DE68921338T2 - Benzotriazol-derivate und diese enthaltende fluoreszierende reagenzien. - Google Patents
Benzotriazol-derivate und diese enthaltende fluoreszierende reagenzien.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft Reagenzien zur Analyse der Proteinbindung, die geeignet sind, die Bindungsstärke zwischen einem Medikament und einem Protein abzuschätzen, insbesondere zwischen einem basischen Medikament und einem α&sub1;-Säureglycoprotein (nachstehend als α&sub1;-AG bezeichnet).
- Die Figur zeigt die Beziehung zwischen Konzentration und Fluoreszensintensität, wobei die Abszisse die Konzentration der Verbindung 1 (x 10&supmin;&sup6; Mol) und die Ordinate die Fluoreszenzintensität (%) zeigt.
- Es ist wichtig, die Bindungsstärke eines Medikaments zum Serumprotein für die Erklärung des Verhaltens eines Medikaments im lebenden Organismus quantitativ abzuschätzen. In letzter Zeit wird einem α&sub1;-AG viel Aufmerksamkeit geschenkt, als einem Protein, das im Blut an ein basisches Medikament gebunden ist, und die Berichte über die Wechselwirkung von α&sub1;- AG mit einer großen Vielfalt von Medikamenten nehmen zu. Das Fluoreszenz-Testsubstanz-Verfahren, ein Verfahren zur Abschätzung der Proteinbindungsstärke, ist hoch empfindlich und leicht zu handhaben, man kann jedoch kaum sagen, daß bekannte Fluoreszenz-Testsubstanzen zur Abschätzung der Bindungsstärke von α&sub1;-AG geeignet sind. Beispielsweise sind Auramin O und Phenprocoumon, etc. bekannt und werden als Fluoreszenz- Testsubstanzen für α&sub1;-AG beschrieben. Die erstgenannte, die in Y. Sugiyama et al., Biochem. Pharmcol. 34(6), 821-829 (1985) offenbart wird, hat den Nachteil einer geringen Empfindlichkeit bei der Bestimmung einer sehr kleinen Proteinmenge, weil ihre Bindungsstärke zu α&sub1;-AG sehr schwach ist. Die letztgenannte, die in M. Otagiri et al., J. of Pharmaceutical Sciences 76(8), 646-649 (1987) offenbart wird, hat auch einige Nachteile, wie etwa daß sie leicht durch Eigenfluoreszenz eines Proteins beeinflußt wird, weil die zur Bestimmung geeignete Wellenlänge im kurzwelligen Bereich liegt.
- Deshalb ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Fluoreszenz-Testsubstanz bereitzustellen, die eine hohe Affinität zu einem Protein aufweist, insbesondere zu α&sub1;-AG und die im langwelligen Bereich bestimmt werden kann.
- Diese Aufgabe wird von den Benzotriazol-Derivaten gelöst, die durch diese Erfindung bereitgestellt und durch folgende Formel wiedergegeben werden
- in der R¹, R² und R³ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und Salzen davon (nachstehend einfach als die Verbindungen dieser Erfindung bezeichnet). Diese Verbindungen fluoreszieren in einer wäßrigen Lösung selbst kaum, während sie in Gegenwart eines Proteins, wie α&sub1;-AG, an das Protein binden, wobei sie stark fluoreszieren. Die Verbindungen dieser Erfindung konkurrieren mit einer großen Vielfalt basischer Medikamente um dieselbe Stelle an einem Protein und dabei kann die Änderung der Fluoreszenzintensität beobachtet werden. Von dieser Änderung der Fluoreszenzintensität kann eine exakte Bestimmung durch Abschätzen der Bindungsstärke des Medikaments zu einem Protein mittels bekannter Fluoreszenz-Testsubstanz- Verfahren einfach durchgeführt werden.
- Weil die Verbindungen dieser Erfindung, wie vorher erwähnt, eine sehr hohe Bindungsaffinität zu einem Protein besitzen, kann auch die quantitative Bestimmung einer sehr geringen Proteinmenge im Blut, insbesondere α&sub1;-AG, sehr leicht durchgeführt werden.
