DE2319097B2 - Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Mono-Amin-Oxydase - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Mono-Amin-OxydaseInfo
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Description
CH2NH2
N = NR
worin R eine Gruppe darstellt, die zusammen mit der benachbarten — N= N-Gruppe zur Bildung
einer chromophoren Gruppe befähigt ist. oder dessen Säureadditionssalz enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß R eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe mit wenigstens einer Hydroxygruppe,
Aminogruppe, Niedrigalkylgruppe oder Di-niedrigalkylaminogruppe darstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da:3 R eine Naphthylgruppe oder eine
substituierte Naphthylgruppe mit wenigstens einer Hydroxygruppe, Carboxygruppe. Aminogruppe
oder Alkylgruppe bedeutet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß R eine Pyrazolongruppe der allgemeinen Formel
O = C N — R;!
HC
N
//
R1
bedeutet, worin R1 eine Niedrigalkyl-, Niedrigcycloalkyl-
oder eine Nitro-substituierte Niedrigalkylgruppe und R2 eine Phenyl-, Niedrigcycloalkyl-,
Tolyl- oder eine Styrylgruppe darstellt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat
l-(4'-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydrochlorid verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderivat
l-(3'-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydro-Chlorid verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennteichnet. daß man als Benzylamino-Azoderivat
4 - (3' - AminomsMhylphenylazo) - N,N - dimethyl-■nilin-dihydrochloiid
verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennieichnet,
daß man als Benzylamino-Azoderivat 4 - (4' - Aminomethylphenylazo) - 3 - hydroxy-N,N
- dimethylanilin - hydrochlorid verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Benzylamino-Azoderiva
4 - (3' - Aminomethylphenylazo) - 3 - hydroxy RN-dimethylanilin-hydrochlorid verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man als Benzylamino-Azode
rivat 2 - (4' - Aminomethylphenyiazo) - ρ - cresol
hydrochlorid verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 1, '-"«lurch ge kennzeichnet, daß man als Benzyla:- o-Azodj
rivat 1 -(4'-Aminomethylphenylazo)- naphthalinhydrochlorid verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzylamino-A/oderivat
4 - (4' - Aminomethylphenylazo) - 1 - phenyl-3 - methyl - 5 - jpyrazolon - hydrochlorid verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Abtrennung des gebildeten Benzaldehyd-Azoderivates durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmiuel. ausgewählt
unter η-Hexan. Cyclohexan. Decalin. Xylol. Äthylacetat, Iiiopropylacetat. Äthyläther und Methyl-butylketon,
durchführt.
14. Verfahren nach Anspruch 13. dadurch gekennzeichnet,
daß die Extraktion in Anwesenheit eines neutralen Salzes durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13. dadurch gekennzeichnet,
daß die Extraktion in Anwesenheit einer Säure durchgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die optische Bestimmung des
Benzaldehyd-Azoderivates in einem organischen Lösungsmittel erfolgt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von in einer Organismusprobe
enthaltener Monoamin-Oxydase (»MAO«) durch Umsetzung der Organismusprobe mit einer
Substratlösung, die als Substrat eine Benzylaminverbindung enthält. Abtrennen der gebildeten Benzaldehydverbindung
von der Reaktionsmischung und Bestimmung der optischen Absorption der gebildeten
Benzaldehydverbindung bei einer geeigneten Wellenlänge.
MAO ist ein Enzym, das am A mi η Stoffwechsel im
Organismus teilnimmt und die oxydative Deaminie-
rungsreaktion der Amine katalysiert, die nach folgender Reaktionsgleichung abläuft:
ArCH2NH2 + O2 + H2O
-ArCHO + NH3 + H2O2
worin Ar für eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe steht.
Auf Grund neuerer MAO-Untersuchungen ist berichtet
worden, daß MAO in den meisten Fällen von Leberzirrhose und in einigen Fällen von chronischem
Herzversagen, Diabetes mellitus oder Hypcrthyreoidismus abnormale Aktivitätsspiegel aufweist.
Bisher wurde bei der klinischen Untersuchung der Leber eine Nadel-Biopsie oder eine Nadcl-Biopsic
unter laparoskopisicher Beobachtung als Methode für den genauen Nachweis von Fibröse in der Leber verwendet.
Von diesen Untersuchungsmethoden kann jedoch nicht viel erwartet werden, da die Menge von
erhältlichem Untersuchungsmaterial beschränkt ist
und eine häufigere Probeentnahme aus dem Organismus schwierig ist. Alternativ hat man Anstrengungen
unternommen, chemische Substanzen oder die Aktivität der Enzyme, die am Stoffwechsel dieser
chemischen Substanzen teilnehmen, in den Körperflüssigkeiten, wie im Serum oder Urin oder in einem
Bindegewebe zu bestimmen, um den Krankheitszustand herauszufinden. Als Ergebnis vieler Bestimmungen
fand man, daß die Bestimmung der MAO-Aktivität im Blut eine wirksame diagnostische Hilfsmethode
bei Leberfibrose ist (Ken-ich lto ei al..
»Saikin Igaku«, Bd. 25, Nr. 11. S. 2342 [!97O]).
