DE2261832A1 - 5-dihydrocoriolin c und verfahren zur herstellung desselben - Google Patents

Description

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8l-l-9-.-93.7P . 1"8-,- 12. 1972

ZAIDAN HOJIN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYU ΚΑΙ, To k y ο (Japan)

5-Dihydrocoriolin G und Verfahren zur Herstellung desselben

Gegenstand der Erfindung ist 5-Dlhydrocoriolin. 0 sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben insbesondere durch Züchtung von zu den Basidiomyceten gehörenden iiikroorganismen, die befähigt sind, in einem für die Erzeugung von 5-DihydrocoriolinG unter aeroben Bedingungen geeigneten Medium 5-Dihydrocoriolin C zu. bilden und Gewinnung des 5-Dihydro-.coriolin C aus dem.resultierenden Kulturmedium.

Das erfindungsgemäße 5-Dlhydrocoriolin C ist eine neue Substanz, die in der lage ist, durch Oxidation Coriolin C
und 2'-Dehydrocorlolin G mit antibakterieller und Antitumorwirkung zu bilden.

81-(POS 29 558) UoHe

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Das IR-Absroptionsspektrum des erfindungsgemäßen 5-Dihydrocoriolin C (bestimmt an einer Tablette aus 5-Bihydrocoriolin G und Kaliumbromid) ist der angefügten Zeichnung zu entnehmen.

Das gemäß der Erfindung erhaltene 5-Dihydrocoriolin C wird in rohem und Kristallinem Zustand gewonnen und besitzt selbst keine antibakterielle oder Antitumorwirkung, jedoch zeigen Coriolin C und 2'-Dehydrocoriolin C, die durch Oxidation von 5-Dihydrocoriolin G mit einem Oxidationsmittel erhalten werden, eine antibakterielle Wirkung gegenüber Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, etc. und eine lebensverlängernde Wirkung beim Bhrlich-Ascitestumor bei der Haus und Mäuse-Leukämia L-1210, wie aus den nachfolgenden Versuchsergebnissen hervorgeht (bzgl. Coriolin C siehe Umezawa u.a.i Tetrahedron letters, Nr. 19, (1970) Seiten 1637-1639; 2'-Uehydrocoriolin G ist eine neue Verbindung).

Die Ergebnisse einer Untersuchung der antibakteriellen Wirkungen von Coriolin C und 2'-Dehydrocoriolin (J nach der Agar-Agar-Verdünnungsmethode sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.

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Tabelle 1

Antibakterielle Wirkung von Coriolin C und 2'-Dehydrocoriolin 0

Test-Organismen	Coriolin 0	2'-Dehydro coriolin C
St. aureus PDA 209-P	1,56* 1,56 1,56 <0,78 <0,78 <0,78 25,0 ;>100,0 12,5 •>100,0	1,56* 1,56 1,56 1,56 <0,78 1,56 100,0 ;> 1oo,ο 12,5 ' 100,0
Terajima Smith M. flavus EDA-16
B. anthracis
B. subtilis NRR B-558
£L co11 NIHJ S. t,yphi-T63
enteritis
Ps. aeruginosa AS

* Minimale inhibierende Konzentration (jug/ml)

Diese beiden Verbindungen besitzen eine Wirkung hinsichtlich der Inhibition des Wachstums von grampositiven Mikroorganismen und mit beiden Substanzen können nahezu gleiche Wirkungen erzielt werden.

Die Y/irkungen von Ooriolin G und 2'-Dehydrocoriolin G auf den Ehrlich-Ascitestumor bei der Maus, Mäuse-leukämia L-1210 und das Wachstum von Yoshida-Sarkomzellen in Gewebskulturen wurden untersucht und folgende Ergebnisse erhalten:

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Die Behandlung von Ehrlich-Ascitestumoren bei Mäusen wurde mit einer täglichen Verabreichung von 0,19 bis 12,5 mg/kg von jeder der beiden Verbindungen über 10 Tage hinweg durchgeführt. Während alle Kontrolltiere innerhalb von 23 Tagen nach Einimpfung der Tumorzellen tot waren, überlebten iläuse, die mit 12,5; 6,25; 3,12; 1,56 und 0,678 mg/kg Coriolin G oder 2'-Dehydrocoriolin G unter Verabreichung in die Bauchhöhle behandelt worden waren, zu 90 yö, 80 <ß>, 65 ^, 63 ί° und 60 io (bei Verabreichung von Goriolin G) mehr als 50 Tage und zu 80 #, 75 "At 60 y», 60 y£ und 50 yi (bei Verabreichung von 2'-Dehydrocoriolin C) mehr als 50 Tage und es wurde keine Ascitesretention beobachtet.