- Die von dieser Erfindung bereitgestellten Benzotriazol-Derivate können einfach mit in der organischen Chemie bekannten Reaktionen hergestellt werden. Beispielsweise wird, wie nachstehend gezeigt, 5-substituiertes Metaphenylendiamin (a) einer bekannten Diazokupplungs-Reaktion mit einem Paraphenylendiamin-Derivat (b) (Stufe 1) und dann einer Ringschluß-Reaktion (Stufe 2) unterzogen, wobei die Verbindungen dieser Erfindung erhalten werden.
- In diesem Reaktionsschema haben jeweils R¹, R² und R³ die gleiche, vorstehend angegebene Bedeutung.
- Das vorstehende Verfahren wird nachstehend Stufe für Stufe erklärt.
- Die Reaktion wird gewöhnlich in einer wäßrigen Lösung bei einer Temperatur von Eiskühlung bis 15ºC durchgeführt. Die Verbindung (b) wird in einer anorganischen Säure gelöst oder suspendiert, die dann mit salpetriger Säure, die als Natriumnitrit zugegeben wird, umgesetzt wird, wobei eine sehr reaktive Diazoverbindung erhalten wird. Dazu wird Sulfaminsäure oder Harnstoff gegeben, um die überschüssige salpetrige Säure zu entfernen.
- Als nächstes wird die Verbindung (a) dazugegeben, wodurch sie leicht mit der Diazoverbindung gekuppelt wird und wobei die Verbindung (c) erhalten wird. Die Reaktion wird in einigen Minuten bis einigen Stunden abgeschlossen.
- Die Azogruppe der Verbindung (c) reagiert intramolekular leicht mit dem benachbarten Amin, wobei die Verbindungen (I) dieser Erfindung erhalten werden. Die Reaktion wird in einigen Minuten bis einigen zehn Stunden bei Raumtemperatur oder unter Erhitzen abgeschlossen, wenn sie in einem Wasser enthaltenden organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Kupfer-Ammoniak- Komplexes durchgeführt wird.
- In dieser Erfindung bedeutet Halogenatom ein Fluor-, Chlor- oder Bromatom. C&sub1;-C&sub5;-Alkylrest bedeutet einen geraden oder verzweigtkettigten C&sub1;-C&sub5;-Alkylrest, einschließlich der Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, sec-Butyl-, tert-Butyl-, n-Pentyl-, Isopentyl-, Neopentyl- und der tert- Pentylgruppe, etc.
- C&sub3;-C&sub7;-Cycloalkylrest bedeutet die Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl- und die Cycloheptylgruppe, die einen oder zwei Substituenten, wie ein Halogenatom, einen C&sub1;-C&sub5;-Alkylrest oder einen C&sub1;-C&sub5;- Alkyloxyrest besitzen können.
- Arylrest bedeutet einen Phenylrest mit einem oder zwei Substituenten und umfaßt beispielsweise die Phenyl-, Tolyl-, Xylyl-, Cumenyl- oder die o-, m-, p-Chlorphenylgruppe.
- Der C&sub3;-C&sub7;-Alkylenrest umfaßt die Propylen-, Butylen-, Pentylen-, Hexylen und die Heptylengruppe, etc.
- Die typischen Beispiele der Verbindungen dieser Erfindung, die den Bereich dieser Erfindung nicht einschränken, werden nachstehend aufgelistet:
- (1) 7-Chlor-2-(p-diethylaminophenyl)-2H-benzotriazolyl-5-amin,
- (2) 7-Chlor-2-(p-methylaminophenyl)-2H-benzotriazolyl-5-amin,
- (3) 7-Chlor-2-(p-anilinophenyl)-2H-benzotriazolyl-5-amin,
- (4) 7-Chlor-2-(p-morpholinophenyl)-2H-benzotriazolyl-5-amin,
- (5) Ethyl-6-amino-2-(p-diethylaminophenyl)-2H-benzotriazol-4- carboxylat,
- (6) 2-(p-Cyclohexylaminophenyl)-2H-benzotriazolyl-5-amin,
- (7) 7-Cyano-2- (p-piperidinophenyl)-2H-benzotriazolyl-5-amin,
- (8) 7-Brom-2-(p-cyclopropylaminophenyl)-2H-benzotriazolyl-5- amin
- (9) 7-Chlor-2-(p-piperazinophenyl)-2H-benzotriazolyl-5-amin und
- (10) Methyl-6-amino-2-(p-diisopentylaminophenyl)-2H- benzotriazol-4-carboxylat.
