DE2637545A1

DE2637545A1 - Antibiotica bm123 und ihre herstellung

Info

Publication number: DE2637545A1
Application number: DE19762637545
Authority: DE
Inventors: John Henry Edward James Martin; John Norman Porter; Homer David Tresner
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1975-08-21
Filing date: 1976-08-20
Publication date: 1977-03-03
Also published as: FR2321296A1; JPS5225089A; DE2637545B2; BE845336A; CA1087537A; DE2637545C3; JPS5442981B2; FR2321296B1; ZA764338B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue antibakterielle Mittel, die als BM1 23gamma... und BM123gamma„ bezeichnet werden, ihre Herstellung durch Fermentation, Verfahren zu ihrer Gewinnung und Anreicherung aus rohen Lösungen und Verfahren zu ihrer Reinigung. Im Rahmen der Erfindung liegen auch verdünnte Formen der antibakteriellen Mittel sowie Rohkonzentrate und reine Formen dieser· Mittel. Die Wirkungen der neuen antibakteriellen Mittel auf bestimmte Mikroorganismen sowie ihre chemischen und physikalischen Eigenschaften unterscheiden sich von früher beschriebenen antibakteriellen Mitteln.

Die antibakteriellen Mittel BMi23gamma₁ und BMi23gamma₂ sind Strukturisomere und können durch die folgenden Strukturformeln I bzw. II wiedergegeben werden:

09009/1224

CN

•"^

CM L) I

cn

CN

709809/12

CN to

Öl CN

■S-» O—

cn

709809/Ϊ2 2 4

Die neuen erfindungsgemäßen antibakteriellen Mittel sind organische Basen und können daher mit einer Reihe organischer oder anorganischer salzbildender Verbindungen Säureadditionssalze bilden. Die Herstellung solcher Salze erfolgt durch Vermischen der freien Base des jeweiligen antibakteriellen Mittels mit bis zu 3 Äquivalenten einer Säure, zweckmäßigerweise in einem neutralen Lösungsmittel. Für die Salzbildung geeignete Säuren sind beispielsweise Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, SuIfaminsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Essigsäure, Benzoesäure, Gluconsäure und Ascorbinsäure. Die Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen antibakteriellen Mittel sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, die sich im allgemeinen in Wasser, Methanol oder Äthanol verhältnismäßig gut lösen, in nichtpolaren Lösungsmitteln, wie Diäthylather, Benzol oder Toluol, jedoch verhältnismäßig unlöslich sind. Die freien Basen der antibakteriellen Mittel sind erfindungsgemäß als äquivalent zu ihren nichttoxischen Säureadditionssalzen anzusehen. BMi23gamma bezieht sich auf Mischungen von BM1 23gamma.. und BMi23gamma₂ in beliebigen Mengenverhältnissen.

Die Antibiotica mit den Bezeichnungen BM1 23gamma., und BM1 2 3gamma._? entstehen während der Züchtung eines neuen Stammes einer undeterminierten Species von Nocardia unter kontrollierten Bedingungen. Dieser neue Antibioticum produzierende Stamm wurde aus einer Probe Gartenerde isoliert, die bei Oceola, Iowa, gefunden wurde, und wird in der Kultursammlung der Lederle Laboratories Division, America Cyanamid Company, Pearl River, New York, als Kultur No, BM123 aufbewahrt. Eine lebende Kultur des neuen Mikroorganismus wurde bei dem Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, 111., hinterlegt und dort in die ständige Kulturensammlung aufgenommen. Sie ist von dort unter der Hinterlegungs-Nr. NRRL 564 6 frei erhältlich.

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Im folgenden wird der Mikroorganismus No.card.ia sp., NRRL. 5646, aufgrund der bei ihm festgestellter charakteristischer Merkmale allgemein beschrieben. Die Ermittlung der Kulturmerkmale, physiologischen Merkmale und morphologischen Merkmale des. Organismus erfolgte nach den Methoden, wie sie von Shirling und Gottlieb in Internat. Journ. of Syst. Bacterial. Bd. 16, S. 313-340 (1966) näher beschrieben sind. Die chemische Zusammensetzung der Kultur wurde nach den von Lechevalier et al. in Advan. Appl. Microbiol. Bd. 14, S. 47-72 (1971) beschriebenen Verfahren bestimmt. Die unterstrichenen beschreibenden Farbangaben und die Farbplättchen-Bezeichnungen wurden nach Color Harmony Manual, 3, Auflage (1948), Container Corp. of America, Chicago, 111., ermittelt. Die Beschreibungseinzelheiten finden sich in den folgenden Tabelle I bis V.

Stärke des Wachstums

Mäßiges Wachstum auf Hefeextrakt-, Asparagin-Dextrose-, Benedict-, Bennett-, Kartoffeldextrose- und Weinstein-Agar, leichtes Wachstum auf Hickey- und Tresner-, Tomatenpasten-, Hafermehl- und Pablum-Agar, Spurenwachstum auf anorganische Salze-Stärke-, Kuster-Haferflocken-, Czapek-Lösungs- und Reis-Agar.

Luftmycel ·

Das Luftmyeel ist, falls vorhanden, weißlich, wird nur auf Hefeextrakt-, Asparagin-Dextrose-, Benedict-, Bennett- sowie Kartoffeldextrose-Agar gebildet.

Lösliche Pigmente

Es werden keine lösliche Pigmente produziert.

Unterseitenfarbe

Farblos bis gelbliche Schattierungen.

