DE2319097B2 - Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Mono-Amin-Oxydase - Google Patents

Description

CH₂NH₂

N = NR

worin R eine Gruppe darstellt, die zusammen mit der benachbarten — N= N-Gruppe zur Bildung einer chromophoren Gruppe befähigt ist. oder dessen Säureadditionssalz enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe mit wenigstens einer Hydroxygruppe, Aminogruppe, Niedrigalkylgruppe oder Di-niedrigalkylaminogruppe darstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da:3 R eine Naphthylgruppe oder eine substituierte Naphthylgruppe mit wenigstens einer Hydroxygruppe, Carboxygruppe. Aminogruppe oder Alkylgruppe bedeutet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Pyrazolongruppe der allgemeinen Formel

O = C N — R^;!

HC

N //

R¹

bedeutet, worin R¹ eine Niedrigalkyl-, Niedrigcycloalkyl- oder eine Nitro-substituierte Niedrigalkylgruppe und R² eine Phenyl-, Niedrigcycloalkyl-, Tolyl- oder eine Styrylgruppe darstellt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat l-(4'-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydrochlorid verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat l-(3'-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydro-Chlorid verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennteichnet. daß man als Benzylamino-Azoderivat 4 - (3' - AminomsMhylphenylazo) - N,N - dimethyl-■nilin-dihydrochloiid verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennieichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat 4 - (4' - Aminomethylphenylazo) - 3 - hydroxy-N,N - dimethylanilin - hydrochlorid verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderiva 4 - (3' - Aminomethylphenylazo) - 3 - hydroxy RN-dimethylanilin-hydrochlorid verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azode rivat 2 - (4' - Aminomethylphenyiazo) - ρ - cresol hydrochlorid verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 1, '-"«lurch ge kennzeichnet, daß man als Benzyla:- o-Azodj rivat 1 -(4'-Aminomethylphenylazo)- naphthalinhydrochlorid verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-A/oderivat 4 - (4' - Aminomethylphenylazo) - 1 - phenyl-3 - methyl - 5 - jpyrazolon - hydrochlorid verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung des gebildeten Benzaldehyd-Azoderivates durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmiuel. ausgewählt unter η-Hexan. Cyclohexan. Decalin. Xylol. Äthylacetat, Iiiopropylacetat. Äthyläther und Methyl-butylketon, durchführt.

14. Verfahren nach Anspruch 13. dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in Anwesenheit eines neutralen Salzes durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13. dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in Anwesenheit einer Säure durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die optische Bestimmung des Benzaldehyd-Azoderivates in einem organischen Lösungsmittel erfolgt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von in einer Organismusprobe enthaltener Monoamin-Oxydase (»MAO«) durch Umsetzung der Organismusprobe mit einer Substratlösung, die als Substrat eine Benzylaminverbindung enthält. Abtrennen der gebildeten Benzaldehydverbindung von der Reaktionsmischung und Bestimmung der optischen Absorption der gebildeten Benzaldehydverbindung bei einer geeigneten Wellenlänge.

MAO ist ein Enzym, das am A mi η Stoffwechsel im Organismus teilnimmt und die oxydative Deaminie-

rungsreaktion der Amine katalysiert, die nach folgender Reaktionsgleichung abläuft:

ArCH₂NH₂ + O₂ + H₂O

-ArCHO + NH₃ + H₂O₂

worin Ar für eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe steht.

Auf Grund neuerer MAO-Untersuchungen ist berichtet worden, daß MAO in den meisten Fällen von Leberzirrhose und in einigen Fällen von chronischem Herzversagen, Diabetes mellitus oder Hypcrthyreoidismus abnormale Aktivitätsspiegel aufweist.

Bisher wurde bei der klinischen Untersuchung der Leber eine Nadel-Biopsie oder eine Nadcl-Biopsic unter laparoskopisicher Beobachtung als Methode für den genauen Nachweis von Fibröse in der Leber verwendet. Von diesen Untersuchungsmethoden kann jedoch nicht viel erwartet werden, da die Menge von erhältlichem Untersuchungsmaterial beschränkt ist

und eine häufigere Probeentnahme aus dem Organismus schwierig ist. Alternativ hat man Anstrengungen unternommen, chemische Substanzen oder die Aktivität der Enzyme, die am Stoffwechsel dieser chemischen Substanzen teilnehmen, in den Körperflüssigkeiten, wie im Serum oder Urin oder in einem Bindegewebe zu bestimmen, um den Krankheitszustand herauszufinden. Als Ergebnis vieler Bestimmungen fand man, daß die Bestimmung der MAO-Aktivität im Blut eine wirksame diagnostische Hilfsmethode bei Leberfibrose ist (Ken-ich lto ei al.. »Saikin Igaku«, Bd. 25, Nr. 11. S. 2342 [!97O]).