Bisher hat man als Methode zur Bestimmung der MAO-Aktivität in einer Organprobe eine Methode
vorgeschlagen, bei der eine chemische Substanz bestimmt wird, die bei der Reaktion ein;r MAO-haltigen
Körperprobe unter Verwendung von Benzylamin als Substrat gebildet wird. Beispielsweise beschreibt
Charles M. McEwen. Journal of Biological
Chemistry, Bd. 240, S. 2003 bis 2010 (1965), eine Methode, bei der das UV-Absorptionsspektrum
von Benzaldehyd spektrophotometrisch ermittelt wird, d. h. man bestimmt die Absorption bei 250 nm
(nm = Nanometer, 10 9m), um die gebildete Bcn/-aldehydmenge
heiauszufinden und dadurch die MAO-Aktivität in der Probe zu finden. Diese Methode ist
recht zuverlässig. Da jedoch die Untersuchung des UV-Absorptionsspektrums durch andere in der Probe
enthaltene Materialien gestört wird, die eine Absorption im UV-Gebiet aufweisen, z. B. Proteine.
Nucleinsäuren, Bilirubin und Vitamine, ist die Durchführung mühsam, und es sollte bei jeder Bestimmung
ein Leertest mit der Probe durchgeführt werden. Außerdem hat die Bestimmung der Absorption im
UV-Gebiet die Verbreitung dieser Diagnosemethode in herkömmlichen Laboratorien behindert.
Obgleich die Entwicklung einer coiorimetrischen Methode für die Bestimmung von gebildetem Benzaldehyd
mit Hilfe geeigneter Reagenzien ebenfalls versucht worden ist, konnte kein exakter Wert erhalten
werden, weswegen die Methode nicht befriedigt.
Außerdem ist die Tatsache, daß fur die enzymatische Reaktion, bei der Benzylamin als Substrat verwendet
wird, relativ viel Zeit benötigt, ein weiterer Nachteil der obigen Bestimmungsmethode.
Eine Methode, bei der ein anderes Produkt, nämlich Ammoniak, bestimmt wird, wird durch Ammoniak
und flüchtige Amine, die ursprünglich in der Probe enthalten sind, gestört, und die exakte Bestimmung
der MAO-Aktivität kann nicht mit Hilfe dieser Methode erreicht werden.
Eine weitere Methode, bei der gebildetes Wasserstoffperoxyd
sowohl mit Hilfe von Catalase als auch mit Hilfe einer reaktiven Farbe bestimmt wird, um
so die MAO-Aktivität zu ermitteln, liefert keine exakten Ergebnisse, da die leaktive Farbe sich
während der Bestimmungsoperation ändert, was Fehler verursacht.
Da MAO bei der oben geschilderten enzymatischen Reaktion Sauerstoff verbraucht, gibt es auch eine
Methode, die die verbrauchte Sauerstoffmenge mit
einem Manometer bestimmt. Diese Methode ist jedoch für klinische Tests, bei denen eine winzige Menge einer
Körperprobe verwendet wird, wegen der geringen Empfindlichkeit nicht brauchbar. Alle bisherigen
Methoden zur Bestimmung der MAO-Aklivität haben somit viele Nachteile, die diese Methoden ungeeignet
erscheinen lassen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur genauen und raschen Bestimmung
der MAO-Aktivität durch Bestimmung des enzymatischen Reaktionsproduktes mit Hilfe des
sichtbaren Absorptionsspektrums. Die für die enzymatische Reaktion erforderliche Zeit soll ebenfalls
verkürzt werden, und die Methode soll sich für die Bestimmung der MAO-Aktiviiät in Laboratorien
eignen.
Das crfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung
der enzymatischen Aktivität von in einer Organismusprobe enthaltener Monoamin-Oxydase ist dadurch
gekennzeichnet, daß man eine Substratlösung verwendet, die als Substrat ein Benzylamin-azoderivat
der Formel 1
CH1NH,
N = NR
worin R für eine Gruppe steht, die zusammen mit der benachbarten — N = N-Gruppe zur Bildung einer
chromophoren Gruppe befähigt ist, oder 'hr Siiureadditionssalz enthält.
Die vorliegende Erfindung schafft somit eine Methode zur coiorimetrischen, spektrophotometrischen
oder visuellen Bestimmung eines Benzaldehyd-azoderivates,
das durch die folgende enzymatische Reaktion gebildet wird:
CH7NH,
+ O, + H,0
N= NR
CHO
MAO
+ NH3 + H2O,
N = NR
(II)
worin R die obengenannte Bedeutung besitzt.
Der Rest R in der allgemeinen Formel I der Benzylamin-azoderivate,
die als Substrate in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bedeutet bevorzugt eine
unsubstituierte oder substituierte Phenyl- oder Naphthylgruppe, dabei kann die Phenylgruppe bevorzugt
mit wenigstens einer Hydroxy-, Amino-, Niedrigalkyl-
oder Di-niedrigalkylaminogruppe und die Naphthylgruppe
mit wenigstens einer Hydroxy-, Carboxy-. Amino- oder Alkylgruppe substituiert sein. Das
Symbol R kann auch für eine Pyrazolongruppc der allgemeinen Formel:
O = C N —R2
— HC
I
R1
stellen, worin R1 eine Niedrigalkyl-, Niedrigcycloalkyl-
oder eine Nitro-subs.tituierte Niedrigalkylgruppe
23 1909
und R2 eine Phenyl-, Niedrigcycloalkyl-, Tulyl- oder
eine Styrylgruppe darstellt.