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Verschiedene physiologische Reaktionen

Keine Ge latinever fluss igung, Nitrate v/erden innerhalb von 7 Tagen zu Nitriten reduziert, auf Pepton-Eisen-Agar werden keine melanoiden Pigmente gebildet, keine Peptonisierung oder Gerinnungsbildung in Purpurmilch, Natriumchloridtoleranz in Hefeextrakt-Agar

^4 %, jedoch <7 %_f optimales Wachstum bei einer
Temperatur von 32 °C; Kohlenstoffverwertung nach
J. Bacteriol. Bd. 56, S. 107-114 (1948): gute Verwertung von Glycerin, Salicin, d-Trehalose und Dextrose, mäßige Verwertung von Isoinosit und schlechte
bis keine Verwertung von d-Fructose, Maltose, Adonit, 1-Arabinose, Lactose, d-Mannit, d-Melibiose, d-Raffinose, 1-Rhamnose, Saccharose und d-Xylose.

Chemische Zusammensetzung

Dar Organismus gehört zum Zellwandtyp IV, d. h. er
enthält meso-2,6-Diaminopimelinsäure und hat ein Gesamtzellenzuckerspektrum vom Typ A, was besagt, daß
er Arabinose und Galactose enthält. Methylierte Ganzzellenextrakte zeigen im Gaschromatogramm Fettsäurespektren, die den von Nocardia asteroides ATCC 3308
gebildeten ähnlich sind.

Mikromorphologie

Das Luftmycel wächst aus dem Substratmycel in Form schwach verzweigter langer gewundener Elemente heraus, die gewöhnlich in länglichen einfachen Spiralen enden. Die gewundenen Elemente sind unregelmäßig in kurze elliptische bis zylindrische Sektionen (Sporen?) segmentiert, die sich leicht zergliedern. Die Spiralendbereiche sind weniger deutlich segmentiert. Die Segmente haben im allgemeinen Abmessungen von 0,3 bis 1,7 ,um χ 0,3 bis 0,5 »um, mit einem Mittelwert von 0,4 .um χ 1,2 .um.

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- ν - 26375Λ5

Diagnose

Die morphologischen Charakteristiken der Kultur BM123 sind wegen der schlechten Entwicklung von Luftmycel auf den meisten Medien nur schwierig zu beobachten und zu interpretieren. Der chemischen Analyse zur Bestimmung der allgemeinen Beziehungen des Organismus kommt daher notwendigerweise eine beträchtliche Bedeutung zu. Auf Basis des von Lechevalier et al. vorgeschlagenen Systems enthält die Kultur BM123 meso-2,6-Diaminopimelinsäure in ihren Gesamtzellen, und bei der Zuckeranalyse ergibt sich das Vorhandensein von Arabinose und Galactose. Die Kultur gehört daher dem Zellwandtyp IV an. Ein Vergleich des GasChromatographenspektrums der Kultur BM123 mit demjenigen von Nocardia asteroides ATCC 3308 zeigt, daß sich beide beachtlich ähneln. Andere Charakteristiken der Kultur BM123, die mit dem Nocardia-Konzept übereinstimmen, sind ihr fragmentierendes Luftwachstum auf einigen Medien und das totale Fehlen von Luftwachstum auf den meisten Medien. Wegen des Fehlens adäquater Kriterien für die Charakterisierung von Nocardia hinsichtlich der Species erfolgte auch keine derartige Bestimmung. Die Kultur BM123 wird daher als eine nicht bestimmte Species von Nocardia angesehen, bis sich eine derartige Diagnose stellen läßt.

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Tabelle Kulturcharakteristiken von Nocardla sp. NRRL 5646

Inkubation: 14 Tage Temperatur: 32 C

	Medium	Ausmaß des Wachstums
7 0 9 8 0	Hefe-Extrakt-Agar	mittelmäßig
1	Hickey- und Tresner- Agar	gering
Ni IO JP-	Asparagin-Dextrose- Ag ar	mittelmäßig
	Benedict-Agar	mittelmäßig
	Bennett-Agar	mittelmäßig
	Anorganischer SaIz- Stärke-Agar	Spur

Luftmycel und/oder Sporen

Luftmycel weißlich, schwach

kein Luftmycel

Spur eines weißlichen Luftmycels

Luftmycel weißlich, schwach

Spur eines weißlichen Luftmycels

kein Luftmycel

lösliches Pigment	Unterseiten farbe
keines	senffarben
	(3 Ie)
keines	farblos bis gelblich- grün
keines	amberfarben
	(3 Ic)
keines	durchsichtig
	lohfarben
	(4 gc)
keines	camelfarben
	(3 ie)
keines	farblos

Bemerkungen

dunkle Zonen im Substratmycel; Coremiebildung auf der Myceloberfläche

die peripheren Zonen der <y Kolonien werden olivgrün

Oberfläche leicht gerunzelt

auf der Myceloberfläche reichlich Coremiebildung

Oberfläche leicht gerunzelt

to

CD OO

cn

Tabelle

(Fortsetzung)

Kulturcharakteristiken von Nocardia sp. NRRL 5646

Inkubation: 14 Tage

	Medium	Ausmaß des Wachstums
β ζ> τ* -Jb.	Kuster-Haferflocken- Agar Czapek-Lösungs-Agar	Spur Spur
If--»	Kartoffel-Dextrose- Agar	mittelmäßig
	Tomatenpaste-Hafer- mehl-Agar	gering
	Pablum-Agar	gering
	Reis-Agar	Spur
	Weinstein-Agar	mittelmäßig