Eine Behandlung von Mäuse-Leukämia L-1210 durch tägliche Verabreichung von 6 bis 100 mg/kg Coriolin C oder 2*-Dehydrocoriolin G über 10 Tage hinweg ergab bei Mäusen, denen 6; 12,5; 25; 50 bzw. 100 mg/kg Coriolin C oder 2'-Dehydrocoriolin C verabreicht worden waren, eine lebensverlängernde Wirkung von 119 ^l/i>, 131 #, HO yo, 150 > bzw. 175 > bei Goriolin C und von 115 >, 120 %, 125 '/<>, 135 ^ bzw. 160 yb beim 2'-Dehydrocoriolin G (bezogen auf die Überlebensdauer der Kontrolltiere (100 ,i) ).

Bei der Untersuchung der Wachstumshemmung an Gewebskulturen von Yoshida-Sarkomzellen bei Ratten wurde eine 60 y^ige Fortpflanzungsinhibition mit 0,75 ,ug/mg mit Coriolin C bzw. 2'-Üehydrocoriolin C erhalten.

Untersuchungen der akuten Toxizität von Goriolin G und 2'-Oehydrocoriolin C bei Mäusen ergaben, daß die ÜLcq bei Verabreichung in die Bauchhöhle über 50 mg/kg und bei subkutaner Verabreichung über 90 mg/kg liegt, ferner überlebten

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im Falle der kontinuierlichen Verabreichung in die Bauchhöhle über 10 Tage hinweg alle geprüften Mäuse für mehr als 50 Tage, selbst wenn die G-esamtdosis TOO mg/kg erreichte und es wurde gefunden, daß die Toxizität gering i-st.

Aus dem Vorstehenden folgt, daß Coriolin G und 2'-Dehydrocoriolin C eine ausgezeichnete antibakterielle und Antitumorwirkung besitzen.

Coriolin G kann auch direkt durch einen Fermentations- bzw. Gärprozeß erzeugt werden, jedoch ist die Ausbeute so gering, daß ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Fermentation wegen zu geringer Produktivität industriell kaum durchgeführt werden kann, Auf der anderen Seite kann 5-Dihydrocoriolin C gemäß der Erfindung in hoher Ausbeute erhalten werden, und das so erhaltene 5-Dihydroeoriolin G kann glatt durch Oxidationsmittel in Coriolin G umgewandelt werden. Die Erzeugung von Goriolin G erfolgt daher wirtschaftlicher über die Oxidation von 5-Dihydrocoriolin G als auf direktem fermentativen Wege. Das gemäß der Erfindung erhaltene5-Dihydrocoriolin G ist mithin als Ausgangsmaterial für die Erzeugung dieses Goriolin G und des damit verwandten 2'-Dehydrocoriolin G sehr nützlich.

Das gemäß der Erfindung erhaltene 5-Dihydrocoriolin G hat die folgenden Eigenschaften:

5-Dihydrocoriolin C wird in Form von farblosen Kristallen erhalten, die bei 183°C schmelzen und in Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform und Benzol löslich, aber in Wasser und Petroläther wenig oder garnicht löslich sind. 5-Dihydrocoriolin C zeigt keine andere Ultraviolettabsorption als Endabsorption (end absorption). Das IR-Absorptionsspektrum

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von 5-Bihydrocoriolin C, das an 5-Mhydrocoriolin C-Kaliumbromidtabletten bestimmt wurde, ist in der angefügten Zeichnung dargestellt. Wie man sieht, erfolgt die Hauptabsorption bei Wellenzahlen (cnf¹) von 3490; 3360; 2950; 1741; 1649; 1460; 1419; 1389} 1370; 1340; 1315; 1270; 1184; 1139t 1109} 1081; 1032; 1003; 983; 965; 949; 921; 891; 868; 841; 809; 788; 781; 751; 716 und 672.