Bei den Benzylamin-azcderivaten (Ij handelt es sich um neue in der Literatur nicht beschriebene Verbindungen,
die alle einen charakteristischen Absorptionspeak im sichtbaren Gebiet aufweisen. Diese
Benzylamin-azoderivate(l) können hergestellt werden, indem man Aminobenzylamin (oder ein Aminobenzylamin,
das mit einer leicht von der Benzylaminogrupp entfernbaren Gruppe geschützt ist) auf übliche Weis
unter Bildung einer Diazoverbindung diazotiert um anschließend die Diazoverbindung mit einer Kupp
lungskomponente umsetzt, die dem Substituenten f
entspricht. Die Strukturen geeigneter Benzylamin Azoderivate und ihre physikalischen Eigenschaftei
sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammen gefaßt
X =
Substrat-Verbindung
OH
CH3
- OH
CH,
OH
X -S
N(CH,), ■ HCl
γ =
Tabelle l.i CH2NH2 · HCl
N=N-
CH2NH2 · HCl
Y -y /-- N(CH,),- HC
Ausbeute
78 Schmelzpunkt
( C|
( C|
275—277
>3(X)
>30()
218
218-219
46
50
54 >300
> 300
177
I4X
/.,„„ in Wasser (nm)
384
374
370
357
356
450
453
452
Substrat-Verbindung
OH X -\~y— N(CH3),
OH
Y —<f~V- N(CH3I2
OH
CH3
X —
OH
X -
OH
OH
OH
1-ortsct/ung
Ausheule ("..I
57
76
50
Schmelzpunkt
247
222
236
207
177
IKO 1S5
235
237
3(M)
- 300
/. , in NN μ-Ι um I
45S
460
330
374
372
170
4S5
4S4
4X0
4X0
/I"
Su bsiru I-Verbindung
HO
HO
HO COOH
x —f~S
HO COOH
γ
S
X -~<f - NH2 HCI
NH, HCl
Fortsetzung
Ausheule
76
80
S4
K4
10
Schmcl/.punkl
276
245
> 300
> 3(K)
257
240
217
200
/ , in Wa
I π m I
472
475
490
4S6
512
5(X)
470
478
Substrat-Verbindung
C N
\ | N / C I |
CH3 | |
CH3 | |
X-/ | _VoH |
> |
Fortsetzung
Ausheule
12
Schmelzpunkt | ',„„ in w |
I C) | (nm) |
153—155 | 390 |
>300 | 480 |
Tabelle 1.2 | Y' = | CH2NH, 1Z2H2SO4 | |
• V2 H2SO4 | N = N- | ||
CH2NH2 | |||
λ N = |
|||
= N- |
Substrat-Verbindung | Ausbeute ("/«I |
Schmelzpunkt (Ci |
|
OH I |
|||
Y' | 47 | >300 | |
NH, | |||
X' | -\~\~ NH2 H7SO4 | 52 | > 300 |
Y' | |||
HO | 72 | >300 | |
O OH | |||
'•m.« in Wasser
(nml
374
450
426
Weitere Aminomethylphcnylazopyrazolonderivate. die als Substrat in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können, sind die folgenden Verbindungen :
4-(.V-Aminomethylphenylazo)-l-phcnyl-S-methyl-S-pyrazolonhydrochlorid,
4-(2'-AminomelhylphenylazoH-phenyl-
.Vmethyl-5-pyrazolonhydrochIorid,
4-(4'-Aminomethyi_')henyla2o)-l-cyclohexyl-
3-propyl-5-pyrazolonhydrochiorid,
4-( 3 '-Aminomet hylphenylazo)-1 -cyclohexyl-
3-propyl-5-pyrazolonhydrochlorid, 4-( 2 '-Aminomethylphenylazo)-1 -cyclohexy 1-3-propyl-5-pyrazolonhydrochlorid.
23
097$
4-(4'-Aminomctliylphenylazo)-l-tolyl-3-cyclo-
pcnlyl-5-pyrazolonhydrochlorid.
4-(3'-Aminomcthylphcnylazo)-l-tolyl-3-cyelo-
4-(3'-Aminomcthylphcnylazo)-l-tolyl-3-cyelo-
pentyl-5-pyrazolonhydrochlorid.
4-(2'-Aminomcthylphenylazo)-l-tolyl-3-cyclo-
4-(2'-Aminomcthylphenylazo)-l-tolyl-3-cyclo-
pentyl-S-pyrazolonhydrochlorid.
4-(4'-Aminomethylphenylazo)-l-styryl-3-nitro-
4-(4'-Aminomethylphenylazo)-l-styryl-3-nitro-
methyl-5-pyrazolonhydrochlorid.
4-(3'-Aminomcthylphenylazo)-l-styryl-3-nitro-
4-(3'-Aminomcthylphenylazo)-l-styryl-3-nitro-
mcthyl-5-pyrazolonhydrochlorid. ι ο
4-(2'-Aminomethylphcnylazo)-l-styryl-3-niiro-
methyl-5-pyrazolonhydrochlorid.