Luftmycel und/oder Sporen

kein Luftmycel kein Luftmycel

Luftmycel weißlich, schwach

kein Luftmycel kein Luftmycel kein Luftmycel kein Luftmycel

Temperatür: 32 C

lösliches	Unterseiten
Pigment	farbe
keines	farblos
keines	farblos
keines	camelfarben
	(3 ie)
keines	farblos
keines	• farblos
keines	farblos
keines	farblos
	bis gelblich

Bemerkungen Tabelle

II

Mikromorphologie von Nocardia sp. NRRL 5646

Medium

Hefeextrakt-Agar

Luftmycel und/oder Sporiferen-Strukturen

Das Luftmycel tritt aus dem Trägermycel in Form schwach verzweigter gewundener Elemente aus, die gewöhnlich in länglichen einfachen Spiralen enden. Die gewundenen Elemente sind unregelmäßig in kurze Sektionen (Sporen?) segmentiert, die leicht disartikulieren. Die Spiralendbereiche sind weniger deutlich segmentiert. Die Segmente haben im allgemeinen die Abmessungen 0,8 bis 1,7 ,um χ 0,3 bis 0,5 ,um, mit einem Mittelwert von 0,4 .um χ 1,2 ,um.

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Tabelle III Verschiedene physiologische Reaktionen von Nocardia sp. NRRL 5646

Medium

	Gelatine	Nitrat
-α	Gelatine
ο
co	Organische	Nitrat
OO	brühe
ο
CD	Organische
	brühe

Pepton-Eisen-Agar

Purpurmilch

Hefeextrakt-Agar

plus (4, 7, 10 und
13 %) NaCl

Inkubationszeit

7	Tage
14	Tage
7	Tage

14 Tage

24 bis 48 Stunden 7 Tage 7 Tage Ausmaß des Wachstums gering gut gut

gut

mittelmäßig

Physiologische Reaktion keine Verflüssigung keine Verflüssigung

Nitrate werden zu Nitriten reduziert

Nitrate werden zu Nitrilen reduziert

keine Reduzierung von Melaninpigmenten

keine Peptonisierung oder Gerinnung

NaCl Toleranz <	^ 4 %	cn
jedoch < 7 %		OJ
		cn
		cn

Tabelle IV

Kohlenstoffverwertungsverhalten von Nocardia sp. MRRL 5646 Inkubation; 10 Tage Temperatur: 32 ⁰C

Kohlenstoffquelle Verwertung

Adonit ■ 0

1-Arabinose 0

Glycerin 3

d-Fructose 1

i-Inosit 2

Lactose 0

d-Mannit 0

Salicin 2

d-Melibiose 0

d-Raffinose 0

Rhannose 0

Maltose 1

Saccharose 0

d-Trehalose 3

d-Xylose 0

Dextrose 3

Negative Kontrolle 0

3 - Gute Verwertung 1 - Schlechte Verwertung

2 - mäßige Verwertung 0 - keine Verwertung

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Tabelle V Chemische Zusammensetzung von Nocardia sp. HRRL 5646

Zellwandtyp Hauptbestandteile

Typ IV meso-DAP,

Arabinose,
Galactose

Die Produktion dieser neuen antibakteriellen Mittel ist nicht
auf diesen besonderen Organismus oder die Organismen beschränkt, die völlig dem oben beschriebenen Wachstumsverhalten und den angeführten mikroskopischen Eigenschaften genügen, welche lediglich zu Illustrationszwecken angegeben sind» Es werden aus diesem Organismus daher auch durch verschiedene Mittel Mutanten gebildet, wie beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost, Actinophagen oder dergleichen. Eine lebende Kultur eines typischen derartigen Mutantenstammes wurde bei
Northern Utilization Research and Development Division, United
States Department of Agriculture, Peoria, 111., hinterlegt und
dort in die ständige Sammlung aufgenommen, von wo sie unter der
Nummer NRRL 8050 bezogen werden kann. Obwohl die Kulturmerkmale, die physiologischen Merkmale und die morphologischen Merkmale
von NRRL 8050 praktisch die gleichen sind wie diejenigen von
NRRL 5646, produziert der erstere während einer aeroben Fermentation größere Mengen an BM123gamma. Der Organismus NRRL 8050 unterscheidet sich ferner vom Stammorganismus NRRL 5646 durch
folgende Merkmale:

(a) er reduziert Nitrate langsamer zu Nitriten und

(b) er bildet auf Bennett- sovrLe auf Hefeextrakt-Agar ein
rosenholz-lohfarbenes Mycelpigment.

Die antibakteriellen Mittel werden unter Verwendung verschiedener grampositiver und gramnegativer Bakterien sowie von M. smegmatis nach der Standard-Agarverdünnungsmethode in vitro miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI als minimale Inhibierungskonzentrationen (mcg/ml) angegeben. Gentamicinsulfat wird zu Vergleichszwecken mitgeprüft.