5-Dihydrocoriolin G hat ein Molekulargewicht von 424 (massenspektrometrisch bestimmt) und zeigt bei der Elementaranalyse folgende Werte: Cj 65,07 & und Hi 8,55 i°\ es enthält keinen Stickstoff.

Anhand der obigen Werte der Elementaranalyse und des massenspektrometrisch ermittelten Molekulargewichte wird als Summenformel C?3**36^7 (Molekulargewicht: 424) gefunden.

Als Ergebnis der Analyse des Kernmagnetresonanzspektrums von 5-Dihydrocoriolin C und aufgrund seines Verhaltens gegenüber Reagenzien wurde gefunden, daß 5-Dihydrocoriolin 0 folgende Strukturformel besitzt:

Das 5-Dihydrocoriolin C wird auch durch Basidiomyceten gebildet, unterscheidet sich jedoch hinsichtlich der physika-

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lischen und chemischen Eigenschaften, Summenformel und Strukturformel von den bereits bekannten Produkten Goriolin, Coriolin B, Coriolin G, 5~Ketocoriolin B oder Hirustinsäure C und ist als neue Substanz zu betrachten, deren Existenz und Ghemismus bislang unbekannt waren.

Der im Eahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus, der befähigt ist, 5-Dihydroeoriolin G zu bilden, ist der Coriolus consors (Berk) Imaz ATCC Hr. 20305, der von Honshu bis Kyushu (Japan) weit verbreitet und im Detail im "Zoku Genshoku Hippon Kinrui Zukan" (farbiges ja-" panisches "Bakterienbilderbuch", Ports.) von Rokuya Imazeki und Jiro Hongo, Seiten 141-142, Hoikusha Publishing Go., Japan, Auflagevon 1968 beschrieben ist.

zur Bildung von 5-Dihydroeoriolin G befähigte Mikroorganismen in ein geeignetes Medium eingeimpft und unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden, kann ein 5-Dihydrocoriolin C enthaltender Kulturliquor erhalten werden. Obwohl es möglich ist, für die Züchtung eine.Peststoffkulturmethode anzuwenden, wird für die Massenproduktion ein flüssiges Kulturverfahren bevorzugt. Hinsichtlich der Kulturtemperatur besteht keine Beschränkung, solange die Temperaturen ein Wachstum der zur Bildung von 5-Dihydrocoriolin C befähigten Mikroorganismen zulassen, jedoch werden üblicherweise 15 bis 30⁰C und insbesondere 25 bis 28⁰O für die Züchtung bevorzugt.

Als Kulturmedium für die Bildung von 5-Dihydrocoriolin C kann ein eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze, Produktionspromotoren usw. enthaltendes Medium verwendet werden.

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Als Kohlenstoffquelle können handelsüblich erhältliche Zucker, öle und Fette usw. verwendet werden, wie beispielsweise Glucose, Glycerine, Stärke, Dextrin, Maltose, Lactose, Saccharose, Öl und Fett, Melassen etc. in reinem oder rohem Zustand.

Als Stickstoffquelle können Sojabohnenpulver, Fleischextrakt, Pepton, getrocknete Bierhefe, Hefeextrakt, Getreideweichlauger, Casein, Baumwollsamenöl, (grobes) Fischmehl, Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff, Aminosäuren wie Glutaminsäure usw. verwendet werden.

Als anorganische Salze kommen Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Galciumcarbonat, Phosphate etc. oder sehr geringe Mengen von Salzen von Schwermetallen wie Kupfer, Mangan, Eisen, Zink usw, in Betracht. Ferner erhöht die Zugabe, insbesondere Teilungszugabe, von Essigsäure oder Malonsäure bzw. Mevalonsäure (mevalonic acid) die Bildung von 5-Dihydrocoriolin C während der Züchtung.