Man führt das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise
so durch, daß man eine bestimmte Menge is Substratlösung, hergestellt durch Auflösen eines Überschusses
von Bcnzylamin-Azodcrivat (1) als Substrat in einer Pufferlösung mit einem pH von 6.0 bis 8.0.
vorzugsweise 7,0 bis 7.2, zusammen mit einer bestimmten Menge der MAO-haltigcn Organismusprobe
bei einer Temperatur von 10 bis 45 C. vorzugsweise 25 bis 37 C 0,3 Stunden bei 3.0 Stunden lang,
vorzugsweise 0,5 bis 2,0 Stunden lang, in den Brutschrank stellt. Da mit dem Fortschreiten der enzymalischcn
Reaktion die Reaktionsmischung mit der Bildung eines Benzaldehyd-azoderivates (11) ihre l-'arbe
ändert, läßt sich ein Ende der Reaktion feststellen.
Im Anschluß an die Inkubation gibt man ein organisches
inertes Lösungsmittel, in dem nur das Ben/aldchyd-azodcrivat
(11) löslich ist. das aber mit Wasser nicht mischbar ist. zur Reaktionsmischung, um das
Benzaldehyd-azodcrivat zu extrahieren. Als inertes Lösungsmittel verwendet man organische Lösungsmittel,
wie aliphalischc Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe. Ester. Äther und Ketone.
bevorzugt n-Hexan.Cyclohexan.Decalin. Xylol. Äthylacetat.
Isopropylacctat, Äthyläther und Methylvinylketon.
Vorzugsweise trennt man die Lösungsmitlelschichi. in die das Benzaldchyd-Azoderivat (II) extrahiert
worden ist. rasch von der wäßrigen Schicht ab. /.. B. mit Hilfe eines Zentrifugenverfahrens, wobei die Zugabe
eines Ncutralsalz.es, z. B. Natriumsulfat oder Natriumdodecylsulfat, die Abtrennung erleichtert.
Man kann auch eine Säure als ein die enzymatischc Aktivität stoppendes Mittel nach der enzymatischen
Reaktion zur Reaktionsmischung geben, falls erforderlich, um die Reaktionsflüssigkeit sauer zu machen und
dann das Benzaldehyd-Azoderivat(Il) mit dem Lösungsmittel extrahieren. In diesem Falle können anorganische
Säuren, wie z. B. Chlorwasserstoffsäure und Perchlorsäure oder organische Säuren, wie z. B.
Trichloressigsäure und Essigsäure, erfolgreich als die enzymatische Aktivität stoppende Mittel verwendet
werden.
Die Absorption der mit dem Lösungsmittel extrahierten
Lösung, die das gebildete und extrahierte Benzaldehyd-azodcrivat (11) enthält, wird bei der spektrophotometrisch
günstigsten Wellenlänge im sichtbaren Gebiet, die für das Bcnzaldehyd-azoderivat (II)
charakteristisch ist, bestimmt, und die erhaltene Absorption wird als Absorption (A) bezeichnet. Bei der
Bestimmung der Absorption wird eine mit Lösungsmittel extrahierte Lösung, die durch Zugabe eines
bestimmten Volumens destilliertes Wasser zu der Substratlösung, anstelle der Organisniusprobc. und
durch die gleiche Behandlung wie im Falle der Organismusprobe erhalten worden ist, als Kontrolle
verwendet.
Andererseits wird als Standard ein bestimmte*
Volumen einer wäßrigen Lösung des Bcnzaldehydazodcrivatcs. die die vorgeschriebene Konzentration
hat. an Stelle der Organismusprobe /ur Subsirailösung
gegeben, und die resultierende Lösung wird genauso wie die Organismusprobe behandelt, so daß
man eine mit Lösungsmittel extrahierte Lösung erhall,
und deren Absorption wird in der gleichen Weise bestimmt, und diese Absorption wird als Absorption (B)
bezeichnet. Die gebildete Bcnzaldchyd-azoderival-(H)-Mengc.
:\f (ug) wird wie folgt berechnet:
V/ (viii
Menge!ug) des Ben/aldchyd-a/odcrnats (U). 1
die in der verwendeten Slandardlösung enthalten ist J
Absorption (A)
Absorption (B)
Absorption (B)
In der vorliegenden Erfindung entspricht die en/ymatisehe Aktivität von MAO der Zahl der Mole (iitj.Mol
milli-micro-Moh des pro Milliliter der Serumprobe pro Stunde cnzymatischcr Reaktionszeit gebildeten
Ben/aldchyd-azodenvaieslll). und dieser Wert wird als enzv malische tinheit (Ew) ausgedrückt.
Molekulargewicht 1
des Benzaldehvd-azodernales ill)
Verwendete Scn'mprobcnmcngc
(ml)
(ml)
Vl
"Reaktionszeit]
(Stunde) |
(Stunde) |
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Bcnzylamin-azodcrivate(l) haben als Substrat
eine höhere Anpassungsfähigkeit bei der Reaktion mit MAO als das bekannte Substrat, und es ist daher
möglich, die fur die enzymatischc Reaktion erforderliche
Zeil, verglichen mit der bekannten Methode,
zu verkürzen. Außerdem wird eine geringere Menge Oriianisnvjsprohe. d.h. nur ein Viertel der Menge.