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Tabelle

VI

Minimale Inhibierungskonzentration (mcg/ml)

C3 CO OO O CO

Organismus

Mycobacterium smegmatis ATCC Staphylococcus aureus Rose ATCC 14154 Staphylococcus aureus Smith ATCC 13709 Staphylococcus aureus 4O5OB122-3 Bacillus cereus ATCC 9634 Bacillus globigii Bacillus subtilis No. 17 Stansly R-78 Bacillus subtilis No. 18 Stansly R-76 Corynebacterium xerosis NRRL B-1397 Streptococcus faecalis GK Sarcina lutea ATCC 9341 Enterobacter aerogenes Escherichia coli U-311

BMI 23gamma

0,25

0,5

0,25

BM^Sgamrr^a 0,1 0,25 0,1 0,25 0,25 0,1 0,1 0,25 0,25 2,5 0,5 0,1 0,1

BM123gamma₂

0,25

0,5

0,1

0,25

2,5

0,1

Gentamicinsulfat

0,1

0,05

0,25

0,025

0,1

0,025

2,5

0,25

0,1

0,05

- 15 -

Tabelle VI (Fortsetzung)

Minimale Inhibierungskonzentration (mcg/ml)

Organismus

Escherichia coli No. Klebsiella pneumoniae AD Proteus inirabilis ATCC 4671 Proteus morganii ATCC 8019 Proteus vulgaris ATCC 9484 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Pseudomonas aeruginosa 1A7 Salmonella gallinarum Salmonella typhosa ATCC 6539 Shigella shiga

BMi23gamma	BMi23gamma,.	BMi23gamma₂	Gentamicin- sulfat	ro CD cn -P- crt
0,25	0,05	0,1	0,05
0,1	0,05	0,05	0,05
0,25	0,25	0,25	0,25
0,25	0,1	0,1	0,1
0,25	0,1	o,i	0,1
5	2,5	5	2,5
10	5	ro	5
0,1	0,1	0,1	0,05
0,1 0,25	0,05 0,25	0,05 0,25	0,1 0,25

- 16 -

Das antibakterielle Mittel BM123gamma ist auch in vivo gegen eine Vielzahl der verschiedensten Organismen wirksam. Dieser neue antibakterielle Stoff ist deshalb als therapeutisches Mittel zur Behandlung von bakteriellen Infektionen von Säugern brauchbar. Es kann damit gerechnet werden, daß dieses neue antibakterielle Mittel mit Vorteil zur Behandlung oder Bekämpfung von bakteriellen Infektionen durch parenterale Verabreichung verwendet v/erden kann.

Die guten Eigenschaften dieses neuen antibakteriellen Mittels werden durch seine Fähigkeit, letale systemische Infektionen von Mäusen zu bekämpfen, nachgewiesen» Die neue Substanz zeigt bei Mäusen eine hohe in-vivo-antibakterielle Aktivität gegen Proteus mirabilis ATCC 4671, Klebsiella pneumoniae AD und Escherichia coli US311, wenn sie in einer subkutanen Einzeldosis an Gruppen von Carworth Farms CF-1-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g verabreicht v/erden, die intraperetoneal mit einer letalen Dosis dieser Bakterien in Trypticase-Sojabrühe TSP mit einer Verdünnung von 10 ' , 1Q~~ bzw. 10 infiziert worden sind, wobei eine 5-stündige TSP-Blutkultur verwendet wird.

In der folgenden Tabelle VII wird die antibakterielle Aktivität von BMi23gamma gegen diese drei Bakterien in vivo veranschaulicht.

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Tabelle

subcutane Einzeldosis, mg/kg

4 2 1 VII

Überlebende/Gesamtzahl der Prüfmäuse, 7 Tage nach der Infektion

BMi23gamma Proteus mirabilis

2O/2O 9/25 2/20

infizierte unbehandelte Kontrollen

4 2 1 0,5 68/70 Mäuse starben innerhalb eines Tages nach Infektion

Klebsiella pneumoniae AD 5/5 8/10 4/10 0/10

infizierte unbehandelte Kontrollen

subcutane Einzel dosis, mg/kg
4
2
1
0\|
0,
0,



r5
r25
,12

20/20 Mäuse starben innerhalb 2 Tagen nach Infektion

Überlebende/Gesamtzahl der Prüfmäuse, 7 Tage nach der Infektion

Escherichia coli 10/10 9/1O 5/1O 4/10 3/10 1/5

infizierte unbehandelt'e Kontrollen 18/20 Mäuse starben innerhalb 3 Tagen nach Infektion

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Die Züchtung von Nocardia sp. NRRL 8050 kann in einer großen Zahl verschiedener flüssiger Kulturmedien durchgeführt werden. Medien, die sich für die Erzeugung dieses neuen antibakteriellen Mittels eignen, enthalten eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, zum Beispiel Stärke, Zucker, Melasse oder Glycerin, eine assimilierbare Stickstoffquelle, z.B. Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren oder Maisquellwasser sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Sulfat, Carbonat, Phosphat und Chlorid. Spurenelemente wie Bor, Molybdän und Kupfer liegen als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums vor. Die Belüftung in Tanks und Flaschen erfolgt durch Durchleiten von steriler Luft durch das gärende Medium oder Aufblasen von steriler Luft auf die Oberfläche des Mediums. Außerdem wird in Tanks durch mechanische Mittel für Bewegung gesorgt. Je nach Bedarf kann ein Entschäumer wie Specköl (Hodag (R), FD 82) zugesetzt werden.

Inokulumherstellung für BM123gamma

Ein SchütteIkolbeninokulum von Nocardia sp. NRRL 8050 wird durch Beimpfen von 100 ml sterilem flüssigem Medium in 500 ml-Kolben mit abgeschabten oder abgewaschenen Sporen einer Schrägagerkultur hergestellt. Ein geeignetes Medium ist beispielsweise folgendes:

Bac to-trypt on	5 mg
Hefeextrakt	5 g
Rindfleischextrakt	3 g
Glucose	10 g
Wasser auf	1000 ml

Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 bis 29 ⁰C, vorzugsweise 28 C, unter kräftiger Bewegung auf einer Drehschütte !vorrichtung 30 bis' 48 Stunden inkubiert. Die Inokula werden dann in sterile Kulturrohre mit Schraubverschlüssen überführt

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und unter -18 C gelagert. Diese Reihe von vegetativem Inokulum wird anstelle von Schrägagarabschabungen zur Beimpfung weiterer Schüttelkolben zur Herstellung dieses Inokulums der ersten Stufe verwendet.