Bisher hat man als Methode zur Bestimmung der MAO-Aktivität in einer Organprobe eine Methode vorgeschlagen, bei der eine chemische Substanz bestimmt wird, die bei der Reaktion ein;r MAO-haltigen Körperprobe unter Verwendung von Benzylamin als Substrat gebildet wird. Beispielsweise beschreibt Charles M. McEwen. Journal of Biological Chemistry, Bd. 240, S. 2003 bis 2010 (1965), eine Methode, bei der das UV-Absorptionsspektrum von Benzaldehyd spektrophotometrisch ermittelt wird, d. h. man bestimmt die Absorption bei 250 nm (nm = Nanometer, 10 ⁹m), um die gebildete Bcn/-aldehydmenge heiauszufinden und dadurch die MAO-Aktivität in der Probe zu finden. Diese Methode ist recht zuverlässig. Da jedoch die Untersuchung des UV-Absorptionsspektrums durch andere in der Probe enthaltene Materialien gestört wird, die eine Absorption im UV-Gebiet aufweisen, z. B. Proteine. Nucleinsäuren, Bilirubin und Vitamine, ist die Durchführung mühsam, und es sollte bei jeder Bestimmung ein Leertest mit der Probe durchgeführt werden. Außerdem hat die Bestimmung der Absorption im UV-Gebiet die Verbreitung dieser Diagnosemethode in herkömmlichen Laboratorien behindert.

Obgleich die Entwicklung einer coiorimetrischen Methode für die Bestimmung von gebildetem Benzaldehyd mit Hilfe geeigneter Reagenzien ebenfalls versucht worden ist, konnte kein exakter Wert erhalten werden, weswegen die Methode nicht befriedigt.

Außerdem ist die Tatsache, daß fur die enzymatische Reaktion, bei der Benzylamin als Substrat verwendet wird, relativ viel Zeit benötigt, ein weiterer Nachteil der obigen Bestimmungsmethode.

Eine Methode, bei der ein anderes Produkt, nämlich Ammoniak, bestimmt wird, wird durch Ammoniak und flüchtige Amine, die ursprünglich in der Probe enthalten sind, gestört, und die exakte Bestimmung der MAO-Aktivität kann nicht mit Hilfe dieser Methode erreicht werden.

Eine weitere Methode, bei der gebildetes Wasserstoffperoxyd sowohl mit Hilfe von Catalase als auch mit Hilfe einer reaktiven Farbe bestimmt wird, um so die MAO-Aktivität zu ermitteln, liefert keine exakten Ergebnisse, da die leaktive Farbe sich während der Bestimmungsoperation ändert, was Fehler verursacht.

Da MAO bei der oben geschilderten enzymatischen Reaktion Sauerstoff verbraucht, gibt es auch eine Methode, die die verbrauchte Sauerstoffmenge mit einem Manometer bestimmt. Diese Methode ist jedoch für klinische Tests, bei denen eine winzige Menge einer Körperprobe verwendet wird, wegen der geringen Empfindlichkeit nicht brauchbar. Alle bisherigen Methoden zur Bestimmung der MAO-Aklivität haben somit viele Nachteile, die diese Methoden ungeeignet erscheinen lassen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur genauen und raschen Bestimmung der MAO-Aktivität durch Bestimmung des enzymatischen Reaktionsproduktes mit Hilfe des sichtbaren Absorptionsspektrums. Die für die enzymatische Reaktion erforderliche Zeit soll ebenfalls verkürzt werden, und die Methode soll sich für die Bestimmung der MAO-Aktiviiät in Laboratorien eignen.

Das crfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von in einer Organismusprobe enthaltener Monoamin-Oxydase ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substratlösung verwendet, die als Substrat ein Benzylamin-azoderivat der Formel 1

CH₁NH,

N = NR

worin R für eine Gruppe steht, die zusammen mit der benachbarten — N = N-Gruppe zur Bildung einer chromophoren Gruppe befähigt ist, oder 'hr Siiureadditionssalz enthält.

Die vorliegende Erfindung schafft somit eine Methode zur coiorimetrischen, spektrophotometrischen oder visuellen Bestimmung eines Benzaldehyd-azoderivates, das durch die folgende enzymatische Reaktion gebildet wird:

CH₇NH,

+ O, + H,0

N= NR

CHO

MAO

+ NH₃ + H₂O,

N = NR

(II)

worin R die obengenannte Bedeutung besitzt.