Ein Beispiel für ein geeignetes Kulturmedium für die Erzeugung von 5-Dihydrocoriolin G wird nachfolgend angegeben:

Zusammensetzung I (Impfmedium)

Glucose 5,0 i>

Pepton 0,2 f°

getrocknete Bierhefe 0,3 %

Kai iumdihyd rogen phosphat 0,3 i°

Magnesiumsulfat 0,1 $

polyoxyathylenisch.es ober- _{n ni c}.· flächenaktives Mittel ^{υ>υι Α}

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Zusammensetzung II (Produktionsmedium)

Glucose 5,0 ^c/o

Pe pt on 0,2 "/ο

getrocknete Bierhefe . 0,3 °/o

Kaliumdihydrogenphosphat 0,3 i»

Magnesiumsulfat 0,1 °/o

polyoxyäthylenisches oberflächen- _{n ni uf}

aktives Mittel υ,υι _/0

Galciumcarbonat 1,6 fo

Gesondert sterilisiert und zum Medium beim Start der \ Kultur zugesetzt.

Bei der iJurchführung der Erfindung wird ein Impf liquor von in dem als Zusammensetzung I bezeichneten Mediun kultivierten, zur Bildung von 5-Dihydrocoriolin G befähigten Mikroorganismen unter Schütteln zunächst in dein als Zusammensetzung H bezeichneten Medium einige Tage lang bei 15 bis 3O⁰G kultiviert. Im Falle der Züchtung in großem Maßstabe unter Verwendung eines Fermentationstanks wird die 'Impfkultivierung in zwei Stufen durchgeführt. Gemäß der üblichen Verfahrensweise wird der durch Kultivierung in einem Impfmedium in einer Schüttelflasche erhaltene erste Impfliquor zunächst in einen vorangehend mit Impfmedium versehenen Fermentationstank überführt und der Kultivierung unterworfen. Abschließend wird der zweite Impfliquor in das in einem anderen Fermentationstank enthaltene Produktionsmedium eingeimpft und der Kultivierung unterworfen. Es ist jedoch auch möglich, die zweite Impfkultivierung wegzulassen.

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Durch diese Kultivierungen werden Coriolin_t Coriolin B, 5-Ketocoriolin B und 5-Dihydrocoriolin G gebildet, und da das Coriolin hauptsächlich im flüssigen Anteil vorhanden ist, während Goriolin B, 5-Ketocoriolin 3 und 5-Dihydrocoriolin G hauptsächlich im Mycel vorhanden sind, wird der Coriolin B, 5-Ketocoriolin B und 5-Dihydrocoriolin G enthaltende Mycelanteil der Kulturflüssigkeit nach allgemein bekannten Methoden wie Filtrieren, Zentrifugaltrennung usw. abgetrennt. Wenn dieser Mycelanteil einer Extraktion mit organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Aceton, Äthylacetat, Butylacetat, Methylisobutylketon usw. unterworfen wird, so wird daa 5-Dihydrocoriolin C.in die vom organischen Lösungsmittel gebildete Schicht überführt.

Wenn bei der Extraktion ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel wie beispielsweise Aceton, Methanol, Äthanol usw. als Sxtraktionsmittel verwendet wird, so wird die Bxtraktflüssigkeit unter vermindertem Druck eingeengt und die eingeengte Flüssigkeit dann einer erneuten Extraktion mit einem nicht-hydrophilen organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Äthylacetat, Methylisobutylketon usw. unterworfen, wodurch wasserlösliche Verunreinigungen entfernt werden können.

In der Extraktflüssigkeit sind neben dem gewünschten 5-Dihydrocoriolin C zusätzlich Coriolin B, 5-Ketocoriolin B usw. enthalten; da jedoch Goriolin B von diesen Nebenprodukten in Äthylacetat am wenigsten löslich ist, wird es durch Ein^ engen des flüssigen Extraktes zuerst ausgeschieden und kann durch Filtrieren entfernt werden.

5-Dihydrocoriolin G ist aus der (dabei erhaltenen) Mutterlauge besser kristallisierbar als 5-Ketocoriolin B, so

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daß das Einengen der vom Coriolin B befreiten Mutterlauge und Stehenlassen der eingeengten Flüssigkeit zur Ausscheidung von 5-Dihydrocöriolin 0 in Form von nadelähnlichen Kristallen führen kann, die gewonnen werden.