Diese Inokula der ersten Stufe werden dann zum Beimpfen von 12 Liter-Ansätzen des gleichen Mediums in gläsernen Ferraentatonsgefäßen mit einem Fassungsvermögen von 20 Liter verwendet. Die Maische wird mit steriler Luft behandelt, während die Züchtung 30 bis 48 Stunden fortgesetzt wird«

Die 12-Liter-Ansätze der Inokula der zweiten Stufe werden zum Beimpfen von Fermentationstanks verwendet, die 300 Liter des folgenden sterilen flüssigen Mediums enthalten, wodurch Inokulum der dritten und letzten Stufe erzeugt wird:

lösliche Fleischstoffe Ammoniumsulfat

Kaliumphosphat, zweibasisch Calciumcarbonat

Magnesiumsulfat-heptahydrat Glucose

Wasser auf

Die Glucose wird gesondert sterilisiert.

Das Inokulum der dritten Stufe wird mit 0,4 bis 0,8 Liter steriler Luft je Liter Brühe und Minute belüftet, und die Gärmischung wird mit einem mit 150 bis 300 U/Min, betriebenen Rührer in Bewegung gehalten. Die Temperatur wird bei 2 5 bis 29 °C, gewöhnlich 2 8 C, gehalten. Die Züchtung wird 48 bis 72 Stunden fortgesetzt, wonach das Inokulum zum Beimpfen einer 3000 Liter Tankfermentation verwendet wird.

15	g
3	g
3	g
1	g
1,	5 g
10	g
1000	ml

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Tankfermentation zur Erzeugung von BM123gamma

Zur Erzeugung von BM123gamma in Fermentationstanks wird in der Regel folgendes Medium verwendet:

lösliche Fleischstoffe . 30 g

Ammoniumsulfat 6g

Kaliumphosphat, zweibasisch 6 g

Calciumcarbonat 2g

Magnesiumsulfat-heptahydrat 3g

Glucose 20 g

Wasser auf 1000 ml

Die Glucose wird gesondert sterilisiert.

Jeder Tank wird mit 5 bis 10 %■ des wie oben beschrieben hergestellten Inokulums der dritten Stufe beimpft. Die Fermentationsmaische wird bei einer Temperatur von 25 bis 28 C, gewöhnlich bei 26 °C, gehalten. Die Belüftung wird durch Zufuhr von 0,3 bis 0,5 Liter sterile Luft je Liter Maische und Minute bewirkt, und die Gärmischung wird durch einen mit 70 bis 100 U/Min, betriebenen Rührer bewegt. Die Fermentation wird gewöhnlich 65 bis 90 Stunden fortgesetzt, wonach die Maische aufgearbeitet wird.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1
Bereitung des Inokulums für BMi23gamma

Ein beispielhaftes Medium, das zur Züchtung des Inokulums der ersten und zweiten Stufe verwendet wird, wird aus folgenden Bestandteilen hergestellt:

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Bacto-trypton 5 g

Hefeextrakt 5 g

Rindfleischextrakt .3 g

Glucose 1Og

Wasser auf 1OOO ml

Zwei 500 ml-Kolben/ die jeweils 100 ml des oben angegebenen sterilen Mediums enthalten , v/erden mit je 5 ml eines gefrorenen vegetativen Inokulums von Nocardia sp* NRRL 8050 beimpft. Die Kolben werden auf eine DrehschütteIvorrichtung aufgebracht und 48 Stunden bei 28 ⁰C kräftig bewegt. Das so erhaltene Kolbeninokulum wird in ein Glasfermentationsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 19 Litern überführt, das 12 Liter des oben beschriebenen sterilen Mediums enthält. Die Maische wird mit steriler Luft belüftet, während die Züchtung etwa 48 Stunden geführt wird. Danach werden die Gefäßinhalte zum Besamen eines 380 Liter-Fermentationstanks verwendet _t der 300 Liter des folgenden sterilen flüssigen Mediums enthält:

loslxche Fleischstoffe	15	g
Ammoniumsulfat	3	g
Kaliumphosphat, zweibasisch	3	g
Calciumcarbonat	1	g
Magnes iumsulfat-heptahydrat	1,
Glucose	10	g
Wasser auf	1000	ml

Die Glucose wird gesondert sterilisiert.

Die dritte Stufe der Inokulummaische wird mit steriler Luft, die in einem Verhältnis von 0,4 Liter Luft je Liter Maische und Minute in das Fermentationsgefäß eingeführt wird, belüftet. Bewegung wird durch einen mit 2 40 Umdrehungen pro Minute betriebenen Rührer erzielt. Die Maische wird bei 28 ⁰C gehalten, und

(P) als Entschäumungsmittel wird Hodag FD82 verwendet. Nach

48-stündigem Wachstum wird die Inokulummaische zum Besamen einer 3000 Liter-Fermentation verwendet.

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Beispiel 2

Fermentation unter Verwendung von Nocardia sp. NRFlL 8050 - zur Herstellung von BM123gamma

Ein Fermentationsmedium wird aus den folgenden Bestandteilen hergestellt:

lösliche Fleischstoffe 30 g

Ammoniumsulfat 6g

Kaliumphosphat, zweibasisch 6g

Calciumcarbonat 2g

Magnesiumsulfat-heptahydrat 3 g

Glucose 20 g Wasser auf . 1000 ml

Die Glucose wird gesondert sterilisiert.