- Unter Verwendung der vorstehenden Verbindungen dieser Erfindung, kann (1) die Bindungsstärke eines Medikaments zu einem Protein und (2) die Proteinmenge im Blut leicht und präzise bestimmt werden. Die Analyseverfahren werden in den folgenden Beispielen erklärt.
- Zwei verschiedene Lösungen, wovon eine α&sub1;-AG und eine der vorstehend aufgelisteten Verbindung dieser Erfindung enthält und die andere α&sub1;-AG, die Verbindung dieser Erfindung und ein Medikament enthält, werden hergestellt, um die Fluoreszenzintensität bei der Fluoreszenz-Anregungswellenlänge zu messen, wie in Tabelle 2 gezeigt wird. Gemäß der im voraus aufgestellten Arbeitskurve wird die Bindungsrate der Verbindung zu α&sub1;-AG in jeder Lösung bestimmt, und die Bindungskonstante eines Medikaments zu α&sub1;-AG wird aus dem Unterschied zwischen den Bindungsraten in Gegenwart und Abwesenheit eines Medikaments errechnet.
- Eine Lösung mit einer Verbindung wird zu einer Lösung mit Albumin gegeben, und mit der gemischten Lösung wird die Bestimmung der Fluoreszenzintensität bei der Fluoreszenz- Anregungswellenlänge, wie in Tabelle 2 gezeigt, durchgeführt. Gemäß der im voraus hergestellten Arbeitskurve mit der Standard-Albuminlösung wird die Albuminkonzentration in der Probelösung bestimmt.
- Sulfosalicylsäure wird zu der Probenlösung mit α&sub1;-AG gegeben, um gleichzeitig vorhandene Proteine zu entfernen, und zu der Probenlösung wird eine Lösung mit einer Verbindung gegeben. Von der gemischten Lösung wird, wie in Tabelle 2 gezeigt, die Fluoreszenzintensität bei der Fluoreszenz- Anregungswellenlänge bestimmt. Gemäß der Arbeits-kurve der Standardlösung von α&sub1;-AG wird die Konzentration von α&sub1;-AG in der Probe bestimmt.
- Diese Erfindung wird ausführlicher in den folgenden Beispielen und Experimenten, die den Bereich dieser Erfindung nicht einschränken sollen, erklärt.
- Die Verbindungen dieser Erfindung 1-5 wurden wie in den folgenden Beispielen 1-5 hergestellt. Die physikalischen Konstanten jeder Verbindung werden in Tabelle 1 gezeigt.
- Eine 10% wäßrige Lösung (7 ml) Natriumnitrit wurde unter Rühren und Eiskühlen zu einer Lösung aus N,N-Diethyl-p- phenylendiamindihydrochlorid (10 mMol), gelöst in 50 ml 10% Salzsäure gegeben. 15 min später wurde 10% Ammoniumsulfamat (15 ml) zugegeben und das Gemisch 15 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Natriumacetat auf ungefähr pH 5 eingestellt, dann 5-Chlor-m-phenylendiamin (10 mMol) zugegeben und das entstandene Gemisch 2 h gerührt.
- Das Reaktionsgemisch wurde mit 1N Natriumhydroxyd auf ungefähr pH 9 eingestellt und dann mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde eingedampft, wobei ein Rückstand blieb, der in Pyridin (40 ml) gelöst wurde, dann wurde eine ammoniakalische Kupfersulfatlösung, die durch Lösen von 10 g Kupfersulfat-Pentahydrat in 60 ml 14% Ammoniak hergestellt wurde, zugegeben,und das entstandene Gemisch 4 h unter Rückfluß erhitzt. Als nächstes wurde nach dem Kühlen der Reaktionslösung das entstandene Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft, wobei ein Rückstand blieb, der in Ethylacetat (5 ml) gelöst wurde, dann wurde das entstandene Gemisch unter Verwendung der Kieselgel-Chromatographie mit Ethylacetat als Eluens gereinigt, wobei die beabsichtigte Verbindung 1 erhalten wurde.