Der Rest R in der allgemeinen Formel I der Benzylamin-azoderivate, die als Substrate in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bedeutet bevorzugt eine unsubstituierte oder substituierte Phenyl- oder Naphthylgruppe, dabei kann die Phenylgruppe bevorzugt mit wenigstens einer Hydroxy-, Amino-, Niedrigalkyl- oder Di-niedrigalkylaminogruppe und die Naphthylgruppe mit wenigstens einer Hydroxy-, Carboxy-. Amino- oder Alkylgruppe substituiert sein. Das Symbol R kann auch für eine Pyrazolongruppc der allgemeinen Formel:

O = C N —R²

— HC

I R¹

stellen, worin R¹ eine Niedrigalkyl-, Niedrigcycloalkyl- oder eine Nitro-subs.tituierte Niedrigalkylgruppe

23 1909

und R² eine Phenyl-, Niedrigcycloalkyl-, Tulyl- oder eine Styrylgruppe darstellt.

Bei den Benzylamin-azcderivaten (Ij handelt es sich um neue in der Literatur nicht beschriebene Verbindungen, die alle einen charakteristischen Absorptionspeak im sichtbaren Gebiet aufweisen. Diese Benzylamin-azoderivate(l) können hergestellt werden, indem man Aminobenzylamin (oder ein Aminobenzylamin, das mit einer leicht von der Benzylaminogrupp entfernbaren Gruppe geschützt ist) auf übliche Weis unter Bildung einer Diazoverbindung diazotiert um anschließend die Diazoverbindung mit einer Kupp lungskomponente umsetzt, die dem Substituenten f entspricht. Die Strukturen geeigneter Benzylamin Azoderivate und ihre physikalischen Eigenschaftei sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammen gefaßt

X =

Substrat-Verbindung

OH

CH₃

- OH

CH,

OH

X -S

N(CH,), ■ HCl

γ ₌

Tabelle l.i CH₂NH₂ · HCl

N=N-

CH₂NH₂ · HCl

Y -^y /-- N(CH,),- HC

Ausbeute

78 Schmelzpunkt
( C|

275—277

>3(X)

>30()

218

218-219

46

50

54 >300

> 300

177

I4X

/.,„„ in Wasser (nm)

384

374

370

357

356

450

453

452

Substrat-Verbindung

OH X -\~y— N(CH₃),

OH

Y —<f~V- N(CH₃I₂

OH

CH₃

X —

OH

X -

OH

OH

OH

1-ortsct/ung

Ausheule ("..I

57

76

50

Schmelzpunkt

247

222

236

207

177

IKO 1S5

235

237

3(M)

- 300

/. , in NN μ-Ι um I

45S

460

330

374

372

170

4S5

4S4

4X0

4X0

/I"

Su bsiru I-Verbindung

HO

HO

HO COOH

x —f~S

HO COOH

γ S

X -~<f - NH₂ HCI

NH, HCl

Fortsetzung

Ausheule

76

80

S4

K4

10

Schmcl/.punkl

276

245

> 300

> 3(K)

257

240

217

200

/ , in Wa

I π m I

472

475

490

4S6

512

5(X)

470

478

Substrat-Verbindung

C N

\	N / C I
	CH3
	CH3
X-/	_VoH
	>

Fortsetzung

Ausheule

12

Schmelzpunkt	',„„ in w
I C)	(nm)
153—155	390
>300	480

	Tabelle 1.2	Y' =	CH2NH, 1Z2H2SO4
	• V2 H2SO4		N = N-
CH2NH2
λ N =
= N-

	Substrat-Verbindung	Ausbeute ("/«I	Schmelzpunkt (Ci
	OH I
Y'		47	>300
	NH,
X'	-\~\~ NH2 H7SO4	52	> 300
	Y'
HO		72	>300
	O OH

'•m.« in Wasser (nml

374

450

426

Weitere Aminomethylphcnylazopyrazolonderivate. die als Substrat in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die folgenden Verbindungen :

4-(.V-Aminomethylphenylazo)-l-phcnyl-S-methyl-S-pyrazolonhydrochlorid, 4-(2'-AminomelhylphenylazoH-phenyl-

.Vmethyl-5-pyrazolonhydrochIorid, 4-(4'-Aminomethyi_')henyla2o)-l-cyclohexyl-

3-propyl-5-pyrazolonhydrochiorid, 4-( 3 '-Aminomet hylphenylazo)-1 -cyclohexyl-

3-propyl-5-pyrazolonhydrochlorid, 4-( 2 '-Aminomethylphenylazo)-1 -cyclohexy 1-3-propyl-5-pyrazolonhydrochlorid.

23

097$

4-(4'-Aminomctliylphenylazo)-l-tolyl-3-cyclo-

pcnlyl-5-pyrazolonhydrochlorid.
4-(3'-Aminomcthylphcnylazo)-l-tolyl-3-cyelo-

pentyl-5-pyrazolonhydrochlorid.
4-(2'-Aminomcthylphenylazo)-l-tolyl-3-cyclo-

pentyl-S-pyrazolonhydrochlorid.
4-(4'-Aminomethylphenylazo)-l-styryl-3-nitro-

methyl-5-pyrazolonhydrochlorid.
4-(3'-Aminomcthylphenylazo)-l-styryl-3-nitro-

mcthyl-5-pyrazolonhydrochlorid. ι ο

4-(2'-Aminomethylphcnylazo)-l-styryl-3-niiro-

methyl-5-pyrazolonhydrochlorid.