Das Fermentationsmedium wird 60 Minuten bei 120 C mit Dampf

von einem Druck von 1,4 kg/cm sterilisiert. Danach liegt der pH-Wert des Mediums bei 6,9. 3000 Liter des sterilen Mediums in einem Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von 4000 Liter werden mit 300 Liter des in Beispiel 1 beschriebenen Inokulums beimpft, und die Fermentation wird unter

(R)
Verwendung von Hodag FD82 als Entschäumungsmittel bei

26 °C geführt. Das Belüftungsverhältnis liegt bei 0,35 Liter sterile Luft je Liter Maische und Minute. Die Maische wird mit Hilfe eines mit 70 bis 72 U/Min, angetriebenen Rührers in Bewegung gehalten. Nach einer Fermentationsdauer von 67 Stunden wird die Maische aufgearbeitet.

Beispiels Isolierung von BM123gamma

3000 Liter der nach Beispiel 2 erzeugten Fermentationsmaische vom .pH 4,3 werden mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0

709809/1 224 "

-2A-

eingestellt und unter Verwendung von 5-prozentiger Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert. Der Filterrückstand wird mit etwa 100 Liter Wasser gewaschen und verworfen. Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat wird durch drei parallel angeordnete Säulen aus rostfreiem Stahl mit den Abmessungen 21 χ 122 cm, deren jede 15 Liter CM Sephadex^(R) C-25 /Na*/-Harz enthält, von unten nach oben gepumpt. Die beladenen Säulen werden mit insgesamt etwa 390 Liter Wasser gewaschen und dann mit 200 Liter 1-prozentigem wässrigen Natriumchlorid und danach mit 560 Liter 5-prozentigem wässrigem Natriumchlorid entwickelt. Das mit 5-prozentigem wässrigem Natriumchlorid erhaltene Eluat wird durch Diatomeenerde filtriert, und das klare Filtrat wird durch eine Glassäule mit den Abmessungen 22,9 χ 152 cm geleitet, die 25 Liter granulierte Aktiv-

(R)
kohle (Darco ) mit einer Teilchengröße von 0,8 bis 0,4 mm (20 - 40 mesh) enthält. Die beladene Säule wird mit 120 Liter Wasser gewaschen und dann mit 120 Liter 15-prozentigem wässrigem Methanol und danach mit 340 Liter 50-prozentigem wässrigem Methanol und schließlich mit 120 Liter 50-prozentigem wässrigem Aceton entwickelt. Das mit 50-prozentigem

(R) wässrigem Methanol erhaltene Eluat wird mit Amberlite -IR-45 (OH )-Harz von pH 4,65 auf 6,0 gebracht. Das Harz wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum auf etwa 6,3 Liter eingeengt und lyophylisiert, wodurch 213 g Substanz erhalten werden, die hauptsächlich aus BMi23gamma besteht. Das mit 50-pro-

(R) zentigem wässrigem Aceton erhaltene Eluat wird mit Amberlite IR-45(OH )-Harz von pH 4,0 auf 6 _f 0 eingestellt. Das Harz wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum auf etwa 1,5 Liter eingeengt. Durch Lyophylisieren des Konzentrats werden 56 g verunreinigtes BMi23gamma erhalten.

Beispiel 4 Weitere Reinigung von BMi23gamma

(R) + Eine Aufschlämmung von CM Sephadex C-25 /NH._/ in 2-prozentigem wässrigem Ammoniumchlorid wird in eine Glassäule von 2,6 cm

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Durchmesser bis zu einer Harzhöhe von etwa 62 cm gegossen» Der Überschuß an 2-prozentiger wässriger Ämmonitimchloridlösung wird ablaufen gelassen, und 5,0 g des wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellten BM123gaminä werden in etwa 1O ml 2-prozentigem wässrigem Ammoniumchlorid gelöst und auf die Säule aufgegeben. Die Säule wird dann mit jeweils 6 Liter 2- und 4-prozentigem wässrigem Ammoniumchlorid eluiert. Fraktionen von jeweils etwa 75 ml werden automatisch alle 15 Minuten aufgefangen. Durch Überwachung des Ausflusses aus der Säule im Ultraviolettlicht und durch Bioautographie von getränkten Papierscheiben auf großen Agarplatten, die mit Klebsieila pneumoniae, Stamm AD, besamt sind, wird das Antibioticum BM123gamma festgestellt. Der größte Teil des BM123gamma befindet sich in den Fraktionen 71 bis 107.

(R) 130 ml granulierte Aktivkohle (Darco , 0,4 bis 0,8 mm) werden in Wasser suspendiert, in eine Glassäule gegeben und absitzen gelassen, und der Wasserüberschuß wird abtropfen gelassen. Die Fraktionen 84 bis 96 der vorstehend beschriebenen Chromatographie mit CM Sephadex werden vereinigt und durch die Säule mit Kohlegranulat geleitet. Die beladene Säule wird mit 600 ml Wasser gewaschen und mit 1 Liter 20-prozentigem wässrigem Methanol und anschließend mit 1 Liter 50-prozentigem wässrigem Aceton entwickelt. Diese Eluate, die beide BMi23gamma enthalten, werden im Vakuum bis zum Verbleib von wässrigen Phasen konzentriert und dann lyophylisiert, wodurch insgesamt 886 mg BMi23gamma als Hydrochlorid erhalten werden. Durch Wiederholung der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise wird eine Mikroanalysenprobe erhalten.