Wenn jedoch im Extrakt viel Verunreinigungen enthalten sind, ist die Ausscheidung von 5-Dihydroeoriolin C-Kristallen schwierig und das 5-Dihydrocoriolin C wird daher vom 5-Ketocoriolin B üblicherweise durch chromatographische Methoden unter Verwendung von Silicagel als Trägermedium und einer Lösungsmischung von Methanol-Chloroform, Chloroform, Benzol usw. als Elutionsmittel getrennt. Bei der Elution wird 5-Ketocoriolin B zuerst eluiert und dann das 5-Dihydrocoriolin C. Ihre Trennung ist zufriedenstellend, da die Anzahl der Hydroxylgruppen im Molekül bei beiden Verbindungen um zwei voneinander abweicht.

Die durch Einengen der 5-Dihydrocoriolin C-Elutionsfraktion zur Trockne erhaltenen rohen Pulver werden in einer geringen Menge eines organischen Lösungsmittels gelöst, und das 5-Dihydrocoriolin C kann daraus in Form von nadelähnlichen Kristallen durch Zugabe von Lösungsmitteln, in denen 5-Dihydrocoriolin C schwer löslich ist, wie beispielsweise n-Hexan, V/asser usw. ausgeschieden werden.

Zur Erzeugung von Coriolin C und 2'-Dehydrocoriolin C aus 5-Dihydrocoriolin C durch Oxidation stehen unterschiedliche Methoden zur Verfugung, wie (1) die Oxidation mit Chromsäure in Pyridin, (2) die Oxidation mit Mangandioxid in neutraler Lösung, (3) die Oxidation mit einer Dicyclohexylcarbodiimidlösung in Dimethylsulfoxid usw.; für die Erzielung der beiden Verbindungen sind jedoch die Verfahrensweisen (1) und (2) besonders zweckmäßig.

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Nachfolgend wird die Erfindung mehr im einzelnen anhand von Beispielen erläutert.

Beiapiel 1

25 g Holzschnitzel (entsprechend ca. 0,3 bis 0,85 mm lichter Maschenweite) von Magnolia hypoleuca wurden in eine konische Flasche von 1 1 Fassungsvermögen gebracht und mit 170 ml eines 2 $> Glucose und 0,5 $ getrocknete Bierhefe enthaltenden flüssigen Kulturmediums (nachfolgend mit "GY-kedium¹¹ bezeichnet) versetzt. Bann wurde die Flasche in einem Autoklaven bei 120⁰G 20 Minuten lang sterilisiert und danach mit zur Bildung von 5-Dihydrocoriolin C befähigten Mikroorganismen (ATCO Nr. 20 305) von einer Agar-Schrägkultür (agar slant) geimpft, die 10 bis 14 Tage lang «nter stationärer Bedingung bei 25 bis 27⁰G kultiviert wurden. Die resultierende Kultur wurde als Holzschnitzel-Impfvorrat verwendet.

Dieser wurde dann zu 500 ml sterilisiertem GY-Medium hinzugegeben zur Herstellung einer Mikroorganismen-Suspension und je 100 ml der Mikroorganismen-Suspension wurden In 5 konische 5 1 Flaschen mit 1 1 Medium der folgenden Zusammensetzung I gebracht bzw. eingeimpft und 72 Stunden lang ,auf einem drehbaren Schüttelkultivator mit 190 Upm bei 27⁰O kultiviert.

Zusammensetzung I (Impfmedium)

Glucose

Pepton

getrocknete Bierhefe Kaliumdihydrogenphosphat Magnesiumsulfat

polyoxyäthylenisches oberflächenaktives Mittel

5,0	*
0,2
0,3
0,3
0,1
0.01

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Me Gesamtmenge dieses ersten Impfliquors wurde in einen 200 1 Fermentationstank aus rostfreiem Stahl mit 120 1 eines Mediums mit der gleichen Zusammensetzung wie oben eingebracht bzw. geimpft und 72 Stunden lang unter Rühren (200 TJpm) und mit einer Belüftu'ngsgeschwindigkeit von 120 l/min bei 27⁰G kultiviert.