- Die Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer daß N-Methyl-p-phenylendiamindihydrochlorid anstelle von N,N-Diethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid verwendet wurde, wobei die beabsichtigte Verbindung 2 erhalten wurde.
- Die Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer daß N-Phenyl-p-phenylendiamindihydrochlorid anstelle von N,N-Diethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid verwendet wurde, wobei die beabsichtigte Verbindung 3 erhalten wurde.
- Die Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer daß p-Morpholinoanilin anstelle von N,N- Diethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid verwendet wurde, wobei die beabsichtigte Verbindung 4 erhalten wurde.
- Die Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer daß Ethyl-3,5-diaminobenzoatdihydrochlorid anstelle von 5-Chlor-m-phenylendiamin verwendet wurde, wobei die beabsichtigte Verbindung 5 erhalten wurde.
- Die Reagenzien dieser Erfindung für die Analyse wurden, wie in den folgenden Beispielen 6-10 gezeigt, hergestellt.
- Zu einer Lösung der Verbindung 1 (31,6 mg), gelöst in 0,1 N Salzsäure (10 ml) wurde die notwendige Wassermenge gegeben, um insgesamt 10 l zu erhalten. Diese Lösung wurde in braune Fläschchen mit jeweils 5 ml verteilt und dann luftdicht verschlossen, wobei das Reagens für die Analyse erhalten wurde.
- Zu einer Lösung der Verbindung 2 (27,4 mg), gelöst in Methanol (10 ml) wurde die notwendige Wassermenge gegeben, um insgesamt 10 l zu erhalten. Diese Lösung wurde in braune Fläschchen mit jeweils 5 ml verteilt und dann luftdicht verschlossen, wobei das Reagens für die Analyse erhalten wurde.
- Das Reagens für die Analyse wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 erhalten, außer daß 33,6 mg der Verbindung 3 und Ethanol verwendet wurden.
- Das Reagens für die Analyse wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 erhalten, außer daß 33,0 mg der Verbindung 4 verwendet wurden.
- Das Reagens für die Analyse wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 erhalten, außer daß 35,3 mg der Verbindung 5 verwendet wurden. Tabelle 1 Erscheinungsbild IR (Nujol) Schmelzpkt. (ºC) Molekülformel Elementanalyse (ber./gef.) orange Platten hellbraune braune geleb Nadeln dunkle Prismen Tabelle 2: Human-Serumalbumin Anregungswellenlänge (nm) Fluoreszenzwellenlänge (nm)
- In eine Fluoreszenzküvette aus Quarz mit Stopfen wurde eine Pufferlösung aus 0,1 Mol Phosphorsäure (2 ml), pH 7,4 gefüllt. 2 ul einer 1 x 10&supmin;&sup4; Mol α&sub1;-AG-Lösung und 2 ul einer 5 x 10&supmin;&sup4; Mol wäßrigen Lösung der Verbindung 1, die durch Auflösen von 3 mg der Verbindung 1 in 1N Salzsäure (1 ml) und anschließendem Verdünnen mit Wasser auf das 200fache Gesamtvolumen hergestellt wurde, wurden mit einem Mikrozylinder zugegeben. Die entstandene Lösung wurde sorgfältig gemischt und die Fluoreszenzintensität bei 508 nm (Anregungswellenlänge: 418 nm) bestimmt. In diesem Fall war die gesamte Verbindung 1 an α&sub1;-AG gebunden und das Verhältnis der Konzentration zur Fluoreszenzintensität wird in der Figur als die gerade Linie 1 gezeigt.
- Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde Tnit einer Pufferlösung einer 0,1 Mol Phosphorsäure (2 ml), pH 7,4 durchgeführt, die 3 x 10-6 Mol α&sub1;-AG enthielt. In diesem Fall war die Bindung der Verbindung 1 an α&sub1;-AG unter Gleichgewichtsbedingungen, und das Verhältnis der Konzentration zur Fluoreszenzintensität wird in der Figur als Kurve 2 gezeigt.
- Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde mit einer Pufferlösung einer 0,1 Mol Phosphorsäure (2 ml), pH 7,4 durchgeführt, die 1 x 10&supmin;&sup6; Mol Chlorpromazin und 3 x 10-6 Mol α&sub1;-AG enthielt. In diesem Fall wurde die Bindung der Verbindung 1 an α&sub1;-AG durch Chlorpromazin gehemmt, und das Verhältnis der Konzentration zur Fluoreszenzintensität wird in der Figur als Kurve 3 gezeigt.
- Die Bindungsrate (X) der Verbindung 1 an α&sub1;-AG wurde aus der folgenden Formel (1) bestimmt
- In dieser Formel bedeutet Fb die Fluoreszenzintensität bei der Konzentration der Verbindung 1, die in Experiment 1 erhalten wurde, Fp die Fluoreszenzintensität bei der gleichen Konzentration der Verbindung 1, die in Beispiel 2 erhalten wurde und Fo den Nullwert.
- Der Wert, gewonnen aus der Bindungsrate der jeweiligen Konzentration der Verbindung 1 wurde gemäß der Formel (2) von Scatchard aufgetragen, wobei der Bindungsparameter für Verbindung 1 mit α&sub1;-AG erhalten wurde.
- r / Df = nKa - rKa (2)
- In dieser Formel ist r die gebundene Menge der Verbindung 1 pro α&sub1;-AG (1 Mol), n die Anzahl der Bindungsstellen, Ka die Bindungskonstante der Verbindung 1 und Df die Konzentration der frei vorhandenen Verbindung 1. Die Bindungsparameter der Verbindung 1 für α&sub1;-AG waren Ka = 1,46 x 10&supmin;&sup6; Mol&supmin;¹ und n = 0,40.
- Die Bindungskonstante von Chlorpromazin wurde aus der Formel von Klotz et al. bestimmt
- In dieser Formel bedeutet Ka und Kb jeweils die Bindungskonstante der Verbindung 1 und Chlorpromazin, Pt und Bt jeweils die Gesamtkonzentration von α&sub1;-AG und Chloropromazin und n die Anzahl der Bindungsstellen. Df und Db bedeutet jeweils die Konzentration der freien und der gebundenen Form der Verbindung 1, die erhalten wurde, wenn Chlorpromazin in Experiment 3 zugegeben wurde. Die Bindungskonstante von Chlorpromazin wird in Tabelle 3 gezeigt.
- Für die anderen in Tabelle 3 aufgeführten basischen Medikamente wurden die Bindungskonstanten auf die gleiche Weise wie in Beispiel 11 erhalten. Die Ergebnisse werden zusammen in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Medikament log Chlorpromazin Amitriptylin Imipramin Trimipramin Desipramin Prochlorperazin Levomepromazin Promethazin Qinidin Diltiazem Pindolol Nicardipin Lidocain Propranolol Dilevalol
Claims (2)
1) Verbindung der folgenden Formel
in der R¹ ein Wasserstoffatom, einen C&sub1;-C&sub5;-Alkylrest, ein
Halogenatom, eine Cyanogruppe oder einen
C&sub1;-C&sub5;-Alkyloxycarbonylrest darstellt, R¹ und R³ jeweils ein wasserstoffatom,
einen C&sub1;-C&sub5;-Alkylrest, einen C&sub3;-C&sub7;-Cycloalkylrest,
gegebenenfalls mit einem oder zwei Halogenatomen, C&sub1;-C&sub5;-Alkyl
- oder C&sub1;-C&sub5;-Alkoxyresten substituiert, oder einen
Phenylrest, gegebenenfalls mit einem Chloratom, einer oder
zwei Methyl- oder einer Isopropylgruppe substituiert,
darstellen oder zusammengenommen einen C&sub3;-C&sub7;-Alkylenrest oder
zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom eine Piperazin
- oder Morpholingruppe bilden können, oder das Salz davon, außer
der Verbindung 2-(p-Dimethylaminophenyl)-2H-benzotriazolyl-5-
amin.
2) Reagens zur Analyse der Proteinbindung oder Bestimmung
eines Proteins, umfassend eine Verbindung gemäß Anspruch 1.
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