Das Antibioticum BMi23gamma hat keinen definierten Schmelzpunkt; seine allmähliche Zersetzung beginnt bei etwa 2OO ⁰C. Die Mikroanalyse einer Probe, die 24 Stunden bei 22 ⁰C und einer relativen Feuchtigkeit von 23 % gehalten wird, ergibt folgende Werte: C 39,44 %s H 6,10%; N 16,19 %;"C1 (ionisch). 11,54 %; Trocknungsverlust 8,19 %-, In Wasser ergibt BM123gamma ein UV-Absorptionsmaximum bei 286 nm, E ^- = 250. Die Lage dieses Maximums

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verändert: sich mir dem pH-Wert nicht. BM123gamma hat eine spezifische Drehung von /alpha/ = + 71 (c = 0,97 in Wasser).

Das Antibioticum BMi23gamma zeigt charakteristische Absorptionen im infraroten Bereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen: 770, 83O, 87O, 93O, 980, 1035, 1105, 1175, 1225, 1300, 1340, 1370, 1460, 151O, 1555, 1605, 1660, 1740, 2950 und 3350 cm"¹. Ein Infrarotabsorptionsspektrum von BM123gamma in einem KBr-Preßling ist in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen wiedergegeben.

Beispiel 5 Isolierung, von BM123gamma..

(R) + Eine Aufschlämmung von CM Sepahdex C-25 /Na_/ in 2-prozentigem wässrigem Natriumchlorid wird bis zu einer Harzhöhe von etwa 70 cm in eine Glassäule vom Durchmesser 2,6 cm gegossen. Der Überschuß an 2-prozentigein wässrigem Natriumchlorid wird abgezogen und 4,11 g einer Probe, die hauptsächlich BM^Sgamma^ neben etwas BMi23gamma₂ und anderen Verunreinigungen enthält und wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt war, werden als Lösungen in etwa 1O ml 2—prozentigem wässrigem Natriumchlorid auf die Säule aufgegeben. Die Säule wird mit je 4 Liter 2-prozentiger bzw. 4-prozentiger wässriger Natriumchloridlösung eluiert. Fraktionen von. etwa 75 ml werden alle 15 Minuten automatisch gesammelt. Durch Überwachung des Säulenabflusses im Ultraviolettlicht und durch Bioautographie getränkter Papierscheiben auf großen Agarplatten, die mit Klebsielle pneumoniae, Stamm AD, besamt sind_r wird festgestellt, daß sich der Hauptteil des BM123ganH!!a in den Fraktionen 64 bis 90 befindet, wobei die ersten Fraktionen (64 bis 80) ein Gemisch aus BMi23gamma.. und BMi23gamiaa₂ und die späteren Fraktionen (81 bis 90) praktisch reines BM123gamma.. enthalten.

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(R) 100 ml Aktivkohle in Granulatform (Darco , 0,4 bis 0,8 ram) werden in Wasser suspendiert, in eine Glassäule gegeben und absitzen gelassen, und das überschüssige Wasser läßt man ablaufen. Die Fraktionen 81 bis 90 der vorstehend beschriebenen Chromatographie werden vereinigt und durch die Säule mit Kohlegranulat geleitet. Die beladene Säule wird mit 500 ml Wasser gewaschen und dann mit 500 ml 10-prozentigem wässrigem Methanol und anschließend mit 1 Liter 50-prozentigem wässrigem Methanol entwickelt. Das mit 50-prozentigem wässrigem Methanol erhaltene Eluat, das den Hauptteil des BMi23gamma.. enthält, wird mit Amberlite^iRi IR-45 (0H~")~Harz von pH 5,9 auf 6,0 eingestellt. Nach Abfiltrieren des Harzes wird das Filtrat im Vakuum bis zu einer wässrigen Phase eingeengt, die lyophylisiert wird. Man erhält so 294 mg amorphes BM 123gamma₁ als Hydrochlorid.

Das Antibioticum BM123gamma.. hat keinen definierten Schmelzpunkt, aber seine allmähliche Zersetzung beginnt bei etwa 200 °C. Die Mikroanalyse einer Probe, die 24 Stunden bei 21 ⁰C und 6O % relativer Feuchtigkeit gehalten wurde, ergibt folgende Werte: C 37,84 %; H 5,73 %; N 15,58 %; Cl (ionisch) 10,01 %; Trocknungsverlust 10,45 %. In Methanol zeigt BMi23gamma₁ ein tFV-Absorptionsmaximum bei 286 nm,

E„'° =225. Die Lage dieses Maximums ändert sich mit dem I cm

pH-Wert nicht. BM123gamma_J. hat eine spezifische Drehung von + 55° (c= O,8O3 in Wasser).

Das Antibioticum BM^Sgamma- zeigt charakteristische Absorptionen im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen: 770, 830, 870, 930, 980, 1045, 1080, 1110, 1125, 1175, 1225, 1305, 1345, 1380, 1465, 1515, 1560, 1605, 1660, 1730, 2950 und 335O cm . Ein Infrarotabsorptionsspektrum von BM123gamma₁ in einem KBr-Preßling ist in Figur 2 der beigefügten Zeichnungen wiedergegeben. Ein magnetisches Protonresonanzspektrum von BMi23gamma.., das mit einer D₂0-Lösung in einem 100 Megahertz-Spektrometer bestimmt wurde, ist in Figur der beigefügten Zeichnungen wiedergegeben.