Man führt das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise so durch, daß man eine bestimmte Menge is Substratlösung, hergestellt durch Auflösen eines Überschusses von Bcnzylamin-Azodcrivat (1) als Substrat in einer Pufferlösung mit einem pH von 6.0 bis 8.0. vorzugsweise 7,0 bis 7.2, zusammen mit einer bestimmten Menge der MAO-haltigcn Organismusprobe bei einer Temperatur von 10 bis 45 C. vorzugsweise 25 bis 37 C 0,3 Stunden bei 3.0 Stunden lang, vorzugsweise 0,5 bis 2,0 Stunden lang, in den Brutschrank stellt. Da mit dem Fortschreiten der enzymalischcn Reaktion die Reaktionsmischung mit der Bildung eines Benzaldehyd-azoderivates (11) ihre l-'arbe ändert, läßt sich ein Ende der Reaktion feststellen. Im Anschluß an die Inkubation gibt man ein organisches inertes Lösungsmittel, in dem nur das Ben/aldchyd-azodcrivat (11) löslich ist. das aber mit Wasser nicht mischbar ist. zur Reaktionsmischung, um das Benzaldehyd-azodcrivat zu extrahieren. Als inertes Lösungsmittel verwendet man organische Lösungsmittel, wie aliphalischc Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe. Ester. Äther und Ketone. bevorzugt n-Hexan.Cyclohexan.Decalin. Xylol. Äthylacetat. Isopropylacctat, Äthyläther und Methylvinylketon.

Vorzugsweise trennt man die Lösungsmitlelschichi. in die das Benzaldchyd-Azoderivat (II) extrahiert worden ist. rasch von der wäßrigen Schicht ab. /.. B. mit Hilfe eines Zentrifugenverfahrens, wobei die Zugabe eines Ncutralsalz.es, z. B. Natriumsulfat oder Natriumdodecylsulfat, die Abtrennung erleichtert.

Man kann auch eine Säure als ein die enzymatischc Aktivität stoppendes Mittel nach der enzymatischen Reaktion zur Reaktionsmischung geben, falls erforderlich, um die Reaktionsflüssigkeit sauer zu machen und dann das Benzaldehyd-Azoderivat(Il) mit dem Lösungsmittel extrahieren. In diesem Falle können anorganische Säuren, wie z. B. Chlorwasserstoffsäure und Perchlorsäure oder organische Säuren, wie z. B. Trichloressigsäure und Essigsäure, erfolgreich als die enzymatische Aktivität stoppende Mittel verwendet werden.

Die Absorption der mit dem Lösungsmittel extrahierten Lösung, die das gebildete und extrahierte Benzaldehyd-azodcrivat (11) enthält, wird bei der spektrophotometrisch günstigsten Wellenlänge im sichtbaren Gebiet, die für das Bcnzaldehyd-azoderivat (II) charakteristisch ist, bestimmt, und die erhaltene Absorption wird als Absorption (A) bezeichnet. Bei der Bestimmung der Absorption wird eine mit Lösungsmittel extrahierte Lösung, die durch Zugabe eines bestimmten Volumens destilliertes Wasser zu der Substratlösung, anstelle der Organisniusprobc. und durch die gleiche Behandlung wie im Falle der Organismusprobe erhalten worden ist, als Kontrolle verwendet.

Andererseits wird als Standard ein bestimmte* Volumen einer wäßrigen Lösung des Bcnzaldehydazodcrivatcs. die die vorgeschriebene Konzentration hat. an Stelle der Organismusprobe /ur Subsirailösung gegeben, und die resultierende Lösung wird genauso wie die Organismusprobe behandelt, so daß man eine mit Lösungsmittel extrahierte Lösung erhall, und deren Absorption wird in der gleichen Weise bestimmt, und diese Absorption wird als Absorption (B) bezeichnet. Die gebildete Bcnzaldchyd-azoderival-(H)-Mengc. :\f (ug) wird wie folgt berechnet:

V/ (viii

Menge!ug) des Ben/aldchyd-a/odcrnats (U). 1 die in der verwendeten Slandardlösung enthalten ist J

Absorption (A)
Absorption (B)

In der vorliegenden Erfindung entspricht die en/ymatisehe Aktivität von MAO der Zahl der Mole (iitj.Mol milli-micro-Moh des pro Milliliter der Serumprobe pro Stunde cnzymatischcr Reaktionszeit gebildeten Ben/aldchyd-azodenvaieslll). und dieser Wert wird als enzv malische tinheit (Ew) ausgedrückt.