Danach wurden 12 1 des resultierenden zweiten Impfliquors in einen 200 1 Fermentationstank aus rostfreiem Stahl mit 120 1 Medium der nachfolgenden Zusammensetzung II gebracht bzw. eingeimpft Und 168 Stunden lang unter den gleichen Kultur-

S.

bedingungen wie oben kultiviert.

Zusammensetzung II (Produktionsmedium)

Glucose ' '5,0 $ Pepton . 0,2 fo

getrocknete Bierhefe 0,3 'p '

Kaliumdihydrogenphosphat 0,3 ^

Magnesiumsulfat 0,1 $

polyoxyäthylenisches oberflächenaktives Mittel .0,01$

Galeiumearbonat 1,6 ^

Getrennt sterilisiert und zum Medium beim Start der Kultivierung zugesetzt.

iiach Beendigung der Kultivierung wurde die resultierende Kulturflüssigkeit abfiltriert, wodurch 5,5 kg feuchtes Mycel erhalten wurden. Dieses wurde in einen Behälter überführt und mit 9 I Aceton versetzt, lach Durchrühren wurde die Jiösung abfiltriebt und das Mycel weiter mit 3 1 Aceton gewaschen und die Waschflüssigkeit sowie das filtrat vereinigt und eingeengt,

Der resultierende eingeengte Liquor wurde mit 5 1 Äthylacetat gemischt, gerührt und extrahiert.

Die Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck auf 350 ml eingeengt und stehengelassen, wobei sich kristalle des Nebenproduktes Coriolin 3 abschieden. Die Kristalle wurden abfiltriert und mit einer kleinen Menge Benzol gewaschen. Die Waschflüssigkeit und das Filtrat wurden vereinigt und weiter auf 150 ml eingeengt, wobei ein 5-Dihydrocoriolin C-Niederschlag abgeschieden wurde. Dieser wurde abfiltriert, mit Benzol gewaschen und getrocknet, wodurch 8,59 g rohe Kristalle erhalten wurden.

Die rohen Kristalle wurden aus einer wässrigen 80 ^c/oigen Methanollösung umkristallisiert, wodurch 5,19 g reines 5-Bihydrocoriolin C (Schmelzpunkt: 183⁰G) erhalten wurden.

Beispiel 2

Je 10 ml des in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhaltenen zweiten Impfliquors wurden in 150 Schüttelflaschen (mit einem Fassungsvermögen von 500 ml) mit 125 ml des Mediums gemäß Zusammensetzung II gegeben und 7 Tage lang bei 27⁰C auf einer hin- und hergehenden 3chüttelmaschine mit 130 Hin- und Herbewegungen (reciprocations) pro Minute kultiviert. 15,5 1 der resultierenden Kulturflüssigkeit wurden filtriert, wodurch 550 g feuchtes Mycel erhalten wurden.

Dieses feuchte Mycel wurde mit 2 1 Aceton gemischt, gerührt, extrahiert, filtriert und mit 1 1 Aceton gewaschen. Die Waschflüssigkeit und das Filtrat wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. 600 ml des eingeengten Liquors wurden mit 1,2 1 Äthylacetat gemischt und extrahiert.

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Die resultierende Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt, unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingeengt und stehengelassen, wodurch Kristalle des Nebenproduktes Goriolin B ausgeschieden wurden. Die Kristalle wurden abfiltriert und mit Benzol gewaschen.

Bas Filtrat und die Yfaschflüssigkeit wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wodurch 5,6 g eines das gewünschte 5-Dihydrocoriolin 0 enthaltenden öligen" Materials erhalten wurden.