die bei der bekannten Methode benötigt wurde, benötigt,
somit kann die Organismusprobe und das dem Patienten entnommene Volumen kleiner sein, wodurch
die Belastung des Patienten verringert wird. 1 in Vergleich der erfindungsgemäßen Methode mit
dei bekannten Methode ist in der folgenden Tabelle 11
dargestellt:
Substrat- Verbindung | hrfindungsgemäße Methode | 4-(4-Amino- | |
Bekannte | melhyl- | ||
Methode | phenyiazol- | ||
H4'-Amino- | 1-phenjl- | ||
melhyl- | 3-meihjl- | ||
Bedingungen | phenylazol- | 5-pyra/oKir!- | |
Benz\l- | 2-naphtho! | hydro- | |
amii] | hydro- | chlond | |
chlorid | |||
0.3 | |||
Verwendetes | |||
Serumvolumen | 0,3 | ||
(ml) | 1,2 | ||
ein | |||
schließ | |||
lich | |||
0.6 ml | |||
für einen | |||
Leertest) | -> | ||
Brutzeit unter | |||
Schütteln bei | 2 | ||
34 C (Stunden) | 3 | ||
Wellenlänge, bei | |||
der die Be | 395 | ||
stimmung | |||
durchgeführt | 480 | ||
wurde (nm) | 242 | 36.5 | |
Enzymatische | |||
Aktivität von | 36,5 | ||
MAO (Ku) ... | 25 |
IS
35
Man löst 2,0 g 4-Aminobenzylamin-dihydrochiorid in einer Lösung von 4 ml Chlorwasserstoffsäure in
50 ml Wasser und gibt eine Lösung von 0,7 g Natriumnitrit in 50 ml Wasser unter Kühlen hinzu. Nach Beendigung
der Diazotierungsreaktion gibt man eine Lösung von 1,2 g p-Cresol. 4.0 g Natriumhydroxyd
und 30 ml Wasser hinzu und rührt die Mischung 1 Stunde lang. Man säuert die Reaktionsmischung mit
Chlorwasserstoffsäure an, wobei Kristalle ausfallen, die ausgefallenen Kristalle werden abfiltrierl, getrocknet
und aus Methanol umkristallisiert. Man erhält so 2,1 g (Ausbeute: 76%) kristallines 2-(4'-Aminomethylphenylazo)-p-cresol-hydroch!orid
mit einem Schmelzpunkt von 233 bis 236 C (unter Zersetzung).
Elementaranalyse für C14H15N3O ■ HCl:
Berechnet ... C 60.48. H 5,76. N 15.12;
gefunden .... C 60,22, H 5,85, N 15,31.
Berechnet ... C 60.48. H 5,76. N 15.12;
gefunden .... C 60,22, H 5,85, N 15,31.
).max 330 nm (in Wasser).
Man löst 18.0 g 4-Aminobenzylamin-dihydrochlorid
in einer Lösung von 36 ml Chlorwasserstoffsäure in 100 ml Wasser und gibt eine Lösung von 6.3 Natriumnitrit
in 50 ml Wasser unter Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion
gibt man eine Lösung von 13,0/(-Naphthol. 36 g Natriumhydroxyd und IDOmI Wasser hinzu. Man
säuert die Reaktionsmisüiung mit Chlorwasserstoffsäure
an. dabei fallen Kristalle aus. die man abfiltrierl. trocknet und aus Methanol umkrislallisicrt. Man
erhält so 21 g (Ausbeute: 73%) orangefarbenes kristallines l-(4'-Aminomethylphenylazo)-,i-naphlhol-hy-
SO
55 drochlorid mit einem Schmelzpunkt von 233 bis 235 C (unter Zersetzung).
Elementaranaiyse für C17H15ON3 · HCl:
Berechnet ... C65,10, H 5,11, N 13,08;
gefunden .... C 64,59, H 4,86, N 13,15.
Berechnet ... C65,10, H 5,11, N 13,08;
gefunden .... C 64,59, H 4,86, N 13,15.
'■max = 485 nrn (in Wasser).
Man löst 5,0 g N-(3'-Aminobenzyl)phthalimid in einer Lösung von 6,0 g Chlorwasserstoffsäure in
300 ml Wasser und gibt eine Lösung von 1,4 g Natriumnilrit in 50 ml Wasser unter Rühren und Kühlen
hinzu. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion gibt man eine Lösung von 2,6 g N,N-Dimethylanilin,
5 ml Chlorwasscrstoffsäure und 50 ml Wasser hinzu und rührt die Reaktionsmischung 1 Stunde lang,
wobei man eine wäßrige Lösung von Natriumacetat so zugibt, daß die Reakiionsmischung eine gelblichgrüne Farbe erhält. Schließlich gibt man eine wäßrige
Natriumcarbonatlösung hinzu, um die Reaktionsmischung alkalisch zu machen, filtriert die Reaktionsmischung und erhält 7.4 g (Ausbeute 97%I gelbes
kristallines N - (p - N.N - Dimethylaminobenzola/o-3-benzyl
!-phthalimid.
Die oben erhaltenen Kristalle werden zusammen mit verdünntem Alkohol und Hydrazinhydrat bis zum
Rückfluß erhitzt und nach Zugabe von Chlorwasserstoffsäure erneut zum Rückfluß erhitzt. Nach der Umsetzung
wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt, man gibt Wasser hinzu, filtriert
die Mischung und erhält Phthalhydrazid. Man gibt eine wäßrige Natriumcarbonatlösung zum Filtrat.
um den pH-Wert auf 2 zu bringen und extrahiert dann eine lösliche Fraktion mit Cyclohexan. das man entfernt.