Molekulargewicht 1

des Benzaldehvd-azodernales ill)

Verwendete Scn'mprobcnmcngc
(ml)

Vl

"Reaktionszeit]
(Stunde) |

Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Bcnzylamin-azodcrivate(l) haben als Substrat eine höhere Anpassungsfähigkeit bei der Reaktion mit MAO als das bekannte Substrat, und es ist daher möglich, die fur die enzymatischc Reaktion erforderliche Zeil, verglichen mit der bekannten Methode, zu verkürzen. Außerdem wird eine geringere Menge Oriianisnvjsprohe. d.h. nur ein Viertel der Menge.

die bei der bekannten Methode benötigt wurde, benötigt, somit kann die Organismusprobe und das dem Patienten entnommene Volumen kleiner sein, wodurch die Belastung des Patienten verringert wird. 1 in Vergleich der erfindungsgemäßen Methode mit dei bekannten Methode ist in der folgenden Tabelle 11 dargestellt:

Tabelle II

	Substrat- Verbindung	hrfindungsgemäße Methode	4-(4-Amino-
	Bekannte		melhyl-
	Methode		phenyiazol-
		H4'-Amino-	1-phenjl-
		melhyl-	3-meihjl-
Bedingungen		phenylazol-	5-pyra/oKir!-
	Benz\l-	2-naphtho!	hydro-
	amii]	hydro-	chlond
		chlorid
			0.3
Verwendetes
Serumvolumen		0,3
(ml)	1,2
	ein
	schließ
	lich
	0.6 ml
	für einen
	Leertest)		->
Brutzeit unter
Schütteln bei		2
34 C (Stunden)	3
Wellenlänge, bei
der die Be			395
stimmung
durchgeführt		480
wurde (nm)	242		36.5
Enzymatische
Aktivität von		36,5
MAO (Ku) ...	25

IS

Beispiel 1

35

Man löst 2,0 g 4-Aminobenzylamin-dihydrochiorid in einer Lösung von 4 ml Chlorwasserstoffsäure in 50 ml Wasser und gibt eine Lösung von 0,7 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion gibt man eine Lösung von 1,2 g p-Cresol. 4.0 g Natriumhydroxyd und 30 ml Wasser hinzu und rührt die Mischung 1 Stunde lang. Man säuert die Reaktionsmischung mit Chlorwasserstoffsäure an, wobei Kristalle ausfallen, die ausgefallenen Kristalle werden abfiltrierl, getrocknet und aus Methanol umkristallisiert. Man erhält so 2,1 g (Ausbeute: 76%) kristallines 2-(4'-Aminomethylphenylazo)-p-cresol-hydroch!orid mit einem Schmelzpunkt von 233 bis 236 C (unter Zersetzung).

Elementaranalyse für C₁₄H₁₅N₃O ■ HCl:
Berechnet ... C 60.48. H 5,76. N 15.12;
gefunden .... C 60,22, H 5,85, N 15,31.

)._max 330 nm (in Wasser).

Beispiel 2

Man löst 18.0 g 4-Aminobenzylamin-dihydrochlorid in einer Lösung von 36 ml Chlorwasserstoffsäure in 100 ml Wasser und gibt eine Lösung von 6.3 Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion gibt man eine Lösung von 13,0/(-Naphthol. 36 g Natriumhydroxyd und IDOmI Wasser hinzu. Man säuert die Reaktionsmisüiung mit Chlorwasserstoffsäure an. dabei fallen Kristalle aus. die man abfiltrierl. trocknet und aus Methanol umkrislallisicrt. Man erhält so 21 g (Ausbeute: 73%) orangefarbenes kristallines l-(4'-Aminomethylphenylazo)-,i-naphlhol-hy-

SO

55 drochlorid mit einem Schmelzpunkt von 233 bis 235 C (unter Zersetzung).

Elementaranaiyse für C₁₇H₁₅ON₃ · HCl:
Berechnet ... C65,10, H 5,11, N 13,08;
gefunden .... C 64,59, H 4,86, N 13,15.

'■max = 485 nrn (in Wasser).

Beispiel 3

Man löst 5,0 g N-(3'-Aminobenzyl)phthalimid in einer Lösung von 6,0 g Chlorwasserstoffsäure in 300 ml Wasser und gibt eine Lösung von 1,4 g Natriumnilrit in 50 ml Wasser unter Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion gibt man eine Lösung von 2,6 g N,N-Dimethylanilin, 5 ml Chlorwasscrstoffsäure und 50 ml Wasser hinzu und rührt die Reaktionsmischung 1 Stunde lang, wobei man eine wäßrige Lösung von Natriumacetat so zugibt, daß die Reakiionsmischung eine gelblichgrüne Farbe erhält. Schließlich gibt man eine wäßrige Natriumcarbonatlösung hinzu, um die Reaktionsmischung alkalisch zu machen, filtriert die Reaktionsmischung und erhält 7.4 g (Ausbeute 97%I gelbes kristallines N - (p - N.N - Dimethylaminobenzola/o-3-benzyl !-phthalimid.