Dieses ölige Material wurde in einer geringen Menge Chloroform gelöst und für eine Adsorption über eine mit 250 ml Silieagel (suspendiert in Chloroform) gepackte Säule gegeben. Danach wurde eine 1 ^oß> Methanol-Chloroform-Lösungsmittelmischung in einer etwa der Säule gleichen Volumenmenge durch die Säule geschickt, wodurch 5-Ketocoriolin B als erstes eluiert wurde, wonach durch weiteres Durchleiten der Lösungsmittelmischung in einer etwa dem Zweifachen des Säulenvolumens entsprechenden Menge durch die Säule das gewünschte 5-Bihydrocoriolin C eluiert wurde. Die 5-Dihydrocoriolin C-Fraktion wurde gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und aus einer wässrigen 80 $igen Methanollösung umkristallisiert, wodurch 2,54 g reines 5-Dihydrocoriolin C (Schmelzpunkt: 183⁰C) erhalten wurden.

Bezugsbeispiel 1

3 g 5-Dihydrocoriolin C wurden in 30 ml Pyridin gelöst und mit einer Suspension eines Chromsäure-Pyridinkomplexes in Pyridin, die durch Zugabe von 2,5 g Chromsäure zu 40 ml pyridin erhalten worden war, unter Rühren gemischt und 6 Tage lang bei 3 bis 5°C der Reaktion unterworfen.

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226183?

Nach der Reaktion wurden 350 ml Äthylacetat hinzugegeben und die abgeschiedenen Verunreinigungen abfiltriert· Das Filtrat wurde mit inagesamt 500 ml Wasser in Teilen gewaschen und eine obere Schicht abgetrennt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wodurch 2,53 g Rohprodukt erhalten wurden.

Das Rohprodukt wurde in 10 ml Äthanol gelöst und in einer mit 100 ml Sephadex LH 20 (Warenzeichen für ein Dextranderivat, das zur Gelfiltration in organischen Lösungsmitteln bzw. Flüssigkeiten verwendet und von Pharmacia Pine Chemieale, Inc. hergestellt wird) gefüllten Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit insgesamt 85 ml Äthanol eluiert. Die letzten 25 ml der eluierten Flüssigkeit wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der eingeengte Rückstand wurde in 5 ml Chloroform gelöst und in einer mit 50 ml Silicagel gefüllten Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit 100 ml einer 1 $> Methanol-Chloroform-Lösungsmittelmischung eluiert, wodurch eine eluierte Fraktion von 2'-Dehydrocoriolin C erhalten wurde.

Die Säule wurde dann mit 100 ml einer 2 $> Methanol-Chloroform-Lösung smitte^mis chung eluiert, wodurch eine eluierte Coriolin C-Praktion erhalten wurde.

Beide Fraktionen wurden (einzeln) unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wodurch 267 mg pulverförmiges 2^I-Dehydrocoriolin C (Schmelzpunktt 51 bis 55°C) und 851 mg rohe Kristalle von Coriolin C erhaltenwurden.

Die rohen Kristalle von Coriolin C wurden aus n-Hexan umkristallisiert, wodurch 722 mg Coriolin C (Schmelzpunkt* , 73 bis 75⁰C) erhalten wurden.

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Das im vorliegenden Beispiel erhaltene Coriolin C ist eine bekannte Substanz mit folgender Strukturformel?

OGO-GH-(CH₂) OH

Das 2'-Dehydrocoriolin C ist dagegen eine neue Verbindung mit folgenden Eigenschaftens Farbloses Pulver; Schmelzpunkt: 51 bis 55°G;[of] ψ :-19,0° (C = 1'#; Chloroform); löslich in Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Benzol und Tetrachlorkohlenstoff, jedoch wenig oder garnicht löslich in Wasser, η-Hexan und Petroläther. Die Elementaranalyse von 2'-Dehydrocoriolin C ergibt 65»69 °ß> Kohlenstoff und 7,67 $ Wasserstoff, woraus sich unter Berücksichtigung des masaenspektrometrisen ermittelten Molekulargewichts eine Summenformel von ^G23^H32°7 ^erS^ibt. Als Ergebnis einer Analyse des Kernmagnetresonanzspektrums wurde gefunden, daß das 2'-Dehydrocoriolin G folgende Strukturformel besitzt:

ti 0

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Bezugsbeiapiel 2

1 g 5-Dihydrocoriolin G wurde in 100 ml wasserfreiem Benzol gelöst und mit 8 g Mangandioxid unter Rühren gemischt und bei Zimmertemperatur 32 Stunden lang der Reaktion unterworfen. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und der Niederschlag mit wasserfreiem Benzol gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wodurch 610 mg festes Material erhalten wurden.