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Beispiel 6 Isolierung von BM123gamma₂

25 g einer hauptsächlich BMi23gainma₂ enthaltenden, wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellten Probe wird in etwa 120 ml 2-prozentigem wässrigem Natriumchlorid gelöst und auf eine Säu-Ie aufgegeben, die 1800 ml CM Sephadex^ ' C-25 /Na_/ in 2-prozentigem wässrigem Natriumchlorid enthält. Die Säule wird mit je 20 Liter 2-prozentiger bzw, 4-prozentiger wässriger Natriumchloridlösung eluiert« Die ersten 12 Liter Eluat werden in einem großen Gefäß gesammelt und verworfen. Danach werden Fraktionen von jeweils etwa 800 ml alle 40 Minuten automatisch gesammelt. Durch überwachung des Säulenabflusses im Ultraviolettlicht wird festgestellt, daß sich der Hauptteil des BM123gamma in den Fraktionen 7 bis 18 befindet, wobei die ersten Fraktionen (7 bis 15) praktisch reines BM123gamma._? und die späteren Fraktionen (16 bis 18) ein Gemisch aus BMi23gamma.. und BMi23gamma₂ enthalten.

(R)

600 ml Aktivkohle in Granulatform (Darco , 0,4 bis 0,8 mm) werden in Wasser suspendiert, in eine Glassäule gegeben und absitzen gelassen, und das überschüssige Wasser läßt man ablaufen. Die Fraktionen 7 bis 15 der vorstehend beschriebenen Chromatographie werden vereinigt und durch die Säule mit Kohlegranulat geleitet. Die beladene Säule wird mit 3 Liter Wasser gewaschen und dann mit 3 Liter 10-prozentigem wässrigem Methanol und anschließend mit 6 Liter.50-prozentigem wässrigem Methanol entwickelt. Das mit 10-prozentigem wässrigem Methanol

(R) —

erhaltene Eluat wird mit Äraberlite^v ' IR-45 (OH )-Harz von

pH 5,8 auf 6,0 eingestellt. Nach Abfiltrieren des Harzes wird das Filtrat im Vakuum bis zu einer wässrigen Phase eingeengt, die lyophilisiert wird. Man erhält so 595 mg weißes amorphes

BMi23gamma~ als Hydrochlorid. Das Eluat mit 50-prozentigem

(R) wässrigem Methanol wird mit Amberlite IR-45 (OH )-Harz

von pH 4,6 auf 6,1 eingestellt. Nach Abfiltrieren des Harzes wird das Filtrat im Vakuum bis auf eine wässrige Phase eingeengt und lyophilisiert. Man erhält so 3,645 g etwas weniger reines weißes amorphes BM123gamitia₂ als Hydrochlorid.

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Das Antibioticum BM123 gamma₂ hat keinen definierten Schmelzpunkt, aber seine allmähliche Zersetzung beginnt bei etwa 200 ⁰C. Die Mikroanalyse einer Probe, die 24 Stunden bei 21 °C und 60 % relativer Feuchtigkeit gehalten wurde, ergibt folgende Werte: C 36,14%; H 5,67%; N 15,1%; Cl (ionisch) 11,11 %; Trocknungsverlust 10,87 %. Im Methanol

zeigt BMi23gamma₉ ein ÜV-Absorptionsmaximum bei 286 nm,

1 % ^E1cm ⁼ 220. Die Lage dieses Maximums ändert sich mit dem

pH-Wert nicht. BM123gamma₂ hat eine spezifische Drehung von + 60° (C = 0,851 in Wasser).

Das Antibioticum BM123gamma₂ zeigt charakteristische Absorptionen im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen: 770, 830, 870, 950, 980, 1035, 11'1O, 1175, 1225, 1285, 1345, 1380, 1470, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755, 2950 und 3350 cm . Ein Infrarotabsorptionsspektrum von BMi23gamma~ in einem KBr-Preßling ist in Figur 3 der beigefügten Zeichnungen wiedergegeben. Ein magnetisches Protonresonanzspektrum von BM123garnitur das mit einer D₂0-Lösung in einem 100 Megahertz-Spektrometer bestimmt wurde, ist in Figur 5 der beigefügten Zeichnungen wiedergegeben.

Beispiel 7 Papierverteilungs- und DünnschichtChromatographie von BMi23gamma

Die antibakteriellen Mittel können durch Papierchromatographie voneinander unterschieden werden. Zu diesem Zweck werden auf Streifen aus Whatman No.1-Papier Flecken von wässrigen oder methanolischen Lösungen der Substanzen aufgebracht, worauf

1 bis 2 Stunden in Gegenwart der oberen und unteren Phasen equilibriert wird. Die Streifen werden über Nacht mit der unteren (organischen) Phase entwickelt, die aus einer Mischung von 90-prozentigem Phenol:m-Cresol:Essigsäure:Pyridin:Wasser (100 : 25 : 4 : 4 : 75, jeweils Volumen) erhalten wird. Die Streifen werden aus der Chromatograhierkammer entfernt, 1 bis

2 Stunden an der Luft getrocknet, zur Entfernung von noch vorhandenem Phenol mit Äther gewaschen und auf großen Agarplatten, die mit K. pneumoniae besamt sind, bioautographiert. Rf-Wert: 0,85,

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Claims

Patentansprüche Antibakterielles BM123gamina₁ , eine Verbindung der Formel

CN

K CJ

(M

und seine pharmakologisch annehmbaren Säureadditionssalze.

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Antibakterielles BM123gamma2, eine Verbindung der Formel

CS

a ss

«3· Ol

ι η

C^

'—^U=Q

und seine pharmakologisch annehmbaren Säureadditionssalze.

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Le e rs e i t e