CN100501370C - 一种单胺氧化酶活性的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单胺氧化酶活性的荧光检测方法，所述方法是以单胺氧化酶水解荧光探针形成荧光物质，测定荧光强度，获得单胺氧化酶活性数据；所述荧光探针为香豆素类化合物，结构如式(1)所示，式中，R1、R2各自独立为H或C1～C6的烷基。本发明所用荧光探针制备所需设备简单，操作简便，原料易得到，所制备的单胺氧化酶荧光探针性质稳定，纯度也很高(99%以上)；与目前所用的检测单胺氧化酶活性的基本方法相比，其精确度、灵敏度和检测速率都有很大的提高。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种单胺氧化酶活性的荧光检测方法，尤其是一种以香豆素类化合物为荧光探针的单胺氧化酶活性的荧光检测方法。
(二)背景技术
单胺氧化酶是一类线粒体膜结合酶，它在大脑和周围神经组织中催化生物体内的胺类化合物，氧化脱氨生成相应的醛。研究表明单胺氧化酶在代谢多巴胺的过程中，伴随产生自由基和过氧化氢等内源性物质，其表达量的异常与帕金森病和抑郁症有着极其密切的关系。此外测定分析患者血液中单胺氧化酶活性，对于急、慢性肝炎，肝硬化早期诊断具有重要价值。因此寻找高灵敏度的单胺氧化酶的检测方法具有较大的科研和临床应用价值。然而目前临床诊断中所用的荧光试剂采取非直接法检测单胺氧化酶的活性，准确性不高。
目前有多种方法检测单胺氧化酶的活性：紫外法，分光光度法，放射性法以及荧光法等。前两种方法的灵敏度不高，而放射性法虽具有较高的灵敏度，但是它需要放射性标记的化合物，操作上有一定的危险性。
因此，设计出一种更为快速、灵敏、有效的单胺氧化酶的检测方法是相当必要和迫切的，而荧光探针作为一种非放射性的标记技术，因其具有较好的安全性和较高的灵敏度而被广泛应用于细胞内、外酶蛋白活性的检测。目前虽然有一些通过荧光探针检测和分析单胺氧化酶的方法，但其制备都较为复杂，缺少一种简单、有效的荧光探针检测方法。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种单胺氧化酶活性的荧光检测方法，方法所用到的荧光探针制备方法简单，性质稳定，检测的精确度、准确度高，检测速度快。
本发明采用的技术方案如下：
一种单胺氧化酶活性的荧光检测方法，所述方法是以单胺氧化酶水解荧光探针形成荧光物质，测定荧光强度，获得单胺氧化酶活性数据；其特征在于：所述荧光探针为香豆素类化合物，所述香豆素类化合物结构如式(I)所示：
式中，R1、R2各自独立为H或C1～C6的烷基。较好的，所述的R1、R2各自独立为H、CH3或C2H5，即所述的香豆素类化合物为7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素、7-[3-(二甲基氨基)-丙氧基]-香豆素、7-[3-(二乙基氨基)-丙氧基]-香豆素、7-[3-(甲乙基氨基)-丙氧基]-香豆素、7-[3-(甲基氨基)-丙氧基]-香豆素或7-[3-(乙基氨基)-丙氧基]-香豆素；更优选的，R1、R2各自独立为H。
所述的方法为将待测单胺氧化酶活性的样品溶于离心管(EP管)中，取部分放入pH7.4～9.0的硼酸缓冲液中，25～40℃恒温预热后，加入香豆素类化合物及BSA溶液反应，反应完全后检测其荧光强度，进而获得单胺氧化酶活性数据。所述的硼酸缓冲液浓度推荐为50mM。
预热时可在恒温水浴摇床中进行，预热时间以5～10min为宜。检测荧光强度时可在全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中检测。
较为具体的，单胺氧化酶活性的荧光检测方法为将待测单胺氧化酶活性的样品溶于EP管中，按照1:9(V/V)的比例将样品放入pH8.4的硼酸缓冲液中，35℃恒温预热后，加入所述的香豆素类化合物及BSA溶液，终浓度分别为香豆素类化合物5-500μmol/L，BSA0.2-20mg/mL，反应完全，在96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测，获得单胺氧化酶的活性数据。
较好的，缓冲液中香豆素类化合物的终浓度为50μmol/L，BSA的终浓度为1-2mg/mL。
以所述的香豆素类化合物为7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素为例，所述的方法按照以下步骤进行：将待测单胺氧化酶活性的样品溶于EP管中，取100体积份EP管中的溶液放入900体积份50mM pH8.4的硼酸缓冲液中，置于恒温水浴摇床中，35℃预热5min，加入5体积份浓度为10mM7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素溶液和2体积份的1g/mLBSA反应，反应结束后，在96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测。