Man gibt eine wäßrige Nalriumcarbonatlösung zur isolierten wäßrigen Schicht, um den pH-Wert
auf 14 oder einen höheren Wert zu bringen, und extrahiert
mit Chloroform. Die Chloroformschicht wird mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und dann
unter vermindertem Druck eingeengt Den Rückstand löst man in Aceton, gibt Chlorwasserstoffsäure hinzu
und dampft die Mischung unter vermindertem Druck zur Trockene ein. Man erhält 3.5 g (Ausbeute: 57%)
bläulichvioletter Kristalle von 4-(3'-Aminomelhylphenylazo)-N,N-dimethylanilin-dihydrochlorid.
mit einem Schmelzpunkt von 144 bis 145 C (unter Zersetzung).
Elementaranalyse für C1Jl18N4 · 2HCl:
Berechnet . . . C 55.00 H 6.11. N 1 7.11;
gefunden .... C 55.14. H 6.04. N 16.89.
Berechnet . . . C 55.00 H 6.11. N 1 7.11;
gefunden .... C 55.14. H 6.04. N 16.89.
'■max = 455 nm (in Wasser).
2.0 g 4-Aminohcnzylamin-dihydroehlorid löst man
in einer Lösung vein 4 ml ("hlorwasserstoffsäure in
50 ml Wasser und gibt eine Lösung von 0.7 g Natriumnitrit
in 50 ml Wasser unter Rühren und Kühlen hinzu. Nach Beendigung der Dia/olierungsreaktion
wird die Lösung in eine wäßrige Lösung von 1.9g l-I'henyl-3-melhyl-5-pyra/Ol(in. 2 g Natriumhydroxyd
und 50ml Wasser gegossen. Nach der Kupplungsreaklion wild die Reaktionsmischung durch Zugabe
von Chlorwasserstoffsäuri.1 sauer gemacht und ausiiesal/1.
wobei man rohe Kristalle erhall. Beim I'm-
kristallisieren aus Methanol erhält man 3,4 g (Ausbeute: 90%) gelblichoranger Kristalle von 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon
mit einem Schmelzpunkt von 153 bis 155CC.
Elementaranalyse für C17H18N5OCl:
Elementaranalyse für C17H18N5OCl:
Berechnet ... C 61,91, H 5,SU, N 16,99;
gefunden .... C 61,50, H 5,31, N 16.76.
'-«« = 390 nm (in Wasser).
IO
Man stellt eine Substrat-Pufferlösung her, indem man 1 mM l-(4'-Aminomethylphenylazo)-2-naphtholhydrochlorid,
hergestellt im Beispiel 2, als Substrat in einer 0,1-m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Pufferlösung
auflöst. 2,0 ml der Substrat-Pufferlösung gibt man in ein Zentrifugenröhrchen und erwärmt
3 Minuten lang bei 37" C, dann gibt man 0,3 ml einer Serumprobe hinzu und stellt die Mischung
2 Stunden lang bei 37 C in ein thermostatisiertes Gefäß. Man gibt 4 ml Cyclohexan hinzu, schüttelt
und extrahiert die Mischung 30 Sekunden lang ir einem Vibro-Mixer, zentrifugiert dann 10 Minuten'25
lang bei 3000 Upm und isoliert die obere Schicht (eine Lösungsmittel-Extraktschicht). Bei der Abtrennung
gibt man 10 mg Natriumsulfat hinzu, um die Abtrennung der extrahierten Schicht zu erleichtern.
0.3 ml einer wäßrigen Lösung von 1-(4'-Benz-30 aldehydazo)-2-naphthol mit einer Konzentration von
50 μg/ml - als Standardlösung und 0,3 ml destilliertes
Wasser — als Kontrolle gibt man in verschiedene Zentrifugenrohre und behandelt sie genauso wie die
Serumprobe, so daß man eine Lösungsmittel-Extraktschicht erhält.
Die Absorption (A) der mit der Serumprobe erhaltenen
Lösungsmittel-hxtraktschichl und die Absorption (B) der mit der Standardlösung erhaltenen Lösungsmittel-Extraktschicht
werden bei dem Färb-Peak von l-(4-Benzaldehydazo)-2-naphthol, d.h. bei
480 nm, gemessen, wobei die mit destilliertem Wasser erhaltene Lösungsmittel-Extraktschicht als Kontrolle
verwendet wird. Man erhält die folgenden Ergebnisse: Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.
Aus diesen Werten wird die durch die Einwirkung von MAO in der Serumprobe gebildete l-(4'-Benzaldehydazo)-2-naphtho!-Menge
wie folgt berechnet:
wird beim Farb-Peak des 4-(4f-Benzaldehyda«jj-N.N-dimethylanilin-hydrochlond.
d. h. bei 430 nm.