Die oben erhaltenen Kristalle werden zusammen mit verdünntem Alkohol und Hydrazinhydrat bis zum Rückfluß erhitzt und nach Zugabe von Chlorwasserstoffsäure erneut zum Rückfluß erhitzt. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt, man gibt Wasser hinzu, filtriert die Mischung und erhält Phthalhydrazid. Man gibt eine wäßrige Natriumcarbonatlösung zum Filtrat. um den pH-Wert auf 2 zu bringen und extrahiert dann eine lösliche Fraktion mit Cyclohexan. das man entfernt. Man gibt eine wäßrige Nalriumcarbonatlösung zur isolierten wäßrigen Schicht, um den pH-Wert auf 14 oder einen höheren Wert zu bringen, und extrahiert mit Chloroform. Die Chloroformschicht wird mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und dann unter vermindertem Druck eingeengt Den Rückstand löst man in Aceton, gibt Chlorwasserstoffsäure hinzu und dampft die Mischung unter vermindertem Druck zur Trockene ein. Man erhält 3.5 g (Ausbeute: 57%) bläulichvioletter Kristalle von 4-(3'-Aminomelhylphenylazo)-N,N-dimethylanilin-dihydrochlorid. mit einem Schmelzpunkt von 144 bis 145 C (unter Zersetzung).

Elementaranalyse für C₁Jl₁₈N₄ · 2HCl:
Berechnet . . . C 55.00 H 6.11. N 1 7.11;
gefunden .... C 55.14. H 6.04. N 16.89.

'■max ⁼ 455 nm (in Wasser).

Beispiel 4

2.0 g 4-Aminohcnzylamin-dihydroehlorid löst man in einer Lösung vein 4 ml ("hlorwasserstoffsäure in 50 ml Wasser und gibt eine Lösung von 0.7 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Dia/olierungsreaktion wird die Lösung in eine wäßrige Lösung von 1.9g l-I'henyl-3-melhyl-5-pyra/Ol(in. 2 g Natriumhydroxyd und 50ml Wasser gegossen. Nach der Kupplungsreaklion wild die Reaktionsmischung durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäuri.¹ sauer gemacht und ausiiesal/1. wobei man rohe Kristalle erhall. Beim I'm-

kristallisieren aus Methanol erhält man 3,4 g (Ausbeute: 90%) gelblichoranger Kristalle von 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon

mit einem Schmelzpunkt von 153 bis 155^CC.
Elementaranalyse für C₁₇H₁₈N₅OCl:

Berechnet ... C 61,91, H 5,SU, N 16,99;

gefunden .... C 61,50, H 5,31, N 16.76.

'-«« = 390 nm (in Wasser).

IO

Beispiel 5

Man stellt eine Substrat-Pufferlösung her, indem man 1 mM l-(4'-Aminomethylphenylazo)-2-naphtholhydrochlorid, hergestellt im Beispiel 2, als Substrat in einer 0,1-m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Pufferlösung auflöst. 2,0 ml der Substrat-Pufferlösung gibt man in ein Zentrifugenröhrchen und erwärmt 3 Minuten lang bei 37" C, dann gibt man 0,3 ml einer Serumprobe hinzu und stellt die Mischung 2 Stunden lang bei 37 C in ein thermostatisiertes Gefäß. Man gibt 4 ml Cyclohexan hinzu, schüttelt und extrahiert die Mischung 30 Sekunden lang ir einem Vibro-Mixer, zentrifugiert dann 10 Minuten'25 lang bei 3000 Upm und isoliert die obere Schicht (eine Lösungsmittel-Extraktschicht). Bei der Abtrennung gibt man 10 mg Natriumsulfat hinzu, um die Abtrennung der extrahierten Schicht zu erleichtern.

0.3 ml einer wäßrigen Lösung von 1-(4'-Benz-30 aldehydazo)-2-naphthol mit einer Konzentration von 50 μg/ml - als Standardlösung und 0,3 ml destilliertes Wasser — als Kontrolle gibt man in verschiedene Zentrifugenrohre und behandelt sie genauso wie die Serumprobe, so daß man eine Lösungsmittel-Extraktschicht erhält.

Die Absorption (A) der mit der Serumprobe erhaltenen Lösungsmittel-hxtraktschichl und die Absorption (B) der mit der Standardlösung erhaltenen Lösungsmittel-Extraktschicht werden bei dem Färb-Peak von l-(4-Benzaldehydazo)-2-naphthol, d.h. bei 480 nm, gemessen, wobei die mit destilliertem Wasser erhaltene Lösungsmittel-Extraktschicht als Kontrolle verwendet wird. Man erhält die folgenden Ergebnisse: Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.