方法中所述香豆素类化合物可按如下方法制备得到：将7-羟基-香豆素与NaH溶于二甲基亚砜中，充分混匀后，加入N-Boc-3-溴丙胺类化合物，加热至回流温度下反应8～10小时，反应液经分离纯化得到N-Boc香豆素类化合物，再将所述的N-Boc香豆素类化合物与20％(体积浓度)三氟乙酸水溶液混合，加入二氯甲烷溶剂，室温反应2～3小时，除去溶剂及三氟乙酸(TFA)，即得所述香豆素类化合物，各物质的投料物质的量比为：7-羟基-香豆素:NaH:N-Boc-3-溴丙胺类化合物为1:1.0～1.5:1.0～1.5，N-Boc香豆素类化合物与三氟乙酸物质的量比为1:5～20，加入的二氯甲烷的体积量为N-Boc香豆素类化合物质量的8～12倍。
所述反应液分离纯化方法可如下进行：在反应液中加入饱和NaCl溶液，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液体脱水、过滤、蒸干，即得所述N-Boc香豆素类化合物。
更为具体的，检测时取单胺氧化酶提取液，离心，取沉淀用生理盐水溶解，再次离心，取沉淀溶于EP管，再按照以上操作方法放入pH8.4的硼酸缓冲液溶解，加入BSA及荧光探针进行反应，于全功能荧光分光光度计的96孔筛板中，实时检测荧光强度。
可根据米氏方程将得到的荧光强度换算出单胺氧化酶活性的各种反应常数。
本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：
(1)所用荧光探针制备所需要的设备简单，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且所制备的单胺氧化酶荧光探针性质很稳定，纯度也很高(99％以上)；
(2)与以前所用的检测单胺氧化酶活性的基本方法相比，其精确度、灵敏度和检测速率都有很大的提高，耗时则仅需几分钟。
(四)附图说明
图1为实施例2探针选择性试验的检测结果图。
图2为实施例3加入单胺氧化酶抑制剂的对比图。
(五)具体实施方式：
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1：
以从大鼠肝提取的单胺氧化酶为例，用制备的7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素作为荧光探针检测单胺氧化酶活性：
将从大鼠肝提取的单胺氧化酶的待测样品溶于1ml EP管中，取100μL放入900μL 50mM pH8.4的硼酸缓冲液中，置于恒温水浴摇床中，35℃预热5min，加入5μl浓度为10mM的7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素和2μl的1g/mL BSA反应液进行反应。反应结束后，在96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测。
实验证明，只要存在微量的单胺氧化酶(5～10mmol/L)，就能高效的水解荧光探针，通过全功能微孔板检测***测定出荧光强度从1000增加到20000，变化的幅度较大，直观地得出单胺氧化酶的活性的变化，再根据米氏方程得到酶的各种反应常数。
实施例2
采用与实施例1相同的方法，采用以下酶制剂对底物进行作用：脂肪酶(EC 3.1.1.3 Type VII from Candida rugosa，和hog pancreas国药集团化学试剂有限公司)，磷酸酶(Phosphatase，Alkalinebovine)，多种蛋白酶(Protease from Aspergillus oryzae，Proteasefrom Aspergillus sojae，Protease from bovine pancreas)和一种复合酶(BS-031江门市莲江区拜奥生物化学厂)，结果显示，只有单胺氧化酶显示强烈的荧光，结果如图1所示，只有单胺氧化酶能使底物转化，也说明了起到水解作用的是我们提取所得的单胺氧化酶，而其他的酶对底物没有作用。
实施例3：
取100μl pH8.4的硼酸缓冲液，加入单胺氧化酶提取液15μl，0.1mM的单胺氧化酶抑制剂--盐酸羟胺溶液2μl，置于35℃恒温水浴摇床中，30分钟后，按照实施例1的量加入7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素及BSA溶液反应，反应结束后，在全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测，实时检测荧光强度。