Vf =
J
1 (ml)
1 (ml)
0,3 (ml)
0,052
0.130
0.130
und die enzymatische Einheit [Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:
Eu =
6,0 (ag)
"276
"276
1,0 (ml)
0,3 (ml)"
0,3 (ml)"
1
2 ihr)
2 ihr)
= 36.4
55
60
Man verwendet 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-N, N-dimethylanilindihydrochlorid mit 4-(4'-Benzaldehydazo)-N,N-dimethylani'linhydrochlorid
an Stelle von dem im Beispiel 1 verwendeten l-(4'-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydrochlorid
bzw. dem l-(4 -Benzaldehydazo)-2-naphthol und führt die Umsetzung wie im Beispiel 1 durch. Die Absorption
uOn(A) = 0,050, Absorption (B) = 0.125.
Die Benzaldehyd-Azoderivatmenge(M), gebildet durch Einwirkung von MAO in der Serumprobe, wird wie folgt berechnet:
Die Benzaldehyd-Azoderivatmenge(M), gebildet durch Einwirkung von MAO in der Serumprobe, wird wie folgt berechnet:
X1 = J0.!ML
M 1 (ml)
M 1 (ml)
0,050
Die enzymatische Einheit (£w) von rvUü in der
Serumprobe wird wie folgt berechnet:
_6,0_(;xg)
E" ~ 289,5
E" ~ 289,5
1,0 im!)
0.3 (ml)
0.3 (ml)
2(hr)
= 34.5
Man verwendet η-Hexan an Stelle von dem im
Beispiel 1 als Lösungsmittel verwendeten Cyclohexan und fiihrt die Umsetzung in gleicher Weise wie im
Beispiel 1 durch. Die erhaltenen Ergebnisse sind folgende:
Absorption (A) = 0,052. Absorption (B) = 0,130.
Absorption (A) = 0,052. Absorption (B) = 0,130.
Die enzymatische Einheit (£«) von MAO in der Serumprobe: Eu = 36.4.
Eine Substrat-Pufferlösung und eine Standardlosung werden wie im Beispiel 1 hergestellt. Man gibt
2.0 ml der Substrat-Pufferlösung in ein Zentrifugenrohr und erwärmt 3 Minuten bei 37 C, dann gibt
man 0,3 m! der Serumprobe hinzu, und die Mischung wird in einem thermostatisierten Gefäß 2 Stunden
lang bei 37 C inkubiert. Man macht die Reaktionsmischung sauer, indem man einen Tropfen Chlorwasserstoffsäure,
die als die enzymatische Aktivität beseitigendes Mittel dient, zugibt und setzt 4 ml Cyclohexan
als Lösungsmittel zu, danach wird die Operation wie im Beispiel 1 ausgeführt. Man erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.
Die enzymatische Einheit (£u) von MAO in der Serumprobe: Eu = 36,5.
Man verwendet Perchlorsäure an Stelle der im Beispiel 4 als die enzymatische Aktivität stoppendes
Mittel verwendeten Chlorwasserstoffsäure und führt danach die Operation so wie im Beispiel 4 durch. Man
erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.
Absorption (A) = 0,052, Absorption (B) = 0,130.
Die enzymatische Einheit (Eu) von MAO in der Serumprobe: Eu = 36.4.
Man gibt 0,5 ml der Serumprobe zu 1,0 ml einer Substratlösung von 1-(3'- Aminomethylphenylazo)-1-naphthol-hydrochlorid
in einer 0,1-rn Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl
(pH 7,2)-Pufferlösung (mit
ge-
einer Konzentration von i mM) und erwärmt die Mischung 60 Minuten lang bei 37 C, säuert sie dann
durch Zugabe von 1 Tropfen Perchlorsäure an und extrahiert unter Schütteln mit 5 ml Cyclohexan. Nach
der Extraktion wird die Absorption bei 480 nm
messen und die MAO-Aktivität durch Vergleich mit der Standardlösung, die l-(3'-Benzaldehydazo)-2-naphlhoI (50μ£/ΐη1) enthält, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind folgende:
Absolution (A) = 0,030, Absorption (B) = 0,120.
messen und die MAO-Aktivität durch Vergleich mit der Standardlösung, die l-(3'-Benzaldehydazo)-2-naphlhoI (50μ£/ΐη1) enthält, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind folgende:
Absolution (A) = 0,030, Absorption (B) = 0,120.
Die 1 -(3'- Benzaldehydazo)- 2-naphthol - M enge (Λί).
gebildet durch die Wirkung von MAO in der Serumprobe, wird wie folgt berechnet:
Die enzymatische Einheil (Eu) von MAO in der
Serumprobe wird wie folgt berechnet:
>5
Eu =
6,25 (μ? | ) 1,0 | (ml) |
"276 | 0,5 | (ml) |
Be | i spiel | 1! |
= 45.4
20 | 11,1 | HCl |
Tabelle | NH2- | |
CH1 | ||
A X=! I "V |
= N — | HCl |
I N = |
CH2NH2 · | N — |
Y-() | HCl | |
CH I |
= N- | |
'- ■ 6 | ||
\ N = |
||
,NH2- | ||
-N = | ||
25
Man gibt 0,5 ml einer Serumprobe zu 1 ml einer Substratlösung (mit einer Konzentration von 0,01 g/
tnl), hergestellt durch Auflösen von 4-(4'-Aminomethylphenylazo)-1
-phenyl-3-methyl-5-pyra2:olon. hergestellt im Beispiel 4, in einer 0,1-m Tris-(hydroxymethyl)
- aminomethan - HCl - Pufferlösung und erwärmt die Mischung und läßt sie bei 37 C 60 Minuten
lang reagieren. Dann gibt man einen Tropfen Perchlorsäure hinzu, um die Reaktionsmischung sauer
zu machen und extrahiert unter Schütteln mit 4,0 ml Cyclohexan. Nach der Extraktion wird die Absorption
des Extraktes bei 395 nm gemessen. Die MAO-Aktivität bestimmt man durch Vergleich mit der Absorption
einer Standardlösung, die 5O1IgZmI 4-(4'-Benzaldehydazo)-l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon
enthält. Man erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) = 0,095, Absorption (B) = 0,215.