Dieses feste Material wurde in 3 ml Äthanol gelöst und in einer mit 25 ml Sephadex®LH 20 gefüllten Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit insgesamt 25 ml Äthanol eluiert. Die letzten 9 ml der eluierten flüssigen Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.

Der eingeengte Rückstand wurde in 1,2 ml Chloroform aufgelöst und in einer mit 15 ml Silicagel gefüllten Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit 30 ml einer 1 ^O Methanol-Chloroform-Lösungsmittelmischung eluiert, wodurch eine eluierte Fraktion von 2'-Dehydrocoriolin C erhalten wurde. Danach wurden durch Elution der Säulen mit 30 ml einer 2 "ß> Methanol-Chloroform-Lösungsmittelmischung eine eluierte Fraktion von Coriolin C erhalten. Beide Fraktionen wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wodurch 62 mg pulverförmiges 2'-Dehydrocoriolin G (Schmelzpunkt: 51 bis 55°C) und 180 mg rohe Kristalle von Coriolin C erhalten wurden.

Die letzteren wurden aus η-Hexan umkristallisiert, wodurch 132 mg Coriolin G-Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 73 bis 75⁰G erhalten wurden.

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Bezugsbeispiel 3

200 mg 5-Dihydrocoriolin ο wurden in einer Lösungsmischung von 1,2 ml wasserfreiem DirnethyIsulfoxid, 0,7 ml Benzol, 0,0?7 ml Pyridin und 0,038. ml Trifluoressigsäure gelöst und mit 300 mg Dicyclohexyl.carbodiimid unter Rühren gemischt. Die lösung wurde 1 Stunde lang bei normaler Temperatur stehengelassen und dann wer
Reaktion unterworfen.

gelassen und dann weiter 15 Stunden lang bei 3 bis 4 G der

Nach Beendigung der Reaktion wurden 12 ml Äther und 130 mg Oxalsäure (als eine 10 folge Lösung in Methanol) hinzugegeben und nach 30 Minuten 12 ml Wasser zugesetzt. Die resultierenden Niederschläge wurden abfiltriert und mit Äther gewaschen.

Eine ätherische Schicht wurde vom Filtrat abgetrennt und mit einer 5 ^igen wässrigen Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde durch Chromatographie an Silicagel in gleicher Weise wie beim Bezugsbeispiel 1 aufgetrennt, wodurch 42 mg Coriolin G-Kristalle (Schmelzpunkt; 73 Ws 75⁰O) und 13 mg pulverförmiges 2'-Dehydrocoriolin G (Schmelzpunkt; 51 bis 55⁰C) erhalten wurden.

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Claims (7)

Patentansprüche

1. 5-Dihydrocoriolin C der Formel:

OCO-CH-(GH₂ OH

2. Verfahren zur Herstellung von 5-Dihydrocoriolin C, dadurch gekennzeichnet, daß man zu den Baaidiomyceten gehörende Mikroorganismen, die zur Bildung von 5-Dihydrocoriolin C befähigt sind, in einem geeigneten Medium für die Bildung von 5-Dihydrocoriolin C unter aeroben Bedingungen kultiviert und das gebildete 5-Dihydrocoriolin C aus der resultierenden Kultur gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei 15 bis 30⁰C vorgenommen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung des 5-Dihydrocoriolins C aus der resultierenden Kultur unter Verwendung eines organischen Lösungsmittel8, das zur Auflösung von 5-Dihydrocoriolin C befähigt ist, vorgenommen wird.

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5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus, der zur Bildung von 5-Bihydrocoriolin C befähigt ist, Goriolus consors verwendet wird·

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus, der zur Bildung von 5-Dihydrocoriolin C befähigt ist, Coriolus consors ATGG 20 305 verwendet wird.

7. Verwendung von 5-Dihydrocoriolin G zur Herstellung von Goriolin C und 2'-Dehydrocorxolin C durch Oxidation.

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