实验证明，单胺氧化酶的活性被盐酸羟胺抑制后，用我们制备的探针检测不出活性，结果如图2所示。
实施例4～8
采用实施例1的方法，将7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素分别用以下香豆素类化合物替代作为荧光探针，实施例4为7-[3-(二甲基氨基)-丙氧基]-香豆素，实施例5为7-[3-(二乙基氨基)-丙氧基]-香豆素，实施例6为7-[3-(甲乙基氨基)-丙氧基]-香豆素，实施例7为7-[3-(甲基氨基)-丙氧基]-香豆素，实施例8为7-[3-(乙基氨基)-丙氧基]-香豆素，结果表明单胺氧化酶对这类探针具有专一性。
Claims (9)
1.一种单胺氧化酶活性的荧光检测方法，所述方法是以单胺氧化酶水解荧光探针形成荧光物质，测定荧光强度，获得单胺氧化酶活性数据；其特征在于：所述荧光探针为香豆素类化合物，所述香豆素类化合物结构如式(I)所示：
式中，R1、R2各自独立为H或C1～C6的烷基。
2.如权利要求1所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述的R1、R2各自独立为H、CH3或C2H5。
3.如权利要求2所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述的R1、R2各自独立为H。
4.如权利要求1所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述的方法为将待测单胺氧化酶活性的样品溶于离心管中，取部分放入pH7.4～9.0的硼酸缓冲液中，25～40℃恒温预热后，加入香豆素类化合物及BSA溶液反应，反应完全，检测其荧光强度，获得单胺氧化酶活性数据。
5.如权利要求4所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述的方法为将待测单胺氧化酶活性的样品溶于离心管中，按照1:9(V/V)的比例将样品放入pH8.4的硼酸缓冲液中，35℃恒温预热后，加入所述的香豆素类化合物及BSA溶液，终浓度分别为香豆素类化合物5-500μmol/L，BSA 0.2-20mg/mL，反应完全，在96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测，获得单胺氧化酶活性数据。
6.如权利要求5所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法，其特征在于香豆素类化合物在缓冲液中的终浓度为50μmol/L，BSA在缓冲液中的终浓度为1-2mg/mL。
7.如权利要求6所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述的香豆素类化合物为7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素，所述的方法按照以下步骤进行：将待测单胺氧化酶活性的样品溶于离心管中，取100体积份离心管中的溶液放入900体积份50mM pH8.4的硼酸缓冲液中，置于恒温水浴摇床中，35℃预热5min，加入5体积份浓度为10mM7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素溶液和2体积份的1g/mL BSA溶液反应，反应结束后，在96孔筛板中用全功能荧光分光光度计检测。
8.如权利要求1或2所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述香豆素类化合物由如下方法制备得到：将7-羟基-香豆素与NaH溶于二甲基亚砜中，充分混匀后，加入N-Boc-3-溴丙胺类化合物，加热至回流温度下反应8～10小时，反应液经分离纯化得到N-Boc香豆素类化合物，再将所述的N-Boc香豆素类化合物与体积浓度为20％的三氟乙酸水溶液混合，加入二氯甲烷溶剂，室温反应2～3小时，除去溶剂及三氟乙酸，即得所述香豆素类化合物，各物质的投料物质的量比为：7-羟基-香豆素：NaH：N-Boc-3-溴丙胺类化合物为1:1.0～1.5:1.0～1.5，N-Boc香豆素类化合物与三氟乙酸物质的量比为1:5～20，加入的二氯甲烷的体积量为N-Boc香豆素类化合物质量的8～12倍。
9.如权利要求8所述的单胺氧化酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述反应液分离纯化方法如下：在反应液中加入饱和NaCl溶液，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液体脱水、过滤、蒸干，即得所述N-Boc香豆素类化合物。
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