Absorption (A) = 0,095, Absorption (B) = 0,215.
Die 4 - (4' - Benzaldehydazo) -1 - phenyl - 3 - methy I-5-pyrazolon-Menge
(M), gebildet durch die Wirkung von MAO in der Serumprobe, errechnet sich wie folgt:
Substrat-Verbindung
Die enzymatische Einheit [Eu) von MAO in der Serumprobe wird wie folgt berechnet:
343
11I = M.
"0.5TmI)
"0.5TmI)
55
Eine Vielzahl von Substraten und die entsprechenden Benzaldehyd-Azoderivate werden als Standardsubstanzen
an Stelle von l-(3'-Aminomethylphenylazo)-2-naphthol-hydroehlorid und dem im Beispiel 6
verwendeten 1 - (3' - Benzaldehydazo) - 2 - naphthol verwendet, und die Absorption wird bei der in der
nachfolgenden Tabelle 111 angegebenen Wellenlänge im sichtbaren Gebiet gemessen, daraus wird die MAO-Aktivität
bestimmt.
VVeI len- :inge des
Farb-Jeaks des
entsprechen den Benzaldehyd-
Azoderivates
(nm)
380
375
320
360
350
460
MAO-Aklivität
(£nj
21
Fortsetzung
22
Substrat-Verbindung
NH, - HCl
NH,-HCl
OH
Oll
Wellenlänge des
Farb-Peaks des
entsprechen den Ben/ aldehyd-
Azodenvates
(nml
450
460
460
450
350
375
370
365
470
475
475
MAO-AUivttät
JEu) 43.3 '5
44.2
20
46.4
47.2
44.5 46.0
45.0
44.0
42.3
42.9
40
45
55
46.5
Substrat-Verbindung
Y-f
OH
OH
X
X
OH
>- OH
HO COOH
HO COOH
X ^ "V- NH2- HCl
V- NH2-HCl
CH,
as X
OH
Wellen- \ länge des \
Furb- ! Peaks des
entsprechen
den Ben/·
aldehyd-
den Ben/·
aldehyd-
A/iidernütes
Inml
475
MAO-Akii-
(Ei. I
490
490
510 46.5
500
470
480
472
23
Tabelle 111,2
CH2NH2 · 1Z2 H
1Z
Su bsi ral-Verbindung
N = N-CH2NH2-1Z2H2SO4
Y' =
O.
X'
N = N-
Wellen | MAO- Aklivitüt |
|
länge des | ||
Färb- | ||
Peaks | ||
Subslrat-Verbindung | des ent sprechen |
|
den Benz- | (£") | |
aldehyd- | ||
Azo- | 43.2 | |
derivatcs | ||
(mn I | ||
OH | ||
γ- -rjv- oh | 375 | |
NH, H.SO^
- OH
Wellenlänge des Farb-Peaks
des entsprechen den Bcnzaldehyd-
Azoderivates
(nm)
460
490
MAO-Akiiviiä
Man verwendet 1 - (4' - Aminomcthylphcnylazo)
2-naphlhol (die freie Form) an Stelle von dem im Beispiel
1 benutzten 1 - (4' - Aminomethylphenylazo) 2-naphthol-hydrochloric! und führt die Umsctzuru
und die Operationen wie im Beispiel 1 durch. Mai erhält folgende Ergebnisse:
Absorption (A) ="o.O52, Absorption (B) = 0.130.
Absorption (A) ="o.O52, Absorption (B) = 0.130.
Die cnzymatische Hinheil (Eu) von MAO in dci
Scrumprobe errechnet sich zu: Eu = 36.4.
SO?» 509/3*
Claims (1)
- Patentansprüche:ί. Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von in einer Organi·musprobe enthaltener Monoaminoxydase durch Umsetzung der Organismusprobe mit einer Substratlösung, die als Substrat eine Benzylaminverbindung enthält. Abtrennen der gebildeten Benzaldehydverbindung von der Reaktionsmischung und Bestimmung der optischen Absorption der gebildeten Benzaldehydverbindung bei einer geeigneten Wellenlänge, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substratlösung verwendet, die als Substrat ein Benzylamin-azoderivat der Formel I
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JP2352173A JPS5551559B2 (de) | 1973-02-27 | 1973-02-27 |
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---|---|
DE2319097A1 DE2319097A1 (de) | 1973-11-08 |
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ID=26360889
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---|---|
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---|---|---|---|---|
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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-
1973
- 1973-04-16 US US351642A patent/US3894914A/en not_active Expired - Lifetime
- 1973-04-16 DE DE2319097A patent/DE2319097C3/de not_active Expired
- 1973-04-18 FR FR7314130A patent/FR2181376A5/fr not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
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