Aus diesen Werten wird die durch die Einwirkung von MAO in der Serumprobe gebildete l-(4'-Benzaldehydazo)-2-naphtho!-Menge wie folgt berechnet:

wird beim Farb-Peak des 4-(4^f-Benzaldehyda«jj-N.N-dimethylanilin-hydrochlond. d. h. bei 430 nm.

Vf =

J
1 (ml)

0,3 (ml)

0,052
0.130

und die enzymatische Einheit [Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:

Eu =

6,0 (ag)
"276

1,0 (ml)
0,3 (ml)"

Beispiel 6

1
2 ihr)

= 36.4

55

60

Man verwendet 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-N, N-dimethylanilindihydrochlorid mit 4-(4'-Benzaldehydazo)-N,N-dimethylani'linhydrochlorid an Stelle von dem im Beispiel 1 verwendeten l-(4'-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydrochlorid bzw. dem l-(4 -Benzaldehydazo)-2-naphthol und führt die Umsetzung wie im Beispiel 1 durch. Die Absorption uOn(A) = 0,050, Absorption (B) = 0.125.
Die Benzaldehyd-Azoderivatmenge(M), gebildet durch Einwirkung von MAO in der Serumprobe, wird wie folgt berechnet:

_{X1 =} J0.!ML
^M 1 (ml)

0,050

Die enzymatische Einheit (£w) von rvUü in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:

_6,0_(;xg)
^E" ~ 289,5

1,0 im!)
0.3 (ml)

Beispiel 7

2(hr)

= 34.5

Man verwendet η-Hexan an Stelle von dem im Beispiel 1 als Lösungsmittel verwendeten Cyclohexan und fiihrt die Umsetzung in gleicher Weise wie im Beispiel 1 durch. Die erhaltenen Ergebnisse sind folgende:
Absorption (A) = 0,052. Absorption (B) = 0,130.

Die enzymatische Einheit (£«) von MAO in der Serumprobe: Eu = 36.4.

Beispiel 8

Eine Substrat-Pufferlösung und eine Standardlosung werden wie im Beispiel 1 hergestellt. Man gibt 2.0 ml der Substrat-Pufferlösung in ein Zentrifugenrohr und erwärmt 3 Minuten bei 37 C, dann gibt man 0,3 m! der Serumprobe hinzu, und die Mischung wird in einem thermostatisierten Gefäß 2 Stunden lang bei 37 C inkubiert. Man macht die Reaktionsmischung sauer, indem man einen Tropfen Chlorwasserstoffsäure, die als die enzymatische Aktivität beseitigendes Mittel dient, zugibt und setzt 4 ml Cyclohexan als Lösungsmittel zu, danach wird die Operation wie im Beispiel 1 ausgeführt. Man erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.

Die enzymatische Einheit (£u) von MAO in der Serumprobe: Eu = 36,5.

Beispiel 9

Man verwendet Perchlorsäure an Stelle der im Beispiel 4 als die enzymatische Aktivität stoppendes Mittel verwendeten Chlorwasserstoffsäure und führt danach die Operation so wie im Beispiel 4 durch. Man erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.

Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe: Eu = 36.4.

Beispiel 10

Man gibt 0,5 ml der Serumprobe zu 1,0 ml einer Substratlösung von 1-(3'- Aminomethylphenylazo)-1-naphthol-hydrochlorid in einer 0,1-rn Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl (pH 7,2)-Pufferlösung (mit

ge-

einer Konzentration von i mM) und erwärmt die Mischung 60 Minuten lang bei 37 C, säuert sie dann durch Zugabe von 1 Tropfen Perchlorsäure an und extrahiert unter Schütteln mit 5 ml Cyclohexan. Nach der Extraktion wird die Absorption bei 480 nm
messen und die MAO-Aktivität durch Vergleich mit der Standardlösung, die l-(3'-Benzaldehydazo)-2-naphlhoI (50μ£/ΐη1) enthält, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind folgende:
Absolution (A) = 0,030, Absorption (B) = 0,120.

Die 1 -(3'- Benzaldehydazo)- 2-naphthol - M enge (Λί). gebildet durch die Wirkung von MAO in der Serumprobe, wird wie folgt berechnet:

Die enzymatische Einheil (Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:

>5

Eu =

6,25 (μ?	) 1,0	(ml)
"276	0,5	(ml)
Be	i spiel	1!

