34. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung des Benzaldehyd-Azoderivates durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, ausgewählt . unter η-Hexan, Cyclohexan, Decalin, Xylol, Äthylacetat, Isopropylacetat, Xthyläther und Methyl-butylketon, durchführt.
- 35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in Anwesenheit eines neutralen Salzes durchgeführt wird.
- 36. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in Anwesenheit einer Säure durchgeführt wird.
- 37. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Bestimmung des Benzaldehyd-AzoderiYates in einem organischen Lösungsmittel erfolgt.- 35 -309845/0856
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