= 45.4

20	11,1	HCl
Tabelle	NH2-
CH1
A X=! I "V	= N —	HCl
I N =	CH2NH2 ·	N —
	Y-()	HCl
CH I	= N-
'- ■ 6
\ N =
,NH2-
-N =

25

Man gibt 0,5 ml einer Serumprobe zu 1 ml einer Substratlösung (mit einer Konzentration von 0,01 g/ tnl), hergestellt durch Auflösen von 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-1 -phenyl-3-methyl-5-pyra2:olon. hergestellt im Beispiel 4, in einer 0,1-m Tris-(hydroxymethyl) - aminomethan - HCl - Pufferlösung und erwärmt die Mischung und läßt sie bei 37 C 60 Minuten lang reagieren. Dann gibt man einen Tropfen Perchlorsäure hinzu, um die Reaktionsmischung sauer zu machen und extrahiert unter Schütteln mit 4,0 ml Cyclohexan. Nach der Extraktion wird die Absorption des Extraktes bei 395 nm gemessen. Die MAO-Aktivität bestimmt man durch Vergleich mit der Absorption einer Standardlösung, die 5O₁IgZmI 4-(4'-Benzaldehydazo)-l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon enthält. Man erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,095, Absorption (B) = 0,215.

Die 4 - (4' - Benzaldehydazo) -1 - phenyl - 3 - methy I-5-pyrazolon-Menge (M), gebildet durch die Wirkung von MAO in der Serumprobe, errechnet sich wie folgt:

Substrat-Verbindung

Die enzymatische Einheit [Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:

343

¹¹I = M.
"0.5TmI)

55

Beispiel 12

Eine Vielzahl von Substraten und die entsprechenden Benzaldehyd-Azoderivate werden als Standardsubstanzen an Stelle von l-(3'-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydroehlorid und dem im Beispiel 6 verwendeten 1 - (3' - Benzaldehydazo) - 2 - naphthol verwendet, und die Absorption wird bei der in der nachfolgenden Tabelle 111 angegebenen Wellenlänge im sichtbaren Gebiet gemessen, daraus wird die MAO-Aktivität bestimmt.

VVeI len- :inge des

Farb-^Jeaks des

entsprechen den Benzaldehyd-

Azoderivates

(nm)

380

375

320

360

350

460

MAO-Aklivität

(£nj

21

Fortsetzung

22

Substrat-Verbindung

NH, - HCl

NH,-HCl

OH

Oll

Wellenlänge des

Farb-Peaks des

entsprechen den Ben/ aldehyd-

Azodenvates

(nml

450

460

460

450

350

375

370

365

470

475

475

MAO-AUivttät

JEu) 43.3 '5

44.2

20

46.4

47.2

44.5 46.0

45.0

44.0

42.3

42.9

40

45

55

46.5

Substrat-Verbindung

Y-f

OH

OH
X

OH

>- OH

HO COOH

HO COOH

X ^ "V- NH₂- HCl

V- NH₂-HCl

CH,

as X

OH

Wellen- \ länge des \ Furb- ! Peaks des

entsprechen
den Ben/·
aldehyd-

A/iidernütes

Inml

475

MAO-Akii-

(Ei. I

490

490

510 46.5

500

470

480

472

23

Tabelle 111,2

CH₂NH₂ · ¹Z₂ H

¹Z

Su bsi ral-Verbindung

N = N-CH₂NH₂-¹Z₂H₂SO₄

Y' =

O.

X'

N = N-

	Wellen	MAO- Aklivitüt
	länge des
	Färb-
	Peaks
Subslrat-Verbindung	des ent sprechen
	den Benz-	(£")
	aldehyd-
	Azo-	43.2
	derivatcs
	(mn I
OH
γ- -rjv- oh	375

NH, H.SO^

- OH

Wellenlänge des Farb-Peaks des entsprechen den Bcnzaldehyd-

Azoderivates

(nm)

460

490

MAO-Akiiviiä

Beispiel 13

Man verwendet 1 - (4' - Aminomcthylphcnylazo) 2-naphlhol (die freie Form) an Stelle von dem im Beispiel 1 benutzten 1 - (4' - Aminomethylphenylazo) 2-naphthol-hydrochloric! und führt die Umsctzuru und die Operationen wie im Beispiel 1 durch. Mai erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) ="o.O52, Absorption (B) = 0.130.

Die cnzymatische Hinheil (Eu) von MAO in dci Scrumprobe errechnet sich zu: Eu = 36.4.

SO?» 509/3*

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   ί. Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von in einer Organi·musprobe enthaltener Monoaminoxydase durch Umsetzung der Organismusprobe mit einer Substratlösung, die als Substrat eine Benzylaminverbindung enthält. Abtrennen der gebildeten Benzaldehydverbindung von der Reaktionsmischung und Bestimmung der optischen Absorption der gebildeten Benzaldehydverbindung bei einer geeigneten Wellenlänge, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substratlösung verwendet, die als Substrat ein Benzylamin-azoderivat der Formel I